Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie van muis preadipocyten uit onderhuids vet, hun differentiatie in volwassen adipocyten en de inductie van insulineresistentie. De werking van insuline wordt geëvalueerd door de fosforylering/activering van leden van de insulinesignaleringsroute door western blot. Deze methode maakt directe bepaling van insulineresistentie/gevoeligheid in primaire adipocyten mogelijk.
Abstract
Insulineresistentie is een verminderd effect van insuline op de doelcellen, meestal afgeleid van verminderde insulinereceptorsignalering. Insulineresistentie draagt bij aan de ontwikkeling van diabetes type 2 (T2D) en andere van obesitas afgeleide ziekten met een hoge prevalentie wereldwijd. Daarom is het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan insulineresistentie van groot belang. Verschillende modellen zijn gebruikt om insulineresistentie zowel in vivo als in vitro te bestuderen; Primaire adipocyten vormen een aantrekkelijke optie om de mechanismen van insulineresistentie te bestuderen en moleculen te identificeren die deze aandoening tegengaan en de moleculaire doelen van insuline-sensibiliserende geneesmiddelen. Hier hebben we een insulineresistentiemodel opgesteld met behulp van primaire adipocyten in cultuur behandeld met tumornecrosefactor-α (TNF-α).
Adipocytenvoorlopercellen (APC's), geïsoleerd uit collagenase-verteerd onderhuids vetweefsel van muizen door magnetische celscheidingstechnologie, worden gedifferentieerd in primaire adipocyten. Insulineresistentie wordt vervolgens geïnduceerd door behandeling met TNF-α, een pro-inflammatoir cytokine dat de tyrosinefosforylering / activering van leden van de insulinesignaleringscascade vermindert. Verminderde fosforylering van insulinereceptor (IR), insulinereceptorsubstraat (IRS-1) en eiwitkinase B (AKT) worden gekwantificeerd door western blot. Deze methode biedt een uitstekend hulpmiddel om de mechanismen te bestuderen die insulineresistentie in vetweefsel bemiddelen.
Introduction
Insuline is een anabolisch hormoon geproduceerd door pancreas eilandje β-cellen en de belangrijkste regulator van glucose en lipiden metabolisme. Onder de vele functies reguleert insuline de opname van glucose, glycogeensynthese, gluconeogenese, eiwitsynthese, lipogenese en lipolyse1. Het initiële moleculaire signaal na insuline-interactie met zijn receptor (IR) is de activering van de intrinsieke tyrosine-eiwitkinaseactiviteit van IR2, resulterend in de autofosforylering3 en de daaropvolgende activering van een familie van eiwitten die bekend staat als insulinereceptorsubstraten (IRS), die bindt aan adaptoreiwitten die leiden tot activering van een cascade van eiwitkinasen4 . Insuline activeert twee belangrijke signaalroutes: fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)-eiwitkinase B (AKT) en Ras-mitogeen-geactiveerd eiwitkinase (MAPK). De eerste vormt een belangrijk vertakkingspunt of knooppunt 4,5 voor de activering van talrijke downstream-effectoren die betrokken zijn bij diverse fysiologische functies, waaronder de regulatie van brandstofhomeostase, terwijl de laatste de celgroei en differentiatie reguleert 4,6. Insuline acties zijn uiteindelijk afhankelijk van het celtype en de fysiologische context7.
Een van de belangrijkste insuline-responsieve metabole weefsels is het vetweefsel. Wit vetweefsel is het meest voorkomende type vet bij mensen en knaagdieren, verdeeld in onderhuids vet (tussen de huid en spieren) en visceraal vet (rond de organen in de buikholte). Gezien hun grote volume zijn adipocyten of vetcellen het meest voorkomende celtype in vetweefsel. Deze vetcellen kunnen bruin/beige (thermogeen), roze (in de borstklier) en wit 8,9 zijn. Witte adipocyten houden de belangrijkste energiereserves in het lichaam in de vorm van triglyceriden, een insulineafhankelijk proces. Insuline bevordert glucosetransport en lipogenese, terwijl het lipolyse of lipidenafbraak remt 7,10. Het vergemakkelijkt ook de differentiatie van preadipocyten in adipocyten - de volwassen vetopslagcellen11.
Insulineresistentie treedt op wanneer een normaal insulineniveau een verzwakte biologische respons produceert, wat resulteert in compenserende hyperinsulinemie12. Insulineresistentie is een aandoening geassocieerd met overgewicht en obesitas5, die in combinatie leidt tot diabetes type 2 (T2D) en andere stofwisselingsziekten13. Hyperinsulinemie compenseert insulineresistentie in perifere weefsels om normale bloedglucosespiegels te handhaven14. Uiteindelijk β-celverlies of -uitputting, samen met verergerde insulineresistentie, leidt echter tot verhoogde bloedglucosespiegels die consistent zijn met T2D5. Daarom kunnen insulineresistentie en hyperinsulinemie bijdragen aan de ontwikkeling van van obesitas afgeleide metabole ziekten15. Bovendien kan obesitas chronische laaggradige lokale ontsteking veroorzaken die insulineresistentie in vetweefsel bevordert15,16,17. Bovendien leiden van obesitas afgeleide veranderingen in vetweefsel, zoals fibrose, ontsteking en verminderde angiogenese en adipogenese, tot lagere adiponectine-serumspiegels (een insulinesensibilisator) en verhoogde secretie van factoren zoals plasminogeenactivatorremmer 1 (PAI-1), vrije vetzuren en exosomen in de bloedbaan, waardoor insulineresistentie wordt verergerd17.
Veel aspecten die ten grondslag liggen aan insulineresistentie blijven onbekend. In vitro en in vivo modellen zijn ontwikkeld om de mechanismen te bestuderen die insulineresistentie bemiddelen in belangrijke doelweefsels, waaronder vetweefsel. Het voordeel van in vitro modellen is dat onderzoekers meer controle hebben over de omgevingscondities en insulineresistentie in specifieke celtypen kunnen evalueren. Met name adipocytenvoorlopercellen (APC's) hebben het individuele fenotype van het donorweefsel, dat de fysiologie beter kan weerspiegelen dan adipocytcellijnen. Een belangrijke factor die insulineresistentie in vitro induceert, is tumornecrosefactor-α (TNF-α). TNF-α is een pro-inflammatoir cytokine dat wordt uitgescheiden door adipocyten en macrofagen in vetweefsel18. Hoewel het nodig is voor een goede remodellering en expansie van vetweefsel19, induceert langdurige blootstelling aan TNF-α insulineresistentie in vetweefsel in vivo en in adipocyten in vitro20. Chronische TNF-α behandeling van verschillende celtypen leidt tot verhoogde serinefosforylering van zowel IR als IRS-1, waardoor verminderde tyrosinefosforylering wordt bevorderd21. Verhoogde fosforylering van IRS-1 op serineresiduen remt de IR-tyrosinekinaseactiviteit en kan een van de belangrijkste mechanismen zijn waardoor chronische TNF-α behandeling de insulinewerking schaadt22,23. TNF-α activeert routes waarbij de serine/threonine kinaseremmer van nucleaire factor ĸB kinase β (IKKβ) en c-Jun N terminal kinase (JNK)24 betrokken zijn. JNK induceert een complex pro-inflammatoir transcriptioneel programma, maar fosforyleert ook direct IRS-16.
Het begrijpen van de pathogenese van insulineresistentie is steeds belangrijker geworden om de ontwikkeling van toekomstige therapieën tegen T2D te begeleiden. APC's hebben bewezen een uitstekend model te zijn voor de studie van vetcelbiologie, inclusief de gevoeligheid en resistentie tegen insuline, en voor het identificeren van de intrinsieke eigenschappen van adipocyten onafhankelijk van de systemische omgeving. APC's kunnen gemakkelijk worden verkregen uit verschillende vetdepots en onder de juiste omstandigheden worden gedifferentieerd in volwassen adipocyten. Met deze methode kunnen directe effecten op insulineresistentie/gevoeligheid in adipocyten worden geëvalueerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle knaagdierexperimenten werden goedgekeurd door de Commissie Bio-ethiek van het Instituut voor Neurobiologie van de UNAM, protocolnummer 075.
1. Isolatie van adipocytenvoorlopercellen van muizen
- Euthanaseer 8-10 weken oude mannelijke C57BL/6-muizen (bijv. door CO 2-inhalatie en daaropvolgende cervicale dislocatie) (vier dieren per isolatie). Desinfecteer de muizen door te wrijven met 70% ethanol en verkrijg het vetweefsel onmiddellijk na het offer.
OPMERKING: Isoleer na de euthanasie van knaagdieren het vetweefsel onmiddellijk en voer alle stappen uit in een steriele laminaire stroomkap. Muizen worden onder 12 uur licht/donker cycli gehouden met vrije toegang tot voedsel en water. - Ontleed het inguinale onderhuidse vetweefsel van elke muis. Verwijder alleen het vetweefsel, vermijd de verwijdering van spieren, huid of ander weefsel en verzamel het in een conische buis van 50 ml met 15 ml type 1 collagenase-oplossing (1,5 mg / ml) op ijs. Los type 1 collagenase op in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoog glucose-1% runderserumalbumine (BSA) en filtreer door spuitfilters van 0,2 μm.
- Snijd het vetweefsel in kleine stukjes met een steriele chirurgische schaar en verteer de monsters door incubatie met type 1 collagenase-oplossing bij 37 °C in een orbitale shaker (150 rpm) gedurende 30 minuten (plaats de buis met vet en collagenase in een horizontale positie voor een groter schudoppervlak). Controleer de spijsvertering elke 10 minuten om er zeker van te zijn dat deze werkt (weefselafbraak is zichtbaar) en om overdigestie te voorkomen (zie aanvullende figuur S1).
- Filter met een mesh-spuit van 200 μm (voorheen geautoclaveerd) om weefsel te verwijderen dat niet is verteerd met collagenase. Breng het filter over de rand van de buis om zoveel mogelijk cellen in de oplossing af te voeren. Voeg 15 ml koude DMEM-1% BSA toe om de spijsvertering te stoppen en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
- Zuig de bovenste laag met rijpe adipocyten en het grootste deel van de vloeibare laag op; Vermijd het aanraken of verstoren van de pellet. Voeg 20 ml koud fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)-2% foetaal runderserum (FBS) toe en resuspensie van de pellet. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en zuig eerst de bovenste laag aan om de resterende adipocyten en vet te verwijderen. Resuspendeer de pellet in 1 ml ammoniumchloridekalium (ACK) lyseringsbuffer (om rode bloedcellen te lyseren) en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Voeg 10 ml PBS-2% FBS toe, meng en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
- Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 200 μL anti-Fc-oplossing (gezuiverde rat anti-muis CD16/CD32 verdund in PBS-2% FBS [1:150]) om de Fc-receptor-gemedieerde binding door antilichamen van belang te verminderen. Incubeer op ijs gedurende 5 min. Breng de celsuspensie over in een buis van 5 ml die in de voorgekoelde rekken van een magnetische celscheider past en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
- Elimineer het supernatant, voeg 200 μL van het mengsel van CD31 (PECAM-1) monoklonaal antilichaam (390) -biotine (1:100) en CD45 monoklonaal antilichaam (30-F11)-biotine (1:100) toe, meng goed en incubeer gedurende 15 minuten op ijs (bereid antilichaamverdunningen in anti-Fc-oplossing; zie tabel 1). Voeg 400 μL PBS-2% FBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
OPMERKING: CD31 en CD45 zijn markers van respectievelijk endotheelcellen en hematopoëtische cellen. - Zuig het supernatant op en incubeer in 100 μL anti-biotine microbeads (1:5) gedurende 15 minuten op ijs (bereid antilichaamverdunningen in anti-Fc-oplossing, zie tabel 1). Voeg 400 μL PBS-2% FBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
- Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 350 μL PBS-2% FBS. Verwijder celaggregaten of grote deeltjes uit de eencellige suspensies met een voorscheidingsfilter (70 μm). Activeer eerst het filter met 100 μL PBS-2% FBS, passeer de celsuspensie door het filter (verzamel in een schone buis) en was ten slotte het filter met 100 μL PBS-2% FBS.
- Voer magnetische scheiding van cellen uit met behulp van de negatieve scheidingsstrategie met een magnetische celscheider.
- Plaats het monster in positie A van het koelrek (zorg ervoor dat het rek is voorgekoeld) en twee lege buizen in positie B en C om respectievelijk de niet-gelabelde en gelabelde cellen terug te winnen.
- Laad de wasbuffer en de lopende buffer in de bijbehorende flessen voordat u de apparatuur inschakelt. Programmeer de apparatuur om de magnetische scheiding van cellen uit te voeren met het DEPLETE-protocol .
OPMERKING: Dit protocol is voor uitputting in de standaardmodus voor het verwijderen van cellen met normale antigeenexpressie (in dit geval cellen gelabeld met anti-CD31 en anti-CD45), als herstel de hoogste prioriteit heeft. - Selecteer in de scheidingssectie het aantal monsters dat moet worden gescheiden en selecteer het DEPLETE-protocol . Druk op Uitvoeren en start de scheiding. Aan het einde van het programma worden de niet-gelabelde cellen teruggewonnen en centrifugeer u gedurende 5 minuten bij 400 × g bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en resuspensie van de pellet in 500 μL groeimedium (tabel 1).
- Zaai de APC's in een put van een 12-putplaat die eerder is bedekt met 2,5% keldermembraanmatrix (ongeveer 50.000-75.000 cellen worden verkregen). Voeg 400 μL 2,5% keldermembraanmatrix toe om het hele oppervlak van elke put te bedekken. Laat de plaat onmiddellijk na het verwijderen van de overtollige oplossing en het achterlaten van slechts een kleine laag de plaat drogen (zonder deksel) in de laminaire stroomkap gedurende ten minste 1 uur. Incubeer bij 37 °C in een CO 2-atmosfeer van 5%. Verander het medium elke 48 uur totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken.
- Verwijder bij 80% samenvloeiing het medium volledig en was met 350 μL PBS-2% FBS. Oogst de cellen met 350 μL 0,05% trypsine-EDTA gedurende 2 minuten bij 37 °C. Voeg 2 ml groeimedium toe en verzamel de cellen in een nieuwe conische buis van 50 ml en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten op 400 × g .
- Passeer de APC's naar 12-putplaten (10.000-20.000 cellen per put) die eerder zijn bedekt met 2,5% keldermembraanmatrix. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2. Verander het medium elke 48 uur totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken.
OPMERKING: APC's kunnen eenmaal worden gepasseerd. Vervolgens verliezen ze hun vermogen om zich te vermenigvuldigen en te differentiëren. Zie de workflow voor het APC-isolatieproces in aanvullende figuur S2.
2. Adipocytendifferentiatie en inductie van insulineresistentie
OPMERKING: Houd de cellen op 37 °C in 5% CO2 en voer stappen uit waarbij het medium wordt veranderd en behandelingen met TNF-α en insuline in een steriele kap.
- Begin bij 80% samenvloeiing met het differentiatieproces; zuig elk groeimedium af en vervang het door 500 μL differentiatiemedium (tabel 1) met 3,3 nM botmorfogenetisch eiwit (BMP4) in elk putje.
- Vervang het medium na 48 uur door het differentiatiemedium (500 μL per put) en de differentiatiecocktail (tabel 1).
- Verwijder het medium 72 uur later en voeg 100 nM insuline toe aan 500 μL vers differentiatiemedium.
OPMERKING: Cellen beginnen een rond uiterlijk te vertonen met kleine lipidedruppeltjes erin. - Zuig elk differentiatiemedium af en vervang het 48 uur later door 500 μL eenvoudig medium-2% FBS (tabel 1). Induceer insulineresistentie met 4 ng/ml TNF-α. Inclusief controleputten zonder TNF-α behandeling.
- Voeg na 24 uur incubatie 4 ng/ml TNF-α toe in eenvoudige medium-0% FBS (tabel 1). Onderhoud controleputten zonder TNF-α behandeling.
- Activeer de insulinesignaleringsroute 24 uur later door 100 nM insuline toe te voegen en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C in een 5% CO 2-atmosfeer. Verwijder het medium en was met 500 μL PBS. Inclusief controleputten zonder insulinebehandeling.
3. Evaluatie van de insulinesignaleringsroute door western blot
- Eiwitextractie en kwantificering
- Was elk putje van cellen met 500 μL PBS en houd het op ijs om de cellen te lyseren in 50 μL RIPA-buffer (tabel 1) met 1% proteaseremmercocktail toegevoegd net voor de monsterisolatie. Schraap het hele oppervlak van de put met een punt en breng het lysaat over in een microcentrifugebuis van 0,6 ml (op ijs houden).
- Incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C in een roterende schudder, meng door vortexing en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 8.000 × g bij 4 °C en win het supernatant terug (op ijs houden).
- Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test (verdun het monster niet om te kwantificeren).
- Neem het benodigde volume dat overeenkomt met 40-60 μg en denatureer met 6x Laemmli-buffer (tabel 1) door gedurende 15 minuten bij 97 °C te broeden terwijl u schudt bij 550 tpm. Invriezen tot gebruik.
- SDS-polyacrylamide gel elektroforese
- Voer SDS-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) uit met een 7,5% polyacrylamide gel van 1,5 mm dikte. Steek de gel in de tank en vul met loopbuffer (tabel 1).
- Voeg 3 μL voorgeroeste eiwitstandaard toe aan de eerste put van de gel en laad elk monster in volgende putjes.
- Laat de gel ongeveer 15 minuten op 80 V draaien om ervoor te zorgen dat het monster in de gelmatrix van de polyacrylamideconcentrator komt. Verhoog daarna de spanning tot 90 V gedurende 2,5 uur of totdat de 37 kDa molecuulgewichtsmarker aan de onderkant van de gel te zien is.
- Breng de eiwitten van de gel over naar een nitrocellulosemembraan in een halfdroge kamer gedurende 35 minuten bij 25 V. Dompel vooraf de gel, het membraan en de filters gedurende enkele minuten onder in de transferbuffer (tabel 1).
- Western blot
- Was het membraan na de overdracht gedurende 3 minuten met Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,1% Tween 20 (TBS-T 0,1%) (tabel 1) met schudden bij 30 tpm.
- Blokkeer het membraan met de blokkeringsoplossing (tabel 1) bij 4 °C gedurende 1 uur in constante rotatie.
- Snijd het membraan in drie delen volgens de molecuulgewichtsmarker om 's nachts te incuberen met verschillende primaire antilichamen (verdund in blokkerende oplossing) bij 4 °C in constante rotatie: fosfo-IRS1 (Tyr608) antilichaam (1:1.000), verwachte band bij 180 kDa; Fosfo-insulinereceptor β (Tyr1150/1151) antilichaam (1:1.000), verwachte band bij 95 kDa; Fosfo-Akt (Ser473) antilichaam (1:1.000), verwachte band bij 60 kDa.
- Was de vliezen 5x gedurende 5 min elk met TBS-T 0,1%.
- Incubeer de membranen met het overeenkomstige peroxidase-gekoppelde secundaire antilichaam (verdund in blokkerende oplossing) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur in constante rotatie: peroxidase affiniPure ezel anti-konijn IgG (H + L) (1: 5.000).
- Was de vliezen 5x gedurende 5 min elk met TBS-T 0,1%.
- Detecteer de eiwitten met behulp van het chemiluminescentiedetectiesysteem. Bereid het substraat voor volgens de instructies van de fabrikant.
- Doe de vlek in een plastic zak en voeg 200 μL chemiluminescent substraat toe om het membraan volledig te bedekken. Laat overtollig substraat aftappen en verwijder eventuele luchtbellen.
- Stel elke vlek gedurende 30-60 s bloot in een hoogwaardig beeldvormingssysteem dat compatibel is met chemiluminescentie.
- Strip de membranen (stappen 10-13 van de western blot-sectie) om de antilichaam-antigeeninteracties te breken en zo nitrocellulosemembranen opnieuw te laten uitwissen. Recupereer de membranen en was 3x gedurende 5 min elk met TBS-T 1% bij 50 rpm.
- Incubeer gedurende 7 minuten met 10 ml van 0,2 M NaOH bij 50 tpm.
- Was 3x gedurende 5 min elk met kraanwater op 50 rpm.
- Was gedurende 10 minuten met TBS-T 1% bij 50 tpm.
- Herhaal stap 2-9 van de western blot-sectie om het membraan te incuberen met anti-bèta-tubuline (55 kDa) als belastingscontrole met behulp van 1:1.000 verdunning.
- Voer densitometrische analyse25 uit voor elk eiwit met behulp van ImageJ-software (https://imagej.nih.gov/).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de afgelopen jaren heeft de toegenomen prevalentie van obesitas en T2D geleid tot een intense zoektocht naar de mechanismen die insulineresistentie in vetweefsel bemiddelen. Met het hier beschreven protocol kunnen APC's worden gedifferentieerd in volwassen adipocyten om insulineresistentie en -gevoeligheid te evalueren. Zodra de APC's confluentie bereiken, duurt het 10 dagen om hun differentiatie in volwassen adipocyten en hun TNF-α-gemedieerde inductie van insulineresistentie te voltooien (figuur 1).
APC's vertonen een fibroblastachtige morfologie, gekenmerkt door hun platte en langwerpige vorm en hun hechting aan de plaat die 48 uur na het zaaien is voltooid (figuur 2A). APC's hebben 2-5 dagen nodig om 80% confluentie te bereiken (afhankelijk van het aantal gezaaide cellen), een tijd waarop het differentiatieproces wordt gestart door blootstelling aan de differentiërende cocktail (figuur 2A). Volwassen adipocyten beginnen te verschijnen in de volgende 6-8 dagen. Gedifferentieerde adipocyten worden gekenmerkt door een ronde morfologie en de intracellulaire accumulatie van lipidedruppels. Tot 80% van de cellen wordt gedifferentieerd aan het einde van het differentiatieproces (figuur 2B).
Insulineresistentie wordt geïnduceerd in primaire adipocyten door TNF-α behandeling (4 ng / ml) gedurende 48 uur; deze concentratie van TNF-α heeft geen invloed op de levensvatbaarheid van cellen (aanvullende figuur S3). Vervolgens wordt de insulinesignaleringsroute geactiveerd door gedurende 15 minuten 100 nM insuline toe te voegen en wordt de fosforylering van de belangrijkste signaalmoleculen (IR, IRS-1 en AKT) gemeten door western blot. Insuline stimuleert de fosforylering van deze drie moleculen (figuur 3) in vergelijking met controle, niet-behandelde gedifferentieerde adipocyten. TNF-α vermindert de door insuline geïnduceerde fosforylering van IR (30%), IRS-1 (20%) en AKT (45%) (figuur 3). Insulineresistente cellen vertonen minder activering van de insulinesignaleringsroute in vergelijking met insulinegevoelige cellen. Bovendien vermindert de behandeling met TNF-α de mRNA-expressie van bekende insulinegevoeligheidsmarkers: Insr, Irs2, Glut4 en Adipoq (aanvullende figuur S4). Deze bevindingen bevestigen dat TNF-α de werking van insuline in primaire adipocyten vermindert en daardoor insulineresistentie induceert.
Figuur 1: Schematische tijdlijn die het proces van adipocytenvoorloperceldifferentiatie en de inductie van insulineresistentie weergeeft. APC's worden geïsoleerd uit onderhuids vetweefsel met behulp van collagenasebehandeling en magnetische celscheidingstechnologie. Vervolgens ondergaan ze een differentiatieproces van 7 dagen om primaire adipocyten te verkrijgen. Vervolgens wordt insulineresistentie geïnduceerd met TNF-α gedurende 48 uur, de eerste 24 uur in medium met 2% FBS en de volgende 24 uur met serumvrij medium om de activering van de insulinesignaleringsroute te voorkomen. De signaalcascade wordt geactiveerd met insuline en eiwit wordt geëxtraheerd voor western blot-analyse 10 dagen na het starten van het differentiatieproces om de fosforylering / activering van IR, IRS-1 en AKT te evalueren. Afkortingen: APC's = adipocytenvoorlopercellen; BMP4 = Botmorfogenetisch eiwit; IBMX = 3-isobutyl-1-methylxanthine; TNF-α = tumornecrosefactor-α; FBS = foetaal runderserum; IR = insulinereceptor; IRS = insulinereceptorsubstraat; AKT = eiwitkinase B; Tx = behandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologie van adipocytenvoorlopercellen en rijpe adipocyten . (A) Subcutane APC's bij 80% samenvloeiing voorafgaand aan het induceren van differentiatie in 12-well kweekplaten. (B) Subcutane primaire adipocyten na 7 dagen van inducerende differentiatie in 12-well kweekplaten. Foto's zijn gemaakt met een vergroting van 10x. Schaalstaven = 100 μm. Afkorting: APC's = adipocytenvoorlopercellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Insulineresistentie geïnduceerd door TNF-α in subcutane primaire adipocyten aangetoond door verminderde insuline-geïnduceerde fosforylering van IR, IRS-1 en AKT. Subcutane adipocyten werden behandeld met TNF-α (4 ng/ml) gedurende 48 uur en serum-uitgehongerd gedurende de laatste 24 uur. Na de stimulatie met insuline (100 nM) gedurende 15 minuten werd 40 μg totaal eiwit geladen op 7,5% gels en onderworpen aan SDS-PAGE, overgebracht naar nitrocellulosemembranen en geblokkeerd in 4% magere melk in TBS-T 0,1%. Het membraan werd onderzocht met anti-gefosforyleerd IR (pIR), anti-gefosforyleerd IRS-1 (pIRS-1) en anti-gefosforyleerd AKT (pAKT), evenals met een anti-konijn HRP secundair antilichaam. Het signaal werd gevisualiseerd met chemiluminescentiedetectie en anti-β tubuline werd gebruikt als belastingscontrole. (A) Representatieve vlekken en (B) kwantificering van drie onafhankelijke experimenten. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM; *, p < .05 versus controle. Afkortingen: TNF-α = tumornecrosefactor-α; IR = insulinereceptor; IRS = insulinereceptorsubstraat; pX = gefosforyleerde vorm van X; b-Tub = bèta-tubuline; HRP = mierikswortelperoxidase; Ctrl = controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Anti-Fc oplossing | gezuiverde rat anti-muis CD16 / CD32 verdund in PBS-2% FBS [1:150] | |||
| TBS-T 0,1% | 0,01 M Tris-HCl (pH 8), 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20 | |||
| Blokkerende oplossing | 4% magere droge melk verdund in TBS-T 0,1% | |||
| Groeimedium | 60% DMEM lage glucose, 40% MCDB 201 medium, 1x penicilline-streptomycine, 1 nM dexamethason, 0,1 mM L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 1x insuline, transferrine, natrium, seleniet (ITS) vloeibaar mediasupplement, 1x linolzuur-albumine van BSA, 10% FBS, 10 ng/ml epidermale groeifactor (EGF), 10 ng/ml leukemieremmende factor (LIF), 10 ng/ml van bloedplaatjes afgeleide groeifactor BB (PDGF-BB), 5 ng/ml fibroblast groeifactor-basisch (bFGF) en 50 μg/ml normocine | |||
| Differentiatiemedium | 60% DMEM laag glucosegehalte, 40% MCDB 201 medium, 1x penicilline-streptomycine, 1 nM dexamethason, 0,1 mM L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 1x ITS vloeibaar mediasupplement, 1x linolzuur-albumine van BSA en 2% FBS | |||
| Differentiatie cocktail | 0,5 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine [IBMX], 1 μM dexamethason, 10 μM rosiglitazon en 100 nM insuline | |||
| Eenvoudige medium-2% FBS | 60% DMEM lage glucose, 40% MCDB 201 medium, 1x penicilline-streptomycine en 2% FBS | |||
| Eenvoudig medium–0% FBS | 60% DMEM lage glucose, 40% MCDB 201 medium, 1x penicilline-streptomycine | |||
| RIPA-buffer | 50 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% octylfenoxy poly(ethyleenoxy)ethanol, 1 mM Na3VO 4, 48,8 mM NaF, 8,2 mM Na4 P2O7 en 0,26 M sacharose | |||
| 6x Laemmli buffer | 1,2 g SDS, 6 mg broomfenol blauw, 4,7 ml glycerol, 1,2 ml Tris-base 0,5 M pH 6,8, 845 μl 2- mercaptoethanol en 2,1 ml H2O | |||
| Lopende buffer | 25 mM Tris base, 192 mM glycine, 1% SDS | |||
| Buffer voor overdrachten | 25 mM Tris-base, 192 mM glycine, 20% methanol | |||
Tabel 1: Oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
Aanvullende figuur S1: Onderhuids vetweefsel verteerd met collagenase. Zodra het vetweefsel is verwijderd, wordt het met een schaar in kleine stukjes gesneden om het verteringsproces te starten (A), waarna het gedurende 30 minuten wordt geïncubeerd met collagenase type 1 bij 37 °C, 150 tpm (B). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Schema van het celisolatieproces van de adipocytenvoorloper. Ontleed het inguinale onderhuidse vetweefsel en verteer de monsters met collagenase. Verwijder rijpe adipocyten door centrifugeren en was de pellet om overtollig vet te verwijderen. Lyseer de rode bloedcellen en blokkeer om niet-specifieke binding te verminderen. Label de endotheelcellen en macrofagen met antilichamen gekoppeld aan magnetische deeltjes. Voer de magnetische scheiding van cellen uit met behulp van de negatieve scheidingsstrategie met een magnetische celscheider. Zaad APC's (ongelabelde cellen) in platen bedekt met keldermembraanmatrix. Verander het medium elke 48 uur totdat de cellen 80% samenvloeiing bereiken. Afkortingen: APC's = adipocytenvoorlopercellen; BSA = runderserumalbumine; FBS = foetaal runderserum. Gemaakt met Biorender.com. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: Behandeling met TNF-α om insulineresistentie te induceren, verandert de levensvatbaarheid van adipocyten niet. De levensvatbaarheid van rijpe adipocyten werd gemeten met de MTT-test na behandeling met 4 ng/ml TNF-α gedurende 48 uur. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM. Afkortingen: TNF-α = tumornecrosefactor-α; Ctrl = controle. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S4: TNF-α behandeling in adipocyten vermindert de expressie van insulinegevoeligheidsmarkers. De mRNA-expressie van Insr, Irs, Glut4 en Adipoq werd gemeten met real-time PCR na behandeling met 4 ng/ml TNF-α gedurende 48 uur. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM; *, p < .05 versus controle. Afkortingen: TNF-α = tumornecrosefactor-α; Ctrl = controle. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit artikel biedt een methode voor het bestuderen van insulineresistentie die primaire adipocyten gebruikt in cultuur behandeld met TNF-α. Dit model heeft het voordeel dat primaire adipocyten gedurende lange tijd onder gedefinieerde omstandigheden kunnen worden gekweekt met een strakke controle van cellulaire omgevingsfactoren26. De testduur is 15-20 dagen, hoewel variaties in het percentage gedifferentieerde adipocyten kunnen optreden tussen experimenten. Primaire adipocyten hebben voordelen ten opzichte van cellijnen, omdat ze niet voortdurend in cultuur zijn uitgebreid en de diversiteit van het weefsel waaruit ze zijn afgeleid beter vastleggen27. Bovendien maken primaire adipocyten het mogelijk om donoren te bestuderen onder verschillende fysio-pathologische contexten, zoals mager versus zwaarlijvig, mannelijk versus vrouwelijk, jong versus oud en cellen uit verschillende vetdepots. Een ander voordeel van deze methode is dat cellijnen van CRE- en knock-outmuizen kunnen worden gegenereerd na APC-isolatie.
Een mogelijk probleem tijdens APC-isolatie en -differentiatie is dat deze cellen het vermogen om te differentiëren kunnen verliezen, wat waarschijnlijk zou optreden wanneer 80% confluentie wordt overschreden aan het begin van het differentiatieproces. Het medium moet ook heel voorzichtig worden veranderd, vooral na lipideaccumulatie, omdat gedifferentieerde adipocyten gemakkelijk loskomen van de kweekschaal. Bovendien moet elke partij collagenase worden getest op verteringsefficiëntie, celopbrengst en cytotoxiciteit26. Er zijn technieken ontwikkeld om APC's te identificeren en te isoleren uit de stromovasculaire fractie van wit vetweefsel, met behulp van negatieve markers zoals CD31 en CD45, evenals positieve stamcelpopulatiemarkers zoals CD34 en Sca128,29. In dit protocol voeren we alleen een negatieve scheiding uit, waarbij endotheelcellen en macrofagen uit de stromovasculaire fractie worden geëlimineerd, waardoor het verlies van preadipocyten in de positieve scheiding wordt vermeden.
Hoewel primaire culturen de studie van donorvariabiliteit en complexiteit27,30 mogelijk maken, introduceert het instellen van het experimentele model beperkingen. Adipocyten geïsoleerd uit oude dieren hebben bijvoorbeeld een lagere differentiatiecapaciteit en een hogere mate van lipotoxiciteit in vergelijking met die van jonge dieren31,32. Het protocol kan ook worden aangepast om verschillende celscheidingstechnieken te gebruiken. Als er geen automatische magnetische celscheider beschikbaar is, kan handmatige scheiding van de cellen worden bereikt met kolommen of FACS-sortering. De hier beschreven methode voor APC-isolatie met behulp van een magnetische celscheider is een aangepaste en vereenvoudigde versie van het FACS-sorteerprotocol beschreven door Macotela et al.28.
Verschillende inflammatoire cytokines zijn gebruikt om insulineresistentie in vetcellen te induceren, waaronder TNF-α, IL-1β en IL-6 18,33,34,35,36. Gekweekte 3T3-L1 adipocyten blootgesteld aan TNF-α binnen enkele dagen insulineresistent worden, zoals beoordeeld door het verminderde vermogen van insuline om glucoseopname te stimuleren37. Deze resultaten tonen aan dat TNF-α de door insuline geïnduceerde fosforylering van IR, IRS-1 en AKT21,23 vermindert, gemeten door de western blot-detectie van totaal eiwit geëxtraheerd uit primaire adipocyten. Proteasen en fosfatasen die vrijkomen tijdens cellyse kunnen echter de detectie van western blots beïnvloeden. De actieve toestand van eiwitten moet worden behouden door de toevoeging van protease- en fosfataseremmers aan de lysisbuffer en na eiwitkwantificering door het monster te mengen met de Laemmli-buffer. Kortom, deze methode biedt een nuttig hulpmiddel om de mechanismen te bestuderen die insulineresistentie bemiddelen in adipocyten die zich onderscheiden van muis-APC's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Acknowledgments
We bedanken Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla en María Antonieta Carbajo voor hun technische assistentie, en Jessica Gonzalez Norris voor het kritisch bewerken van het manuscript. Dit protocol werd ondersteund door Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (aan Y.M.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer - TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
References
- Elmus, G. B.
- Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
- Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
- Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021).
- Petersen, M. C., Shulm, G. I.
- Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
- Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , Academic Press. 370-384 (2019).
- Cinti, S.
- Kahn, B. B., Flier, J. S.
- Klemm, D. J., et al.
- Wilcox, G.
- Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
- James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
- Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
- Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
- Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
- Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
- Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
- Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
- Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
- Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
- Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
- Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
- Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
- Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
- Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
- Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
- Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
- Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
