Summary
이 프로토콜은 피하 지방에서 마우스 지방전구세포의 분리, 성숙한 지방세포로의 분화 및 인슐린 저항성 유도를 설명합니다. 인슐린 작용은 웨스턴 블롯을 통한 인슐린 신호 전달 경로 구성원의 인산화/활성화에 의해 평가됩니다. 이 방법을 사용하면 원발성 지방세포에서 인슐린 저항성/민감도를 직접 측정할 수 있습니다.
Abstract
인슐린 저항성은 표적 세포에 대한 인슐린의 감소된 효과로, 일반적으로 인슐린 수용체 신호 전달 감소에서 파생됩니다. 인슐린 저항성은 전 세계적으로 유병률이 높은 제2형 당뇨병(T2D) 및 기타 비만 유래 질병의 발병에 기여합니다. 따라서 인슐린 저항성의 기본 메커니즘을 이해하는 것은 매우 중요합니다. 생체 내 및 시험관 내에서 인슐린 저항성을 연구하기 위해 여러 모델이 사용되었습니다. 일차 지방 세포는 인슐린 저항성의 메커니즘을 연구하고 이 상태에 대항하는 분자와 인슐린 감작 약물의 분자 표적을 식별하는 매력적인 옵션을 나타냅니다. 여기에서 우리는 종양 괴사 인자-α(TNF-α)로 처리된 배양에서 일차 지방 세포를 사용하여 인슐린 저항성 모델을 확립했습니다.
자성 세포 분리 기술에 의해 콜라게나제로 분해된 마우스 피하 지방 조직에서 분리된 지방 세포 전구 세포(APC)는 1차 지방 세포로 분화됩니다. 인슐린 저항성은 인슐린 신호 전달 캐스케이드 구성원의 티로신 인산화/활성화를 감소시키는 전염증성 사이토카인인 TNF-α로 처리하여 유도됩니다. 인슐린 수용체 (IR), 인슐린 수용체 기질 (IRS-1) 및 단백질 키나아제 B (AKT)의 감소된 인산화는 웨스턴 블롯에 의해 정량화된다. 이 방법은 지방 조직에서 인슐린 저항성을 매개하는 메커니즘을 연구하는 훌륭한 도구를 제공합니다.
Introduction
인슐린은 췌장 섬 β 세포에서 생성되는 단백 동화 호르몬이며 포도당과 지질 대사의 핵심 조절자입니다. 인슐린은 많은 기능 중에서 포도당 흡수, 글리코겐 합성, 포도당 생성, 단백질 합성, 지방 생성 및 지방 분해를 조절합니다1. 인슐린과 인슐린의 수용체(IR) 상호작용 후의 초기 분자 신호는IR2의 내인성 티로신 단백질 키나아제 활성의 활성화이며, 그 결과 자가인산화3 및 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrates, IRS)로 알려진 단백질 계열의 활성화가 일어나며, 이는 어댑터 단백질에 결합하여 단백질 키나아제4의 캐스케이드를 활성화시킨다 . 인슐린은 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K)-단백질 키나아제 B(AKT)와 라스-미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK)의 두 가지 주요 신호 전달 경로를 활성화합니다. 전자는 연료 항상성의 조절을 포함하여 다양한 생리적 기능에 관여하는 수많은 다운스트림 이펙터의 활성화를 위한 주요 분기점 또는 노드(4,5)를 구성하는 반면, 후자는 세포 성장 및 분화를 조절합니다(4,6). 인슐린 작용은 궁극적으로 세포 유형과 생리학적 맥락에 따라 달라진다7.
주요 인슐린 반응성 대사 조직 중 하나는 지방 조직입니다. 백색 지방 조직은 인간과 설치류에서 가장 풍부한 지방 유형으로, 피하 지방 (피부와 근육 사이)과 내장 지방 (복강 내 장기 주변)에 분포합니다. 부피가 크면 지방 세포 또는 지방 세포는 지방 조직에서 가장 풍부한 세포 유형입니다. 이 지방 세포는 갈색/베이지색(열성), 분홍색(유선) 및 흰색 8,9일 수 있습니다. 백색 지방 세포는 인슐린 의존 과정 인 트리글리세리드의 형태로 신체의 주요 에너지 매장량을 유지합니다. 인슐린은 포도당 수송과 지방 생성을 촉진하는 반면, 지방 분해 또는 지질 분해를 억제한다 7,10. 또한 지방전구세포가 지방세포(성숙한 지방을 저장하는 세포)로 분화하는 것을 촉진한다11.
인슐린 저항성은 정상적인 인슐린 수치가 약독화된 생물학적 반응을 일으켜 보상성 고인슐린혈증을 유발할 때 발생한다12. 인슐린 저항성은 과체중 및 비만과 관련된 질환으로5, 인슐린 저항성이 복합적으로 발생하면 제2형 당뇨병(T2D) 및 기타 대사 질환을 유발한다13. 고인슐린혈증은 말초 조직의 인슐린 저항성을 보상하여 정상적인 혈당 수치를 유지한다14. 그러나 인슐린 저항성 악화와 함께 궁극적인 β세포 손실 또는 고갈은 T2D와 일치하는 혈당 수치 상승으로 이어집니다5. 따라서 인슐린 저항성과 고인슐린혈증은 비만 유래 대사 질환의 발병에 기여할 수 있다15. 또한, 비만은 지방 조직에서 인슐린 저항성을 촉진하는 만성 저등급 국소 염증을 유발할 수 있다15,16,17. 또한, 섬유증, 염증, 혈관신생 및 지방생성 감소와 같은 지방 조직의 비만 유래 변화는 아디포넥틴 혈청 수치(인슐린 감작제)를 낮추고 플라스미노겐 활성제 억제제 1(PAI-1), 유리 지방산 및 엑소좀과 같은 인자의 혈류로의 분비를 증가시켜 인슐린 저항성을 악화시킵니다17.
인슐린 저항성의 기저에 있는 많은 측면은 아직 알려지지 않았습니다. 시험관 내 및 생체 내 모델은 지방 조직을 포함한 주요 표적 조직에서 인슐린 저항성을 매개하는 메커니즘을 연구하기 위해 개발되었습니다. 시험관 내 모델의 장점은 연구자가 환경 조건을 더 잘 제어할 수 있고 특정 세포 유형에서 인슐린 저항성을 평가할 수 있다는 것입니다. 특히, 지방세포 전구체 세포(APC)는 기증자 조직의 개별 표현형을 가지고 있으며, 이는 지방세포 세포주보다 생리학을 더 잘 반영할 수 있습니다. 시험관 내에서 인슐린 저항성을 유도하는 주요 인자는 종양 괴사 인자-α(TNF-α)입니다. TNF-α는 지방 조직18에서 지방세포와 대식세포에 의해 분비되는 전염증성 사이토카인이다. 적절한 지방조직 리모델링 및 확장에 필요하지만19, TNF-α에 장기간 노출되면 생체 내 지방 조직과 시험관 내 지방 세포에서 인슐린 저항성이 유발된다 20. 여러 세포 유형의 만성 TNF-α 처리는 IR 및 IRS-1 모두의 세린 인산화를 증가시켜 티로신 인산화 감소를 촉진한다21. 세린 잔기 상의 IRS-1의 증가된 인산화는 IR 티로신 키나아제 활성을 억제하며, 만성 TNF-α 치료가 인슐린 작용을 손상시키는 주요 기전 중 하나일 수 있다22,23. TNF-α는 핵 인자 ĸB 키나제 β(IKKβ) 및 c-Jun N 말단 키나아제(JNK)의 세린/트레오닌 키나제 억제제와 관련된 경로를 활성화합니다.24. JNK는 복잡한 전염증성 전사 프로그램을 유도할 뿐만 아니라 IRS-1을 직접 인산화하기도합니다 6.
인슐린 저항성의 병인을 이해하는 것은 T2D에 대한 미래 치료법의 개발을 안내하는 데 점점 더 중요해지고 있습니다. APC는 인슐린에 대한 민감성과 저항성을 포함한 지방 세포 생물학 연구와 전신 환경과 무관한 지방 세포의 고유 특성을 식별하는 데 탁월한 모델임이 입증되었습니다. APC는 다른 지방 저장소에서 쉽게 얻을 수 있으며 적절한 조건에서 성숙한 지방 세포로 분화됩니다. 이 방법을 사용하면 지방 세포에서 인슐린 저항성/민감도에 대한 직접적인 영향을 평가할 수 있습니다.
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Protocol
모든 설치류 실험은 UNAM 신경 생물학 연구소의 생명 윤리위원회 (프로토콜 번호 075)에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 지방세포 전구세포 분리
- 8-10주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 안락사시킵니다(예: CO2 흡입 및 후속 자궁경부 탈구에 의해)(분리당 4마리). 마우스를 70% 에탄올로 문질러 소독하고 희생 직후 지방 조직을 얻습니다.
참고: 설치류를 안락사시킨 후 즉시 지방 조직을 분리하고 멸균 층류 후드 내부의 모든 단계를 수행합니다. 생쥐는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간의 명암주기 아래로 유지됩니다. - 각 마우스에서 사타구니 피하 지방 조직을 해부합니다. 근육, 피부 또는 기타 조직의 제거를 피하고 지방 조직만 제거하고 얼음 위에 15mL의 유형 1 콜라게나제 용액(1.5mg/mL)이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 고포도당-1% 소 혈청 알부민(BSA)에 유형 1 콜라게나제를 용해하고 0.2μm 주사기 필터를 통해 여과합니다.
- 멸균 수술용 가위로 지방 조직을 작은 조각으로 절단하고 37°C에서 30분 동안 안와 진탕기(150rpm)에서 1형 콜라게나제 용액과 함께 배양하여 샘플을 분해합니다(더 큰 진탕 표면을 위해 지방 및 콜라게나제가 포함된 튜브를 수평 위치에 놓으십시오). 10분마다 소화를 점검하여 작동하는지 확인하고(조직 분해가 보임) 과소화를 방지합니다( 보충 그림 S1 참조).
- 200μm 메쉬 주사기(이전에는 오토클레이브)를 사용하여 여과하여 콜라게나제로 분해되지 않은 조직을 제거합니다. 필터를 튜브 가장자리에 통과시켜 가능한 한 많은 셀을 용액으로 배출합니다. 차가운 DMEM-1% BSA 15mL를 넣어 소화를 중지하고 4°C에서 10분 동안 400× g 에서 원심분리합니다.
- 성숙한 지방세포 및 대부분의 액체층을 함유하는 최상층을 흡인하고; 펠릿을 만지거나 방해하지 마십시오. 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)-2% 소 태아 혈청(FBS) 20mL를 넣고 펠릿을 재현탁합니다. 400 × g 에서 4 °C에서 5 분간 원심분리한다.
- 상층액을 제거하고 먼저 상층을 흡인하여 나머지 지방 세포와 지방을 제거합니다. 펠릿을 1mL의 염화암모늄 칼륨(ACK) 용해 완충액(적혈구 용해용)에 재현탁하고 얼음에서 5분 동안 배양합니다. PBS-2% FBS 10mL를 넣고 4°C에서 5분 동안 400× g 에서 혼합하고 원심분리합니다.
- 상층액을 흡인하고 펠릿을 200μL의 항-Fc 용액(PBS-2% FBS로 희석한 정제된 쥐 항-마우스 CD16/CD32[1:150])에 재현탁하여 관심 항체에 의한 Fc 수용체 매개 결합을 감소시킵니다. 얼음에서 5분 동안 배양합니다. 세포 현탁액을 자기 세포 분리기의 예냉 랙에 맞는 5mL 튜브로 옮기고 4°C에서 5분 동안 400× g 에서 원심분리합니다.
- 상층액을 제거하고 CD31(PECAM-1) 단일클론항체(390)-비오틴(1:100)과 CD45 단일클론항체(30-F11)-비오틴(1:100)의 혼합물 200μL를 넣고 잘 섞은 후 얼음에서 15분 동안 배양합니다(항-Fc 용액에 항체 희석액 준비, 표 1 참조). 400μL의 PBS-2% FBS를 추가하고 4°C에서 5분 동안 400× g 에서 원심분리합니다.
참고: CD31 및 CD45는 각각 내피 세포 및 조혈 세포의 마커입니다. - 상층액을 흡인하고 얼음에서 15분 동안 100μL의 항-비오틴 마이크로비드(1:5)에서 배양합니다(항-Fc 용액에서 항체 희석액을 준비, 표 1 참조). 400μL의 PBS-2% FBS를 추가하고 4°C에서 5분 동안 400× g 에서 원심분리합니다.
- 상청액을 버리고 펠릿을 350 μL의 PBS-2% FBS에 재현탁시킨다. 사전 분리 필터(70 μm)를 사용하여 단일 세포 현탁액에서 세포 응집체 또는 큰 입자를 제거합니다. 먼저 PBS-2% FBS 100μL로 필터를 활성화하고 세포 현탁액을 필터에 통과시키고(깨끗한 튜브에 수집) 마지막으로 PBS-2% FBS 100μL로 필터를 세척합니다.
- 자기 셀 분리기와 함께 네거티브 분리 전략을 사용하여 셀의 자기 분리를 수행합니다.
- 냉각 랙의 위치 A에 샘플을 배치하고(랙이 사전 냉각되었는지 확인) 위치 B와 C에 두 개의 빈 튜브를 배치하여 레이블이 지정되지 않은 셀과 레이블이 지정된 셀을 각각 복구합니다.
- 장비를 켜기 전에 세척 버퍼와 실행 버퍼를 해당 병에 넣으십시오. DEPLETE 프로토콜을 사용하여 셀의 자기 분리를 수행하도록 장비를 프로그래밍합니다.
참고: 이 프로토콜은 복구가 가장 높은 우선 순위인 경우 정상 항원 발현을 가진 세포(이 경우 항-CD31 및 항-CD45로 표지된 세포)를 제거하기 위한 표준 모드 의 고갈을 위한 것입니다. - 분리 섹션에서 분리 할 샘플 수를 선택하고 DEPLETE 프로토콜을 선택합니다. Run(실행 )을 누르고 분리를 시작합니다. 프로그램의 종료시에, 표지되지 않은 세포를 회수하고, 4°C에서 5분 동안 400 × g 에서 원심분리한다.
- 상층액을 제거하고 펠릿을 500 μL의 성장 배지에 재현탁시킨다(표 1).
- 이전에 2.5% 기저막 매트릭스로 코팅된 12웰 플레이트의 한 웰에 APC를 시딩합니다(약 50,000-75,000개의 세포가 얻어짐). 400 μL의 2.5% 기저막 매트릭스를 추가하여 각 웰의 전체 표면을 덮습니다. 과량의 용액을 제거하고 작은 층만 남긴 직후, 층류 후드 내부에서 플레이트를 최소 1시간 동안 건조시키십시오(뚜껑 없이). 5%CO2 분위기에서 37°C에서 인큐베이션한다. 세포가 80% 합류에 도달할 때까지 48시간마다 배지를 교체합니다.
- 80% 합류점에서 배지를 완전히 제거하고 350μL의 PBS-2% FBS로 세척합니다. 세포를 37°C에서 2분 동안 350 μL의 0.05% 트립신-EDTA로 수확한다. 성장 배지 2mL를 추가하고 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 세포를 모은 다음 400× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
- APC를 2.5% 기저막 매트릭스로 미리 코팅된 12-웰 플레이트(웰당 10,000-20,000 세포)로 계대시킵니다. 5%CO2와 함께 37°C에서 배양한다. 세포가 80% 합류에 도달할 때까지 48시간마다 배지를 교체합니다.
알림: APC는 한 번 통과할 수 있습니다. 결과적으로 그들은 증식하고 분화하는 능력을 상실합니다. 보충 그림 S2에서 APC 격리 프로세스에 대한 워크플로를 참조하세요.
2. 지방세포 분화 및 인슐린 저항성 유도
참고: 세포를 5%CO2에서 37°C로 유지하고 배지 교체 및 멸균 후드 내부의 TNF-α 및 인슐린 처리와 관련된 단계를 수행합니다.
- 80% 합류에서 분화 과정을 시작합니다. 모든 성장 배지를 흡인하고 각 웰에 3.3nM 뼈 형태 형성 단백질(BMP4)을 포함하는 분화 배지(표 1) 500μL로 교체합니다.
- 48시간 후, 배지를 분화 배지(웰당 500μL) 및 분화 칵테일(표 1)로 교체합니다.
- 72시간 후에 배지를 제거하고 500μL의 신선한 분화 배지에 100nM의 인슐린을 추가합니다.
참고: 세포는 내부에 작은 지질 방울이 있는 둥근 모양을 보이기 시작합니다. - 분화 배지를 흡인하고 48시간 후에 500μL의 단순 배지-2% FBS(표 1)로 교체합니다. 4ng/mL의 TNF-α로 인슐린 저항성을 유도합니다. TNF-α 처리가 없는 대조군 웰을 포함합니다.
- 24시간 배양 후 단순 배지-0% FBS에 4ng/mL TNF-α를 추가합니다(표 1). TNF α 처리 없이 제어 웰을 유지합니다.
- 24시간 후에 100 nM 인슐린을 첨가하여 인슐린 신호전달 경로를 활성화시키고, 5%CO2 분위기에서 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다. 배지를 제거하고 500 μL의 PBS로 세척합니다. 인슐린 치료없이 대조군 웰을 포함하십시오.
3. 웨스턴 블롯에 의한 인슐린 신호전달 경로의 평가
- 단백질 추출 및 정량
- 500 μL의 PBS로 세포의 각 웰을 세척하고, 샘플 분리 직전에 첨가된 1% 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 50 μL의 RIPA 완충액(표 1)에서 세포를 용해시키기 위해 얼음 위에 보관한다. 팁으로 웰의 전체 표면을 긁어내고 용해물을 0.6mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다(얼음 위에 보관).
- 회전식 쉐이커에서 4°C에서 1시간 동안 배양하고, 볼텍싱으로 혼합하고, 4°C에서 15분 동안 8,000× g 에서 원심분리하고 상층액을 회수합니다(얼음에 보관).
- Bradford 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다(정량화를 위해 샘플을 희석하지 마십시오).
- 40-60 μg에 해당하는 필요한 부피를 취하고, 550 rpm에서 진탕하면서 15분 동안 97°C에서 인큐베이션하여 6x Laemmli 완충액(표 1)으로 변성시킨다. 사용할 때까지 얼립니다.
- SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동
- 1.5mm 두께의 7.5% 폴리아크릴아미드 겔로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 수행합니다. 젤을 탱크에 삽입하고 실행 버퍼로 채웁니다(표 1).
- 3 μL의 사전 염색된 단백질 표준물질을 겔의 첫 번째 웰에 첨가하고 각 샘플을 후속 웰에 로딩합니다.
- 겔을 80V에서 약 15분 동안 실행하여 샘플이 폴리아크릴아미드 농축기 겔 매트릭스에 들어가도록 합니다. 그 후, 2.5 h 동안 또는 37 kDa 분자량 마커가 겔의 하단 가장자리에서 보일 때까지 전압을 90V로 증가시킵니다.
- 단백질을 겔에서 니트로셀룰로스 막으로 25V에서 35분 동안 반건조 챔버로 옮기고, 젤, 멤브레인 및 필터를 전달 완충액(표 1)에 몇 분 동안 담근다.
- 웨스턴 블롯
- 이송 후, 멤브레인을 0.1% 트윈 20(TBS-T 0.1%)을 함유하는 트리스-완충 식염수(TBS)(표 1)로 30 rpm에서 진탕하면서 3분 동안 세척하였다.
- 차단액(표 1)으로 멤브레인을 4°C에서 1시간 동안 일정한 회전으로 차단합니다.
- 분자량 마커에 따라 멤브레인을 세 부분으로 절단하여 4°C에서 일정한 회전으로 상이한 1차 항체(블로킹 용액에 희석됨)와 함께 밤새 인큐베이션한다: Phospho-IRS1 (Tyr608) 항체 (1:1,000), 180 kDa에서 예상 밴드; Phospho-Insulin receptor β (Tyr1150/1151) 항체 (1:1,000), 예상 밴드 95 kDa; Phospho-Akt (Ser473) 항체 (1:1,000), 예상 밴드 60 kDa.
- 멤브레인을 TBS-T 0.1%로 각각 5분 동안 5회 세척합니다.
- 상응하는 퍼옥시다아제 결합 2차 항체(블로킹 용액에 희석됨)와 함께 실온에서 일정한 회전으로 2시간 동안 멤브레인을 배양합니다: 퍼옥시다아제 아피니퓨어 당나귀 항토끼 IgG(H+L)(1:5,000).
- 멤브레인을 TBS-T 0.1%로 각각 5분 동안 5회 세척합니다.
- 화학발광 검출 시스템을 사용하여 단백질을 검출합니다. 제조업체의 지침에 따라 기판을 준비하십시오.
- 블롯을 비닐 봉지에 넣고 200μL의 화학발광 기질을 추가하여 멤브레인을 완전히 덮습니다. 여분의 기판을 배출하고 기포를 제거하십시오.
- 각 블롯을 화학발광과 호환되는 고성능 이미징 시스템에서 30-60초 동안 노출시킵니다.
- 멤브레인(웨스턴 블롯 섹션의 10-13단계)을 벗겨 항체-항원 상호작용을 차단하여 니트로셀룰로오스 멤브레인을 다시 블롯팅할 수 있도록 합니다. 멤브레인을 회수하고 50rpm에서 TBS-T 1%로 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
- 50rpm에서 0.2M NaOH 10mL로 7분 동안 배양합니다.
- 3rpm의 수돗물로 각각 5분 동안 50번 세척합니다.
- 50rpm에서 TBS-T 1%로 10분 동안 세척합니다.
- 웨스턴 블롯 섹션의 2-9단계를 반복하여 1:1,000 희석을 사용하여 로딩 대조군으로 항베타 튜불린(55kDa)과 함께 멤브레인을 배양합니다.
- ImageJ 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/)를 사용하여 각 단백질에 대해 밀도 분석25를 수행합니다.
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Representative Results
지난 몇 년 동안 비만과 T2D의 유병률이 증가함에 따라 지방 조직에서 인슐린 저항성을 매개하는 메커니즘에 대한 집중적인 연구가 촉발되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 APC를 성숙한 지방 세포로 분화하여 인슐린 저항성과 민감도를 평가할 수 있습니다. APC가 합류점에 도달하면 성숙한 지방세포로의 분화와 TNF α 매개 인슐린 저항성 유도를 완료하는 데 10일이 걸립니다(그림 1).
APC는 평평하고 길쭉한 모양과 파종 후 48시간 후에 완료된 플레이트에 대한 접착을 특징으로 하는 섬유아세포와 유사한 형태를 보여줍니다(그림 2A). APC는 80% 합류에 도달하는 데 2-5일이 걸리며(시드된 세포 수에 따라 다름), 분화 칵테일에 노출되어 분화 과정이 시작됩니다(그림 2A). 성숙한 지방 세포는 다음 6-8 일 후에 나타나기 시작합니다. 분화된 지방세포는 둥근 형태 및 지질 방울의 세포내 축적을 특징으로 한다. 최대 80%의 세포가 분화 과정이 끝날 때 분화됩니다(그림 2B).
인슐린 저항성은 48시간 동안 TNF-α 처리(4ng/mL)에 의해 원발성 지방세포에서 유도됩니다. 이러한 TNF-α의 농도는 세포 생존율을 변화시키지 않는다(보충 그림 S3). 이어서, 100 nM 인슐린을 첨가하여 15분 동안 인슐린 신호전달 경로를 활성화시키고, 주요 신호전달 분자(IR, IRS-1, 및 AKT)의 인산화를 웨스턴 블롯으로 측정한다. 인슐린은 이 세 분자의 인산화를 자극합니다(그림 3) 대조군, 처리되지 않은 분화된 지방세포와 비교됩니다. TNF-α는 IR(30%), IRS-1(20%) 및 AKT(45%)의 인슐린 유도 인산화를 감소시킵니다(그림 3). 인슐린 저항성 세포는 인슐린 민감성 세포에 비해 인슐린 신호 전달 경로의 활성화가 적습니다. 또한, TNF-α 처리는 공지된 인슐린 감수성 마커인 Insr, Irs2, Glut4 및 Adipoq 의 mRNA 발현을 감소시킵니다(보충 그림 S4). 이러한 발견은 TNF-α가 원발성 지방세포에서 인슐린의 작용을 감소시켜 인슐린 저항성을 유도한다는 것을 확인시켜줍니다.
그림 1: 지방세포 전구체 세포 분화 과정과 인슐린 저항성 유도 과정을 나타내는 개략도 타임라인. APC는 콜라게나제 처리 및 자기 세포 분리 기술을 사용하여 피하 지방 조직에서 분리됩니다. 그런 다음 7 일간의 분화 과정을 거쳐 1 차 지방 세포를 얻습니다. 이어서, 인슐린 저항성은 인슐린 신호 전달 경로의 활성화를 방지하기 위해 48시간 동안 TNF-α로 유도되고, 처음 24시간은 2% FBS를 함유하는 배지에서, 다음 24시간은 무혈청 배지로 유도된다. 인슐린으로 신호전달 캐스케이드를 활성화하고 분화 과정을 시작한 후 10일 후에 웨스턴 블롯 분석을 위해 단백질을 추출하여 IR, IRS-1 및 AKT의 인산화/활성화를 평가합니다. 약어: APCs = 지방세포 전구체 세포; BMP4 = 골형성 단백질; IBMX = 3-이소부틸-1-메틸크산틴; TNF-α = 종양 괴사 인자-α; FBS = 소 태아 혈청; IR = 인슐린 수용체; IRS = 인슐린 수용체 기질; AKT = 단백질 키나아제 B; Tx = 치료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 지방세포 전구체 세포와 성숙한 지방세포의 형태. (A) 12-웰 배양 플레이트에서 분화를 유도하기 전에 80% 합류에서 피하 APC. (b) 12-웰 배양 플레이트에서 분화 유도 7일 후의 피하 일차 지방세포. 이미지는 10x 배율로 촬영되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: APCs = 지방세포 전구체 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 피하 원발성 지방세포에서 TNF-α에 의해 유도된 인슐린 저항성은 IR, IRS-1 및 AKT의 인슐린 유도 인산화 감소에 의해 입증되었습니다. 피하 지방세포는 48시간 동안 TNF-α(4ng/mL)로 처리되었고 마지막 24시간 동안 혈청이 굶주렸습니다. 15분 동안 인슐린(100nM)으로 자극한 후, 40μg의 총 단백질을 7.5% 겔에 로딩하고, SDS-PAGE를 실시하고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, TBS-T 0.1% 중 4% 무지방 우유에 차단하였다. 멤브레인을 항-인산화 IR(pIR), 항-인산화 IRS-1(pIRS-1) 및 항-인산화 AKT(pAKT) 및 항-토끼 HRP 2차 항체로 프로브했습니다. 신호는 화학발광 검출로 시각화되었고 항β 튜불린을 로딩 대조군으로 사용했습니다. (A) 3개의 독립적인 실험으로부터의 대표 블롯 및 (B) 정량화. 데이터는 SEM± 평균입니다. *, p < .05 대 대조군. 약어: TNF-α = 종양 괴사 인자-α; IR = 인슐린 수용체; IRS = 인슐린 수용체 기질; pX = X의 인산화된 형태; b-Tub = 베타-튜불린; HRP = 양 고추 냉이 과산화 효소; Ctrl = 제어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| Anti-Fc 솔루션 | PBS에 희석된 정제된 쥐 항-마우스 CD16/CD32–2% FBS [1:150] | |||
| TBS-T 0.1% | 0.01 M Tris-HCl (pH 8), 0.15 M NaCl, 0.1 % 트윈 20 | |||
| 차단 솔루션 | TBS-T 0.1%에서 묽게 한 4% 탈지분유 | |||
| 성장 배지 | 60% DMEM 저혈당, 40% MCDB 201 배지, 1x 페니실린-스트렙토마이신, 1nM 덱사메타손, 0.1mM L-아스코르브산 2-포스페이트, 1x 인슐린, 트랜스페린, 나트륨, 아셀렌산(ITS) 액체 배지 보충제, BSA의 리놀레산-알부민 1개, 10% FBS, 10ng/mL 표피 성장 인자(EGF), 10ng/mL 백혈병 억제 인자(LIF), 10ng/mL 혈소판 유래 성장 인자 BB(PDGF-BB), 5ng/mL 섬유아세포 성장 인자-염기성(bFGF) 및 50μg/mL 노르모신 | |||
| 분화 매체 | 60% DMEM 저혈당, 40% MCDB 201 배지, 1x 페니실린-스트렙토마이신, 1nM 덱사메타손, 0.1mM L-아스코르브산 2-포스페이트, 1x ITS 액체 배지 보충제, 1x 리놀레산-BSA의 알부민 및 2% FBS | |||
| 차별화 칵테일 | 0.5μM 3-이소부틸-1-메틸크산틴[IBMX], 1μM 덱사메타손, 10μM 로시글리타존 및 100nM 인슐린 | |||
| 단순 중간 2% FBS | 60% DMEM 저혈당, 40% MCDB 201 배지, 1x 페니실린-스트렙토마이신 및 2% FBS | |||
| 단순 중간–0% FBS | 60% DMEM 저혈당, 40% MCDB 201 배지, 1x 페니실린-스트렙토마이신 | |||
| RIPA 버퍼 | 50 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1 % 옥틸 페녹시 폴리 (에틸렌 옥시) 에탄올, 1 mM Na3VO4, 48.8 mM NaF, 8.2 mMNa4 P2O7, 및 0.26 M 사카로스 | |||
| 6x Laemmli 버퍼 | 1.2 g SDS, 6 mg 브로모페놀 블루, 4.7 mL 글리세롤, 1.2 mL 트리스 염기 0.5 M pH 6.8, 845 μL 2-머캅토에탄올, 및 2.1 mLH2O | |||
| 실행 중인 버퍼 | 25 mM 트리스 염기, 192 mM 글리신, 1% SDS | |||
| 전송 버퍼 | 25 mM 트리스 염기, 192 mM 글리신, 20% 메탄올 | |||
표 1: 이 프로토콜에 사용된 솔루션.
보충 그림 S1: 콜라게나제로 분해된 피하 지방 조직. 지방 조직이 제거되면 가위로 작은 조각으로 잘라 소화 과정을 시작한 다음 (A), 37 °C, 150 rpm (B)에서 콜라게나제 유형 1과 함께 30 분 동안 배양합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충도 S2: 지방세포 전구체 세포 분리 과정의 반응식. 사타구니 피하 지방 조직을 해부하고 collagenase로 샘플을 소화합니다. 원심분리로 성숙한 지방세포를 제거하고 펠릿을 세척하여 과도한 지방을 제거합니다. 적혈구를 용해시키고 차단하여 비특이적 결합을 줄입니다. 내피 세포와 대식세포를 자성 입자에 결합된 항체로 표시하십시오. 자성 셀 분리기와 함께 음극 분리 전략을 사용하여 셀의 자기 분리를 수행합니다. 기저막 매트릭스로 덮인 플레이트의 시드 APC(표지되지 않은 세포). 세포가 80% 합류에 도달할 때까지 48시간마다 배지를 교체합니다. 약어: APCs = 지방세포 전구체 세포; BSA = 소 혈청 알부민; FBS = 소 태아 혈청. Biorender.com 로 제작되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S3: 인슐린 저항성을 유도하기 위한 TNF-α 처리는 지방세포의 생존력을 변화시키지 않는다. 성숙한 지방 세포의 생존력은 48시간 동안 4ng/mL의 TNF-α로 처리한 후 MTT 분석으로 측정했습니다. 데이터는 SEM± 평균입니다. 약어: TNF-α = 종양 괴사 인자-α; Ctrl = 제어. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 S4: 지방세포에서 TNF-α 처리는 인슐린 감수성 마커의 발현을 감소시킨다. Insr, Irs, Glut4 및 Adipoq 의 mRNA 발현은 48시간 동안 4ng/mL의 TNF-α로 처리한 후 실시간 PCR로 측정되었습니다. 데이터는 SEM± 평균입니다. *, p < .05 대 대조군. 약어: TNF-α = 종양 괴사 인자-α; Ctrl = 제어. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 논문은 TNF-α로 처리된 배양물에서 일차 지방세포를 이용하는 인슐린 저항성을 연구하는 방법을 제공한다. 이 모델은 세포 환경 인자의 엄격한 제어와 함께 일차 지방 세포가 장기간 동안 정의된 조건 하에서 배양될 수 있다는 장점이 있다26. 분석 기간은 15-20 일이지만 분화 된 지방 세포의 비율에 변화가 실험 사이에 발생할 수 있습니다. 일차 지방세포는 배양에서 지속적으로 확장되지 않았고 세포주가 유래된 조직의 다양성을 더 밀접하게 포착하기 때문에 세포주에 비해 이점이 있다27. 또한, 1차 지방세포는 마른 대 비만, 남성 대 여성, 젊은 대 노인, 다른 지방 저장소의 세포와 같은 다양한 생리병리학적 맥락에서 기증자를 연구할 수 있습니다. 이 방법의 또 다른 장점은 APC 분리 후 CRE 및 녹아웃 마우스의 세포주를 생성할 수 있다는 것입니다.
APC 분리 및 분화 중 발생할 수 있는 한 가지 문제는 이러한 세포가 분화 능력을 잃을 수 있다는 것인데, 이는 분화 과정 시작 시 80% 합류를 초과할 때 발생할 수 있습니다. 배지는 또한 분화된 지방 세포가 배양 접시에서 쉽게 분리되기 때문에 특히 지질 축적 후에 매우 부드럽게 변경되어야 합니다. 또한, 콜라게나제의 각 로트는 소화 효율, 세포 수율 및 세포 독성에 대해 테스트되어야 한다26. CD31 및 CD45와 같은 음성 마커와 CD34 및 Sca1과 같은 양성 줄기 세포 집단 마커를 사용하여 백색 지방 조직의 스트로 모브 혈관 분획에서 APC를 식별하고 분리하는 기술이 개발되었습니다28,29. 이 프로토콜에서 우리는 음성 분리만 수행하여 스트로모혈관 분획에서 내피 세포와 대식세포를 제거하여 양성 분리에서 지방전구세포의 손실을 방지합니다.
1차 배양은 기증자 가변성과 복잡성에 대한 연구를 허용하지만27,30, 실험 모델을 설정하는 것은 한계를 초래합니다. 예를 들어, 늙은 동물에서 분리된 지방세포는 어린 동물에서 분리된 지방세포에 비해 분화 능력이 낮고 지방독성이 더 높습니다31,32. 프로토콜은 또한 다른 세포 분리 기술을 사용하도록 조정될 수 있습니다. 자동 마그네틱 셀 분리기를 사용할 수 없는 경우 컬럼 또는 FACS 분류를 통해 셀을 수동으로 분리할 수 있습니다. 자기 셀 분리기를 사용한 APC 분리를 위해 여기에 설명된 방법은 Macotela et al.28에 의해 설명된 FACS 분류 프로토콜의 적응되고 단순화된 버전입니다.
지방 세포에서 인슐린 저항성을 유도하기 위해 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 18,33,34,35,36을 비롯한 여러 염증성 사이토카인이 사용되었습니다. TNF-α에 노출된 배양된 3T3-L1 지방세포는 포도당 흡수를 자극하는 인슐린의 능력 감소로 평가된 바와 같이 수일 이내에 인슐린 저항성이 된다37. 이러한 결과는 TNF-α이 1차 지방세포로부터 추출된 총 단백질의 웨스턴 블롯 검출에 의해 측정된 IR, IRS-1 및 AKT21,23의 인슐린 유도 인산화를 감소시킨다는 것을 보여준다. 그러나 세포 용해 동안 방출되는 프로테아제와 포스파타제는 웨스턴 블롯 검출에 영향을 미칠 수 있습니다. 단백질의 활성 상태는 용해 완충액에 프로테아제와 포스파타제 억제제를 첨가하고 단백질 정량 후 샘플을 Laemmli 완충액과 혼합하여 보존해야 합니다. 결론적으로, 이 방법은 마우스 APC와 분화된 지방 세포에서 인슐린 저항성을 매개하는 메커니즘을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
기술 지원을 아끼지 않은 다니엘 몬드라곤, 안토니오 프라도, 페르난도 로페스-바레라, 마르틴 가르시아-세르빈, 알레한드라 카스티야, 마리아 안토니에타 카르바호, 그리고 원고를 비판적으로 편집해 준 제시카 곤잘레스 노리스에게 감사드립니다. 이 프로토콜은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (YM에게)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
| ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
| Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
| Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
| Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
| BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
| DMEM | GIBCO | 12800017 | |
| DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| ITS mix | Sigma | I3146 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
| LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
| Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
| MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
| PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
| Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
| Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
| 2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
| BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
| Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
| TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
| 3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
| Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
| Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
| EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
| EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
| FluorChem E system | ProteinSimple | ||
| Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
| Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
| Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
| 2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
| Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
| NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
| NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
| NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
| Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
| Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
| Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
| Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
| Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
| Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
| Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
| Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
| SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
| Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
| Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer - TBS |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |
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