Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung von hochoffenen porösen Mikrosphären (HOPMs) auf Basis von Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) mittels der auf einer Einzelemulsionsformulierung basierenden einfachen mikrofluidischen Technologie. Diese Mikrosphären haben potenzielle Anwendungen im Tissue Engineering und im Arzneimittelscreening.
Abstract
Im Vergleich zu Massengerüsten und der direkten Injektion von Zellen allein haben die injizierbaren modularen Einheiten aufgrund der Bequemlichkeit bei der Verpackung von Zellen, einer verbesserten Zellretention und minimaler Invasivität ein enormes Interesse an der Reparatur von Fehlfunktionen geweckt. Darüber hinaus könnte die poröse Konformation dieser mikroskaligen Träger den Medienaustausch verbessern und das Niveau der Nährstoffe und Sauerstoffversorgung verbessern. Die vorliegende Studie veranschaulicht die bequeme Herstellung von hochoffenporigen Mikrokügelchen (PLGA-HOPMs) auf Basis von Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) durch die einfache mikrofluidische Technologie für Zellabgabeanwendungen. Die resultierenden monodispersen PLGA-HOPMs besaßen Partikelgrößen von ~400 μm und offene Poren von ~50 μm mit miteinander verbundenen Fenstern. Kurz gesagt, die emulgierten Öltröpfchen (PLGA-Lösung in Dichlormethan, DCM), umwickelt mit der 7,5% (w/v) Gelatine-wässrigen Phase, wurden in die 1% (w/v) kontinuierlich fließende Polyvinylalkohol (PVA) wässrige Lösung durch die Koaxialdüse in der maßgeschneiderten mikrofluidischen Anordnung eingebracht. Anschließend wurden die Mikrosphären Lösungsmittelextraktions- und Lyophilisationsverfahren unterzogen, was zur Herstellung von HOPMs führte. Insbesondere verschiedene Formulierungen (Konzentrationen von PLGA und Porogen) und Verarbeitungsparameter (Emulgierleistung, Nadelstärke und Durchflussrate der dispergierten Phase) spielen eine entscheidende Rolle für die Qualitäten und Eigenschaften der resultierenden PLGA-HOPMs. Darüber hinaus könnten diese Architekturen möglicherweise verschiedene andere biochemische Hinweise wie Wachstumsfaktoren für erweiterte Anwendungen in der Arzneimittelforschung und Geweberegeneration kapseln.
Introduction
Zellbeladene Mikrosphären bieten günstige Vorteile, wie z. B. eine verbesserte Zellretentionskapazität in situ, eine effiziente Lieferung von Zellen und die anschließende Fähigkeit zur Zellproliferation in vivo1. Bis heute wurden zahlreiche Untersuchungen zur Entwicklung einer erfolgreichen Gerüststruktur durchgeführt, die eine förderliche Umgebung für Zellen für Geweberegeneration oder Drogenscreening-Anwendungen unterstützt2. Die Hypoxie-Umgebung ist jedoch in den Innenräumen aufgrund unzureichender Versorgung mit Nährstoffen / Sauerstoff und der Ansammlung von Stoffwechselabfällen oft unvermeidlich3. Um diese Probleme zu überwinden, wurden hochporöse Mikrosphären (PMs) unter Verwendung verschiedener Biomaterialien 4,5,6 entwickelt. Darüber hinaus leiden die Gerüste in dynamischer Kultur unter übermäßiger Scherspannung7, und der instabile Zustand des Kulturmediums kann die Genauigkeit von PMs brechen. Alternativ könnte Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) verwendet werden, um PMs mit guter mechanischer Festigkeit für die dynamische Kultur1 zu verarbeiten. Zum Beispiel demonstrierten wir die Co-Injektion von Maus-Myoblasten (C2C12)-beladenen hochoffenen PLGA-PMs (HOPMs) und humanen Nabelschnurvenendothelzellen (HUVEC)-beladenen Polyethylenglykol-Hohlstäbchen, um volumetrischen Muskelverlust zu heilen und eine bemerkenswerte Verbesserung der in situ Skelettmuskelregeneration zu erzielen8.
Insbesondere sind PMs durch große Oberflächen und hohe Porositäten gekennzeichnet, was von besonderem Interesse für die Zelladhäsion und das Wachstum in Richtung minimalinvasiver Zellabgabe ist9. Unter Berücksichtigung dieser Aspekte wurden verschiedene biokompatible Materialien zur Herstellung der PMs10,11 verwendet. Diese designbaren PMs, die mit Zellen kokultiviert werden, bieten eine ausgezeichnete Adhäsion, eine beträchtliche mechanische Festigkeit und stark miteinander verbundene Fenster, die die Zellproliferation zur Reparatur beschädigter Gewebe verbessern könnten12. In diesem Zusammenhang wurden auch verschiedene Technologien zur Herstellung poröser Kugelnentwickelt 13,14. Zum einen wurden PMs mit gasbildenden Mitteln wieNH4HCO3 hergestellt, die aufgrund unzureichender Interkonnektivität 15,16,17 zurückgehalten wurden. Auf der anderen Seite wurden PMs direkt nach der Emulgierung geschert, was zu polydispersen PMs18 führte. Letztendlich ist die Tröpfchenmikrofluidik-Technologie, die auf dem Emulsions-Templating-Ansatz basiert, vielleicht eine effiziente Methode zur Konstruktion von PMs, da sie oft zu Partikeln einheitlicher Größe führt19. Insbesondere hängen die morphologischen Eigenschaften der Mikrosphären oft von der Qualität der erzeugten Emulsionströpfchen (d. h. Wasser-in-Öl, W/O, oder Öl-in-Wasser, O/W) ab, was die Eigenschaften der Biomaterialien signifikant beeinflussen kann20. Es ist erwähnenswert, dass die vorgefertigte mikrofluidische Plattform zur Erzeugung der Mikrofasern oder Mikrokugeln eingesetzt werden kann. In einem Fall demonstrierten Yu et al. die Herstellung von zellbeladenen mikrofaserigen Strukturen auf der Grundlage kapillarbasierter mikrofluidischer Plattformen, die verwendet werden könnten, um zelluläre Netzwerke zur Nachahmung natürlicher Gewebe aufzubauen21. In einem anderen Fall stellten Ye et al. photonische Kristallmikrokapseln durch die Schablonenreplikation kolloidaler Siliziumdioxidkristallperlen durch mikrofluidische Technologien her, was viele Einschränkungen aktueller Techniken überwinden könnte, die eine komplexe Markierung und spezifische Vorrichtung erfordern22.
In der Tat ist die Begründung für die Verwendung dieser Technik auf verschiedene Vorteile zurückzuführen, wie z.B. die einfache Natur, die keine ausgeklügelte Ausrüstung erfordert, und die Bequemlichkeit bei der Synthese von PMs einheitlicher Größe für die Zellabgabe und Anwendungen der regenerativen Medizin. In diesem Zusammenhang können PMs mit vorgefertigten Komponenten des Emulsions-Templating bequem aus einem mikrofluidischen Gerät erhalten werden, das aus Polyvinylchlorid (PVC)-Rohren, einer Glaskapillare und einer Nadel zusammengesetzt ist. Ein W/O-Emulsionsvorläufer wird durch Homogenisieren einer wässrigen Lösung von Gelatine und einer organischen Lösung von PLGA hergestellt. Durch selektives Einspritzen des anwendbaren Teils der Emulsion in die mikrofluidische Plattform werden die PMs mit gleichmäßigen Partikelgrößen und miteinander verbundenen Poren in der gesamten Oberfläche zum Inneren hergestellt. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, die PLGA-HOPMs durch Emulsions-Templating in der mikrofluidischen Plattform herzustellen. Es wird angenommen, dass dieses Protokoll eine reproduzierbare Produktion von PLGA-HOPMs ermöglicht und möglicherweise in den verwandten Bereichen des Tissue Engineering und des Arzneimittelscreenings anwendbar sein wird.
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Protocol
1. Vorbereitung von Lösungen
- Bereiten Sie die PVA-Stammlösung im Voraus vor, indem Sie die PVA-Lösung in einem 80 °C-Wasserbad erhitzen und anschließend bei 4 °C in den Kühlschrank stellen. Abkühlen auf Raumtemperatur (RT) für den experimentellen Einsatz.
- Die Emulsionsvorstufe wird durch Zugabe der wässrigen Gelatinelösung (1 ml, 7,5%, w/v) zur organischen Phase von PLGA (2 ml, 2%, w/v in Dichlormethan, DCM) hergestellt (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Im Allgemeinen umfasst die mikrofluidische Technologie verschiedene Phasen, um die Mikrosphären zu bilden. Die kontinuierliche oder Sammelphase umfasst ein wässriges Polyvinylalkohol (PVA, 600 ml, 1%, w/v).
2. Droplet-mikrofluidische Bauelementmontage und Herstellung von PLGA-HOPMs
HINWEIS: Die für diese Baugruppe erforderlichen Verbrauchsmaterialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
- Passen Sie die Tröpfchengeneratorbaugruppe an.
- Konstruieren Sie einen mikrofluidischen Co-Flow-Generator mit einer Glaskapillare (OD, 1 mm), PVC-Rohren (ID, 1 mm) und einer 26-G-Dosiernadel.
- Verbinden Sie die Glaskapillare mit dem Ende des PVC-Rohres und stechen Sie dann mit einer Nadel in die Verbindung der obigen Struktur.
- Legen Sie das andere Ende des PVC-Rohres während der Tröpfchenerzeugung in die kontinuierliche Phase. Versiegeln Sie die Lücken an der Fuge nach dem Aushärten mit UV-Kleber.
HINWEIS: Die Nadel muss um 45 ° gebogen werden, um das Durchstechen am PVC-Rohr bequem zu ermöglichen, und die Nadelspitze muss in das Kapillarrohr gestreckt werden, um die koaxiale Struktur zu bilden.
- Bereiten Sie die mikrofluidische Tröpfchenplattform vor.
- Verwenden Sie zwei Spritzenpumpen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Verwenden Sie eine 50-ml-Spritze zum Laden der kontinuierlichen Phase und eine 5-ml-Spritze zur Emulsionsbildung.
- Stellen Sie die Durchflussraten der kontinuierlichen Phase und der Dispergierphase auf 2 ml/min bzw. 0,08 ml/min ein.
- Stellen Sie ein 500-ml-Becherglas in ein Eisbad und füllen Sie es mit einer vorgekühlten PVA-wässrigen Lösung (Schritt 1.1).
HINWEIS: Das Ende der Glaskapillare muss in die Sammelphase eingetaucht werden. Es wird empfohlen, den Überstand der Sammelphase nach der Emulsionströpfchenbildung in der Plattform mit dem Glasstab zu rühren (1 h, 60 U/min). Emulsionströpfchen werden an der Spitze der Nadelspitze erzeugt. Im Allgemeinen beeinflusst das Messgerät der Nadel die Größe von PMs, wobei das kleinere Messgerät der kleineren Größe von PMs entspricht. Darüber hinaus korreliert der Porendurchmesser hauptsächlich mit der Porogenkonzentration, die mit entsprechender Gelatinekonzentration ansteigen kann1.
- Führen Sie die Emulgierung und Tröpfchenerzeugung durch.
- Bereiten Sie die Emulsion wie folgt vor.
- Bereiten Sie die Emulsion vor, indem Sie die wässrige Gelatinelösung sofort in die DCM-Lösung von PLGA dekantieren (Schritt 1.2) und mit dem Ultraschallgerät emulgieren (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie die Ultraschallleistung auf 400 W ein und stellen Sie die Gesamtverarbeitungszeit auf 90 s ein (Intervall 2 s, Ultraschallbehandlung 1 s), begleitet von einer ständigen manuellen Änderung der Position der Sonde.
- Stabilisieren Sie die resultierende Emulsion für Spritzenabsaugung und Tröpfchenerzeugung in ca. 20 min.
HINWEIS: Setzen Sie die Sonde des Ultraschall-Zellschalters in die Öl-Wasser-Grenzfläche. Es wird empfohlen, die Ultraschallsonde nicht mit dem Behälter in Kontakt zu lassen.
- Führen Sie die Tröpfchengenerierung durch.
- Die vorbereitete Emulsion (Schritt 2.3.1) wird nach der Ultraschallbehandlung rasch in die 5-ml-Spritze der mikrofluidischen Plattform geladen.
- Die instabile W/O-Emulsion (die sich im Zuge der Phasentrennung befindet) wird als diskontinuierliche Phase in die mikrofluidische Vorrichtung eingebracht. Verwenden Sie gleichzeitig die wässrige Lösung von PVA als kontinuierliche Phase.
- Sammeln Sie die Mikrokugeln mit der Emulsion am Boden des Auffangbechers (PVA, 1%, w/v), nachdem Sie die richtigen Teile der Emulsion in die mikrofluidische Vorrichtung injiziert haben.
- Die Probe wird zur weiteren Stabilisierung über Nacht bei 4 °C platziert.
- Spülen und lyophilisieren Sie die vorbereiteten Mikrosphären (PLGA-HOPMs) gemäß den folgenden Schritten.
HINWEIS: Die erzeugten PLGA-HOPMs enthalten beliebige Poren im Inneren und auf der Oberfläche.- Lagern Sie die Mikrokugeln vor der Normalisierung auf RT bei 4 °C und rühren Sie mit einem Glasstab (1 h, 60 U/min) um, um das verbleibende DCM zu entfernen.
- Filtrieren Sie die Sammelphase im 500-ml-Becherglas vorsichtig und waschen Sie die gesammelten Mikrokugeln dreimal mit entionisiertem Wasser, um das restliche PVA auf der Oberfläche von PMs abzuwaschen.
- Die PLGA-Mikrokugeln für 30 min in das 37 °C warme Wasserbad geben, um die im PLGA-Rückgrat eingewickelte Gelatine aufzulösen.
- Die resultierenden PLGA-HOPMs werden zweimal mit dem entionisierten Wasser gespült, um die Restgelatine zu entfernen, und für die Lyophilisation bei -80 °C für 24 h vorgekühlt.
- Lagern Sie die trockenen PLGA-HOPMs bei -20 °C für weitere Experimente.
- Bereiten Sie die Emulsion wie folgt vor.
3. Rasterelektronenmikroskopische (REM) Bildgebung
- PLGA-HOPMs werden auf dem Probentisch des REM (siehe Materialtabelle) bei RT abgeschieden und der Probentisch in die Sputterzelle des Magnetron-Sputters eingesetzt. Schalten Sie den Transformator und das Magnetron nacheinander ein. Führen Sie die Probe in das REM ein, nachdem sie 1 Minute lang mit Gold gesputtert wurde.
- Erhalten Sie die REM-Bilder, indem Sie die Beschleunigungsspannung auf 5 kV einstellen.
- Zusätzlich quantifizieren Sie die Partikelgröße von PLGA-HOPMs mit 100 PMs im variablen Feld der REM-Bildgebung. Messen Sie das repräsentative Ergebnis, um die Porengrößenverteilung zu quantifizieren.
- Öffnen Sie die Grafiken mit Bild J und verwenden Sie die "gerade Linie", um den Maßstabsbalken des REM-Bildes anzupassen, wodurch die Software Pixel zu Länge identifiziert.
- Klicken Sie auf Analysieren > stellen Sie den Maßstab ein, stellen Sie den "bekannten Abstand" auf den Maßstabsbalken des REM-Bildes ein und klicken Sie auf globale > OK.
- Klicken Sie auf Analyze > Tools > ROI Manager... , um die Poren- oder Partikelgröße von PLGA PMs zu messen und klicken Sie auf Hinzufügen. Messen Sie die Anzahl der Proben basierend auf der Anforderung.
- Klicken Sie auf Messen , um die quantitativen Daten der Grafiken für die weitere Berechnung zu erhalten.
4. Zellkultur- und Fluoreszenzbildgebung
HINWEIS: Für die vorliegende Arbeit wurden mesenchymale Stammzellen (BMSCs) des Knochenmarks von Ratten verwendet. Die Zellen wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).
- Kultur der Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, ergänzt mit L-Glutamin (DMEM/F-12), 10% (v/v) fetalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin. Die Zellen bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren.
- Passieren Sie die Ratten-BMSCs in einem Verhältnis von 1: 2, nachdem Sie 90% des Zusammenflusses erreicht haben.
- Führen Sie die Zelladhäsion durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Die PLGA-HOPMs mit Ethylalkohol (5 ml, 70%, v/v) inkubieren und bei 500 x g für 10 min bei RT sterilisieren.
- Die sterilisierten PLGA-HOPMs zweimal mit Phosphatpufferlösung waschen.
- Inkubieren Sie die HOPMs (fünf an der Zahl) mit der Zellsuspension (5 ml, 1 x 105 Zellen/ml) in einem sterilen Zentrifugenröhrchen (50 ml) unter dynamischer Kultur für die Haftung von BMSCs an PLGA-HOPMs.
- Führen Sie die dynamische Kultur in einem thermostatischen aseptischen Schüttler (37 °C, 90 U/min) durch, indem Sie ein versiegeltes 50-ml-Zentrifugenröhrchen in den Shaker legen (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die dynamische Kultur zielt darauf ab, die Adhärenzrate von BMSCs auf den Gerüsten zu erhöhen, anstatt die PMs und Zellen direkt auf die Kunststoffplatte zu inkubieren. Die Zellen und PLGA PMs werden in ein 50 ml steriles Zentrifugenröhrchen gegeben, wobei das Röhrchen an einem thermostatischen aseptischen Schüttler (37 °C, 90 U/min) inkubiert und das Medium alle 2 Tage gewechselt wird.
- Führen Sie den Live- und Dead-Dual-Färbe-Assay durch.
- Spülen Sie die zellbeladenen PMs dreimal aus, um BMSCs ohne Befestigung an PLGA-HOPMs freizusetzen.
- Legen Sie die zellbeladenen PMs auf die 35 mm Glasbodenplatte. Fügen Sie der PBS-vorgewaschenen Probe 1 ml Färbepuffer (siehe Materialtabelle), einschließlich 1 μL Calcein-AM bzw. Propidiumiodid (PI), hinzu.
- Beurteilen Sie die Proben mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (siehe Materialtabelle). Schalten Sie das Anregungslicht von 488 nm und 552 nm am entsprechenden Detektor ein. Stellen Sie für die z-Overlay-Analyse die z-Breite ein, um die verschiedenen Schichten der Probe durch z-Achsenbewegung des Mikroskops zu erfassen.
HINWEIS: Es ist erwähnenswert, dass die anderen Flecken angemessen für die Analyse verwendet werden können.
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Representative Results
Basierend auf früheren Arbeiten zur Optimierung der Hauptparameter1 wurde PLGA im verdampfbaren DCM-Lösungsmittel gelöst. Die primäre W/O-Emulsion wurde durch Homogenisieren mit Gelatine unter Ultraschallsondenbehandlung hergestellt. Die maßgeschneiderte Co-Flow-Fluidstruktur wurde vereinfacht zusammengesetzt, wobei eine Spritze verwendet wurde, um die Strömungen ständig einzuleiten. Darüber hinaus wurden ausreichende Spülverfahren durchgeführt, um PVA und Gelatine von PLGA-Mikrokugeln zu eliminieren (Abbildung 1A, ergänzende Abbildung 1A,B). Anschließend wurden die morphologischen Eigenschaften von PLGA-HOPMs mittels REM-Bildgebung beobachtet. Es wurde beobachtet, dass die PLGA-HOPMs große Größen (350-500 μm) mit beliebig großen Poren (10-100 μm) und miteinander verbundenen Fenstern aufwiesen, was eine hohe Effizienz beim Sauerstoff- / Stoffwechselabfalltransport ermöglichen könnte (Abbildung 1B). Diese morphologischen Ergebnisse stimmten mit den berichteten Ergebnissen überein1.
Als Proof-of-Concept wurden die BMSCs eingesetzt, um vorläufig innerhalb der PLGA-HOPMs zu kultivieren. Es wurde angenommen, dass die innere Struktur von PMs es den Zellen ermöglichen könnte, während der dynamischen Kultur anzuhaften und die Proliferation sicherzustellen8. Darüber hinaus ist die Begründung für die Auswahl von BMSCs, dass diese Zellen durch multipolare Differenzierung gekennzeichnet sind und beschädigtes Gewebe reparieren und auch häufig verwendet werden, um das biologische Verhalten verschiedener bioaktiver Materialien zu untersuchen23. Die BMSCs wurden verwendet, um in vitro Mikrogewebe mit den Mikrosphären zu konstruieren und die Zellverteilung und den Überlebenszustand durch z-Analyse von CLSM sichtbar zu machen (Abbildung 1C). Es wurde beobachtet, dass eine große Anzahl von Zellen in 1 d an Gerüsten haftete und die grüne Fluoreszenz beibehalten wurde, was eine umfangreiche Adhäsions- und Migrationsfähigkeit von Zellen in PLGA-HOPMs darstellt. Das Zytoplasma wurde indirekt mit Calcein-AM-Färbung abgebildet, da die Acetoxymethylester (AM)-Gruppe eine verbesserte Hydrophobie bietet und das Eindringen durch die lebende Zellmembran erleichtert. Obwohl Calcein-AM keine Fluoreszenz aufweist, kann es durch die endogene Esterase intrazellulär hydrolysiert werden, um das polare Molekül Calcein mit einer starken negativen Ladung zu erzeugen und starke grüne Fluoreszenz zu emittieren24. Daher wird das Zytoplasma indirekt mit Calcein-AM-Färbung sichtbar gemacht (Abbildung 1C, ergänzende Abbildung 1C).
Abbildung 1: Herstellung und Zytokompatibilität von PLGA-HOPMs. (A) Schematische Darstellung der Herstellung der PLGA-HOPMs. (B) Der Porendurchmesser von PMs basierend auf REM-Bildgebung (10-100 μm). Maßstabsbalken = 100 μm. (C) Lebend- (Calcein-AM, grün) und tote (Propidiumiodid, PI, rot) Färbung von BMSCs, die mit PLGA-HOPMs kokultiviert wurden, für 24 h. Maßstabsbalken = 250 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Illustrationen der realen mikrofluidischen Plattform-, Emulsions- und Zwischenschichtbildgebung von zellbeladenen PLGA-HOPMs. (A) Schema der realen Tröpfchenmikrofluidik-Plattform. (B) W/O-Vorläufer, emulgiert durch Ultraschallbehandlung. (C) Die Zwischenschicht von lebender und toter Färbung von BMSCs, die mit PLGA-HOPMs für 24 h kokultiviert wurden. Maßstabsbalken = 250 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Dieser Artikel beschreibt eine effiziente Strategie zur Herstellung von PLGA-basierten Architekturen, nämlich die PLGA-HOPMs. Es ist zu beachten, dass mehrere kritische Schritte sorgfältig unternommen werden müssen, einschließlich der Vermeidung der Lösungsmittelverflüchtigung von PLGA und der sanften Anpassung der Ultraschallleistung an die Zielposition während der Herstellung der Emulsion. Darüber hinaus kann der Flüssigkeitsaustritt der 20-ml-Spritze bis zu einem gewissen Grad eingestellt werden, um die Phasentrennung von emulgierten Vorläufern aufzulösen. Eine Einschränkung besteht jedoch darin, dass, da der Zustand des Porogens von der Umgebungstemperatur beeinflusst wird, die Stabilität der Emulsion unerwünscht sein kann. Zusammen kann die bequeme Montage der tröpfchenmikrofluidischen Plattform die Herstellung von zellbeladenen Mikrogelen für Tissue Engineering- und Arzneimittelscreening-Anwendungen erheblich erleichtern. PLGA wird häufig als Liefervehikel bei der Herstellung von Mikrosphären eingesetzt, da es sich um eine von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Arzneimittelabgabewarehandelt 25. Darüber hinaus bietet der aliphatische Polyester harmlose Abbaueigenschaften durch Hydrolyse entweder in vitro oder in vivo, die vom Anteil an Lactidsäure und Glykolsäure während der Syntheseverfahren abhängig ist26.
Zur Herstellung von PLGA-HOPMs wurden die wässrigen und organischen Phasen mit der Ultraschallsonde zu einer W/O-Emulsion homogenisiert. Dann wurde die W/O-Emulsion in die tropfenmikrofluidische Vorrichtung eingebracht und entwickelte sich an der Nadelspitze zu Wasser-in-Öl-in-Wasser (W/O/W)-Tröpfchen (Abbildung 1A, ergänzende Abbildung 1A, B). Die erhaltenen W/O/W-Tröpfchen konnten durch Extraktion und Verdampfung von DCM in der Sammelphase verfestigt werden. Die vorgekühlte Sammelphase in einem Eisbad könnte es der Gelatine ermöglichen, im Softgel-Zustand zu bleiben und die gut verteilte Emulsion während der Lösungsmittelverdampfung direkt zurückzuhalten, was nach weiterer Lyophilisation zu den PLGA-HOPMs führt (Abbildung 1B).
Darüber hinaus enthält das Emulsions-Templating-Verfahren flüchtige organische Lösungsmittel, die durch Verflüchtigung entfernt werden könnten. Auch der Rückstand von DCM in den PLGA-HOPMs konnte fast vollständig entfernt werden, berechnet aus der gaschromatographischen Messung2. Darüber hinaus würde die mikrofluidische Technologie die Zyto-/Biokompatibilität von PLGA nicht beeinflussen. Tatsächlich zeigten die mit Ratten-BMSCs kultivierten PLGA-HOPMs, dass die Anzahl der lebenden Zellen groß war, mit nur wenigen toten Zellen und der Dehnungsmorphologie. Darüber hinaus konnte das Zytoplasma durch den lebenden Fluoreszenzfarbstoff abgebildet werden, was auf eine Dehnung der HOPMs hinweist.
Zusammen können PLGA-HOPMs mit hervorragenden morphologischen Eigenschaften die Anforderungen an zelluläre Adhäsions- und Spreizfähigkeiten in den HOPMs für die Geweberegeneration und verschiedene biomedizinische Anwendungen erfüllen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
SCL, YW, RKK und AZC bestätigen die finanzielle Unterstützung durch die National Natural Science Foundation of China (NSFC, 32071323, 81971734 und U1605225) und das Program for Innovative Research Team in Science and Technology an der Fujian Province University. YSZ wurde weder von einem dieser Programme unterstützt noch erhielt YSZ irgendeine Art von Bezahlung; stattdessen wird die Unterstützung durch das Brigham Research Institute anerkannt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
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