Summary
Denne protokollen beskriver fabrikasjon av poly (melke-ko-glykolsyre)-baserte svært åpne porøse mikrosfærer (HOPMs) via enkeltemulsjonsformuleringsbasert lettvindig mikrofluidisk teknologi. Disse mikrosfærene har potensielle anvendelser i vevsteknikk og narkotikascreening.
Abstract
Sammenlignet med bulk stillaser og direkte injeksjon av celler alene, har de injiserbare modulære enhetene fått enorm interesse for å reparere funksjonsfeil vev på grunn av bekvemmelighet i pakking av celler, forbedret celleretensjon og minimal invasivitet. Videre kan den porøse konformasjonen av disse mikroskalabærerne øke mediumutvekslingen og forbedre nivået av næringsstoffer og oksygenforsyninger. Denne studien illustrerer den praktiske fabrikasjonen av poly (melke-ko-glykolsyre) -baserte svært åpne porøse mikrosfærer (PLGA-HOPMs) av den enkle mikrofluidiske teknologien for celleleveringsapplikasjoner. De resulterende monodisperserte PLGA-HOPM-ene hadde partikkelstørrelser på ~ 400 μm og åpne porer på ~ 50 μm med sammenhengende vinduer. Kort fortalt ble de emulgerte oljedråpene (PLGA-oppløsning i diklormetan, DCM), innpakket med 7,5% (w / v) gelatinvandig fase, introdusert i 1% (w / v) kontinuerlig flytende poly (vinylalkohol) (PVA) vandig løsning gjennom koaksialdysen i det tilpassede mikrofluidiske oppsettet. Deretter ble mikrosfærene utsatt for løsningsmiddelekstraksjon og lyofiliseringsprosedyrer, noe som resulterte i produksjon av HOPMs. Spesielt spiller forskjellige formuleringer (konsentrasjoner av PLGA og porogen) og prosesseringsparametere (emulgerende kraft, nålemåler og strømningshastighet for dispergert fase) avgjørende roller i egenskapene og egenskapene til de resulterende PLGA HOPMs. Videre kan disse arkitekturene potensielt innkapsle forskjellige andre biokjemiske signaler, for eksempel vekstfaktorer, for utvidet legemiddeloppdagelse og vevregenereringsapplikasjoner.
Introduction
Cellebelastede mikrosfærer gir gunstige fordeler, for eksempel forbedret celleretensjonskapasitet in situ, effektiv levering av celler og påfølgende evne til celleproliferasjon in vivo1. Til dags dato har mange undersøkelser blitt lagt frem for å utvikle en vellykket stillasstruktur for å støtte et gunstig miljø for celler for vevregenerering eller narkotikascreeningsapplikasjoner2. Imidlertid er hypoksimiljøet ofte uunngåelig i interiøret på grunn av utilstrekkelig tilførsel av næringsstoffer / oksygen og metabolsk avfallsakkumulering3. For å overvinne disse problemene har svært porøse mikrosfærer (PM) blitt utviklet ved hjelp av forskjellige biomaterialer 4,5,6. I tillegg, i dynamisk kultur, lider stillasene av overdreven skjærspenning7, og den ustabile tilstanden til kulturmediet kan bryte troskapen til partimedlemmene. For eksempel demonstrerte vi samtidig injeksjon av mus myoblast (C2C12) -laden PLGA svært åpne PMs (HOPMs) og human navlestreng endotelcelle (HUVEC) -laden poly (etylenglykol) hule mikroroder for å helbrede volumetrisk muskeltap, og oppnådde bemerkelsesverdig forbedring av in situ skjelettmuskelregenerering8.
Spesielt er PMs preget av store overflateområder og høye porøsiteter, som er av spesiell interesse for celleadhesjon og vekst mot minimal invasiv cellelevering9. I lys av disse aspektene har ulike biokompatible materialer blitt brukt til å fremstille PMs10,11. Disse utformede PM-ene som er kokulturert med celler, gir utmerket vedheft, betydelig mekanisk styrke og svært sammenkoblede vinduer, noe som kan forbedre celleproliferasjonen for å reparere skadet vev12. I denne forbindelse er det også utviklet ulike teknologier for å fremstille porøse kuler13,14. På den ene siden ble PMs produsert ved hjelp av gassdannende midler, for eksempel NH4HCO3, som ble begrenset på grunn av utilstrekkelig sammenkobling15,16,17. På den annen side ble PMs direkte kuttet etter emulgering, noe som førte til polydisperse PMs18. Til slutt er dråpemikrofluidisk teknologi basert på emulsjonsmalende tilnærming kanskje en effektiv metode for å konstruere PMer, da det ofte resulterer i ensartede partikler19. Spesielt er de morfologiske egenskapene til mikrosfærene ofte avhengige av kvaliteten på de genererte emulsjonsdråpene (dvs. vann-i-olje, W / O eller olje-i-vann, O / W), noe som kan påvirke egenskapene til biomaterialene20 betydelig. Det er verdt å merke seg at den forhåndsdesignede mikrofluidiske plattformen kan brukes til å generere mikrofibre eller mikrosfærer. I et tilfelle demonstrerte Yu og medarbeidere produksjonen av cellebelastede mikrofibroøse strukturer basert på kapillærbaserte mikrofluidiske plattformer, som kunne brukes til å sette sammen cellulære nettverk for å etterligne naturlig vev21. I et annet tilfelle produserte Ye et al. fotoniske krystallmikrokapsler ved malreplikasjon av silikakolloidale krystallperler gjennom mikrofluidiske teknologier, noe som kunne overvinne mange begrensninger av nåværende teknikker som krever kompleks merking og spesifikt apparat22.
Faktisk er begrunnelsen bak bruken av denne teknikken på grunn av ulike fordeler, for eksempel å være lettvint i naturen, krever ikke sofistikert utstyr, og dens bekvemmelighet i å syntetisere ensartede partimedlemmer for cellelevering og regenerative medisinapplikasjoner. I denne sammenheng, med forhåndsdesignede komponenter av emulsjonsmaling, kan PMs med høy porøsitet og sammenkobling enkelt oppnås fra en mikrofluidisk enhet montert fra poly (vinylklorid) (PVC) rør, en glasskapillær og en nål. En W / O-emulsjonsforløper fremstilles ved homogenisering av en vandig løsning av gelatin og en organisk løsning av PLGA. Ved selektiv injeksjon av den aktuelle delen av emulsjonen i den mikrofluidiske plattformen, fremstilles PM-ene med ensartede partikkelstørrelser og sammenkoblede porer i hele overflaten til interiøret. Denne protokollen tar sikte på å fremstille PLGA-HOPM-ene ved å emulsjonsmaler i den mikrofluidiske plattformen. Det antas at denne protokollen tillater reproduserbar produksjon av PLGA-HOPMs og vil potensielt være anvendelig i deres relaterte felt av vevsteknikk og narkotika screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling av løsninger
- Forbered PVA-stamløsningen på forhånd ved å varme opp PVA-oppløsningen i et 80 °C vannbad og deretter plassere den i kjøleskapet ved 4 °C. Avkjøl til romtemperatur (RT) for eksperimentell bruk.
- Forbered emulsjonsforløperen ved å tilsette den vandige gelatinoppløsningen (1 ml, 7,5 %, w/v) til den organiske fasen av PLGA (2 ml, 2 %, w/v i diklormetan, DCM) (se materialtabell).
MERK: Generelt involverer mikrofluidisk teknologi forskjellige faser for å danne mikrosfærene. Den kontinuerlige eller oppsamlingsfasen består av en vandig poly (vinylalkohol) (PVA, 600 ml, 1%, w / v).
2. Dråpemikrofluidisk enhetsmontering og fabrikasjon av PLGA-HOPM
MERK: Forbruksvarene som kreves for denne monteringen, er oppført i materialtabellen.
- Tilpass dråpegeneratorenheten.
- Konstruer en mikrofluidisk generator med co-flow ved hjelp av en glasskapillær (OD, 1 mm), PVC-rør (ID, 1 mm) og en 26 G dispensernål.
- Koble glasskapillæren til enden av PVC-røret og pierce deretter med en nål ved tilkoblingen av strukturen ovenfor.
- Plasser den andre enden av PVC-røret i kontinuerlig fase under dråpegenereringen. Bruk UV-lim til å tette hullene i skjøten etter herding.
MERK: Nålen må bøyes buet ca. 45° for praktisk piercing i PVC-røret, og nålepunktet strekkes inn i kapillærrøret for å danne koaksialstrukturen.
- Forbered dråpemikrofluidisk plattform.
- Bruk to sprøytepumper, som vist i figur 1. Bruk en 50 ml sprøyte til å fylle den kontinuerlige fasen og en 5 ml sprøyte for emulsjonsdannelse.
- Sett strømningshastighetene for kontinuerlige faser og dispersjonsfaser til henholdsvis 2 ml/min og 0,08 ml/min.
- Legg et 500 ml beger i et isbad og fyll det med en forkjølt PVA-vandig løsning (trinn 1.1).
MERK: Enden av glasskapillæren må nedsenkes i oppsamlingsfasen. Det foreslås å røre (1 time, 60 o / min) supernatanten i oppsamlingsfasen med glassstangen etter emulsjonsdråpedannelsen i plattformen. Emulsjonsdråper produseres på spissen av nålepunktet. Generelt påvirker nålens måler størrelsen på PMs, hvor den mindre måleren tilsvarer den mindre størrelsen på PMs. Videre er porediameteren hovedsakelig korrelert med porogenkonsentrasjonen, som er i stand til å øke med passende gelatinkonsentrasjon1.
- Utfør emulgering og dråpegenerering.
- Forbered emulsjonen ved å følge trinnene nedenfor.
- Forbered emulsjonen ved umiddelbart å dekantere den vandige gelatinoppløsningen i DCM-oppløsningen av PLGA (trinn 1.2) og emulgere ved bruk av ultralydsenheten (se Materialfortegnelse).
- Juster ultralydseffekten til 400 W, og sett den totale behandlingstiden til 90 s (intervall 2 s, ultralydbehandling 1 s), ledsaget av kontinuerlig endring av sondens posisjon manuelt.
- Stabiliser den resulterende emulsjonen for sprøytesug og dråpegenerering på ca. 20 minutter.
MERK: Plasser sonden til ultralydcellebryteren i olje-vann-grensesnittet. Det anbefales ikke å la ultralydssonden komme i kontakt med beholderen.
- Utfør dråpegenereringen.
- Last den tilberedte emulsjonen (trinn 2.3.1) raskt i 5 ml sprøyten på den mikrofluidiske plattformen etter ultralydbehandling.
- Introduser den ustabile W / O-emulsjonen (som er i løpet av faseseparasjon) i den mikrofluidiske enheten som den diskontinuerlige fasen. Bruk samtidig den vandige løsningen av PVA som kontinuerlig fase.
- Samle mikrosfærene som inneholder emulsjonen i bunnen av oppsamlingsbegeret (PVA, 1%, w / v) etter injeksjon av riktige deler av emulsjonen i den mikrofluidiske enheten.
- Plasser prøven på 4 °C over natten for ytterligere stabilisering.
- Skyll og lyofiliser de tilberedte mikrosfærene (PLGA-HOPMs) ved å følge trinnene nedenfor.
MERK: De genererte PLGA-HOPMene inneholder vilkårlige porer på innsiden og overflaten.- Oppbevar mikrosfærene ved 4 °C før normalisering til RT og rør med en glassstang (1 t, 60 o/min) for å eliminere gjenværende DCM.
- Filtrer oppsamlingsfasen i 500 ml begeret forsiktig, og vask de oppsamlede mikrosfærene tre ganger med avionisert vann for å vaske av gjenværende PVA på overflaten av PMs.
- Plasser PLGA-mikrosfærene i vannbadet på 37 °C i 30 minutter for å løse opp gelatinen som er pakket inn i PLGA-ryggraden.
- Skyll de resulterende PLGA-HOPMs to ganger med det avioniserte vannet for å fjerne gjenværende gelatin og forkjøl for lyofilisering ved -80 ° C i 24 timer.
- Oppbevar de tørre PLGA-HOPMene ved -20 °C for videre eksperimenter.
- Forbered emulsjonen ved å følge trinnene nedenfor.
3. Skanning elektronmikroskop (SEM) bildebehandling
- Deponer PLGA-HOPMs på prøvetrinnet til SEM (se Materialtabell) ved RT og sett prøvetrinnet inn i sputtercellen til magnetronsputteren. Slå på transformatoren og magnetronen en etter en. Introduser prøven til SEM etter å ha blitt sputterbelagt med gull i 1 min.
- Få SEM-bildene ved å sette akselerasjonsspenningen til 5 kV.
- I tillegg kvantifiserer du partikkelstørrelsen til PLGA-HOPM ved hjelp av 100 PM-er ved det variable feltet for SEM-avbildning. Mål det representative resultatet for å kvantifisere porestørrelsesfordelingen.
- Åpne grafikken med bilde J og bruk den "rette linjen" for å matche skalalinjen til SEM-bildet, noe som gjør at programvaren identifiserer piksel til lengde.
- Klikk på analyser > angitt skala, sett "kjent avstand" til skalalinjen til SEM-bildet, og klikk på global > OK.
- Klikk på analyser > Tools > ROI manager ... for å måle pore- eller partikkelstørrelsen på PLGA PMs og klikk på legg den til. Mål antall prøver basert på kravet.
- Klikk på Mål for å få kvantitative data fra grafikken for videre beregning.
4. Cellekultur og fluorescensavbildning
MERK: Rottebenmarg mesenkymale stamceller (BMSC) ble brukt til det foreliggende arbeidet. Cellene ble hentet fra en kommersiell kilde (se Materialfortegnelse).
- Dyrk cellene i Dulbeccos modifiserte Eagle medium supplert med L-glutamin (DMEM / F-12), 10% (v / v) føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin. Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2.
- Passasje rotte BMSCs i et 1: 2-forhold etter å ha nådd 90% av samløpet.
- Utfør celleadhesjon ved å følge trinnene nedenfor.
- Inkuber PLGA-HOPMs med etylalkohol (5 ml, 70%, v / v) og sentrifuge ved 500 x g i 10 minutter ved RT for å sterilisere.
- Vask de steriliserte PLGA-HOPMene to ganger med fosfatbufferløsning.
- Inkuber HOPM (fem i antall) med cellesuspensjonen (5 ml, 1 x 105 celler / ml) i et sterilt sentrifugerør (50 ml) under dynamisk kultur for BMSC-adhesjon til PLGA-HOPMs.
- Utfør den dynamiske kulturen i en termostatisk aseptisk shaker (37 ° C, 90 o / min) ved å plassere et forseglet 50 ml sentrifugerør i shakeren (se materialtabell).
MERK: Den dynamiske kulturen har til hensikt å forbedre etterlevelsesgraden av BMSCCs på stillasene, i stedet for direkte inkubering av partimedlemmer og celler på plastplaten. Cellene og PLGA PMs tilsettes i et 50 ml sterilt sentrifugerrør, inkuberer røret ved en termostatisk aseptisk shaker (37 ° C, 90 rpm) og endrer media hver 2.
- Utfør den levende og døde dobbeltflekkanalysen.
- Skyll de cellebelastede PM-ene tre ganger for å eluere BMSC-er uten vedlegg til PLGA-HOPM-er.
- Plasser de cellebelastede partimedlemmene på 35 mm glassbunnsplaten. Tilsett 1 ml fargebuffer (se materialtabell), inkludert henholdsvis 1 μL kalsein-AM og propidiumjodid (PI) til PBS-forvasket prøve.
- Vurder prøvene ved konfokal laserskanningsmikroskopi (se materialtabell). Slå på eksitasjonslyset på 488 nm og 552 nm ved den tilsvarende detektoren. For z-overleggsanalyse, sett z-wide for å fange de forskjellige lagene i prøven ved z-aksebevegelse av mikroskopet.
MERK: Det er verdt å merke seg at de andre flekkene kan brukes på riktig måte for analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Basert på tidligere arbeid som optimaliserte hovedparametrene1, ble PLGA oppløst i det evaporable DCM-løsningsmidlet. Den primære W / O-emulsjonen ble fremstilt ved homogenisering med gelatin under ultralydsondebehandling. Den tilpassede samstrømningsfluidiske strukturen ble forenklet montert, der en sprøyte ble ansatt for å introdusere strømmene konstant. Videre ble det utført tilstrekkelige skylleprosedyrer for å eliminere PVA og gelatin fra PLGA-mikrosfærer (figur 1A, supplerende figur 1A, B). Deretter ble de morfologiske egenskapene til PLGA-HOPM observert ved SEM-avbildning. Det ble observert at PLGA-HOPM-ene viste store størrelser (350-500 μm) med porer i vilkårlig størrelse (10-100 μm) og sammenkoblede vinduer, noe som kunne lette høy effektivitet i oksygen / metabolsk avfallstransport (figur 1B). Disse morfologiske resultatene var i samsvar med de rapporterte resultatene1.
Som et proof-of-concept ble BMSC-ene brukt til forsøksvis kultur innenfor PLGA-HOPM-ene. Det ble antatt at PMs indre struktur kunne tillate cellene å feste seg til og sikre spredning under dynamisk kultur8. I tillegg er begrunnelsen for å velge BMSC-er at disse cellene er preget av multipolar differensiering og reparasjon av skadet vev, og brukes også ofte til å studere den biologiske oppførselen til forskjellige bioaktive materialer23. BMSC-ene ble brukt til å konstruere in vitro mikrovev med mikrosfærene og visualiserte cellefordeling og overlevelsestilstand ved z-analyse av CLSM (figur 1C). Det ble observert at et stort antall celler festet seg til stillaser i 1 d, og den grønne fluorescensen ble opprettholdt, noe som representerte omfattende adhesjons- og migrasjonsevner av celler i PLGA-HOPMs. Cytoplasmaet ble indirekte avbildet med kalsein-AM-farging siden acetoksymetylestergruppen (AM) gir forbedret hydrofobisitet og letter penetrasjonen gjennom den levende cellemembranen. Selv om kalsein-AM ikke har fluorescens, kan den hydrolyseres av den endogene esteraseen intracellulært for å generere det polare molekylet calcein med sterk negativ ladning og avgi sterk grønn fluorescens24. Derfor visualiseres cytoplasma indirekte med kalsein-AM-farging (figur 1C, supplerende figur 1C).
Figur 1: Fabrikasjon og cytokompatibilitet av PLGA-HOPMs. (A) Skjematisk illustrasjon av fabrikasjon av PLGA-HOPMs. (B) Porediameteren til partimedlemmer basert på SEM-avbildning (10-100 μm). Skala bar = 100 μm. (C) Levende (calcein-AM, grønn) og død (propidiumjodid, PI, rød) farging av BMSCs cocultured med PLGA-HOPMs i 24 timer. Skala bar = 250 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Illustrasjoner av den virkelige mikrofluidiske plattformen, emulsjonen og mellomlagsavbildningen av cellebelastede PLGA-HOPM-er. (A) Skjema for ekte dråpemikrofluidikkplattform. (B) W / O-forløper emulgert ved ultralydbehandling. (C) Mellomlaget av levende og død farging av BMSC-er cokulturert med PLGA-HOPM i 24 timer. Skala bar = 250 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen beskriver en effektiv strategi for å produsere PLGA-baserte arkitekturer, nemlig PLGA-HOPMs. Det skal bemerkes at flere kritiske skritt må tas nøye, inkludert å unngå løsningsmiddelfordampning av PLGA og forsiktig justering av ultralydseffekten til målposisjonen under fremstillingen av emulsjonen. I tillegg kan væskeutløpet til 20 ml sprøyten justeres til en viss grad for å løse faseseparasjonen av emulgerte forløpere. En begrensning er imidlertid at siden porogens tilstand påvirkes av omgivelsestemperaturen, kan emulsjonens stabilitet være uønsket. Sammen kan den praktiske monteringen av dråpemikrofluidisk plattform vesentlig lette fremstillingen av cellebelastede mikrogeler for vevsteknikk og legemiddelscreeningsapplikasjoner. PLGA brukes ofte som et leveringsbil i fabrikasjon av mikrosfærer siden det er en Food and Drug Administration (FDA) -godkjent legemiddelleveringsvare25. I tillegg tilbyr den alifatiske polyesteren ufarlige nedbrytningsattributter via hydrolyse enten in vitro eller in vivo, som er avhengig av andelen laktidsyre og glykolsyre under synteseprosedyrer26.
For å fremstille PLGA-HOPMs ble de vandige og organiske fasene homogenisert for å danne en W / O-emulsjon ved bruk av ultralydssonden. Deretter ble W/O-emulsjonen introdusert i dråpemikrofluidikken og utviklet seg til vann-i-olje-i-vann (W/O/W)-dråper ved nålespissen (figur 1A, supplerende figur 1A, B). De oppnådde W / O / W-dråpene kunne størknes ved å trekke ut og fordampe DCM i oppsamlingsfasen. Den forkjølte oppsamlingsfasen i et isbad kan tillate gelatinen å forbli i mykgeltilstand, og direkte beholde den godt distribuerte emulsjonen under løsningsmiddelfordampning, noe som resulterer i PLGA-HOPM etter ytterligere lyofilisering (figur 1B).
I tillegg inneholder emulsjonsmalmetoden flyktige organiske løsningsmidler, som kan fjernes ved fordampning. Også resten av DCM i PLGA-HOPMs kunne nesten helt fjernes, beregnet fra gasskromatografimåling2. Videre vil den mikrofluidiske teknologien ikke påvirke PLGAs cyto/biokompatibilitet. Faktisk viste PLGA-HOPMs dyrket med rotte BMSCs at antall levende celler var omfattende, med bare noen få døde celler og strekkmorfologien. Videre kan cytoplasma avbildes av det levende fluorescerende fargestoffet, noe som indikerer strekking på HOPMs.
Sammen kan PLGA-HOPMs med gode morfologiske egenskaper oppfylle kravene til cellulær adhesjon og spredningsevner gjennom HOPMs for vevregenerering og ulike biomedisinske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
SCL, YW, RKK og AZC anerkjenner økonomisk støtte fra National Natural Science Foundation of China (NSFC, 32071323, 81971734 og U1605225) og Program for Innovative Research Team in Science and Technology i Fujian Province University. YSZ ble verken støttet av noen av disse programmene eller mottatt betaling av noe slag; i stedet anerkjennes støtte fra Brigham Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists' Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
