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Biology

Adipocitos diferenciados de ratón en cultivo primario: un modelo de resistencia a la insulina

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/63979
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

Summary

Este protocolo describe el aislamiento de preadipocitos de ratón de la grasa subcutánea, su diferenciación en adipocitos maduros y la inducción de resistencia a la insulina. La acción de la insulina se evalúa mediante la fosforilación/activación de los miembros de la vía de señalización de la insulina a través del western blot. Este método permite la determinación directa de la resistencia/sensibilidad a la insulina en adipocitos primarios.

Abstract

La resistencia a la insulina es un efecto reducido de la insulina en sus células diana, generalmente derivado de la disminución de la señalización del receptor de insulina. La resistencia a la insulina contribuye al desarrollo de diabetes tipo 2 (DT2) y otras enfermedades derivadas de la obesidad de alta prevalencia en todo el mundo. Por lo tanto, comprender los mecanismos subyacentes a la resistencia a la insulina es de gran relevancia. Se han utilizado varios modelos para estudiar la resistencia a la insulina tanto in vivo como in vitro; Los adipocitos primarios representan una opción atractiva para estudiar los mecanismos de resistencia a la insulina e identificar moléculas que contrarresten esta condición y las dianas moleculares de los fármacos sensibilizantes a la insulina. Aquí, hemos establecido un modelo de resistencia a la insulina utilizando adipocitos primarios en cultivo tratados con factor de necrosis tumoral α (TNF-α).

Las células precursoras de adipocitos (APC), aisladas del tejido adiposo subcutáneo de ratón digerido por colagenasa mediante tecnología de separación celular magnética, se diferencian en adipocitos primarios. La resistencia a la insulina es inducida por el tratamiento con TNF-α, una citoquina proinflamatoria que reduce la fosforilación / activación de la tirosina de los miembros de la cascada de señalización de insulina. La disminución de la fosforilación del receptor de insulina (IR), el sustrato del receptor de insulina (IRS-1) y la proteína quinasa B (AKT) se cuantifican mediante Western blot. Este método proporciona una excelente herramienta para estudiar los mecanismos que median la resistencia a la insulina en el tejido adiposo.

Introduction

La insulina es una hormona anabólica producida por las células β de los islotes pancreáticos y el regulador clave del metabolismo de la glucosa y los lípidos. Entre sus múltiples funciones, la insulina regula la captación de glucosa, la síntesis de glucógeno, la gluconeogénesis, la síntesis de proteínas, la lipogénesis y la lipólisis1. La señal molecular inicial después de la interacción de la insulina con su receptor (IR) es la activación de la actividad intrínseca de la proteína tirosina quinasa de IR2, lo que resulta en su autofosforilación3 y la posterior activación de una familia de proteínas conocidas como sustratos receptores de insulina (IRS), que se une a proteínas adaptadoras que conducen a la activación de una cascada de proteínas quinasas4 . La insulina activa dos vías principales de señalización: fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K)-proteína quinasa B (AKT) y proteína quinasa activada por mitógenos Ras (MAPK). El primero constituye un importante punto de ramificación o nodo 4,5 para la activación de numerosos efectores aguas abajo implicados en diversas funciones fisiológicas, incluida la regulación de la homeostasis del combustible, mientras que el segundo regula el crecimiento y la diferenciación celular 4,6. Las acciones de la insulina dependen en última instancia del tipo de célula y del contexto fisiológico7.

Uno de los principales tejidos metabólicos sensibles a la insulina es el tejido adiposo. El tejido adiposo blanco es el tipo de grasa más abundante en humanos y roedores, distribuida dentro de la grasa subcutánea (entre la piel y los músculos) y la grasa visceral (alrededor de los órganos de la cavidad abdominal). Dado su gran volumen, los adipocitos o células grasas son el tipo de célula más abundante en el tejido adiposo. Estas células grasas pueden ser marrones/beige (termogénicas), rosadas (en la glándula mamaria) y blancas 8,9. Los adipocitos blancos mantienen las principales reservas de energía en el cuerpo en forma de triglicéridos, un proceso dependiente de la insulina. La insulina promueve el transporte de glucosa y la lipogénesis, mientras que inhibe la lipólisis o la descomposición lipídica 7,10. También facilita la diferenciación de los preadipocitos en adipocitos, las células maduras que almacenan grasa11.

La resistencia a la insulina ocurre cuando un nivel normal de insulina produce una respuesta biológica atenuada, resultando en hiperinsulinemia compensatoria12. La resistencia a la insulina es una condición asociada al sobrepeso y la obesidad5, que cuando se combina conduce a la diabetes tipo 2 (DT2) y otras enfermedades metabólicas13. La hiperinsulinemia compensa la resistencia a la insulina en los tejidos periféricos para mantener niveles normales de glucosa en sangre14. Sin embargo, la eventual pérdida o agotamiento de β células, junto con la resistencia exacerbada a la insulina, conduce a niveles elevados de glucosa en sangre consistentes con DT25. Por lo tanto, la resistencia a la insulina y la hiperinsulinemia pueden contribuir para el desarrollo de enfermedades metabólicas derivadas de la obesidad15. Además, la obesidad puede causar inflamación local crónica de bajo grado que promueve la resistencia a la insulina en el tejido adiposo15,16,17. Además, las alteraciones derivadas de la obesidad en el tejido adiposo, como la fibrosis, la inflamación y la reducción de la angiogénesis y la adipogénesis, conducen a niveles séricos más bajos de adiponectina (un sensibilizador a la insulina) y al aumento de la secreción de factores como el inhibidor del activador del plasminógeno 1 (PAI-1), ácidos grasos libres y exosomas en el torrente sanguíneo, exacerbando la resistencia a la insulina17.

Muchos aspectos subyacentes a la resistencia a la insulina siguen siendo desconocidos. Se han desarrollado modelos in vitro e in vivo para estudiar los mecanismos que median la resistencia a la insulina en los principales tejidos diana, incluido el tejido adiposo. La ventaja de los modelos in vitro es que los investigadores tienen más control de las condiciones ambientales y pueden evaluar la resistencia a la insulina en tipos específicos de células. En particular, las células precursoras de adipocitos (APC) tienen el fenotipo individual del tejido del donante, que podría reflejar la fisiología mejor que las líneas celulares de adipocitos. Un factor principal que induce la resistencia a la insulina in vitro es el factor de necrosis tumoral α (TNF-α). El TNF-α es una citocina proinflamatoria secretada por adipocitos y macrófagos en el tejido adiposo18. Si bien es necesario para la correcta remodelación y expansión del tejido adiposo19, la exposición a largo plazo al TNF-α induce resistencia a la insulina en el tejido adiposo in vivo y en los adipocitos in vitro20. El tratamiento crónico con TNF-α de varios tipos de células conduce a un aumento de la fosforilación de serina tanto de IR como de IRS-1, promoviendo así la disminución de la fosforilación de tirosina21. El aumento de la fosforilación de IRS-1 en los residuos de serina inhibe la actividad de la tirosina quinasa IR y puede ser uno de los mecanismos clave por los cuales el tratamiento crónico con TNF-α perjudica la acción de la insulina22,23. El TNF-α activa vías que involucran el inhibidor de la serina/treonina quinasa del factor nuclear ĸB quinasa β (IKKβ) y la quinasa terminal c-Jun N (JNK)24. JNK induce un complejo programa transcripcional proinflamatorio, pero también fosforila directamente IRS-16.

Comprender la patogénesis de la resistencia a la insulina se ha vuelto cada vez más importante para guiar el desarrollo de futuras terapias contra la DT2. Las APC han demostrado ser un excelente modelo para el estudio de la biología de las células grasas, incluida la sensibilidad y la resistencia a la insulina, y para identificar las propiedades intrínsecas de los adipocitos independientemente del entorno sistémico. Las APC pueden obtenerse fácilmente de diferentes depósitos adiposos y, en las condiciones adecuadas, diferenciarse en adipocitos maduros. Con este método, se pueden evaluar los efectos directos sobre la resistencia/sensibilidad a la insulina en los adipocitos.

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Protocol

Todos los experimentos con roedores fueron aprobados por el Comité de Bioética del Instituto de Neurobiología de la UNAM, protocolo número 075.

1. Aislamiento de células precursoras de adipocitos de ratón

  1. Eutanasia de ratones machos C57BL/6 de 8-10 semanas de edad (por ejemplo, por inhalación de CO2 y posterior luxación cervical) (cuatro animales por aislamiento). Desinfectar los ratones frotando con etanol al 70% y obtener el tejido adiposo inmediatamente después del sacrificio.
    NOTA: Después de la eutanasia de roedores, aísle el tejido adiposo inmediatamente y realice todos los pasos dentro de una campana de flujo laminar estéril. Los ratones se mantienen bajo ciclos de luz/oscuridad de 12 h con acceso gratuito a alimentos y agua.
  2. Diseccionar el tejido adiposo subcutáneo inguinal de cada ratón. Retire solo el tejido adiposo, evitando la eliminación de músculo, piel o cualquier otro tejido, y recójalo en un tubo cónico de 50 ml que contenga 15 ml de solución de colagenasa tipo 1 (1.5 mg / ml) en hielo. Disuelva la colagenasa tipo 1 en la albúmina sérica bovina (BSA) de alta glucosa Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco y filtre a través de filtros de jeringa de 0,2 μm.
  3. Cortar el tejido adiposo en trozos pequeños con tijeras quirúrgicas estériles y digerir las muestras por incubación con solución de colagenasa tipo 1 a 37 °C en un agitador orbital (150 rpm) durante 30 min (colocar el tubo que contiene grasa y colagenasa en posición horizontal para una mayor superficie de agitación). Compruebe la digestión cada 10 minutos para asegurarse de que funciona (la degradación del tejido es visible) y para evitar la sobredigestión (véase la figura suplementaria S1).
  4. Filtrar con una jeringa de malla de 200 μm (previamente esterilizada en autoclave) para eliminar el tejido no digerido con colagenasa. Pase el filtro sobre el borde del tubo para drenar tantas células como sea posible en la solución. Añadir 15 ml de DMEM-1% BSA frío para detener la digestión y centrifugar a 400 × g durante 10 min a 4 °C.
  5. Aspirar la capa superior que contiene adipocitos maduros y la mayor parte de la capa líquida; Evite tocar o molestar el pellet. Agregue 20 ml de suero bovino fetal tamponado con fosfato frío (PBS)-2% y vuelva a suspender el pellet. Centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
  6. Retire el sobrenadante, aspirando primero la capa superior para eliminar los adipocitos y la grasa restantes. Resuspender el pellet en 1 ml de tampón de lisado de cloruro de amonio potásico (ACK) (para lisar glóbulos rojos) e incubar en hielo durante 5 min. Añadir 10 ml de PBS-2% FBS, mezclar y centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
  7. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 μL de solución anti-Fc (rata purificada anti-ratón CD16/CD32 diluida en PBS-2% FBS [1:150]) para reducir la unión mediada por el receptor Fc por anticuerpos de interés. Incubar en hielo durante 5 min. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 5 ml que encaje en los bastidores preenfriados de un separador magnético de celdas y centrífuga a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
  8. Eliminar el sobrenadante, añadir 200 μL de la mezcla de CD31(PECAM-1) anticuerpo monoclonal (390)-biotina (1:100) y anticuerpo monoclonal CD45 (30-F11)-biotina (1:100), mezclar bien e incubar en hielo durante 15 min (preparar diluciones de anticuerpos en solución anti-Fc; ver Tabla 1). Añadir 400 μL de PBS-2% FBS y centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
    NOTA: CD31 y CD45 son marcadores de células endoteliales y células hematopoyéticas, respectivamente.
  9. Aspirar el sobrenadante e incubar en 100 μL de microperlas antibiotina (1:5) durante 15 min en hielo (preparar diluciones de anticuerpos en solución anti-Fc, ver Tabla 1). Añadir 400 μL de PBS-2% FBS y centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
  10. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 350 μL de PBS-2% FBS. Eliminar agregados celulares o partículas grandes de las suspensiones unicelulares con un filtro de preseparación (70 μm). Primero, active el filtro con 100 μL de PBS-2% FBS, pase la suspensión celular a través del filtro (recoja en un tubo limpio) y finalmente lave el filtro con 100 μL de PBS-2% FBS.
  11. Realice la separación magnética de las células utilizando la estrategia de separación negativa con un separador magnético de células.
    1. Coloque la muestra en la posición A de la rejilla frigorífica (asegúrese de que la rejilla esté preenfriada) y dos tubos vacíos en la posición B y C para recuperar las celdas no etiquetadas y etiquetadas, respectivamente.
    2. Cargue el tampón de lavado y el tampón de ejecución en las botellas correspondientes antes de encender el equipo. Programar el equipo para realizar la separación magnética de celdas con el protocolo DEPLETE .
      NOTA: Este protocolo es para el agotamiento en modo estándar para la eliminación de células con expresión normal de antígeno (en este caso, células marcadas con anti-CD31 y anti-CD45), si la recuperación es la prioridad más alta.
    3. En la sección de separación , seleccione el número de muestras que desea separar y seleccione el protocolo DEPLETE . Presione Ejecutar e inicie la separación. Al final del programa, recuperar las células no marcadas y centrifugar a 400 × g durante 5 min a 4 °C.
  12. Retirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 500 μL de medio de cultivo (Tabla 1).
  13. Sembrar los APC en un pocillo de una placa de 12 pocillos previamente recubierta con una matriz de membrana basal al 2,5% (se obtienen aproximadamente 50.000-75.000 células). Agregue 400 μL de matriz de membrana basal al 2,5% para cubrir toda la superficie de cada pozo. Inmediatamente después de retirar el exceso de solución y dejar solo una pequeña capa, deje secar la placa (sin tapa) dentro de la campana de flujo laminar durante al menos 1 h. Incubar a 37 °C en una atmósfera deCO2 al 5%. Cambiar el medio cada 48 h hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.
  14. Al 80% de confluencia, retirar el medio por completo y lavar con 350 μL de PBS-2% FBS. Cosechar las células con 350 μL de tripsina-EDTA al 0,05% durante 2 min a 37 °C. Agregue 2 ml de medio de crecimiento y recoja las células en un nuevo tubo cónico de 50 ml, luego centrifugar a 400 × g durante 5 min.
  15. Paso de los APC a placas de 12 pocillos (10.000-20.000 células por pozo) previamente recubiertas con una matriz de membrana basal al 2,5%. Incubar a 37 °C con 5% deCO2. Cambiar el medio cada 48 h hasta que las células alcancen el 80% de confluencia.
    NOTA: Los APC se pueden pasar una vez. Posteriormente, pierden su capacidad de proliferar y diferenciarse. Consulte el flujo de trabajo para el proceso de aislamiento de APC en la figura complementaria S2.

2. Diferenciación de adipocitos e inducción de resistencia a la insulina

NOTA: Mantener las células a 37 °C enCO2 al 5% y realizar pasos que impliquen cambio de medio y tratamientos con TNF-α e insulina dentro de una campana estéril.

  1. Al 80% de confluencia, comienza el proceso de diferenciación; aspirar cualquier medio de crecimiento y reemplazarlo con 500 μL de medio de diferenciación (Tabla 1) que contenga 3,3 nM de proteína morfogenética ósea (BMP4) en cada pocillo.
  2. Después de 48 h, reemplazar el medio con el medio de diferenciación (500 μL por pocillo) y el cóctel de diferenciación (Tabla 1).
  3. Retirar el medio 72 h más tarde y añadir 100 nM de insulina en 500 μL de medio de diferenciación fresco.
    NOTA: Las células comienzan a mostrar una apariencia redonda con pequeñas gotas de lípidos en el interior.
  4. Aspirar cualquier medio de diferenciación y reemplazarlo con 500 μL de medio simple-2% FBS (Tabla 1) 48 h después. Inducir resistencia a la insulina con 4 ng/mL de TNF-α. Incluir pozos de control sin tratamiento con TNF-α.
  5. Después de 24 h de incubación, agregar 4 ng/mL de TNF-α en FBS simple al 0% (Tabla 1). Mantener los pocillos de control sin tratamiento con TNF-α.
  6. Activar la vía de señalización de la insulina 24 h después añadiendo insulina 100 nM e incubar durante 15 min a 37 °C en una atmósfera deCO2 al 5%. Retirar el medio y lavar con 500 μL de PBS. Incluir pozos de control sin tratamiento con insulina.

3. Evaluación de la vía de señalización de la insulina por Western blot

  1. Extracción y cuantificación de proteínas
    1. Lave cada pocillo de células con 500 μL de PBS y manténgalo en hielo para lisar las células en 50 μL de tampón RIPA (Tabla 1) que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa al 1% agregado justo antes del aislamiento de la muestra. Raspa toda la superficie del pozo con una punta y transfiere el lisado a un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml (mantener en hielo).
    2. Incubar durante 1 h a 4 °C en una coctelera giratoria, mezclar por vórtice y centrifugar a 8.000 × g durante 15 min a 4 °C y recuperar el sobrenadante (mantener en hielo).
    3. Determine la concentración de proteína utilizando el ensayo de Bradford (no diluya la muestra para cuantificar).
    4. Tomar el volumen necesario correspondiente a 40-60 μg y desnaturalizar con 6x tampón Laemmli (Tabla 1) incubando a 97 °C durante 15 min mientras agita a 550 rpm. Congelar hasta su uso.
  2. Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS
    1. Realizar electroforesis en gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) con un gel de poliacrilamida al 7,5% de 1,5 mm de espesor. Inserte el gel en el tanque y llénelo con el tampón de corriente (Tabla 1).
    2. Agregue 3 μL de proteína estándar preteñida al primer pocillo del gel y cargue cada muestra en los pocillos posteriores.
    3. Ejecute el gel a 80 V durante aproximadamente 15 minutos para asegurarse de que la muestra entre en la matriz de gel del concentrador de poliacrilamida. A partir de entonces, aumente el voltaje a 90 V durante 2,5 h o hasta que se pueda ver el marcador de peso molecular de 37 kDa en el borde inferior del gel.
    4. Transfiera las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa en una cámara semiseca durante 35 minutos a 25 V. De antemano, sumerja el gel, la membrana y los filtros en el tampón de transferencia (Tabla 1) durante unos minutos.
  3. Western blot
    1. Después de la transferencia, lavar la membrana con solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene 0,1% de Tween 20 (TBS-T 0,1%) (Tabla 1) durante 3 min con agitación a 30 rpm.
    2. Bloquear la membrana con solución de bloqueo (Tabla 1) a 4 °C durante 1 h en rotación constante.
    3. Cortar la membrana en tres partes según el marcador de peso molecular para incubar durante la noche con diferentes anticuerpos primarios (diluidos en solución de bloqueo) a 4 °C en rotación constante: anticuerpo Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1.000), banda esperada a 180 kDa; Receptor de fosfoinsulina β (Tyr1150/1151) anticuerpo (1:1.000), banda esperada a 95 kDa; Anticuerpo Phospho-Akt (Ser473) (1:1.000), banda esperada a 60 kDa.
    4. Lave las membranas 5 veces durante 5 minutos cada una con TBS-T 0.1%.
    5. Incubar las membranas con el correspondiente anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa (diluido en solución de bloqueo) durante 2 h a temperatura ambiente en rotación constante: peroxidasa affiniPure burro anti-conejo IgG (H+L) (1:5.000).
    6. Lave las membranas 5 veces durante 5 minutos cada una con TBS-T 0.1%.
    7. Detectar las proteínas mediante el sistema de detección de quimioluminiscencia. Prepare el sustrato de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    8. Coloque la mancha en una bolsa de plástico y agregue 200 μL de sustrato quimioluminiscente para cubrir completamente la membrana. Drene el exceso de sustrato y elimine las burbujas de aire.
    9. Exponga cada mancha durante 30-60 s en un sistema de imágenes de alto rendimiento compatible con quimioluminiscencia.
    10. Pelar las membranas (pasos 10-13 de la sección Western blot) para romper las interacciones anticuerpo-antígeno y así permitir que las membranas de nitrocelulosa se vuelvan a borrar. Recuperar las membranas y lavar 3 veces durante 5 min cada una con TBS-T 1% a 50 rpm.
    11. Incubar durante 7 min con 10 mL de NaOH 0,2 M a 50 rpm.
    12. Lave 3 veces durante 5 minutos cada una con agua del grifo a 50 rpm.
    13. Lavar durante 10 min con TBS-T 1% a 50 rpm.
    14. Repita los pasos 2-9 de la sección Western blot para incubar la membrana con tubulina anti-beta (55 kDa) como control de carga utilizando dilución 1:1.000.
    15. Realice análisis densitométrico25 para cada proteína utilizando el software ImageJ (https://imagej.nih.gov/).

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Representative Results

En los últimos años, el aumento de la prevalencia de obesidad y DT2 ha impulsado una intensa búsqueda de los mecanismos que median la resistencia a la insulina en el tejido adiposo. Con el protocolo descrito aquí, las APC se pueden diferenciar en adipocitos maduros para evaluar la resistencia y sensibilidad a la insulina. Una vez que las APC alcanzan la confluencia, se necesitan 10 días para completar su diferenciación en adipocitos maduros y su inducción mediada por TNF-α de resistencia a la insulina (Figura 1).

Las APC muestran una morfología similar a los fibroblastos, caracterizada por su forma plana y alargada y su adhesión a la placa completada 48 h después de la siembra (Figura 2A). Las APC tardan de 2 a 5 días en alcanzar el 80% de confluencia (dependiendo del número de células sembradas), un momento en el que el proceso de diferenciación se inicia mediante la exposición al cóctel diferenciador (Figura 2A). Los adipocitos maduros comienzan a aparecer en los siguientes 6-8 días. Los adipocitos diferenciados se caracterizan por una morfología redonda y la acumulación intracelular de gotitas lipídicas. Hasta el 80% de las células se diferencian al final del proceso de diferenciación (Figura 2B).

La resistencia a la insulina se induce en los adipocitos primarios mediante el tratamiento con TNF-α (4 ng/mL) durante 48 h; esta concentración de TNF-α no altera la viabilidad celular (Figura Suplementaria S3). Posteriormente, la vía de señalización de la insulina se activa mediante la adición de insulina 100 nM durante 15 min, y la fosforilación de las moléculas de señalización principales (IR, IRS-1 y AKT) se mide mediante Western blot. La insulina estimula la fosforilación de estas tres moléculas (Figura 3) en comparación con los adipocitos diferenciados control, no tratados. El TNF-α reduce la fosforilación inducida por insulina de IR (30%), IRS-1 (20%) y AKT (45%) (Figura 3). Las células resistentes a la insulina muestran menos activación de la vía de señalización de la insulina en comparación con las células sensibles a la insulina. Además, el tratamiento con TNF-α disminuye la expresión de ARNm de marcadores conocidos de sensibilidad a la insulina: Insr, Irs2, Glut4 y Adipoq (Figura suplementaria S4). Estos hallazgos confirman que el TNF-α reduce la acción de la insulina en los adipocitos primarios y, por lo tanto, induce resistencia a la insulina.

Figure 1
Figura 1: Línea de tiempo esquemática que representa el proceso de diferenciación de células precursoras de adipocitos y la inducción de resistencia a la insulina. Las APC se aíslan del tejido adiposo subcutáneo utilizando el tratamiento con colagenasa y la tecnología de separación celular magnética. Luego, se someten a un proceso de diferenciación de 7 días para obtener adipocitos primarios. Posteriormente, se induce resistencia a la insulina con TNF-α durante 48 h, las primeras 24 h en medio que contiene 2% FBS y las siguientes 24 h con medio libre de suero para evitar la activación de la vía de señalización de insulina. La cascada de señalización se activa con insulina y la proteína se extrae para el análisis de Western blot 10 días después de iniciar el proceso de diferenciación para evaluar la fosforilación/activación de IR, IRS-1 y AKT. Abreviaturas: APCs = células precursoras de adipocitos; BMP4 = proteína morfogenética ósea; IBMX = 3-isobutil-1-metilxantina; TNF-α = factor de necrosis tumoral α; FBS = suero fetal bovino; IR = receptor de insulina; IRS = sustrato del receptor de insulina; AKT = proteína quinasa B; Tx = tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Morfología de células precursoras de adipocitos y adipocitos maduros . (A) APC subcutáneas con una confluencia del 80% antes de inducir la diferenciación en placas de cultivo de 12 pocillos. (B) Adipocitos primarios subcutáneos después de 7 días de inducir la diferenciación en placas de cultivo de 12 pocillos. Las imágenes fueron tomadas con un aumento de 10x. Barras de escala = 100 μm. Abreviatura: APCs = células precursoras de adipocitos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Resistencia a la insulina inducida por TNF-α en adipocitos primarios subcutáneos demostrada por la disminución de la fosforilación inducida por insulina de IR, IRS-1 y AKT. Los adipocitos subcutáneos fueron tratados con TNF-α (4 ng/mL) durante 48 h y carentes de suero durante las últimas 24 h. Después de la estimulación con insulina (100 nM) durante 15 min, 40 μg de proteína total se cargaron en geles al 7,5% y se sometieron a SDS-PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se bloquearon en leche descremada al 4% en TBS-T al 0,1%. La membrana se probó con IR antifosforilada (pIR), IRS-1 antifosforilada (pIRS-1) y AKT antifosforilada (pAKT), así como con un anticuerpo secundario HRP anticonejo. La señal se visualizó con detección de quimioluminiscencia y se utilizó tubulina anti-β como control de carga. (A) blots representativos y (B) cuantificación de tres experimentos independientes. Los datos son medias ± SEM; *, p < 0,05 versus control. Abreviaturas: TNF-α = factor de necrosis tumoral α; IR = receptor de insulina; IRS = sustrato del receptor de insulina; pX = forma fosforilada de X; b-Tub = beta-tubulina; HRP = peroxidasa de rábano picante; Ctrl = control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Solución Anti-Fc rata purificada anti-ratón CD16 / CD32 diluido en PBS–2% FBS [1:150]
TBS-T 0.1% 0,01 M Tris-HCl (pH 8), 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20
Solución de bloqueo 4% leche en polvo descremada diluida en TBS-T 0.1%
Medio de crecimiento 60% DMEM bajo glucosa, 40% MCDB 201 medio, 1x penicilina-estreptomicina, 1 nM dexametasona, 0.1 mM ácido L-ascórbico 2-fosfato, 1x insulina, transferrina, sodio, selenito (ITS) suplemento de medios líquidos, 1x ácido linoleico-albúmina de BSA, 10% FBS, 10 ng/ml factor de crecimiento epidérmico (EGF), 10 ng/ml factor inhibidor de la leucemia (LIF), 10 ng/ml factor de crecimiento derivado de plaquetas BB (PDGF-BB), 5 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) y 50 μg/ml de normocina
Medio de diferenciación 60% DMEM bajo en glucosa, 40% MCDB 201 medio, 1x penicilina-estreptomicina, 1 nM dexametasona, 0.1 mM de ácido L-ascórbico 2-fosfato, 1x suplemento de medios líquidos ITS, 1x ácido linoleico-albúmina de BSA y 2% FBS
Cóctel de diferenciación 0,5 μM 3-isobutil-1-metilxantina [IBMX], 1 μM dexametasona, 10 μM de rosiglitazona y 100 nM de insulina
Medio simple-2% FBS 60% DMEM bajo glucosa, 40% MCDB 201 medio, 1x penicilina-estreptomicina y 2% FBS
Medio simple: 0% FBS 60% DMEM bajo glucosa, 40% MCDB 201 medio, 1x penicilina-estreptomicina
Búfer RIPA 50 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% octilfenoxi poli(etilenooxi)etanol, 1 mM Na3VO 4, 48,8 mM NaF, 8,2 mM Na4 P2O7 y 0,26 M sacarosa
6x búfer Laemmli 1,2 g de SDS, 6 mg de azul de bromofenol, 4,7 ml de glicerol, 1,2 ml de Tris base 0,5 M pH 6,8, 845 μL de 2- mercaptoetanol y 2,1 ml deH2O
Ejecución del búfer 25 mM Tris base, 192 mM glicina, 1% SDS
Búfer de transferencia 25 mM Tris-base, 192 mM glicina, 20% metanol

Tabla 1: Soluciones utilizadas en este protocolo.

Figura Suplementaria S1: Tejido adiposo subcutáneo digerido con colagenasa. Una vez que se extrae el tejido adiposo, se corta en trozos pequeños con tijeras para iniciar el proceso de digestión (A), luego se incuba durante 30 min con colagenasa tipo 1 a 37 °C, 150 rpm (B). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S2: Esquema del proceso de aislamiento de células precursoras de adipocitos. Diseccionar el tejido adiposo subcutáneo inguinal y digerir las muestras con colagenasa. Eliminar los adipocitos maduros por centrifugación y lavar el pellet para eliminar el exceso de grasa. Lise los glóbulos rojos y bloquee para reducir la unión inespecífica. Etiquete las células endoteliales y los macrófagos con anticuerpos acoplados a partículas magnéticas. Realice la separación magnética de células utilizando la estrategia de separación negativa con un separador magnético de células. Semillas APC (células no marcadas) en placas cubiertas con matriz de membrana basal. Cambiar el medio cada 48 h hasta que las células alcancen el 80% de confluencia. Abreviaturas: APCs = células precursoras de adipocitos; BSA = albúmina sérica bovina; FBS = suero bovino fetal. Creado con Biorender.com. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S3: El tratamiento con TNF-α para inducir resistencia a la insulina no altera la viabilidad de los adipocitos. La viabilidad de los adipocitos maduros se midió mediante el ensayo MTT después del tratamiento con 4 ng/mL de TNF-α durante 48 h. Los datos son medias ± SEM. Abreviaturas: TNF-α = factor de necrosis tumoral α; Ctrl = control. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria S4: El tratamiento con TNF-α en adipocitos disminuye la expresión de marcadores de sensibilidad a la insulina. La expresión de ARNm de Insr, Irs, Glut4 y Adipoq se midió mediante PCR en tiempo real después del tratamiento con 4 ng / ml de TNF-α durante 48 h. Los datos son medias ± SEM; *, p < 0,05 versus control. Abreviaturas: TNF-α = factor de necrosis tumoral α; Ctrl = control. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Este artículo proporciona un método para estudiar la resistencia a la insulina que utiliza adipocitos primarios en cultivo tratado con TNF-α. Este modelo tiene la ventaja de que los adipocitos primarios pueden ser cultivados bajo condiciones definidas durante largos períodos de tiempo con un estricto control de los factores ambientales celulares26. La duración del ensayo es de 15-20 días, aunque pueden ocurrir variaciones en el porcentaje de adipocitos diferenciados entre experimentos. Los adipocitos primarios tienen ventajas sobre las líneas celulares, ya que no se han expandido continuamente en cultivo y capturan más de cerca la diversidad del tejido del que se derivan27. Además, los adipocitos primarios permiten estudiar a los donantes en diferentes contextos fisiopatológicos, como magros versus obesos, hombres versus mujeres, jóvenes versus viejos y células de diferentes depósitos de grasa. Otra ventaja de este método es que las líneas celulares de ratones CRE y knockout se pueden generar después del aislamiento de APC.

Un posible problema durante el aislamiento y diferenciación de APC es que estas células pueden perder la capacidad de diferenciarse, lo que probablemente ocurriría cuando se excede el 80% de confluencia al inicio del proceso de diferenciación. El medio también debe cambiarse muy suavemente, especialmente después de la acumulación de lípidos, ya que los adipocitos diferenciados se desprenden fácilmente de la placa de cultivo. Además, cada lote de colagenasa debe ser probado para la eficiencia de la digestión, el rendimiento celular y la citotoxicidad26. Se han desarrollado técnicas para identificar y aislar APCs de la fracción stromovascular del tejido adiposo blanco, utilizando marcadores negativos como CD31 y CD45, así como marcadores positivos de población de células madre como CD34 y Sca128,29. En este protocolo, solo realizamos una separación negativa, eliminando células endoteliales y macrófagos de la fracción estromobivascular, evitando así la pérdida de preadipocitos en la separación positiva.

Aunque los cultivos primarios permiten el estudio de la variabilidad y complejidad del donante27,30, el establecimiento del modelo experimental introduce limitaciones. Por ejemplo, los adipocitos aislados de animales viejos tendrán una menor capacidad de diferenciación y una mayor tasa de lipotoxicidad en comparación con los de animales jóvenes31,32. El protocolo también podría adaptarse para utilizar diferentes técnicas de separación celular. Si no se dispone de un separador magnético automático de células, se puede lograr la separación manual de las celdas con columnas o clasificación FACS. El método descrito aquí para el aislamiento de APC utilizando un separador magnético de células es una versión adaptada y simplificada del protocolo de clasificación FACS descrito por Macotela et al.28.

Se han utilizado varias citoquinas inflamatorias para inducir resistencia a la insulina en las células grasas, incluyendo TNF-α, IL-1β e IL-6 18,33,34,35,36. Los adipocitos 3T3-L1 cultivados expuestos al TNF-α se vuelven resistentes a la insulina en varios días, según lo evaluado por la capacidad reducida de la insulina para estimular la absorción de glucosa37. Estos resultados muestran que el TNF-α disminuye la fosforilación inducida por insulina de IR, IRS-1 y AKT21,23, medida por la detección de Western blot de proteína total extraída de adipocitos primarios. Sin embargo, las proteasas y fosfatasas liberadas durante la lisis celular podrían influir en la detección de Western blot. El estado activo de las proteínas debe preservarse mediante la adición de inhibidores de la proteasa y la fosfatasa al tampón de lisis y después de la cuantificación de proteínas, mezclando la muestra con tampón Laemmli. En conclusión, este método proporciona una herramienta útil para estudiar los mecanismos que median la resistencia a la insulina en adipocitos diferenciados de las APC de ratón.

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Disclosures

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos a Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla y María Antonieta Carbajo por su asistencia técnica, y a Jessica González Norris por editar críticamente el manuscrito. Este protocolo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (a Y.M.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells
ACK lysing buffer  LONZA 10-548E
Anti-Biotin Microbeads  Miltenyi 130-090-485
Anti-CD31 eBioscience 13-0311-85
AutoMACS Pro Separator Miltenyi
Basement membrane matrix (matrigel) Corning 354234
bFGF Sigma F0291 Growth factor
BSA Equitech-Bio, Inc. BAC63-1000
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin  eBioscience 13-0451-85
Collagenase, Type 1 Worthington Biochem LS004197
Dexamethasone Sigma D1756
DMEM GIBCO 12800017
DMEM low glucose GIBCO 31600-034
EGF Peprotech 315-09 Growth factor
FBS GIBCO 26140-079
ITS mix Sigma I3146
L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma A8960
LIF Millipore ESG1107 Growth factor
Linoleic acid-albumin Sigma L9530
MCDB 201 medium Sigma M6770
Normocin InvivoGen ant-nr-2
PDGF-BB  Peprotech 315-18 Growth factor
Peniciline-Streptomycine BioWest L0022-100
Pre-Separation Filters (70 µm) Miltenyi 130-095-823
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32  BD Pharmingen 553142
Trypsin-EDTA  GIBCO 25300062
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] Sigma I5879 Differentiation cocktail
BMP4 R&D Systems 5020-BP-010 Differentiation cocktail
Dexamethasone Sigma D1756 Differentiation cocktail
Insulin Sigma I9278
Rosiglitazone Cayman 71742 Differentiation cocktail
TNFα R&D Systems 210-TA-005 
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot
Anti-beta tubulin antibody Abcam ab6046
Bromophenol blue BioRad 161-0404 Laemmli buffer
EDTA Sigma E5134 RIPA buffer
EGTA Sigma E4378 RIPA buffer
FluorChem E system ProteinSimple
Glycerol Sigma G6279 Laemmli buffer
Glycine Sigma G7126 Running and Transfer buffer
Igepal Sigma I3021 RIPA buffer
2- mercaptoethanol Sigma M3148 Laemmli buffer
Methanol JT Baker 907007 Transfer buffer
NaCl JT Baker 3624-05 TBS-T
NaF Sigma 77F-0379 RIPA buffer
NaOH  JT Baker 3722-19
Na4P2O7 Sigma 114F-0762 RIPA buffer
Na3VO4 Sigma S6508 RIPA buffer
Nitrocellulose membrane  BioRad 1620112
Nonfat dry milk BioRad 1706404 Blocking solution
Prestained protein standard  BioRad 1610395
Protease inhibitor cocktail  Sigma P8340-5ML
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)  Jackson ImmunoResearch 711-035-132
Phospho- Insulin Receptor β  Cell signaling 3024
Phospho-Akt (Ser473) Antibody Cell signaling 9271
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody Millipore 9432
Saccharose  JT Baker 407205 RIPA buffer
SDS BioRad 1610302 Running and laemmli buffer
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34577
Tris-base Promega H5135 Running, transfer and laemmli buffer
Tris-HCl JT Baker 4103-02 RIPA buffer - TBS
Tween 20 Sigma P1379 TBS-T

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Adipocitos diferenciados de ratón en cultivo primario: un modelo de resistencia a la insulina
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Ruiz-Herrera, X., Luzardo-Ocampo, I., Martínez de la Escalera, G., Clapp, C., Macotela, Y. Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance. J. Vis. Exp. (192), e63979, doi:10.3791/63979 (2023).

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