Summary
Detta protokoll beskriver tillverkningen av poly(mjölksyra-co-glykolsyra)-baserade mycket öppna porösa mikrosfärer (HUMM) via den enemulsionsformuleringsbaserade facila mikrofluidiska tekniken. Dessa mikrosfärer har potentiella tillämpningar inom vävnadsteknik och läkemedelsscreening.
Abstract
Jämfört med bulkställningar och direktinsprutning av celler ensam har de injicerbara modulära enheterna fått enormt intresse för att reparera felaktiga vävnader på grund av bekvämlighet i cellförpackningen, förbättrad cellretention och minimal invasivitet. Dessutom kan den porösa konformationen hos dessa mikroskalabärare förbättra medieutbytet och förbättra nivån på näringsämnen och syretillförsel. Den aktuella studien illustrerar den praktiska tillverkningen av poly(mjölksyra-co-glykolsyra)-baserade mycket öppna porösa mikrosfärer (PLGA-HOPM) genom den facila mikrofluidiska tekniken för cellleveransapplikationer. De resulterande monodisperserade PLGA-HOPM: erna hade partikelstorlekar på ~ 400 μm och öppna porer på ~ 50 μm med sammankopplade fönster. Kortfattat infördes de emulgerade oljedropparna (PLGA-lösning i diklormetan, DCM), inslagna med 7,5% (w / v) gelatinvattenfasen, i den 1% (w / v) kontinuerliga flytande poly (vinylalkohol) (PVA) vattenlösningen genom koaxialmunstycket i den anpassade mikrofluidiska installationen. Därefter utsattes mikrosfärerna för lösningsmedelsextraktion och lyofiliseringsförfaranden, vilket resulterade i produktion av HUMPM. I synnerhet spelar olika formuleringar (koncentrationer av PLGA och porogen) och bearbetningsparametrar (emulgeringskraft, nålmätare och flödeshastighet för dispergerad fas) avgörande roller i egenskaperna och egenskaperna hos de resulterande PLGA HOPM: erna. Dessutom kan dessa arkitekturer potentiellt kapsla in olika andra biokemiska ledtrådar, såsom tillväxtfaktorer, för utökad läkemedelsupptäckt och vävnadsregenereringsapplikationer.
Introduction
Cellbelastade mikrosfärer erbjuder gynnsamma fördelar, såsom förbättrad cellretentionskapacitet in situ, effektiv leverans av celler och efterföljande förmåga till cellproliferation in vivo1. Hittills har många undersökningar lagts fram för att utveckla en framgångsrik byggnadsställningsstruktur för att stödja en gynnsam miljö för celler för vävnadsregenerering eller läkemedelsscreeningsapplikationer2. Hypoximiljön är dock ofta oundviklig i interiören på grund av otillräcklig tillförsel av näringsämnen / syre och ansamling av metaboliskt avfall3. För att övervinna dessa problem har mycket porösa mikrosfärer (PM) utvecklats med hjälp av olika biomaterial 4,5,6. I dynamisk kultur lider ställningarna dessutom av överdriven skjuvspänning7, och odlingsmediets instabila tillstånd kan bryta troheten hos PM. Alternativt kan poly(mjölk-co-glykolsyra) (PLGA) användas för att bearbeta PM med god mekanisk hållfasthet för dynamisk kultur1. Till exempel demonstrerade vi saminjektion av musmyoblast (C2C12) -laddad PLGA mycket öppna PM (HOPM) och humana navelvenendotelceller (HUVEC) -laddade poly (etylenglykol) ihåliga mikroroder för att läka volymetrisk muskelförlust, vilket uppnådde anmärkningsvärd förbättring av in situ skelettmuskelregenerering8.
I synnerhet kännetecknas PM av stora ytor och höga porositeter, vilket är av särskilt intresse för celladhesion och tillväxt mot minimalt invasiv cellleverans9. Mot bakgrund av dessa aspekter har olika biokompatibla material använts för att tillverka PMs10,11. Dessa designbara PM som odlas tillsammans med celler erbjuder utmärkt vidhäftning, betydande mekanisk hållfasthet och mycket sammankopplade fönster, vilket kan förbättra cellproliferationen för reparation av skadade vävnader12. I detta avseende har olika tekniker också utvecklats för att tillverka porösa sfärer13,14. Å ena sidan producerades PM med hjälp av gasbildande medel, såsomNH4HCO3, som var fasthållna på grund av otillräcklig sammankoppling15,16,17. Å andra sidan skjuvades PM direkt efter emulgering, vilket ledde till polydispers PM18. I slutändan är droppmikrofluidiktekniken baserad på emulsionsmallmetoden kanske en effektiv metod för att konstruera PM, eftersom det ofta resulterar i likformiga partiklar19. I synnerhet beror mikrosfärernas morfologiska attribut ofta på kvaliteten på de genererade emulsionsdropparna (dvs. vatten-i-olja, W/O eller olja-i-vatten, O/W), vilket kan påverka egenskaperna hos biomaterialen20 avsevärt. Det är värt att notera att den fördesignade mikrofluidiska plattformen kan appliceras för att generera mikrofibrerna eller mikrosfärerna. demonstrerade produktionen av cellbelastade mikrofibrösa strukturer baserade på kapillärbaserade mikrofluidiska plattformar, som kan användas för att montera cellulära nätverk för att efterlikna naturliga vävnader21. tillverkade fotoniska kristallmikrokapslar genom mallreplikering av kiseldioxidkolloidala kristallpärlor genom mikrofluidikteknik, vilket kan övervinna många begränsningar av nuvarande tekniker som kräver komplex märkning och specifik apparat22.
Faktum är att motiveringen bakom användningen av denna teknik beror på olika fördelar, såsom att vara lätt i naturen, vilket inte kräver någon sofistikerad utrustning och dess bekvämlighet med att syntetisera likformiga PM för cellleverans och regenerativ medicinapplikationer. I detta sammanhang, med fördesignade komponenter av emulsionsmallning, kan PM med hög porositet och sammankoppling bekvämt erhållas från en mikrofluidisk anordning monterad av poly (vinylklorid) (PVC) rör, en glaskapillär och en nål. En W/O-emulsionsprekursor framställs genom homogenisering av en vattenlösning av gelatin och en organisk lösning av PLGA. Genom att selektivt injicera den tillämpliga delen av emulsionen i den mikrofluidiska plattformen tillverkas PM: erna med enhetliga partikelstorlekar och sammankopplade porer i hela ytan till det inre. Detta protokoll syftar till att tillverka PLGA-HOPM genom emulsion-mallning i den mikrofluidiska plattformen. Man tror att detta protokoll möjliggör reproducerbar produktion av PLGA-HOPM och kommer potentiellt att vara tillämpligt inom deras relaterade områden inom vävnadsteknik och läkemedelsscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av lösningar
- Bered PVA-stamlösningen i förväg genom att värma PVA-lösningen i ett 80 °C vattenbad och därefter placera den i kylskåpet vid 4 °C. Kyl till rumstemperatur (RT) för experimentell användning.
- Bered emulsionsprekursorn genom att tillsätta den vattenhaltiga gelatinlösningen (1 ml, 7,5 %, vikt/volym) till den organiska fasen av PLGA (2 ml, 2 %, w/v i diklormetan, DCM) (se materialförteckning).
OBS: I allmänhet involverar mikrofluidisk teknik olika faser för att bilda mikrosfärerna. Den kontinuerliga fasen eller uppsamlingsfasen består av en vattenhaltig poly (vinylalkohol) (PVA, 600 ml, 1%, w / v).
2. Droppmikrofluidisk anordningsmontering och tillverkning av PLGA-HOPM
OBS: De förbrukningsartiklar som krävs för denna montering listas i materialförteckningen.
- Anpassa droppgeneratorenheten.
- Konstruera en mikrofluidisk generator med samflöde med hjälp av en glaskapillär (OD, 1 mm), PVC-rör (ID, 1 mm) och en 26 G doseringsnål.
- Anslut glaskapillären till slutet av PVC-röret och genomborra sedan med en nål vid anslutningen av ovanstående struktur.
- Placera den andra änden av PVC-röret i den kontinuerliga fasen under droppgenereringen. Använd UV-lim, täta luckorna vid fogen efter härdning.
OBS: Nålen måste böjas böjd ca 45 ° för bekväm piercing vid PVC-röret, och nålspetsen sträckt in i kapillärröret för att bilda koaxialstrukturen.
- Förbered droppmikrofluidikplattformen.
- Använd två sprutpumpar, som visas i figur 1. Använd en 50 ml spruta för att ladda den kontinuerliga fasen och en 5 ml spruta för emulsionsbildning.
- Ställ in flödeshastigheterna för de kontinuerliga faserna och dispersionsfaserna på 2 ml/min respektive 0,08 ml/min.
- Placera en 500 ml bägare i ett isbad och fyll den med en förkyld PVA-vattenlösning (steg 1.1).
OBS: Änden av glaskapillären måste nedsänkas i uppsamlingsfasen. Det föreslås att man rör om (1 h, 60 rpm) supernatanten i uppsamlingsfasen med glasstaven efter bildandet av emulsionsdroppar i plattformen. Emulsionsdroppar produceras vid nålspetsen. I allmänhet påverkar nålens mätare storleken på PM, där den mindre mätaren motsvarar den mindre storleken på PM. Dessutom är pordiametern huvudsakligen korrelerad med porogenkoncentrationen, som kan öka med lämplig gelatinkoncentration1.
- Utför emulgeringen och droppgenereringen.
- Förbered emulsionen enligt stegen nedan.
- Bered emulsionen genom att omedelbart dekantera den vattenhaltiga gelatinlösningen i DCM-lösningen av PLGA (steg 1.2) och emulgera med ultraljudsanordningen (se materialförteckning).
- Justera ultraljudseffekten till 400 W och ställ in den totala bearbetningstiden som 90 s (intervall 2 s, ultraljudsbehandling 1 s), åtföljd av att ständigt ändra sondens position manuellt.
- Stabilisera den resulterande emulsionen för sprutsugning och droppgenerering på cirka 20 minuter.
OBS: Placera sonden på ultraljudscellbrytaren i olje-vattengränssnittet. Det rekommenderas att inte låta ultraljudssonden komma i kontakt med behållaren.
- Utför droppgenereringen.
- Ladda den beredda emulsionen (steg 2.3.1) snabbt i 5 ml sprutan på mikrofluidikplattformen efter ultraljudsbehandling.
- Introducera den instabila W / O-emulsionen (som är under fasseparation) i den mikrofluidiska anordningen som den diskontinuerliga fasen. Använd samtidigt den vattenhaltiga lösningen av PVA som den kontinuerliga fasen.
- Samla mikrosfärerna som innehåller emulsionen i botten av den uppsamlande bägaren (PVA, 1%, w / v) efter att ha injicerat korrekta delar av emulsionen i mikrofluidikanordningen.
- Placera provet vid 4 °C över natten för ytterligare stabilisering.
- Skölj och frystorkade de beredda mikrosfärerna (PLGA-HOPM) enligt stegen nedan.
OBS: De genererade PLGA-HOPM: erna innehåller godtyckliga porer på insidan och ytan.- Förvara mikrosfärerna vid 4 °C innan de normaliseras till RT och rör om med en glasstav (1 h, 60 rpm) för att eliminera den återstående DCM.
- Filtrera uppsamlingsfasen i 500 ml bägare noggrant och tvätta de uppsamlade mikrosfärerna tre gånger med avjoniserat vatten för att tvätta bort den återstående PVA på ytan av PM.
- Placera PLGA-mikrosfärerna i 37 °C vattenbad i 30 minuter för att lösa upp gelatinet som är inslaget i PLGA-ryggraden.
- Skölj de resulterande PLGA-HOPM:erna två gånger med det avjoniserade vattnet för att avlägsna restgelatinet och förkyla för frystorkning vid -80 °C i 24 timmar.
- Förvara de torra PLGA-HOPM:erna vid -20 °C för ytterligare experiment.
- Förbered emulsionen enligt stegen nedan.
3. Avbildning av svepelektronmikroskop (SEM)
- Deponera PLGA-HOPM på provsteget av SEM (se materialtabell) vid RT och sätt provsteget i sprutcellen i magnetronsprutan. Slå på transformatorn och magnetronen en efter en. Introducera provet till SEM efter att ha sprutbelagts med guld i 1 min.
- Hämta SEM-bilderna genom att ställa in accelerationsspänningen på 5 kV.
- Kvantifiera dessutom partikelstorleken för PLGA-HOPM med hjälp av 100 PM vid det variabla fältet för SEM-avbildning. Mät det representativa resultatet för att kvantifiera porstorleksfördelningen.
- Öppna grafiken med bild J och använd den "raka linjen" för att matcha skalfältet för SEM-bilden, vilket gör att programvaran identifierar pixel till längd.
- Klicka på analysera > inställd skala, ställ in det "kända avståndet" till skalfältet i SEM-bilden och klicka på global > OK.
- Klicka på analysera > Verktyg > ROI-hanterare ... för att mäta por- eller partikelstorleken på PLGA PM och klicka på lägg till den. Mät antalet prover baserat på kravet.
- Klicka på Mät för att få kvantitativa data för grafiken för vidare beräkning.
4. Cellodling och fluorescensavbildning
OBS: Råttbenmärgsmesenkymala stamceller (BMSC) användes för detta arbete. Cellerna erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning).
- Odla cellerna i Dulbeccos modifierade Eagle medium kompletterat med L-glutamin (DMEM/F-12), 10% (v/v) fetalt bovint serum, och 1% penicillin/streptomycin. Inkubera cellerna vid 37 °C och 5 %CO2.
- Passera råtta BMSC: er i ett 1: 2-förhållande efter att ha nått 90% av sammanflödet.
- Utför celladhesion enligt stegen nedan.
- Inkubera PLGA-HOPM med etylalkohol (5 ml, 70 %, v/v) och centrifugera vid 500 x g i 10 minuter vid rt för sterilisering.
- Tvätta de steriliserade PLGA-HOPM: erna två gånger med fosfatbuffertlösning.
- Inkubera humlerna (fem till antalet) med cellsuspensionen (5 ml, 1 x 105 celler/ml) i ett sterilt centrifugrör (50 ml) under dynamisk odling för BMSC:s vidhäftning till PLGA-HOPM.
- Utför den dynamiska kulturen i en termostatisk aseptisk skakapparat (37 °C, 90 rpm) genom att placera ett förseglat 50 ml centrifugrör i skakapparaten (se Materialförteckning).
OBS: Den dynamiska kulturen avser att förbättra följsamheten hos BMSC på byggnadsställningarna, snarare än att direkt inkubera PM: erna och cellerna på plastplattan. Cellerna och PLGA PMs tillsätts i ett 50 ml sterilt centrifugrör, inkuberar röret vid en termostatisk aseptisk shaker (37 ° C, 90 rpm) och byter media var 2: e dag.
- Utför live och dead dual-stain-analysen.
- Skölj de cellbelastade PM: erna tre gånger för att eluera BMSC utan att fästas på PLGA-HOPM.
- Placera de cellbelastade PM:erna på 35 mm glasbottenplattan. Tillsätt 1 ml färgningsbuffert (se materialförteckning), inklusive 1 μl kalcein-AM respektive propidiumjodid (PI), till det förtvättade PBS-provet.
- Bedöm proverna med konfokal laserscanningsmikroskopi (se Materialförteckning). Slå på excitationsljuset på 488 nm och 552 nm vid motsvarande detektor. För z-överläggsanalys, ställ in z-wide för att fånga de olika skikten i provet genom z-axelrörelse av mikroskopet.
OBS: Det är värt att notera att de andra fläckarna kan användas på lämpligt sätt för analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baserat på tidigare arbete som optimerade huvudparametrarna1 löstes PLGA upp i det ångbara DCM-lösningsmedlet. Den primära W / O-emulsionen framställdes genom homogenisering med gelatin under ultraljudssondbehandling. Den anpassade samflödesfluidstrukturen monterades förenklat, där en spruta användes för att ständigt införa flödena. Dessutom utfördes tillräckliga sköljningsförfaranden för att eliminera PVA och gelatin i PLGA-mikrosfärer (figur 1A, kompletterande figur 1A, B). Därefter observerades de morfologiska egenskaperna hos PLGA-HOPM genom SEM-avbildning. Det observerades att PLGA-HOPM uppvisade stora storlekar (350-500 μm) med godtyckliga porer (10-100 μm) och sammankopplade fönster, vilket kunde underlätta hög effektivitet vid transport av syre / metaboliskt avfall (figur 1B). Dessa morfologiska resultat överensstämde med de rapporterade resultaten1.
Som ett bevis på konceptet användes BMSC: erna för att preliminärt odla inom PLGA-HOPM: erna. Man trodde att PM: s inre struktur kunde tillåta cellerna att hålla sig till och säkerställa spridningen under dynamisk odling8. Dessutom är motiveringen för att välja BMSC att dessa celler kännetecknas av multipolär differentiering och reparerar skadade vävnader och används också ofta för att studera det biologiska beteendet hos olika bioaktiva material23. BMSC användes för att konstruera in vitro-mikrovävnader med mikrosfärerna och visualiserade cellfördelning och överlevnadstillstånd genom z-analys av CLSM (figur 1C). Det observerades att ett stort antal celler vidhäftade byggnadsställningar i 1 d, och den gröna fluorescensen bibehölls, vilket representerade omfattande vidhäftnings- och migrationsförmåga hos celler i PLGA-HOPM. Cytoplasman avbildades indirekt med kalcein-AM-färgning eftersom acetoximetylestergruppen (AM) ger förbättrad hydrofobicitet och underlättar penetrationen genom det levande cellmembranet. Även om kalcein-AM inte har någon fluorescens kan den hydrolyseras av det endogena esteraset intracellulärt för att generera den polära molekylkalkylen med en stark negativ laddning och avge stark grön fluorescens24. Därför visualiseras cytoplasman indirekt med kalcein-AM-färgning (figur 1C, kompletterande figur 1C).
Figur 1: Tillverkning och cytokompatibilitet av PLGA-HOPM. (A) Schematisk illustration av tillverkningen av PLGA-HOPM. (B) Pordiametern för PM baserad på SEM-avbildning (10-100 μm). Skalstreck = 100 μm. (C) Levande (calcein-AM, grön) och död (propidiumjodid, PI, röd) färgning av BMSC som odlas med PLGA-HOPM i 24 timmar. Skalstreck = 250 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Illustrationer av den verkliga mikrofluidiska plattformen, emulsion och mellanskiktsavbildning av cellbelastade PLGA-HOPM. (A) Schema för verklig droppmikrofluidikplattform. (B) W/O-prekursor emulgerade genom ultraljudsbehandling. (C) Mellanlagret av levande och döda fläckar av BMSC som samodlas med PLGA-HOPM i 24 timmar. Skalstreck = 250 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln beskrivs en effektiv strategi för att tillverka PLGA-baserade arkitekturer, nämligen PLGA-HOPM. Det bör noteras att flera kritiska steg måste vidtas noggrant, inklusive att undvika lösningsmedelsförångning av PLGA och mild justering av ultraljudseffekten till målpositionen under beredningen av emulsionen. Dessutom kan vätskeutloppet för 20 ml sprutan justeras i viss utsträckning för att lösa fasseparationen av emulgerade prekursorer. En begränsning är dock att eftersom porogentillståndet påverkas av omgivningstemperaturen kan emulsionens stabilitet vara oönskad. Tillsammans kan den praktiska monteringen av droppmikrofluidikplattformen avsevärt underlätta tillverkningen av cellbelastade mikrogeler för vävnadsteknik och läkemedelsscreeningsapplikationer. PLGA används ofta som ett leveransfordon vid tillverkning av mikrosfärer eftersom det är en Food and Drug Administration (FDA) -godkänd läkemedelsleveransvara25. Dessutom erbjuder den alifatiska polyestern ofarliga nedbrytningsattribut via hydrolys antingen in vitro eller in vivo, vilket är beroende av andelen laktidsyra och glykolsyra under syntesprocedurer26.
För att tillverka PLGA-HOPMs homogeniserades de vattenhaltiga och organiska faserna för att bilda en W / O-emulsion med hjälp av ultraljudssonden. Därefter infördes W/O-emulsionen i droppmikrofluidikanordningen och utvecklades till vatten-i-olja-i-vatten (W/O/W) droppar vid nålspetsen (figur 1A, kompletterande figur 1A, B). De erhållna W/O/W-dropparna kan stelna genom extraktion och förångning av DCM i uppsamlingsfasen. Den förkylda uppsamlingsfasen i ett isbad kan tillåta gelatinet att förbli i mjukgeltillståndet och direkt behålla den välfördelade emulsionen under lösningsmedelsindunstning, vilket resulterar i PLGA-HOPM efter ytterligare lyofilisering (figur 1B).
Dessutom innehåller emulsionsmallmetoden flyktiga organiska lösningsmedel, vilka kan avlägsnas genom förångning. Återstoden av DCM i PLGA-HOPM kunde också nästan helt avlägsnas, beräknat från gaskromatografimätning2. Dessutom skulle den mikrofluidiska tekniken inte påverka cyto/biokompatibiliteten hos PLGA. Faktum är att PLGA-HOPMs odlade med råtta BMSC visade att antalet levande celler var omfattande, med bara några döda celler och sträckningsmorfologin. Dessutom kan cytoplasma avbildas av det levande fluorescerande färgämnet, vilket indikerar sträckning på HOPM: erna.
Tillsammans kan PLGA-HOPM med utmärkta morfologiska attribut uppfylla kraven på cellulär vidhäftning och spridningsförmåga i hela HOPM för vävnadsregenerering och olika biomedicinska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
SCL, YW, RKK och AZC erkänner ekonomiskt stöd från National Natural Science Foundation of China (NSFC, 32071323, 81971734 och U1605225) och Program for Innovative Research Team in Science and Technology i Fujian Province University. YSZ stöddes varken av något av dessa program eller fick betalning av något slag; I stället erkänns stöd från Brigham Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists' Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
