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Biology

Adipociti di topo differenziati in coltura primaria: un modello di insulino-resistenza

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/63979
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

Summary

Questo protocollo descrive l'isolamento dei preadipociti di topo dal grasso sottocutaneo, la loro differenziazione in adipociti maturi e l'induzione della resistenza all'insulina. L'azione dell'insulina viene valutata mediante fosforilazione/attivazione dei membri della via di segnalazione dell'insulina attraverso il western blot. Questo metodo consente la determinazione diretta della resistenza/sensibilità all'insulina negli adipociti primari.

Abstract

La resistenza all'insulina è un effetto ridotto dell'insulina sulle sue cellule bersaglio, di solito derivato dalla diminuzione della segnalazione del recettore dell'insulina. La resistenza all'insulina contribuisce allo sviluppo del diabete di tipo 2 (T2D) e di altre malattie derivate dall'obesità ad alta prevalenza in tutto il mondo. Pertanto, comprendere i meccanismi alla base della resistenza all'insulina è di grande rilevanza. Diversi modelli sono stati utilizzati per studiare la resistenza all'insulina sia in vivo che in vitro; Gli adipociti primari rappresentano un'opzione interessante per studiare i meccanismi di insulino-resistenza e identificare le molecole che contrastano questa condizione e i bersagli molecolari dei farmaci insulino-sensibilizzanti. Qui, abbiamo stabilito un modello di insulino-resistenza utilizzando adipociti primari in coltura trattata con fattore di necrosi tumorale α (TNF-α).

Le cellule precursori degli adipociti (APC), isolate dal tessuto adiposo sottocutaneo sottocutaneo di topo digerito con collagenasi mediante tecnologia di separazione cellulare magnetica, sono differenziate in adipociti primari. La resistenza all'insulina viene quindi indotta dal trattamento con TNF-α, una citochina proinfiammatoria che riduce la fosforilazione/attivazione della tirosina dei membri della cascata di segnalazione dell'insulina. La diminuzione della fosforilazione del recettore dell'insulina (IR), del substrato del recettore dell'insulina (IRS-1) e della proteina chinasi B (AKT) è quantificata dal western blot. Questo metodo fornisce un ottimo strumento per studiare i meccanismi che mediano l'insulino-resistenza nel tessuto adiposo.

Introduction

L'insulina è un ormone anabolizzante prodotto dalle cellule β delle isole pancreatiche e il regolatore chiave del metabolismo del glucosio e dei lipidi. Tra le sue numerose funzioni, l'insulina regola l'assorbimento del glucosio, la sintesi del glicogeno, la gluconeogenesi, la sintesi proteica, la lipogenesi e la lipolisi1. Il segnale molecolare iniziale dopo l'interazione dell'insulina con il suo recettore (IR) è l'attivazione dell'attività intrinseca della proteina chinasi tirosina di IR2, con conseguente autofosforilazione3 e successiva attivazione di una famiglia di proteine note come substrati del recettore dell'insulina (IRS), che si lega alle proteine adattatrici portando all'attivazione di una cascata di protein chinasi4 . L'insulina attiva due principali vie di segnalazione: fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K)-proteina chinasi B (AKT) e Ras-mitogen-activated protein chinasi (MAPK). Il primo costituisce un importante punto di diramazione o nodo 4,5 per l'attivazione di numerosi effettori a valle coinvolti in diverse funzioni fisiologiche, tra cui la regolazione dell'omeostasi del combustibile, mentre il secondo regola la crescita e la differenziazione cellulare 4,6. Le azioni dell'insulina dipendono in ultima analisi dal tipo di cellula e dal contesto fisiologico7.

Uno dei principali tessuti metabolici insulino-sensibili è il tessuto adiposo. Il tessuto adiposo bianco è il tipo di grasso più abbondante nell'uomo e nei roditori, distribuito all'interno del grasso sottocutaneo (tra la pelle e i muscoli) e del grasso viscerale (intorno agli organi nella cavità addominale). Dato il loro grande volume, gli adipociti o le cellule adipose sono il tipo di cellula più abbondante nel tessuto adiposo. Queste cellule adipose possono essere marroni / beige (termogeniche), rosa (nella ghiandola mammaria) e bianco 8,9. Gli adipociti bianchi mantengono le principali riserve energetiche nel corpo sotto forma di trigliceridi, un processo insulino-dipendente. L'insulina favorisce il trasporto del glucosio e la lipogenesi, mentre inibisce la lipolisi o la degradazione dei lipidi 7,10. Facilita anche la differenziazione dei preadipociti in adipociti - le cellule mature che immagazzinano il grasso11.

La resistenza all'insulina si verifica quando un livello normale di insulina produce una risposta biologica attenuata, con conseguente iperinsulinemia compensatoria12. La resistenza all'insulina è una condizione associata a sovrappeso e obesità5, che quando combinata porta al diabete di tipo 2 (T2D) e ad altre malattie metaboliche13. L'iperinsulinemia compensa la resistenza all'insulina nei tessuti periferici per mantenere normali livelli di glucosio nel sangue14. Tuttavia, l'eventuale perdita o esaurimento delle cellule β, insieme all'esacerbata resistenza all'insulina, porta a livelli elevati di glucosio nel sangue coerenti con T2D5. Pertanto, l'insulino-resistenza e l'iperinsulinemia possono contribuire allo sviluppo di malattie metaboliche derivate dall'obesità15. Inoltre, l'obesità può causare infiammazione locale cronica di basso grado promuovendo la resistenza all'insulina nel tessuto adiposo15,16,17. Inoltre, le alterazioni derivate dall'obesità nel tessuto adiposo, come la fibrosi, l'infiammazione e la riduzione dell'angiogenesi e dell'adipogenesi, portano a livelli sierici di adiponectina più bassi (un sensibilizzante dell'insulina) e ad un aumento della secrezione di fattori come l'inibitore dell'attivatore del plasminogeno 1 (PAI-1), acidi grassi liberi ed esosomi nel flusso sanguigno, esacerbando la resistenza all'insulina17.

Molti aspetti alla base della resistenza all'insulina rimangono sconosciuti. Sono stati sviluppati modelli in vitro e in vivo per studiare i meccanismi che mediano la resistenza all'insulina nei principali tessuti bersaglio, incluso il tessuto adiposo. Il vantaggio dei modelli in vitro è che i ricercatori hanno un maggiore controllo delle condizioni ambientali e possono valutare la resistenza all'insulina in specifici tipi di cellule. In particolare, le cellule precursori degli adipociti (APC) hanno il fenotipo individuale del tessuto donatore, che potrebbe riflettere meglio la fisiologia rispetto alle linee cellulari adipocitarie. Uno dei principali fattori che inducono insulino-resistenza in vitro è il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α). Il TNF-α è una citochina proinfiammatoria secreta dagli adipociti e dai macrofagi nel tessuto adiposo18. Mentre è necessario per il corretto rimodellamento ed espansione del tessuto adiposo19, l'esposizione a lungo termine al TNF-α induce insulino-resistenza nel tessuto adiposo in vivo e negli adipociti in vitro20. Il trattamento cronico con TNF-α di diversi tipi cellulari porta ad un aumento della fosforilazione della serina sia di IR che di IRS-1, promuovendo così una diminuzione della fosforilazione della tirosina21. L'aumento della fosforilazione di IRS-1 sui residui di serina inibisce l'attività della tirosin-chinasi IR e può essere uno dei meccanismi chiave attraverso i quali il trattamento cronico con TNF-α altera l'azione dell'insulina22,23. Il TNF-α attiva vie che coinvolgono l'inibitore della serina/treonina chinasi del fattore nucleare ĸB chinasi β (IKKβ) e della chinasi terminale c-Jun N (JNK)24. JNK induce un complesso programma trascrizionale proinfiammatorio ma fosforila direttamente IRS-16.

Comprendere la patogenesi dell'insulino-resistenza è diventato sempre più importante per guidare lo sviluppo di future terapie contro il T2D. Le APC hanno dimostrato di essere un modello eccellente per lo studio della biologia delle cellule adipose, compresa la sensibilità e la resistenza all'insulina, e per identificare le proprietà intrinseche degli adipociti indipendenti dall'ambiente sistemico. Le APC possono essere facilmente ottenute da diversi depositi adiposi e, nelle condizioni appropriate, differenziate in adipociti maturi. Con questo metodo, gli effetti diretti sulla resistenza/sensibilità all'insulina possono essere valutati negli adipociti.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sui roditori sono stati approvati dal Comitato di Bioetica dell'Istituto di Neurobiologia dell'UNAM, numero di protocollo 075.

1. Isolamento delle cellule precursori degli adipociti di topo

  1. Eutanasia di topi maschi C57BL/6 di 8-10 settimane (ad esempio, per inalazione di CO2 e successiva lussazione cervicale) (quattro animali per isolamento). Disinfettare i topi strofinando con etanolo al 70% e ottenere il tessuto adiposo subito dopo il sacrificio.
    NOTA: Dopo l'eutanasia dei roditori, isolare immediatamente il tessuto adiposo ed eseguire tutti i passaggi all'interno di una cappa a flusso laminare sterile. I topi sono tenuti sotto cicli luce/buio di 12 ore con libero accesso al cibo e all'acqua.
  2. Sezionare il tessuto adiposo sottocutaneo inguinale da ciascun topo. Rimuovere solo il tessuto adiposo, evitando la rimozione di muscoli, pelle o qualsiasi altro tessuto, e raccoglierlo in un tubo conico da 50 ml contenente 15 ml di soluzione di collagenasi di tipo 1 (1,5 mg / ml) su ghiaccio. Sciogliere la collagenasi di tipo 1 nella Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco ad alto glucosio-1% di albumina bovina (BSA) e filtrare attraverso filtri a siringa da 0,2 μm.
  3. Tagliare il tessuto adiposo in piccoli pezzi con forbici chirurgiche sterili e digerire i campioni mediante incubazione con soluzione di collagenasi di tipo 1 a 37 °C in uno shaker orbitale (150 rpm) per 30 minuti (posizionare il tubo contenente grasso e collagenasi in posizione orizzontale per una maggiore superficie di agitazione). Controllare la digestione ogni 10 minuti per assicurarsi che funzioni (la degradazione dei tessuti è visibile) e per prevenire la sovradigestione (vedere Figura supplementare S1).
  4. Filtrare utilizzando una siringa a rete da 200 μm (precedentemente autoclavata) per eliminare il tessuto non digerito con collagenasi. Passare il filtro sul bordo del tubo per drenare il maggior numero possibile di celle nella soluzione. Aggiungere 15 mL di DMEM-1% BSA freddo per interrompere la digestione e centrifugare a 400 × g per 10 minuti a 4 °C.
  5. Aspirare lo strato superiore contenente adipociti maturi e la maggior parte dello strato liquido; Evitare di toccare o disturbare il pellet. Aggiungere 20 ml di siero bovino fetale (FBS) tamponato con fosfato freddo (PBS)-2% e risospendere il pellet. Centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
  6. Rimuovere il surnatante, aspirando prima lo strato superiore per eliminare i rimanenti adipociti e grasso. Risospendere il pellet in 1 ml di tampone lisante di cloruro di ammonio potassio (ACK) (per lisare i globuli rossi) e incubare su ghiaccio per 5 minuti. Aggiungere 10 mL di PBS-2% FBS, miscelare e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
  7. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 200 μL di soluzione anti-Fc (CD16/CD32 purificato anti-topo di ratto diluito in PBS-2% FBS [1:150]) per ridurre il legame mediato dal recettore Fc da parte degli anticorpi di interesse. Incubare su ghiaccio per 5 min. Trasferire la sospensione della cella in un tubo da 5 mL che si inserisce nelle rack prerefrigerate di un separatore magnetico e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
  8. Eliminare il surnatante, aggiungere 200 μL della miscela di CD31(PECAM-1) anticorpo monoclonale (390)-biotina (1:100) e CD45 monoclonale anticorpo (30-F11)-biotina (1:100), mescolare bene e incubare su ghiaccio per 15 minuti (preparare diluizioni anticorpali in soluzione anti-Fc; vedere Tabella 1). Aggiungere 400 μL di PBS-2% FBS e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
    NOTA: CD31 e CD45 sono marcatori rispettivamente delle cellule endoteliali e delle cellule ematopoietiche.
  9. Aspirare il surnatante e incubare in 100 μL di microsfere anti-biotina (1:5) per 15 minuti su ghiaccio (preparare diluizioni anticorpali in soluzione anti-Fc, vedere Tabella 1). Aggiungere 400 μL di PBS-2% FBS e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
  10. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 350 μL di PBS-2% FBS. Rimuovere gli aggregati cellulari o le particelle di grandi dimensioni dalle sospensioni a cella singola con un filtro di preseparazione (70 μm). Innanzitutto, attivare il filtro con 100 μL di PBS-2% FBS, passare la sospensione cellulare attraverso il filtro (raccogliere in un tubo pulito) e infine lavare il filtro con 100 μL di PBS-2% FBS.
  11. Eseguire la separazione magnetica delle celle utilizzando la strategia di separazione negativa con un separatore di celle magnetico.
    1. Posizionare il campione nella posizione A del refrigeratore (assicurarsi che il rack sia preraffreddato) e due tubi vuoti in posizione B e C per recuperare rispettivamente le celle non marcate ed etichettate.
    2. Caricare il tampone di lavaggio e il buffer di funzionamento nelle bottiglie corrispondenti prima di accendere l'apparecchiatura. Programmare l'apparecchiatura per eseguire la separazione magnetica delle celle con il protocollo DEPLEME .
      NOTA: Questo protocollo è per l'esaurimento in modalità standard per la rimozione di cellule con espressione dell'antigene normale (in questo caso, cellule etichettate con anti-CD31 e anti-CD45), se il recupero è la massima priorità.
    3. Nella sezione di separazione, selezionare il numero di campioni da separare e selezionare il protocollo DEPLEME. Premere Esegui e avviare la separazione. Al termine del programma, recuperare le cellule non marcate e centrifugare a 400 × g per 5 minuti a 4 °C.
  12. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di terreno di coltura (Tabella 1).
  13. Seminare gli APC in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti precedentemente rivestita con una matrice di membrana basale al 2,5% (si ottengono circa 50.000-75.000 cellule). Aggiungere 400 μL di matrice a membrana basale al 2,5% per coprire l'intera superficie di ciascun pozzetto. Immediatamente dopo aver rimosso la soluzione in eccesso e aver lasciato solo un piccolo strato, lasciare asciugare la piastra (senza coperchio) all'interno della cappa a flusso laminare per almeno 1 ora. Incubare a 37 °C in atmosfera al 5% di CO2 . Cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza.
  14. All'80% di confluenza, rimuovere completamente il mezzo e lavare con 350 μL di PBS-2% FBS. Raccogliere le cellule con 350 μL di tripsina-EDTA allo 0,05% per 2 minuti a 37 °C. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura e raccogliere le cellule in un nuovo tubo conico da 50 ml, quindi centrifugare a 400 × g per 5 minuti.
  15. Far passare gli APC su piastre da 12 pozzetti (10.000-20.000 celle per pozzetto) precedentemente rivestite con matrice di membrana basale al 2,5%. Incubare a 37 °C con il 5% di CO2. Cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza.
    NOTA: gli APC possono essere passati una sola volta. Successivamente, perdono la loro capacità di proliferare e differenziarsi. Vedere il flusso di lavoro per il processo di isolamento degli APC nella figura supplementare S2.

2. Differenziazione degli adipociti e induzione dell'insulino-resistenza

NOTA: Mantenere le cellule a 37 °C in 5% di CO2 ed eseguire passaggi che comportano il cambiamento del terreno e trattamenti con TNF-α e insulina all'interno di una cappa sterile.

  1. All'80% di confluenza, inizia il processo di differenziazione; aspirare qualsiasi mezzo di crescita e sostituirlo con 500 μL di terreno di differenziazione (Tabella 1) contenente 3,3 nM di proteina morfogenetica ossea (BMP4) in ciascun pozzetto.
  2. Dopo 48 ore, sostituire il mezzo con il mezzo di differenziazione (500 μL per pozzetto) e il cocktail di differenziazione (Tabella 1).
  3. Rimuovere il terreno 72 ore dopo e aggiungere 100 nM di insulina in 500 μL di terreno di differenziazione fresco.
    NOTA: Le cellule iniziano a mostrare un aspetto rotondo con piccole goccioline lipidiche all'interno.
  4. Aspirare qualsiasi mezzo di differenziazione e sostituirlo con 500 μL di semplice mezzo 2% FBS (Tabella 1) 48 ore dopo. Indurre insulino-resistenza con 4 ng/ml di TNF-α. Includere pozzetti di controllo senza trattamento con TNF-α.
  5. Dopo 24 ore di incubazione, aggiungere 4 ng/mL di TNF-α in semplice medio-0% FBS (Tabella 1). Mantenere i pozzetti di controllo senza trattamento con TNF-α.
  6. Attivare la via di segnalazione dell'insulina 24 ore dopo aggiungendo insulina 100 nM e incubare per 15 minuti a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%. Rimuovere il mezzo e lavare con 500 μL di PBS. Includere pozzetti di controllo senza trattamento insulinico.

3. Valutazione della via di segnalazione dell'insulina mediante western blot

  1. Estrazione e quantificazione delle proteine
    1. Lavare ogni pozzetto di cellule con 500 μL di PBS e tenerlo in ghiaccio per lisare le cellule in 50 μL di tampone RIPA (Tabella 1) contenente cocktail di inibitori della proteasi all'1% aggiunti appena prima dell'isolamento del campione. Raschiare l'intera superficie del pozzetto con una punta e trasferire il lisato in una provetta da microcentrifuga da 0,6 mL (tenere in ghiaccio).
    2. Incubare per 1 ora a 4 °C in uno shaker rotante, mescolare a vortice e centrifugare a 8.000 × g per 15 minuti a 4 °C e recuperare il surnatante (mantenere in ghiaccio).
    3. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il saggio di Bradford (non diluire il campione per quantificare).
    4. Prelevare il volume necessario corrispondente a 40-60 μg e denaturare con 6x tampone Laemmli (Tabella 1) incubando a 97 °C per 15 minuti agitando a 550 giri/min. Congelare fino all'uso.
  2. Elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS
    1. Eseguire l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) con un gel di poliacrilammide al 7,5% di spessore 1,5 mm. Inserire il gel nel serbatoio e riempire con tampone corrente (Tabella 1).
    2. Aggiungere 3 μL di proteine standard prestained al primo pozzetto del gel e caricare ogni campione nei pozzetti successivi.
    3. Eseguire il gel a 80 V per circa 15 minuti per assicurarsi che il campione entri nella matrice del gel concentratore di poliacrilammide. Successivamente, aumentare la tensione a 90 V per 2,5 ore o fino a quando il marcatore di peso molecolare da 37 kDa può essere visto sul bordo inferiore del gel.
    4. Trasferire le proteine dal gel a una membrana di nitrocellulosa in una camera semi-asciutta per 35 minuti a 25 V. In precedenza, immergere il gel, la membrana e i filtri nel tampone di trasferimento (Tabella 1) per alcuni minuti.
  3. Macchia occidentale
    1. Dopo il trasferimento, lavare la membrana con soluzione salina tamponata Tris (TBS) contenente 0,1% Tween 20 (TBS-T 0,1%) (Tabella 1) per 3 minuti agitando a 30 giri / min.
    2. Bloccare la membrana con soluzione bloccante (Tabella 1) a 4 °C per 1 ora in rotazione costante.
    3. Tagliare la membrana in tre parti secondo il marcatore di peso molecolare per incubare durante la notte con diversi anticorpi primari (diluiti in soluzione bloccante) a 4 °C in rotazione costante: anticorpo Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1.000), banda prevista a 180 kDa; Recettore della fosfo-insulina β anticorpo (Tyr1150/1151) (1:1.000), banda prevista a 95 kDa; Anticorpo Phospho-Akt (Ser473) (1:1.000), banda prevista a 60 kDa.
    4. Lavare le membrane 5 volte per 5 minuti ciascuna con TBS-T 0,1%.
    5. Incubare le membrane con il corrispondente anticorpo secondario accoppiato alla perossidasi (diluito in soluzione bloccante) per 2 ore a temperatura ambiente in rotazione costante: perossidasi affiniPure donkey anti-rabbit IgG (H+L) (1:5.000).
    6. Lavare le membrane 5 volte per 5 minuti ciascuna con TBS-T 0,1%.
    7. Rilevare le proteine utilizzando il sistema di rilevamento a chemiluminescenza. Preparare il substrato secondo le istruzioni del produttore.
    8. Posizionare la macchia in un sacchetto di plastica e aggiungere 200 μL di substrato chemiluminescente per coprire completamente la membrana. Drenare il substrato in eccesso e rimuovere eventuali bolle d'aria.
    9. Esporre ogni macchia per 30-60 s in un sistema di imaging ad alte prestazioni compatibile con la chemiluminescenza.
    10. Spogliare le membrane (passaggi 10-13 della sezione western blot) per rompere le interazioni anticorpo-antigene e quindi consentire alle membrane nitrocellulosa di essere nuovamente cancellate. Recuperare le membrane e lavare 3 volte per 5 minuti ciascuna con TBS-T 1% a 50 giri/min.
    11. Incubare per 7 minuti con 10 ml di 0,2 M NaOH a 50 giri/min.
    12. Lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno con acqua di rubinetto a 50 giri / min.
    13. Lavare per 10 minuti con TBS-T 1% a 50 giri/min.
    14. Ripetere i passaggi 2-9 della sezione western blot per incubare la membrana con tubulina anti-beta (55 kDa) come controllo di carico utilizzando la diluizione 1:1.000.
    15. Eseguire l'analisi densitometrica25 per ogni proteina utilizzando il software ImageJ (https://imagej.nih.gov/).

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Representative Results

Negli ultimi anni, l'aumento della prevalenza di obesità e T2D ha stimolato un'intensa ricerca dei meccanismi che mediano l'insulino-resistenza nel tessuto adiposo. Con il protocollo qui descritto, le APC possono essere differenziate in adipociti maturi per valutare la resistenza e la sensibilità all'insulina. Una volta che le APC raggiungono la confluenza, ci vogliono 10 giorni per completare la loro differenziazione in adipociti maturi e la loro induzione di insulino-resistenza mediata da TNF-α (Figura 1).

Le APC mostrano una morfologia simile ai fibroblasti, caratterizzata dalla loro forma piatta e allungata e dalla loro adesione alla piastra completata 48 ore dopo la semina (Figura 2A). Le APC impiegano 2-5 giorni per raggiungere l'80% di confluenza (a seconda del numero di cellule seminate), un momento in cui il processo di differenziazione viene avviato dall'esposizione al cocktail differenziante (Figura 2A). Gli adipociti maturi iniziano ad apparire nei successivi 6-8 giorni. Gli adipociti differenziati sono caratterizzati da una morfologia rotonda e dall'accumulo intracellulare di goccioline lipidiche. Fino all'80% delle cellule sono differenziate alla fine del processo di differenziazione (Figura 2B).

L'insulino-resistenza è indotta negli adipociti primari mediante trattamento con TNF-α (4 ng/ml) per 48 ore; questa concentrazione di TNF-α non altera la vitalità cellulare (Figura supplementare S3). Successivamente, la via di segnalazione dell'insulina viene attivata aggiungendo insulina 100 nM per 15 minuti e la fosforilazione delle principali molecole di segnalazione (IR, IRS-1 e AKT) viene misurata dal western blot. L'insulina stimola la fosforilazione di queste tre molecole (Figura 3) rispetto agli adipociti differenziati di controllo non trattati. TNF-α riduce la fosforilazione indotta da insulina di IR (30%), IRS-1 (20%) e AKT (45%) (Figura 3). Le cellule insulino-resistenti mostrano meno attivazione della via di segnalazione dell'insulina rispetto alle cellule insulino-sensibili. Inoltre, il trattamento con TNF-α diminuisce l'espressione di mRNA di marcatori noti di insulino-sensibilità: Insr, Irs2, Glut4 e Adipoq (Figura supplementare S4). Questi risultati confermano che il TNF-α riduce l'azione dell'insulina negli adipociti primari e quindi induce insulino-resistenza.

Figure 1
Figura 1: Cronologia schematica che rappresenta il processo di differenziamento delle cellule precursori degli adipociti e l'induzione della resistenza all'insulina. Le APC sono isolate dal tessuto adiposo sottocutaneo utilizzando il trattamento con collagenasi e la tecnologia di separazione delle cellule magnetiche. Quindi, subiscono un processo di differenziazione di 7 giorni per ottenere adipociti primari. Successivamente, l'insulino-resistenza viene indotta con TNF-α per 48 ore, le prime 24 ore in mezzo contenente il 2% di FBS e le successive 24 ore con mezzo privo di siero per impedire l'attivazione della via di segnalazione dell'insulina. La cascata di segnalazione viene attivata con insulina e la proteina viene estratta per l'analisi western blot 10 giorni dopo l'inizio del processo di differenziazione per valutare la fosforilazione / attivazione di IR, IRS-1 e AKT. Abbreviazioni: APCs = cellule precursori degli adipociti; BMP4 = Proteina morfogenetica ossea; IBMX = 3-isobutil-1-metilxantina; TNF-α = fattore di necrosi tumorale-α; FBS = siero fetale bovino; IR = recettore dell'insulina; IRS = substrato del recettore dell'insulina; AKT = proteina chinasi B; Tx = trattamento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Morfologia delle cellule precursori degli adipociti e degli adipociti maturi . (A) APC sottocutanee all'80% di confluenza prima di indurre la differenziazione in piastre di coltura a 12 pozzetti. (B) Adipociti primari sottocutanei dopo 7 giorni dall'induzione della differenziazione in piastre di coltura a 12 pozzetti. Le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 10x. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazione: APCs = cellule precursori degli adipociti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Insulino-resistenza indotta da TNF-α negli adipociti primari sottocutanei dimostrata da una diminuzione della fosforilazione indotta da insulina di IR, IRS-1 e AKT. Gli adipociti sottocutanei sono stati trattati con TNF-α (4 ng/ml) per 48 ore e affamati di siero per le ultime 24 ore. Dopo la stimolazione con insulina (100 nM) per 15 minuti, 40 μg di proteine totali sono stati caricati su gel al 7,5% e sottoposti a SDS-PAGE, trasferiti su membrane di nitrocellulosa e bloccati nel 4% di latte scremato in TBS-T 0,1%. La membrana è stata sondata con IR antifosforilato (pIR), IRS-1 antifosforilato (pIRS-1) e AKT antifosforilato (pAKT), nonché con un anticorpo secondario HRP anti-coniglio. Il segnale è stato visualizzato con il rilevamento a chemiluminescenza e la tubulina anti-β è stata utilizzata come controllo del carico. (A) macchie rappresentative e (B) quantificazione da tre esperimenti indipendenti. I dati sono medi ± SEM; *, p < .05 rispetto al controllo. Abbreviazioni: TNF-α = fattore di necrosi tumorale-α; IR = recettore dell'insulina; IRS = substrato del recettore dell'insulina; pX = forma fosforilata di X; b-Tub = beta-tubulina; HRP = rafano perossidasi; Ctrl = controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Soluzione anti-Fc ratto purificato anti-topo CD16 / CD32 diluito in PBS–2% FBS [1:150]
TBS-T 0,1% 0,01 m Tris-HCl (pH 8), 0,15 m NaCl, 0,1% Tween 20
Soluzione di blocco 4% latte secco scremato diluito in TBS-T 0,1%
Terreno di crescita 60% DMEM basso glucosio, 40% MCDB 201 medio, 1x penicillina-streptomicina, 1 nM desametasone, 0,1 mM acido L-ascorbico 2-fosfato, 1x insulina, transferrina, sodio, selenito (ITS) liquido media supplemento, 1x acido linoleico-albumina da BSA, 10% FBS, 10 ng / mL fattore di crescita epidermico (EGF), 10 ng / mL fattore inibitorio della leucemia (LIF), 10 ng / mL fattore di crescita derivato dalle piastrine BB (PDGF-BB), 5 ng/mL fattore di crescita dei fibroblasti basico (bFGF) e 50 μg/mL normocin
Mezzo di differenziazione 60% DMEM a basso glucosio, 40% MCDB 201 medio, 1x penicillina-streptomicina, 1 nM desametasone, 0,1 mM acido L-ascorbico 2-fosfato, 1x integratore di media liquidi ITS, 1x acido linoleico-albumina da BSA e 2% FBS
Cocktail di differenziazione 0,5 μM di 3-isobutil-1-metilxantina [IBMX], 1 μM di desametasone, 10 μM di rosiglitazone e 100 nM di insulina
Medio semplice-2% FBS 60% DMEM a basso glucosio, 40% MCDB 201 medio, 1x penicillina-streptomicina e 2% FBS
Medio semplice–0% FBS 60% DMEM basso glucosio, 40% MCDB 201 medio, 1x penicillina-streptomicina
Buffer RIPA 50 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% ottilfenossi poli(etileneossi)etanolo, 1 mM Na3VO 4, 48,8 mM NaF, 8,2 mM Na4 P2O7 e 0,26 M saccarosio
6x buffer Laemmli 1,2 g SDS, 6 mg di blu di bromofenolo, 4,7 mL di glicerolo, 1,2 mL di Tris base 0,5 M pH 6,8, 845 μL 2- mercaptoetanolo e 2,1 mL di H2O
Buffer in esecuzione 25 mM Tris base, 192 mM glicina, 1% SDS
Buffer di trasferimento 25 mM Tris-base, 192 mM glicina, 20% metanolo

Tabella 1: Soluzioni utilizzate in questo protocollo.

Figura supplementare S1: Tessuto adiposo sottocutaneo digerito con collagenasi. Una volta rimosso il tessuto adiposo, viene tagliato in piccoli pezzi con le forbici per avviare il processo di digestione (A), quindi viene incubato per 30 minuti con collagenasi di tipo 1 a 37 ° C, 150 giri / min (B). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Schema del processo di isolamento delle cellule precursori degli adipociti. Sezionare il tessuto adiposo sottocutaneo inguinale e digerire i campioni con collagenasi. Eliminare gli adipociti maturi mediante centrifugazione e lavare il pellet per rimuovere il grasso in eccesso. Lisare i globuli rossi e bloccare per ridurre il legame non specifico. Etichettare le cellule endoteliali e i macrofagi con anticorpi accoppiati a particelle magnetiche. Eseguire la separazione magnetica delle celle utilizzando la strategia di separazione negativa con un separatore di celle magnetico. APC seme (cellule non etichettate) in piastre ricoperte da matrice di membrana basale. Cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza. Abbreviazioni: APCs = cellule precursori degli adipociti; BSA = albumina sierica bovina; FBS = siero fetale bovino. Creato con Biorender.com. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S3: Il trattamento con TNF-α per indurre insulino-resistenza non altera la vitalità degli adipociti. La vitalità degli adipociti maturi è stata misurata mediante il test MTT dopo il trattamento con 4 ng/ml di TNF-α per 48 ore. I dati sono medi ± SEM. Abbreviazioni: TNF-α = fattore di necrosi tumorale-α; Ctrl = controllo. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S4: Il trattamento con TNF-α negli adipociti diminuisce l'espressione dei marcatori di sensibilità all'insulina. L'espressione di mRNA di Insr, Irs, Glut4 e Adipoq è stata misurata mediante PCR in tempo reale dopo il trattamento con 4 ng/ml di TNF-α per 48 ore. I dati sono medi ± SEM; *, p < .05 rispetto al controllo. Abbreviazioni: TNF-α = fattore di necrosi tumorale-α; Ctrl = controllo. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Questo articolo fornisce un metodo per studiare la resistenza all'insulina che utilizza adipociti primari in coltura trattata con TNF-α. Questo modello ha il vantaggio che gli adipociti primari possono essere coltivati in condizioni definite per lunghi periodi di tempo con uno stretto controllo dei fattori ambientali cellulari26. La durata del test è di 15-20 giorni, anche se possono verificarsi variazioni nella percentuale di adipociti differenziati tra gli esperimenti. Gli adipociti primari hanno vantaggi rispetto alle linee cellulari poiché non sono stati continuamente espansi in coltura e catturano più da vicino la diversità del tessuto da cui derivano27. Inoltre, gli adipociti primari consentono di studiare i donatori in diversi contesti fisio-patologici, come magro contro obeso, maschio contro femmina, giovane contro anziano e cellule provenienti da diversi depositi di grasso. Un altro vantaggio di questo metodo è che le linee cellulari di topi CRE e knockout possono essere generate dopo l'isolamento degli APC.

Un possibile problema durante l'isolamento e la differenziazione delle APC è che queste cellule possono perdere la capacità di differenziarsi, cosa che probabilmente si verificherebbe quando la confluenza dell'80% viene superata all'inizio del processo di differenziazione. Il mezzo dovrebbe anche essere cambiato molto delicatamente, specialmente dopo l'accumulo di lipidi, poiché gli adipociti differenziati si staccano facilmente dal piatto di coltura. Inoltre, ogni lotto di collagenasi deve essere testato per l'efficienza della digestione, la resa cellulare e la citotossicità26. Sono state sviluppate tecniche per identificare e isolare le APC dalla frazione stromovascolare del tessuto adiposo bianco, utilizzando marcatori negativi come CD31 e CD45, nonché marcatori di popolazione di cellule staminali positive come CD34 e Sca128,29. In questo protocollo, eseguiamo solo una separazione negativa, eliminando le cellule endoteliali e i macrofagi dalla frazione stromovascolare, evitando così la perdita di preadipociti nella separazione positiva.

Sebbene le colture primarie consentano lo studio della variabilità e della complessità del donatore27,30, l'impostazione del modello sperimentale introduce dei limiti. Ad esempio, gli adipociti isolati da animali anziani avranno una minore capacità di differenziazione e un più alto tasso di lipotossicità rispetto a quelli provenienti da animali giovani31,32. Il protocollo potrebbe anche essere adattato per utilizzare diverse tecniche di separazione cellulare. Se non è disponibile un separatore di celle magnetico automatico, è possibile ottenere la separazione manuale delle celle con colonne o smistamento FACS. Il metodo qui descritto per l'isolamento degli APC utilizzando un separatore di celle magnetiche è una versione adattata e semplificata del protocollo di selezione FACS descritto da Macotela et al.28.

Diverse citochine infiammatorie sono state utilizzate per indurre insulino-resistenza nelle cellule adipose, tra cui TNF-α, IL-1β e IL-6 18,33,34,35,36. Gli adipociti 3T3-L1 in coltura esposti a TNF-α diventano insulino-resistenti entro alcuni giorni, come valutato dalla ridotta capacità dell'insulina di stimolare l'assorbimento del glucosio37. Questi risultati mostrano che il TNF-α diminuisce la fosforilazione indotta dall'insulina di IR, IRS-1 e AKT21,23, misurata dal rilevamento western blot della proteina totale estratta dagli adipociti primari. Tuttavia, le proteasi e le fosfatasi rilasciate durante la lisi cellulare potrebbero influenzare il rilevamento del western blot. Lo stato attivo delle proteine deve essere preservato mediante l'aggiunta di inibitori della proteasi e della fosfatasi al tampone di lisi e dopo la quantificazione delle proteine, miscelando il campione con tampone di Laemmli. In conclusione, questo metodo fornisce uno strumento utile per studiare i meccanismi che mediano l'insulino-resistenza negli adipociti differenziati dagli APC murini.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Ringraziamo Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla e María Antonieta Carbajo per la loro assistenza tecnica, e Jessica Gonzalez Norris per aver curato criticamente il manoscritto. Questo protocollo è stato sostenuto dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (to Y.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer  LONZA 10-548E
Anti-Biotin Microbeads  Miltenyi 130-090-485
Anti-CD31 eBioscience 13-0311-85
AutoMACS Pro Separator Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel) Corning 354234
bFGF Sigma F0291 Growth factor
BSA Equitech-Bio, Inc. BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin  eBioscience 13-0451-85
Collagenase, Type 1 Worthington Biochem LS004197
Dexamethasone Sigma D1756
DMEM GIBCO 12800017
DMEM low glucose GIBCO 31600-034
EGF Peprotech 315-09 Growth factor
FBS GIBCO 26140-079
ITS mix Sigma I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960
LIF Millipore ESG1107 Growth factor
Linoleic acid-albumin Sigma L9530
MCDB 201 medium Sigma M6770
Normocin InvivoGen ant-nr-2
PDGF-BB  Peprotech 315-18 Growth factor
Peniciline-Streptomycine BioWest L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm) Miltenyi 130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32  BD Pharmingen 553142
Trypsin-EDTA  GIBCO 25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] Sigma I5879 Differentiation cocktail
BMP4 R&D Systems 5020-BP-010 Differentiation cocktail
Dexamethasone Sigma D1756 Differentiation cocktail
Insulin Sigma I9278
Rosiglitazone Cayman 71742 Differentiation cocktail
TNFα R&D Systems 210-TA-005 
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody Abcam ab6046
Bromophenol blue BioRad 161-0404 Laemmli buffer
EDTA Sigma E5134 RIPA buffer
EGTA Sigma E4378 RIPA buffer
FluorChem E system ProteinSimple
Glycerol Sigma G6279 Laemmli buffer
Glycine Sigma G7126 Running and Transfer buffer
Igepal Sigma I3021 RIPA buffer
2- mercaptoethanol Sigma M3148 Laemmli buffer
Methanol JT Baker 907007 Transfer buffer
NaCl JT Baker 3624-05 TBS-T
NaF Sigma 77F-0379 RIPA buffer
NaOH  JT Baker 3722-19
Na4P2O7 Sigma 114F-0762 RIPA buffer
Na3VO4 Sigma S6508 RIPA buffer
Nitrocellulose membrane  BioRad 1620112
Nonfat dry milk BioRad 1706404 Blocking solution
Prestained protein standard  BioRad 1610395
Protease inhibitor cocktail  Sigma P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch 711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β  Cell signaling 3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody Cell signaling 9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody Millipore 9432
Saccharose  JT Baker 407205 RIPA buffer
SDS BioRad 1610302 Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34577
Tris-base Promega H5135 Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl JT Baker 4103-02 RIPA buffer - TBS
Tween 20 Sigma P1379 TBS-T

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References

  1. Elmus, G. B. Insulin signaling and insulin resistance. Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).
  2. Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system. Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).
  3. Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor. Science. 215 (4529), 185-187 (1982).
  4. Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).
  5. Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/ (2021).
  6. Petersen, M. C., Shulm, G. I. Mechanisms of insulin action and insulin resistance. Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).
  7. Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes. Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).
  8. Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , Academic Press. 370-384 (2019).
  9. Cinti, S. Pink adipocytes. Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).
  10. Kahn, B. B., Flier, J. S. Obesity and insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).
  11. Klemm, D. J., et al. Insulin-induced adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).
  12. Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).
  13. Yohannes, T. W. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).
  14. James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. The etiology and molecular landscape of insulin resistance. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).
  15. Wondmkun, Y. T. Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications. Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).
  16. Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. What causes the insulin resistance underlying obesity. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).
  17. Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. Why does obesity cause diabetes. Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).
  18. Lo, K., et al. Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance. Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).
  19. Asterholm, I. W., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  20. Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).
  21. Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
  22. Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).
  23. Hotamisligil, G. S., et al. IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science. 271 (5249), 665-668 (1996).
  24. Copps, K. D., White, M. F. Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2. Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).
  25. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  26. Skurk, T., Hauner, H. Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation. Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).
  27. Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).
  28. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  29. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  30. Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. The biology of white adipocyte proliferation. Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).
  31. Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD. Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).
  32. Guo, W., et al. Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).
  33. Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory. Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).
  34. Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
  35. Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects. The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).
  36. Isidor, M. S., et al. Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes. International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).
  37. Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).

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Biologia Numero 192 isolamento dei preadipociti grasso sottocutaneo azione dell'insulina TNF-α
Adipociti di topo differenziati in coltura primaria: un modello di insulino-resistenza
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Ruiz-Herrera, X., Luzardo-Ocampo, I., Martínez de la Escalera, G., Clapp, C., Macotela, Y. Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance. J. Vis. Exp. (192), e63979, doi:10.3791/63979 (2023).

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