Summary
Настоящий протокол описывает изготовление высокооткрытых пористых микросфер (HOPM) на основе поли(молочно-ко-гликолевой кислоты) с помощью легкой микрофлюидной технологии на основе одноэмульсионной композиции. Эти микросферы имеют потенциальное применение в тканевой инженерии и скрининге лекарств.
Abstract
По сравнению с объемными каркасами и прямой инъекцией только клеток, инъекционные модульные блоки вызвали огромный интерес к восстановлению неисправных тканей из-за удобства в упаковке клеток, улучшенного удержания клеток и минимальной инвазивности. Кроме того, пористая конформация этих микромасштабных носителей может улучшить обмен среды и улучшить уровень питательных веществ и кислорода. Настоящее исследование иллюстрирует удобное изготовление высокооткрытых пористых микросфер (PLGA-HOPM) на основе поли(молочно-когликолевой кислоты) с помощью легкой микрофлюидной технологии для приложений доставки клеток. Полученные монодисперсные PLGA-HOPM обладали размерами частиц ~400 мкм и открытыми порами ~50 мкм со смежными окнами. Вкратце, эмульгированные капли масла (раствор PLGA в дихлорметане, DCM), обернутые 7,5% (мас./об.) желатиновой водной фазой, вводили в 1% (мас./об.) непрерывно протекающий поли(виниловый спирт) (ПВА) водный раствор через коаксиальное сопло в настраиваемой микрофлюидной установке. Впоследствии микросферы были подвергнуты процедурам экстракции растворителем и лиофилизации, что привело к образованию HOPM. Примечательно, что различные составы (концентрации PLGA и порогена) и параметры обработки (эмульгирующая сила, игольчатый датчик и скорость потока дисперсной фазы) играют решающую роль в качествах и характеристиках полученных PLGA HOPM. Более того, эти архитектуры могут потенциально инкапсулировать различные другие биохимические сигналы, такие как факторы роста, для расширенного открытия лекарств и регенерации тканей.
Introduction
Микросферы, нагруженные клетками, предлагают благоприятные преимущества, такие как повышенная способность удерживать клетки in situ, эффективная доставка клеток и последующая способность к пролиферации клеток in vivo1. На сегодняшний день были проведены многочисленные исследования для разработки успешной структуры строительных лесов для поддержки благоприятной среды для клеток для регенерации тканей или применения скрининга лекарств2. Тем не менее, гипоксия среды часто неизбежна в интерьерах из-за недостаточного снабжения питательными веществами / кислородом и накопления метаболических отходов3. Для преодоления этих проблем разработаны высокопористые микросферы (ПМ) с использованием различных биоматериалов 4,5,6. Кроме того, в динамической культуре каркасы страдают от чрезмерного напряжения сдвига7, и нестабильное состояние питательной среды может нарушить точность ПМ. В качестве альтернативы, поли(молочно-со-гликолевая кислота) (PLGA) может быть использована для обработки ПМ с хорошей механической прочностью для динамической культуры1. Например, мы продемонстрировали совместную инъекцию полых микростержней PLGA (HOPM), нагруженных миобластами мыши (C2C12), и полых микрородок, наполненных поли(этиленгликолем) пупочной вены человека (HUVEC), для лечения потери объемных мышц, достигнув значительного улучшения регенерации скелетных мышц in situ 8.
Примечательно, что ПМ характеризуются большой площадью поверхности и высокой пористостью, что представляет особый интерес для клеточной адгезии и роста в направлении минимально инвазивной доставки клеток9. С учетом этих аспектов для изготовления ПМ10,11 были использованы различные биосовместимые материалы. Эти кондиционируемые ПМ, кокутивные с клетками, обеспечивают отличную адгезию, значительную механическую прочность и тесно взаимосвязанные окна, которые могут улучшить пролиферацию клеток для восстановления поврежденных тканей12. В связи с этим также были разработаны различные технологии изготовления пористых сфер 13,14. С одной стороны, ПМ производились с использованием газообразующих агентов, таких как NH4HCO3, которые были ограничены из-за недостаточной взаимосвязанности 15,16,17. С другой стороны, ПМ были непосредственно срезаны после эмульгирования, что привело к полидисперсным ПМ18. В конце концов, микрофлюидная технология капель, основанная на эмульсионно-шаблонном подходе, возможно, является эффективным методом построения ПМ, поскольку она часто приводит к образованию частиц однородного размера19. Примечательно, что морфологические характеристики микросфер часто зависят от качества образующихся капель эмульсии (т.е. вода в масле, W/O или масло-in-water, O/W), что может существенно влиять на атрибуты биоматериалов20. Стоит отметить, что предварительно разработанная микрофлюидная платформа может быть применена для генерации микроволокон или микросфер. В качестве примера Yu et al. продемонстрировали производство нагруженных клетками микрофиброзных структур на основе микрофлюидных платформ на основе капилляров, которые могут быть использованы для сборки клеточных сетей для имитации естественных тканей21. В другом случае Ye et al. изготовили фотонные кристаллические микрокапсулы путем шаблонной репликации коллоидных кристаллических шариков кремнезема с помощью микрофлюидных технологий, которые могли бы преодолеть многие ограничения современных методов, требующих сложной маркировки и специального устройства22.
Действительно, обоснование использования этого метода обусловлено различными преимуществами, такими как легкость по своей природе, отсутствие сложного оборудования и удобство синтеза ПМ одинакового размера для доставки клеток и регенеративной медицины. В этом контексте, с предварительно разработанными компонентами эмульсии-шаблонизации, ПМ с высокой пористостью и взаимосвязанностью могут быть удобно получены из микрофлюидного устройства, собранного из поли(винилхлоридной) (ПВХ) трубки, стеклянного капилляра и иглы. Эмульсия-предшественник W/O получают путем гомогенизации водного раствора желатина и органического раствора PLGA. Путем селективного введения соответствующей части эмульсии в микрофлюидную платформу изготавливаются ПМ с одинаковыми размерами частиц и взаимосвязанными порами по всей поверхности вглубь. Настоящий протокол направлен на изготовление PLGA-HOPM путем эмульсии-шаблонизации в микрофлюидной платформе. Считается, что этот протокол позволяет воспроизводить производство PLGA-HOPM и потенциально будет применим в смежных областях тканевой инженерии и скрининга лекарств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление растворов
- Подготовьте раствор ПВА заранее, нагревая раствор ПВА на водяной бане при температуре 80 °C и затем помещая его в холодильник при 4 °C. Охладить до комнатной температуры (RT) для экспериментального использования.
- Готовят эмульсию-предшественник путем добавления водного раствора желатина (1 мл, 7,5%, мас./об.) в органическую фазу PLGA (2 мл, 2%, мас./об.в дихлорметана, DCM) (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, микрофлюидная технология включает в себя различные фазы для формирования микросфер. Непрерывная или сборная фаза содержит водный поли(виниловый спирт) (ПВА, 600 мл, 1%, мас./об.).
2. Сборка капельных микрофлюидных устройств и изготовление PLGA-HOPM
ПРИМЕЧАНИЕ: Расходные материалы, необходимые для этой сборки, перечислены в Таблице материалов.
- Настройте сборку генератора капель.
- Сконструируйте копоточный микрофлюидный генератор с использованием стеклянного капилляра (OD, 1 мм), трубок из ПВХ (ID, 1 мм) и дозирующей иглы 26 G.
- Соедините стеклянный капилляр с концом трубки ПВХ и затем проколите иглой при соединении вышеуказанной структуры.
- Поместите другой конец трубки из ПВХ в непрерывную фазу во время генерации капель. Используя УФ-клей, заделайте зазоры в стыке после отверждения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Игла должна быть изогнута примерно на 45° для удобного прокалывания трубки из ПВХ, а точка иглы растягивается в капиллярную трубку, чтобы сформировать коаксиальную структуру.
- Подготовьте капельную микрофлюидную платформу.
- Используйте два шприцевых насоса, как показано на рисунке 1. Используйте шприц объемом 50 мл для загрузки непрерывной фазы и шприц объемом 5 мл для образования эмульсии.
- Установите скорость потока непрерывной и дисперсионной фаз на уровне 2 мл/мин и 0,08 мл/мин соответственно.
- Поместите стакан объемом 500 мл в ледяную ванну и наполните его предварительно охлажденным водным раствором ПВА (этап 1.1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Конец стеклянного капилляра должен быть погружен в фазу сбора. Предлагается перемешивать (1 ч, 60 об/мин) надводное вещество фазы сбора со стеклянным стержнем после образования эмульсий-капель в платформе. Капли эмульсии образуются на кончике иглы. В общем, датчик иглы влияет на размер PM, в котором меньший калибр соответствует меньшему размеру PM. Кроме того, диаметр пор в основном коррелирует с концентрацией порогена, способной увеличиваться с соответствующей концентрацией желатина1.
- Выполняют эмульгирование и генерацию капель.
- Приготовьте эмульсию, выполнив следующие действия.
- Готовят эмульсию путем немедленного декантирования водного желатинового раствора в раствор DCM PLGA (этап 1.2) и эмульгирования с помощью ультразвукового устройства (см. Таблицу материалов).
- Отрегулируйте ультразвуковую мощность до 400 Вт и установите общее время обработки как 90 с (интервал 2 с, ультразвуковая обработка 1 с), сопровождаемая постоянным изменением положения зонда вручную.
- Стабилизируйте полученную эмульсию для отсасывания шприца и образования капель примерно через 20 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите зонд ультразвукового выключателя ячеек в интерфейс масло-вода. Рекомендуется не допускать контакта ультразвукового зонда с контейнером.
- Выполните генерацию капель.
- Быстро загрузить приготовленную эмульсию (стадия 2.3.1) в шприц 5 мл микрофлюидной платформы после ультразвуковой обработки.
- Вводят нестабильную В/О эмульсию (находящуюся в процессе фазового разделения) в микрофлюидное устройство в виде прерывистой фазы. В то же время используют водный раствор ПВА в качестве непрерывной фазы.
- Соберите микросферы, содержащие эмульсию, в нижней части сборного стакана (ПВА, 1%, мас./об.) после введения соответствующих порций эмульсии в микрофлюидное устройство.
- Поместите образец при температуре 4 °C на ночь для дальнейшей стабилизации.
- Промыть и лиофилизировать подготовленные микросферы (PLGA-HOPM), следуя приведенным ниже шагам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Генерируемые PLGA-HOPM содержат произвольные поры внутри и поверхности.- Храните микросферы при 4 °C перед нормализацией до RT и перемешивайте стеклянным стержнем (1 ч, 60 об/мин) для устранения остаточного DCM.
- Тщательно фильтруйте фазу сбора в стакане объемом 500 мл и трижды промывайте собранные микросферы деионизированной водой, чтобы смыть остаточный ПВА на поверхности ПМ.
- Поместите микросферы PLGA на водяную баню с температурой 37 °C в течение 30 минут, чтобы растворить желатин, обернутый в основу PLGA.
- Полученные PLGA-HOPM дважды промыть деионизированной водой для удаления остаточного желатина и предварительно охладить для лиофилизации при -80 °C в течение 24 ч.
- Храните сухие PLGA-HOPM при -20 °C для дальнейших экспериментов.
- Приготовьте эмульсию, выполнив следующие действия.
3. Визуализация сканирующего электронного микроскопа (SEM)
- Нанесите PLGA-HOPM на стадию образца SEM (см. Таблицу материалов) в RT и поместите стадию образца в ячейку напыления магнетронного напыления. Включите трансформатор и магнетрон один за другим. Вводят образец в SEM после напыления золота в течение 1 мин.
- Получение SEM-изображений путем установки напряжения ускорения на уровне 5 кВ.
- Кроме того, количественно оцените размер частиц PLGA-HOPM, используя 100 ПМ в переменном поле визуализации SEM. Измерьте репрезентативный результат для количественной оценки распределения по размерам пор.
- Откройте графику с помощью Image J и используйте «прямую линию», чтобы соответствовать шкале масштаба изображения SEM, что заставляет программное обеспечение идентифицировать пиксель по длине.
- Нажмите « Анализировать > установить масштаб, установить «известное расстояние» на шкалу масштаба изображения SEM и нажмите на глобальный > OK.
- Нажмите на анализ > Инструменты > менеджер ROI ... чтобы измерить размер пор или частиц PLGA PM и нажмите на добавить его. Измерьте количество образцов в зависимости от требования.
- Нажмите на Измерение , чтобы получить количественные данные графиков для дальнейшего расчета.
4. Клеточная культура и флуоресцентная визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящей работы были использованы мезенхимальные стволовые клетки костного мозга крыс (BMSCs). Ячейки были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).
- Культивируйте клетки в модифицированной среде Eagle от Dulbecco, дополненной L-глютамином (DMEM / F-12), 10% (v / v) фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллином / стрептомицином. Инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO2.
- Прохождение крысиных BMSC в соотношении 1:2 после достижения 90% слияния.
- Выполните адгезию клеток, выполнив следующие действия.
- Инкубировать PLGA-HOPM с этиловым спиртом (5 мл, 70%, v/v) и центрифугой при 500 х г в течение 10 мин при RT для стерилизации.
- Дважды промыть стерилизованные PLGA-HOPM фосфатным буферным раствором.
- Инкубировать HOPM (пять в количестве) с клеточной суспензией (5 мл, 1 x 105 клеток/мл) в стерильной центрифужной трубке (50 мл) под динамической культурой для адгезии BMSC к PLGA-HOPM.
- Выполните динамическую культуру в термостатическом асептическом шейкере (37 °C, 90 об/мин), поместив герметичную центрифужную трубку емкостью 50 мл в шейкер (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Динамическая культура предназначена для повышения скорости адгезии BMSC на каркасах, а не для непосредственной инкубации PM и клеток на пластиковой пластине. Ячейки и PLGA PM добавляют в стерильную центрифужную трубку объемом 50 мл, инкубируя трубку в термостатическом асептическом шейкере (37 °C, 90 об/мин) и меняя среду каждые 2 дня.
- Выполните анализ с двойным пятном живых и мертвых.
- Трижды промывайте ПМ, нагруженные ячейками, для элюирования BMSC без подключения к PLGA-HOPM.
- Поместите ПМ, нагруженные ячейками, на стеклянную пластину толщиной 35 мм. Добавьте 1 мл окрашивающего буфера (см. Таблицу материалов), включая 1 мкл кальциина-AM и йодида пропидия (PI), соответственно, к предварительно промытому образцу PBS.
- Оценить образцы с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (см. Таблицу материалов). Включите свет возбуждения 488 нм и 552 нм на соответствующем детекторе. Для z-оверлейного анализа установите z-ширину для захвата различных слоев образца движением микроскопа по оси Z.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стоит отметить, что другие пятна могут быть надлежащим образом использованы для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основываясь на предыдущей работе, которая оптимизировала основные параметры1, PLGA растворяли в испаряемом растворителе DCM. Первичную эмульсию W/O получали путем гомогенизации желатином под ультразвуковой зондовой обработкой. Была упрощенно собрана индивидуальная флюидная структура сопотока, в которой использовался шприц для постоянного введения потоков. Кроме того, были проведены достаточные процедуры полоскания для устранения ПВА и желатина из микросфер PLGA (Рисунок 1A, Дополнительный Рисунок 1A, B). Впоследствии морфологические признаки PLGA-HOPM наблюдались с помощью визуализации SEM. Было отмечено, что PLGA-HOPM демонстрируют большие размеры (350-500 мкм) с порами произвольного размера (10-100 мкм) и взаимосвязанными окнами, что может способствовать высокой эффективности транспортировки кислорода/метаболических отходов (рисунок 1B). Эти морфологические результаты согласовывались с сообщенными результатами1.
В качестве доказательства концепции BMSC были использованы для предварительного культивирования в рамках PLGA-HOPM. Считалось, что внутренняя структура ПМ может позволить клеткам прилипать и обеспечивать пролиферацию во время динамической культуры8. Кроме того, обоснование выбора BMSC заключается в том, что эти клетки характеризуются многополярной дифференцировкой и восстановлением поврежденных тканей, а также обычно используются для изучения биологического поведения различных биологически активных материалов23. BMSC были использованы для построения микротузий in vitro с микросферами и визуализации распределения клеток и состояния выживания с помощью z-анализа CLSM (рисунок 1C). Было отмечено, что большое количество клеток прилипает к каркасам за 1 d, и сохраняется зеленая флуоресценция, представляющая обширные адгезионные и миграционные возможности клеток в PLGA-HOPM. Цитоплазма была косвенно изображена с окрашиванием кальциеном-AM, поскольку группа ацетоксиметилового эфира (AM) обеспечивает улучшенную гидрофобность и облегчает проникновение через живую клеточную мембрану. Хотя кальцин-AM не имеет флуоресценции, он может быть гидролизован эндогенной эстеразой внутриклеточным образом для генерации полярной молекулы кальцеина с сильным отрицательным зарядом и испускания сильной зеленой флуоресценции24. Поэтому цитоплазма косвенно визуализируется с окрашиванием кальцеином-АМ (Рисунок 1С, Дополнительный Рисунок 1С).
Рисунок 1: Изготовление и цитосовместимость PLGA-HOPM. (A) Схематическая иллюстрация изготовления PLGA-HOPM. (B) Диаметр пор ПМ на основе визуализации SEM (10-100 мкм). Шкала бара = 100 мкм. (C) Живое (кальцеин-AM, зеленый) и мертвое (йодид пропидия, PI, красный) окрашивание BMSCs, кокультурированных с PLGA-HOPM в течение 24 ч. Шкала = 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Иллюстрации реальной микрофлюидной платформы, эмульсии и межслойной визуализации нагруженных клетками PLGA-HOPM. (A) Схема платформы микрофлюидики реальной капли. (B) Без прекурсора, эмульгированного ультразвуковой обработкой. (C) Промежуточный слой живого и мертвого окрашивания BMSC, кокультурированных с PLGA-HOPM в течение 24 ч. Шкала = 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье описывается эффективная стратегия создания архитектур на основе PLGA, а именно PLGA-HOPM. Следует отметить, что необходимо осторожно предпринять несколько критических шагов, в том числе избегать испарения PLGA растворителем и мягкой регулировки ультразвуковой мощности в целевое положение во время приготовления эмульсии. Кроме того, жидкое выходное отверстие шприца объемом 20 мл может быть в определенной степени отрегулировано для решения фазового разделения эмульгированных прекурсоров. Однако ограничение заключается в том, что, поскольку на состояние порогена влияет температура окружающей среды, стабильность эмульсии может быть нежелательной. Вместе удобная сборка микрофлюидной платформы капель может существенно облегчить изготовление нагруженных клетками микрогелей для тканевой инженерии и скрининга лекарств. PLGA часто применяется в качестве средства доставки при изготовлении микросфер, поскольку это одобренный Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) товар доставки лекарств25. Кроме того, алифатический полиэстер обладает безвредными свойствами деградации посредством гидролиза in vitro или in vivo, который зависит от пропорции лактидной кислоты и гликолевой кислоты во время процедур синтеза26.
Для изготовления PLGA-HOPM водную и органическую фазы гомогенизировали с образованием эмульсии W/O с использованием ультразвукового зонда. Затем эмульсия W/O вводили в капельное микрофлюидное устройство и превращали в капли воды в масле в воде (W/O/W) на кончике иглы (рисунок 1A, дополнительный рисунок 1A, B). Полученные капли W/O/W могут быть затвердевшими путем экстракции и испарения DCM на этапе сбора. Предварительно охлажденная фаза сбора в ледяной ванне может позволить желатину оставаться в мягком гелевом состоянии, непосредственно сохраняя хорошо распределенную эмульсию во время испарения растворителя, что приводит к образованию PLGA-HOPM после дальнейшей лиофилизации (рисунок 1B).
Кроме того, эмульсионно-шаблонный способ содержит летучие органические растворители, которые могут быть удалены путем испарения. Кроме того, остаток DCM в PLGA-HOPM может быть почти полностью удален, рассчитанный из измерения газовой хроматографии2. Кроме того, микрофлюидная технология не повлияет на цито/биосовместимость PLGA. Фактически, PLGA-HOPM, культивируемые с помощью крысиных BMSC, показали, что количество живых клеток было обширным, с несколькими мертвыми клетками и растягивающейся морфологией. Кроме того, цитоплазма может быть визуализирована живым флуоресцентным красителем, что указывает на растяжение на HOPM.
Вместе PLGA-HOPM с различными морфологическими свойствами могут соответствовать требованиям, касающимся клеточной адгезии и способности к распространению по всему HOPM для регенерации тканей и различных биомедицинских применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
SCL, YW, RKK и AZC признают финансовую поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (NSFC, 32071323, 81971734 и U1605225) и Программы инновационных исследований в области науки и техники в Университете провинции Фуцзянь. YSZ не поддерживалась ни одной из этих программ и не получала никаких платежей; вместо этого признается поддержка со стороны Научно-исследовательского института имени Бригама.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists' Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
