Summary
מודלים ניתוחיים לבביים בעכברים בני >7 ימים דורשים אינטובציה, אך זה מאתגר עבור גורי עכברים טרום-אשפוזיים (בני 8-14 יום) ויש מעט מידע על משטרי הרדמה לאינטובציה. כאן אנו מציגים משטרי מינון של קטמין/קסילזין/אטרופין בגורי עכברים C57BL/6J בני 10 ימים המאפשרים אינטובציה אנדוטרכאלית, תוך מזעור תמותת בעלי חיים.
Abstract
מודלים כירורגיים של מורין ממלאים תפקיד חשוב במחקר פרה-קליני. תובנות מכניסטיות על התחדשות שריר הלב לאחר פגיעה לבבית ניתן לקבל ממודלים של ניתוחי לב-חזה בעכברים בני 0-14 יום, שהקרדיומיוציטים שלהם, בניגוד לאלה של מבוגרים, שומרים על יכולת הרבייה. גורי עכברים עד גיל 7 ימים משותקים ביעילות על ידי היפותרמיה ואינם דורשים אינטובציה לניתוח לב-חזה. גורי עכברים טרום-מתבגרים (בני 8-14 יום), לעומת זאת, דורשים אינטובציה, אך זה מאתגר ויש מעט מידע לגבי הרדמה כדי להקל על אינטובציה. כאן אנו מציגים משטרי מינון של קטמין/קסילזין/אטרופין בגורי עכברים C57BL/6J בני 10 ימים המאפשרים אינטובציה אנדוטרכאלית, תוך מזעור תמותת בעלי חיים. טיטרציה אמפירית של משטרי מינון קטמין/קסילזין/אטרופין למשקל הגוף הצביעה על כך שהתגובה להרדמה של גורי עכברים במשקלים שונים הייתה לא ליניארית, לפיה מינונים של 20/4/0.12 מ"ג/ק"ג, 30/4/0.12 מ"ג/ק"ג ו-50/6/0.18 מ"ג/ק"ג הקלו על אינטובציה של גורים במשקל שבין 3.15-4.49 גרם (n = 22), 4.50-5.49 גרם (n = 20), ו-5.50-8.10 גרם (n = 20), בהתאמה. גורים במשקל גוף נמוך יותר נזקקו ליותר ניסיונות אינטובציה מאשר גורים כבדים יותר (עמ' < 0.001). הישרדות לאחר אינטובציה מתואמת עם משקל הגוף (59%, 70% ו-80% עבור קבוצות משקל נמוך, בינוני וגבוה, בהתאמה, R2 = 0.995). עבור ניתוח אוטם שריר הלב לאחר אינטובציה, מישור כירורגי של הרדמה הושרה עם 4.5% איזופלורן ב 100% חמצן ונשמר עם 2% איזופלוראן ב 100% חמצן. ההישרדות לאחר הניתוח הייתה דומה עבור שלוש קבוצות המשקל עם 92%, 86% ו-88% (p = 0.91). יחד עם שיפורים בשיטות הטיפול בבעלי חיים עבור אינטובציה וניתוח, ומזעור קניבליזציה על ידי הסכר לאחר הניתוח, ההישרדות הכוללת של ההליך כולו (אינטובציה בתוספת ניתוח) מתואמת עם משקל הגוף (55%, 60% ו -70% עבור קבוצות משקל נמוך, בינוני וגבוה, בהתאמה, R2 = 0.978). לאור הקושי בו נתקלים באינטובציה של גורים בני 10 ימים והתמותה הגבוהה הנלווית לכך, אנו ממליצים להגביל ניתוחי לב-חזה בגורים בני 10 ימים לגורים במשקל של 5.5 גרם לפחות.
Introduction
מודלים של מורין הם כלים שלא יסולא בפז במחקר קרדיו-ריאה פרה-קליני, בפרט בגלל הקלות שבה ניתן ליצור קווי עכברים מהונדסים גנטית, וגם את הקלות שבה ניתן לתמרן את העכברים בניתוח כדי לספק מודלים של מחלות פתולוגיות כדי לאפשר, למשל, את המחקר של התחדשות שריר הלב לאחר פגיעה לבבית1 . בהקשר זה, מעניין שבניגוד לעכברים בוגרים שבהם קרדיומיוציטים נסוגו ממחזור התא, לבבות עכברים יילודים בני 0-2 ימים מתקנים עם הצטלקות מינימלית לאחר כריתה אפית או אינדוקציה של אוטם שריר הלב 2,3,4. לעומת זאת, לבבות ילודים בני 7 ימים מתחדשים באופן חלקי עם שכיחות גבוהה יותר של צלקות 2,3. מאחר שקרדיומיוציטים בקצה החדר השמאלי שומרים על יכולת ההתרבות עד שבועיים לאחר הלידה, מחקרים מכניסטיים של התחדשות לאחר פגיעה לבבית בעכברים בני 0-14 יום עשויים להיות אינפורמטיביים לזיהוי מטרות טיפוליות להתחדשות הלב הבוגר הפצוע5.
פיתוח מודלים של עכברים של פגיעה בלב כרוך מניפולציה כירורגית תחת הרדמה. זה דורש לפתוח את בית החזה כדי לגשת ללב, אשר בדרך כלל מחייב אינטובציה והנשמה מכנית. מאמץ העכבר, משקל הגוף והגיל משפיעים על הרגישות לחומרי הרדמה6. ניתן להרדים עכברים בוגרים עם מגוון רחב של חומרים, משטר נפוץ לאינטובציה הוא קטמין/קסילזין/אטרופין ב-100/13/0.5 מ"ג/ק"ג 6,7. עכברים ילודים (בני 0-7 ימים) חסרים רפלקס כאב מרכזי, וניתן לשתק אותם ביעילות על קרח ולעבור ניתוח ללא אינטובציה 6,8,9. לא ניתן להרדים גורי עכברים טרום-מתבגרים (בני 8-14 יום) עם היפותרמיה 9,10; הם דורשים אינטובציה לניתוח לב-חזה. אין מחקרים קודמים על ניתוחי לב-חזה בעכברים טרום-דורסניים בני פחות מ-14 יום. מניסיוננו, אינטובציה של עכברים טרום-מתבגרים שעברו הרדמה של איזופלורן מתחת לגיל 14 היא קשה. משטר ההרדמה המומלץ בהזרקה המדווח לעכברים מעל 7 ימים הוא 50-150 מ"ג/ק"ג קטמין ו-5-10 מ"ג/ק"ג קסילזין10. עכברים טרום-מתבגרים עדיין מתפתחים מבחינה נוירולוגית ותגובותיהם לתרופות ולמטבוליזם של תרופות שונות מאוד מחיות בוגרות6. זה מהווה סיכון מוגבר לחוסר איזון בנוזלים, אלקטרוליטים וחומצה-בסיס, כמו גם היפוגליקמיה והיפותרמיה בשל לא רק קצב חילוף החומרים הגבוה שלהם, אשר מרוקן במהירות את מאגרי האנרגיה המוגבלים שלהם, אלא גם בשל חוסר הבשלות התרמורגולטורית שלהם 6,11,12. לכן, יש מעט מידע על משטרי הרדמה כי הן להקל על אינטובציה למקסם את ההישרדות של עכברים preadolescent.
כאן תיקנו באופן אמפירי את משטרי המינון של קטמין/קסילזין/אטרופין בגורי עכברים C57BL/6J בני 10 ימים, שמשקלם נע בין 3-8 גרם כדי להשיג מישור הרדמה מספיק כדי לאפשר אינטובציה אנדוטרכאלית לניתוחי לב-חזה הבאים, תוך מזעור תמותת בעלי חיים. כמו כן, שיכללנו את שיטות הטיפול בבעלי חיים כדי להפחית את התמותה מאינטובציה, ניתוחים וקניבליזם אימהי לאחר ניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים גארוואן/סנט וינסנט בהתאם לקוד הנוהג האוסטרלי לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות ולהנחיות ARRIVE, וכל הניסויים בוצעו על ידי מנתח מנוסה בבעלי חיים קטנים (JW) בהנחיית מרדים ילדים (JJS).
1. הכנת מכשירים
- ביום הניתוח, הגדירו ציוד מיוחד לאינטובציה של גורים בני 10 ימים (איור 1A,B). זה כולל מנורת חימום, פלטפורמת אינטובציה, אור סיבים אופטיים, מלקחיים קטנים, לרינגוסקופ מעוצב מתוך חתיכת חוט נחושת בקוטר 0.02 מ"מ (60 מ"מ אורך עם קצה החוט מעוצב למעגל בקוטר 3 מ"מ בזווית של 175 מעלות; איור 1B), וצינורית פלסטיק תוך-ורידית (i.v.) בעלת 24 מדים, המשמשת כצינור אנדו-טרכאלי.
- ודא שהצינורית מורכבת מצינורות פלסטיק באורך 19 מ"מ (0.7 מ"מ OD) המחוברים למתאם מנעול לואר נשי מפלסטיק בקוטר 21 מ"מ (איור 1B). הקשיחו את צינורות הצינורית על ידי החדרת פיסת חוט נחושת דרך מתאם מנעול הלואר. השתמש בצינורית עם נפח כולל של 130 μL עבור עכבר עם נפח גאות של ~ 8 μL / g13,14.
2. הרדמה של עכברים בני 10 ימים
- ביום הניתוח, הוציאו את הסכר מכלוב של גורי C57BL/6J בני 10 ימים והניחו את הכלוב על כרית חימום (37 מעלות צלזיוס).
- הרדמת גורים בהזרקה תוך-פריטוניאלית של 10 מיקרו-ליטר לגרם משקל גוף באמצעות מזרק אינסולין של 0.5 מ"ל ומחט של 29 גרם עם קטמין/קסילזין/אטרופין ביחסים המפורטים בטבלה 1 לקבוצות משקל שונות.
- מיד לאחר ההזרקה, הכניסו את הגור לתא פרספקס מחומם (37 מעלות צלזיוס) שחומצן מראש ב-100% חמצן.
3. אינטובציה של עכברים בני 10 ימים
- לאחר 3-4 דקות של חמצון, העבירו את הגור לפלטפורמה לאינטובציה בעצם כמו לעכברים בוגרים. בצעו זאת כשהגור נמצא במצב שכיבה (איור 1C) או תלוי בזוויתשל 45° 15. שמרו על טמפרטורה בעזרת מנורת חימום.
- לפני אינטובציה, להעריך את עומק ההרדמה על ידי רפלקס קמצוץ הכפה. עבור אינטובציה אופטימלית, רפלקס כיווץ כפות עדיין חייב להיות נוכח אך מופחת במידה ניכרת מזה של בעל חיים מודע.
- לאחר שהצמידו את הגור המרדים לפלטפורמת אינטובציה (איור 1C), החזיקו את הלשון עם מלקחיים קטנים והשתמשו בגרון שנוצר מתוך פיסת חוט נחושת (איור 1B) כדי לחשוף את הגלוטיס ואת מיתרי הקול. סייעו בהדמיה של מיתרי הקול על-ידי הארה טרנס-תאורה עם אור גמיש בסיבים אופטיים (איור 1D).
- בעזרת צינורית נוקשה, הטה את הצינורית כך שקצה הנעילה של הלואר יהיה מעט נמוך יותר (~10°) מהקצה, וברגע שמיתרי הקול נפרדים, הכנס את הצינורית וקדם אותה עד שמתאם הנעילה של Luer יהיה ממש מחוץ לפה. הסר את החוט מיד לאחר אינטובציה.
הערה: לא צפויה התנגדות במהלך אינטובציה בעכברים בגיל זה, אלא אם כן הצינורית מתקדמת רחוק מדי, וההתנגדות מורגשת מהקארינה.- להעריך את עומק ההרדמה לאחר אינטובציה על ידי היכולת של החיה לנשום באופן ספונטני. אשר אינטובציה מוצלחת של קנה הנשימה של גורים נושמים באופן ספונטני על ידי חסימה קצרה של קטטר האינטובציה כדי לבדוק שזה מונע תנועה בחזה.
- העבירו מיד את הגור המושרה למשטח חימום (37 מעלות צלזיוס) וחברו את הצינורית האנדוטרכאלית למכונת הנשמה המספקת 100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה עם 30 מיקרול/שבץ, 40 מיקרול/שבץ, או 50 מיקרול/שבץ עבור 3.15-4.59 גרם, 4.50-5.49 גרם, או 5.50-8.10 גרם גורים, בהתאמה, ו-150 פעימות לדקה.
- בצע הליכים אלה במהירות, תוך <15 שניות כדי למזער את הנשימה מחדש.
4. ניתוח אוטם שריר הלב של עכברים בני 10 ימים
- כדי לגרום למישור ניתוחי של הרדמה לניתוח, החליפו את הגז הזורם למכונת ההנשמה מ-100% חמצן ל-4.5% איזופלוראן בחמצן (ריכוז האיזופלוראן נקבע על ידי מכשיר אידוי) למשך 4-5 דקות.
- לאחר המעבר לאיזופלוראן, אשר שוב אינטובציה בקנה הנשימה על ידי בדיקה כי תדירות תנועת דופן בית החזה שווה לזו של מכונת ההנשמה. אובדן נשימה ספונטנית ואחריו היעדר רפלקס זנב או כפה מצביע על כך שהגיע מישור כירורגי של הרדמה (לאחר 4-5 דקות).
- לשמור על הרדמה עם 2% isoflurane בחמצן.
- לבצע ניתוח אוטם שריר הלב תחת מיקרוסקופ כירורגי (10x ו 16x אובייקטיבי) כמתואר ב16.
- יש לחטא את העור בתנועה מעגלית מספר פעמים עם סיבובים מתחלפים של פילינג על בסיס יוד או על בסיס כלורהקסידין ו-70% אלכוהול. באמצעות מספריים עדינים, לעשות חתך עור אופקי בין הצלע השלישית והרביעית (שטח intercostal הרביעי) בקיר הצדדי השמאלי של החזה. באמצעות מלקחיים עדינים, לפתוח את בית החזה על ידי דיסקציה קהה של החלל intercostal ולהשתמש retractor כדי לשמור על החלל פתוח.
- לגרום אוטם שריר הלב על ידי קשירת העורק הכלילי השמאלי רק דיסטלי לתוספת פרוזדורים שמאלית עם 9-0 פוליפרופילן מונופילמנט תפר. לאחר ניתוח אוטם ~ 10 דקות, לסגור את העור עם 7-0 פרולן ולחטא את החתך עם betadine. נקו את הגור מדם עם 70% אתנול או מלוחים.
הערה: קשירת העורק הכלילי השמאלי בגורים טרום-מתבגרים היא למעשה חסרת דם, כפי שהיא עם קשירת בוגרים. - מתן אחד אחרי השני עם מזרק אינסולין 0.5 מ"ל ומחט 29 גרם: atipamezole (1-5 מ"ג / ק"ג, 10 μL, intraperitoneal) להתאוששות מהירה מהרגעה, משכך כאבים (buprenorphine, 0.075 מ"ג / ק"ג, 10 μL, תת עורית), ומלוח (50 μL, intraperitoneal).
- אפשרו לבעלי חיים להתאושש על ידי הפסקת האיזופלורן. הקפידו על חידוש הנשימה הספונטנית תוך מספר דקות לאחר מכן.
- החזירו את הגור לתא המחומצן שחומם ועקבו ברציפות במהלך ההתאוששות עד להחזרתו של רפלקס הימין, ואז מוציאים את הגור.
- שפשפו בעדינות את הגור במצעי הכלוב הביתיים, שמרו על חום גופו, בדקו שהנשימה סדירה ושהגור מסוגל לתנועה ספונטנית. זה יפחית את הקניבליזם שלאחר הניתוח על ידי הסכר.
- החזירו את הסכר לכלוב כאשר כל הגורים התאוששו לחלוטין מההרדמה.
הערה: הזמן הכולל שלוקח להכנה, הרדמה, אינטובציה, ניתוח והתאוששות של גור אחד יכול לנוע בין 40-60 דקות. - סכר הבית וגורים לילה בכלוב ממוקם חצי על / חצי על כרית חימום 37 מעלות צלזיוס.
5. הערכה לאחר הניתוח של גודל אוטם
- ביום השלישי שלאחר הניתוח, מרדימים גורים על ידי הכנסתם לתא פרספקס טרום שיווי משקל עם 4.5% איזופלוראן בחמצן בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה.
- לאחר שהגיע מישור ניתוחי של הרדמה (לאחר 4-5 דקות), המוערך על ידי רפלקס כיווץ הכפה, הסר את הגור מהתא והובטח במצב שכיבה על כרית חימום על ידי הקשה על הזנב.
- הניחו חוט מעל החותכות והטייפ למקומו כדי לשמור על הראש מורחב והכניסו את הראש לתוך חרוט אף המחובר למכונת הנשמה המספקת 4.5% איזופלוראן בחמצן ב-200 μL/stroke, 150 משיכות לדקה. לשמור על מישור כירורגי של הרדמה עם 2% isoflurane בחמצן.
- לחטא את העור עם 70% אתנול. באמצעות מספריים עדינים, לבצע חתך של 1 ס"מ בעור מעל עורק הצוואר המשותף הימני לאורך קנה הנשימה ולתמרן את כלי הדם החשוף באמצעות צינור פוליאתילן לומן יחיד (OD 0.61 מ"מ, ID 0.28 מ"מ) כדי לתת 0.2 מ"ל של מלוחים heparinized (200 U) במשך 1 דקות כדי למנוע קרישת דם.
- הגדל את isoflurane ל 4.5% בחמצן במשך דקה אחת לפני מתן במהירות 0.2 מ"ל של 3.3 M KCl בתוך 2 שניות כדי לעצור את הלב בדיאסטולה.
- נתחו את הווריד הג'וגולרי הימני דרך אותו חתך והעבירו אותו. יש להעשיר את הלב ב-0.2 מ"ל של תמיסת מלח חצוצת פוספט (PBS), ולאחר מכן להזליף עם 0.1 מ"ל של 0.2% כחול אלקסיאני כדי להכתים את שריר הלב המרוחק שאינו אוטם. בדוק זילוף מוצלח, עדות על ידי שטיפה של דם, PBS, ולאחר מכן כחול Alcian דרך הווריד jugular.
- פתח את בית החזה וכרת את הלב על ידי ניתוח רקמת החיבור וכלי הדם שמסביב כדי לשחרר את הלב. שטפו את הלב ב-PBS, הסירו את האטריה אם תרצו, וצלמו את הלב עם מצלמה המותקנת על מיקרוסקופ כירורגי באמצעות מטרה של פי 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הרדמה של עכברים בני 10 ימים. ניתן להרדים את הגורים בני 10 הימים עם 4.5% איזופלוראן תוך 4-5 דקות; עם זאת, הם מתאוששים מהרדמה בתהליך ההכנה לאינטובציה. בשל גודלם הקטן, אינטובציה תחת הרדמה איזופלורן המועברת על ידי חרוט אף סטנדרטי אינה אפשרית. השתמשנו בעבר במשטר הרדמה של קטמין/קסילזין/אטרופין של 100/13/0.5 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, לניתוחי לב-חזה בגורים בני 15 ו-21 יום ובמבוגריםבני 4,7. בניסויים ראשוניים, שכללו תוספת חמצן, נמצא כי משטר ההזרקה המומלץ של 50-150 מ"ג/ק"ג קטמין ו-5-10 מ"ג/ק"ג קסילזין 10 הביא לתמותה בלתי מתקבלת על הדעת אצל גורים בני10 ימים. בהינתן המתאם ההופכי בין משקל הגוף לגודל המלטה של גורים בני 10 ימים (R2 = 0.250, p < 0.0001; איור 2), תיקרנו את משטר ההרדמה לפי קבוצות משקל הגוף. הפחתת מינון הקטמין/קסילזין/אטרופין ל-50/6/0.18 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, הביאה לעומק מספיק של הרדמה כדי לאפשר אינטובציה אנדוטרכאלית של גורים נושמים באופן ספונטני במשקל 5.5-8.10 גרם (טבלה 1), אך מינון זה לא נסבל על ידי גורים קלים יותר. הפחתת מינון הקטמין/קסילזין/אטרופין ל-30/4/0.12 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, אפשרה אינטובציה של גורים במשקל 4.50-5.49 גרם, תוך הפחתה נוספת של מינון הקטמין ל-20 מ"ג/ק"ג אפשרה אינטובציה של גורים במשקל 3.15-4.49 גרם (טבלה 1). טבלה 1 מציגה את המספר והאחוז של הגורים המושרשים שהמשיכו לניתוח; עם זאת, קשה לחלץ מנתונים אלה תמותה הקשורה להרדמה מתמותה הקשורה ליותר מדי ניסיונות אינטובציה. למען צמצום בזבוז בעלי חיים, לא התייחסנו באופן ספציפי לתמותה הקשורה להרדמה.
אינטובציה של עכברים בני 10 ימים. התוצאות היו הטובות ביותר כאשר אינטובציה הושגה לאחר ניסיון אחד או שניים בלבד. גורים עם משקל גוף נמוך יותר היו קשים יותר לאינטובציה מאשר גורים כבדים יותר ודרשו יותר ניסיונות (p < 0.001; טבלה 1). הישרדות לאחר אינטובציה בקורלציה עם משקל גוף עם 59%, 70% ו-80% הישרדות עבור קבוצות במשקל נמוך, בינוני וגבוה, בהתאמה (R2 = 0.995, p = 0.04; טבלה 1).
ניתוח אוטם שריר הלב של עכברים בני 10 ימים. הגורים היו במעקב במשך יומיים לאחר הניתוח. לא היו סימנים לכאבים לאחר הניתוח. מבין הגורים שלא שרדו למעקב בשעה 48 שעות (טבלה 1), אחד מהקבוצה במשקל נמוך מת 6 שעות לאחר הניתוח, גור אחד מכל אחת מקבוצות המשקל הבינוני והגבוה מת לפני שהוכנס בחזרה עם הסכר, וגור אחד מכל אחת מקבוצות המשקל הבינוני והגבוה עבר קניבליזציה על ידי הסכר תוך 16 שעות מהניתוח, עם חלקי גוף קטנים או כלום שנותר למחרת בבוקר. ההישרדות יומיים לאחר ניתוח אוטם שריר הלב הייתה עקבית בין קבוצות המשקל השונות ב-86%-92% (p = 0.91; טבלה 1). שריר הלב האוטם, כפי שהוערך יומיים לאחר הניתוח על-ידי זלוף אלקי-כחול של הלב, ניכר על-ידי תיחום ברור של רקמה איסכמית (לא מוכתמת) מוכתמת, שאינה אוטמת (כחולה), דיסטלית לקשירת (איור 1E).
ההישרדות הכוללת של ההליך כולו (אינטובציה פלוס ניתוח) נמצאה בקורלציה עם משקל גוף של גור של 55%, 60% ו-70% עבור קבוצות במשקל נמוך, בינוני וגבוה, בהתאמה (R2 = 0.978, טבלה 1), אם כי מתאם זה לא השיג מובהקות סטטיסטית (p = 0.09).
איור 1: אינטובציה אנדוטרכאלית של גור עכברים C57BL/6J בן 10 ימים. (A) מערך אינטובציה המציג מנורת חימום גדולה (WL), פלטפורמת אינטובציה (IP) ותאורת סיבים אופטיים גמישה (FL) המשמשת לסיוע בהדמיה של מיתרי הקול בזמן האינטובציה. (B) מלקחיים, לרינגוסקופ, צינורית בעלת 24 מדים המשמשת כצינור אנדוטרכאלי, ופיסת חוט נחושת המוחדרת לצינור האנדוטרכאלי דרך מתאם מנעול הלואר כדי להקשיח את הצינורית במהלך אינטובציה (סרגל קשקשים = 1 ס"מ). (C) הגור המרדים מאובטח בשכיבה על ידי הדבקת הזנב והגפיים הקדמיות על פלטפורמת האינטובציה (12 ס"מ (L) x 8.5 ס"מ (W) x 7.5 ס"מ (גובה)). חוט המונח מעל החותכות משמש להארכת הראש ומודבק במקומו. (D) אור הסיב האופטי ממוקם מעל הצוואר כדי להאיר את קנה הנשימה ממש מתחת למיתרי הקול. הלשון מוחזקת עם מלקחיים קטנים, ולאחר מכן התנועה של מיתרי הקול הוא דמיינו על ידי חשיפת glottis עם הלרינגוסקופ. הצינור האנדוטרכאלי מוכנס לקנה הנשימה בזמן שמיתרי הקול פתוחים. (E) תצלום של לב גור עכברים ייצוגי עם כחול אלקסיאני (מבט חזיתי עם בסיס הלב בחלק העליון והקודקוד בתחתית, ואטריה הוסרה) 48 שעות לאחר קשירה (תפר שחור, חץ שחור) של העורק הכלילי השמאלי שצולם תחת מיקרוסקופ כירורגי (10x מטרה) המותקן עם מצלמה. שריר הלב שאינו אוטם מוכתם בכחול, שריר הלב האוטם בנקודת השיא אינו מוכתם וחיוור; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. נתון זה שונהמ-17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: משקל הגוף של גורי C57BL/6 בני 10 ימים נמצא בקורלציה הפוכה עם גודל המלטה. הגורים היו מהמלטות בגודל של 4-10. גודל ההמלטה הממוצע של C57BL/6 הוא שבעה18. הנתונים נותחו על ידי רגרסיה ליניארית פשוטה, כאשר p < 0.05 נחשב משמעותי. נתון זה שונהמ-17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| משטר הרדמה: קטמין / קסילזין / אטרופין (מ"ג / ק"ג); נתון במשקל גוף של 10 מ"ל/גרם, ip | משקל גוף, g | מספר הגורים שנחקרו | ניסיונות אינטובציה (A, 1-2; B, 3-4 או C, >4) ומספר הגורים המונפשים, n (%) | גורים מונשמים הממשיכים לניתוח, n (%) | הישרדות יומיים לאחר הניתוח, n (%) | הישרדות כללית לאחר אינטובציה בתוספת ניתוח, n (%) | ||
| A | B | C | ||||||
| 20/4/0.12 | 3.15 - 4.49 | 22 | 8 (36) | 9 (41) | 5 (23) | 13 (59) | 12 (92) | 12 (55) |
| 30/4/0.12 | 4.50 - 5.49 | 20 | 13 (65) | 5 (25) | 2 (10) | 14 (70) | 12 (86) | 12 (60) |
| 50/6/0.18 | 5.50 - 7.30 | 20 | 13 (65) | 3 (15) | 4 (20) | 16 (80) | 14 (88) | 14 (70) |
| p (מבחן צ'י-ריבוע) | פ<0.001 | p=0.91 | ||||||
| R2 (מקדם מתאם, | 0.995, | 0.978, | ||||||
| ערך p) | p=0.04 | p=0.09 | ||||||
טבלה 1: משטר הרדמה, מספר ניסיונות אינטובציה והישרדות לאחר ההליך של גורי עכברים בני 10 ימים. הנתונים נותחו על ידי מבחן צ'י בריבוע, כאשר p < 0.05 נחשב משמעותי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נכון לעכשיו, אין שיטות מתועדות היטב להרדמה ואינטובציה של עכברים בני 10 ימים לניתוחי לב-חזה. לשם כך, ביצענו משטרי מינון קטמין/קסילזין/אטרופין למשקל הגוף, לפיהם מינונים של 20/4/0.12 מ"ג/ק"ג, 30/4/0.12 מ"ג/ק"ג ו-50/6/0.18 מ"ג/ק"ג הקלו על אינטובציה של גורים עם משקל גוף נמוך (3.15-4.49 גרם), בינוני (4.50-5.49 גרם) וגבוה (5.50-8.10 גרם), בהתאמה. הישרדות לאחר אינטובציה מתואמת עם משקל הגוף (59%, 70% ו-80% לקבוצות בעלות משקל נמוך, בינוני וגבוה, בהתאמה). בהתחשב בקושי שנתקלים באינטובציה של גורים בני 10 ימים והתמותה הגבוהה הנלווית לכך, אנו ממליצים להגביל ניתוחי לב-חזה בגורים בני 10 ימים לבעלי חיים במשקל של לפחות 5.50 גרם. מגבלה של טכניקת אינטובציה זו היא שהיא תלויה במיומנות ובניסיון של המפעיל, ובאיזו מהירות הם יכולים ללמוד. עם זאת, צפוי כי מפעיל מנוסה באינטובציות בוגרות יכול להשיג מיומנות באינטובציה טרום-מתבגרת לאחר תרגול על 10 המלטות של שבעה עד שמונה גורים. מגבלה נוספת היא שהישרדות הגורים הכוללת לאחר אינטובציה וניתוח אוטם שריר הלב נעה בין 55% (קבוצת משקל הגוף הנמוכה ביותר) ל-70% (קבוצת משקל הגוף הגבוהה ביותר). עם זאת, זה דומה להישרדות של 60%-70% שדווחה עבור גורים בני יום אחד, שאינם דורשים אינטובציה כאשר הם נתונים לאוטם שריר הלב לאחר אימוביליזציה על קרח8.
מצאנו שלגורי עכברים בני 10 ימים במשקלים שונים הייתה תגובה לא ליניארית למשטר ההרדמה של קטמין/קסילזין/אטרופין. זה עשוי לשקף את ההבדלים ההתפתחותיים במספר תחומים חשובים. קצב חילוף החומרים הבסיסי משתנה באופן אלומטרי לכוח של שלושה רבעים של מסה, מתאים בודדים ליונקים19. זה ישפיע על נטיית הסמים בבעלי החיים במחקר, שמשקלם השתנה פי שניים וחצי. הבשלות של חילוף החומרים של תרופות או מנגנוני ניקוי רעלים היא גורם נוסף שמשתנה במהירות בתקופה המיידית שלאחר הלידה, כמו גם מנגנונים המשפיעים על זמינות תרופות חופשיות, כגון קשירת חלבון20. הבדלים פרמקוקינטיים עשויים שלא להיות ההסבר היחיד ליחסי השפעה לא ליניאריים על תרופות, שכן הבדלים בתגובות פרמקודינמיות לתרופות הרגעה אפשריים גם6. השימוש בחמצון לאחר הזרקה תוך צפקית של חומרי הרדמה ולפני אינטובציה ככל הנראה שיפר את בטיחות ההליך, כפי שצוין לאחרונה למבוגרים21. התאמות נוספות במינון, במיוחד עבור קבוצת משקל הגוף הנמוכה ביותר, עשויות לשפר את ההישרדות.
עומק ההרדמה היה קריטי לאינטובציה מוצלחת. אינטובציה הייתה קשה אם מישור ההרדמה היה קל מדי, ואם עמוק מדי, גורים הפסיקו לנשום באופן ספונטני, או במהלך אינטובציה או לאחר אינטובציה תוך כדי הנשמה עם חמצן. טיפול בגורים גם גרם לעיתים לעצירת נשימה, במיוחד במהלך אינטובציה. אם הנשימה נעצרה במהלך אינטובציה, גירוי של כף הרגל או הזנב, או החזרת גורים לחדר מלא חמצן מחומם, היה קריטי כדי להחזיר את הנשימה סדירה. אינטובציה נוסתה מחדש כאשר הגור חזר לנשום באופן סדיר. אם הנשימה נעצרה לאחר אינטובציה, בעלי החיים היו מאווררים עד 10 דקות עם חמצן. אם הנשימה הספונטנית התחדשה בתקופה זו, בעלי החיים המשיכו לניתוח. עם זאת, מצאנו שאם הנשימה הספונטנית לא שוחזרה תוך פרק זמן זה, הגורים לא התאוששו מההרדמה או, אם עברו ניתוח, מתו במהלך תקופת ההחלמה.
בהתחשב בקצב חילוף החומרים הגבוה של גורים בני 10 ימים, עדיף להגביל את הידלדלות מאגרי האנרגיה על ידי הפרדת הסכר מהגורים שלו לזמן קצר ככל האפשר, ובכך להגביל את מספר הפעולות הכירורגיות לארבעה או חמישה גורים להמלטה ליום במשך תקופה מקסימלית של 5-6 שעות. כדי להפחית את הקניבליזם האימהי של גורים שעברו ניתוח, כל חברי המלטה שלא עברו ניתוח הוסרו לאמהות אומנה או נלכדו לפני החזרת הסכר לכלוב. שיטות הטיפול שלנו להפחתת התמותה מקניבליזם אימהי לאחר ניתוח היו דומות לאלה שדווחו עבור יילודים9.
לסיכום, מחקר ההיתכנות שלנו מצביע על כך שמשטר הרדמה של קטמין/קסילזין/אטרופין בהזרקה נמוך משמעותית מזה המשמש לעכברים מבוגרים יותר נדרש כדי למזער את התמותה מאינטובציה של גורי עכברים בני 10 ימים לניתוחי לב-חזה הבאים, כמו גם שיטות טיפול ספציפיות להפחתת התמותה מאינטובציה, ניתוחים וקניבליזם אימהי לאחר ניתוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק תוכנית NHMRC [ID 1074386], מענק רשת טרנס-אטלנטית של מצוינות במחקר לב וכלי דם [RMG], ומענק מקרן RT Hall [RMG & SEI].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole (Antisedan) | Provet (NSW) Pty Ltd | ATIP I | |
| Atropine 600 mcg/mL | Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd | 1957699 PFIZER-0143386 | |
| Betadine | Livingstone International | BU0520 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Provet (NSW) Pty Ltd | TEMG I | |
| Fiber-optic light | Leica | 3011350 | CLS 150X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 9.1.2 | |
| Intubation platform | - | - | Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H) |
| Isoflurane | Provet (NSW) Pty Ltd | ISOF 07 | |
| Ketamine 100 mg/mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | |
| Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety | BD Insyte | CE0086 | 19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL |
| Single lumen polyethylene tube | Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW | Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm | |
| Small forceps | F.S.T. | NO 11051-10 | |
| Surgical microscope (camera optional) | Leica | M651 (Leica IC80 HD camera) | 10x and 16x objective |
| Suture 7-0 prolene | Ethicon | 8708H | |
| Suture 9-0 polypropylene monofilament | Ethicon | 2813 | |
| V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm | VetEquip | 901820 | |
| Vented 2-Liter plexiglass induction chamber | VetQuip Pty Ltd | 942102 | 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H) |
| Warming lamp | Brilant Lighting | 99223 | |
| Xylazine | Provet (NSW) Pty Ltd | XYLA Z 2 |
References
- Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovascular Research. 74 (1), 29-38 (2007).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Bogush, N., et al. DUSP5 expression in left ventricular cardiomyocytes of young hearts regulates thyroid hormone (T3)-induced proliferative ERK1/2 signaling. Scientific Reports. 10 (1), 21918 (2020).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. Third edition. , Elsevier Inc. (2009).
- Iismaa, S. E., et al. Cardiac hypertrophy limits infarct expansion after myocardial infarction in mice. Scientific Reports. 8 (1), 6114 (2018).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Boston University Institutional Animal Care and Use Committee. Anesthesia and Analgesia: Neonatal Mice and Rats. , Available from: https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/anesthesia/anesthesia-and-analgesia-neonatal-mice-and-rats-iacuc/ (2019).
- University of Texas at Austin Animal Resources Center. Mouse-Specific Anesthesia Guidance. , Available from: https://research.utexas.edu/qpcontent/uploads/sites/7/2020/02/Mouse_Anesthesia_guidance_ARC_112519.pdf (2019).
- Paddleford, R. Manual of Small Animal Anaesthesia. Second edition. , Masson. (2000).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Daubenspeck, J. A., Li, A., Nattie, E. E. Acoustic plethysmography measures breathing in unrestrained neonatal mice. Journal of Applied Physiology. 104 (1), 262-268 (2008).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visulaized Experiments. (90), e51755 (2014).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Du, X. -J., Gao, X., Ramsey, D. Surgical methods of inducing transverse aortic stenosis and myocardial infarction in the mouse. Asia Pacific Heart Journal. 7 (3), 187-192 (1998).
- Wu, J., et al. Anesthesia and intubation of 10-Day old C57BL/6J mouse pups for cardiothoracic surgery. Research Square. , (2021).
- Silver, L. M. Mouse Genetics: Concepts and Applications. Mouse Genome Informatics, The Jackson Laboratory. , (2008).
- West, G. B., Woodruff, W. H., Brown, J. H. Allometric scaling of metabolic rate from molecules and mitochondria to cells and mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 1 2473-2478 (2002).
- Moscovitz, J. E., Aleksunes, L. M. Establishment of metabolism and transport pathways in the rodent and human fetal liver. International Journal of Molecular Science. 14 (12), 23801-23827 (2013).
- Blevins, C. E., Celeste, N. A., Marx, J. O. Effects of oxygen supplementation on injectable and inhalant anesthesia in C57BL/6 mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 60 (3), 289-297 (2021).
