Summary
I modelli chirurgici cardiotoracici nei topi di età >7 giorni richiedono l'intubazione, ma questo è difficile per i cuccioli di topo preadolescenti (8-14 giorni) e ci sono poche informazioni sui regimi anestetici per l'intubazione. Qui, presentiamo regimi di dosaggio di ketamina / xilazina / atropina in cuccioli di topo C57BL / 6J di 10 giorni che consentono l'intubazione endotracheale, riducendo al minimo la mortalità animale.
Abstract
I modelli chirurgici murini svolgono un ruolo importante nella ricerca preclinica. Approfondimenti meccanicistici sulla rigenerazione miocardica dopo danno cardiaco possono essere ottenuti da modelli di chirurgia cardiotoracica in topi di 0-14 giorni, i cui cardiomiociti, a differenza di quelli degli adulti, mantengono la capacità proliferativa. I cuccioli di topo fino a 7 giorni sono efficacemente immobilizzati dall'ipotermia e non richiedono l'intubazione per la chirurgia cardiotoracica. I cuccioli di topo preadolescenti (8-14 giorni), tuttavia, richiedono l'intubazione, ma questo è impegnativo e ci sono poche informazioni sull'anestesia per facilitare l'intubazione. Qui, presentiamo regimi di dosaggio di ketamina / xilazina / atropina in cuccioli di topo C57BL / 6J di 10 giorni che consentono l'intubazione endotracheale, riducendo al minimo la mortalità animale. La titolazione empirica dei regimi di dosaggio di ketamina/xilazina/atropina al peso corporeo ha indicato che la risposta all'anestesia di cuccioli di topo di peso diverso era non lineare, per cui dosi di 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg e 50/6/0,18 mg/kg hanno facilitato l'intubazione di cuccioli di peso compreso tra 3,15-4,49 g (n = 22), 4,50-5,49 g (n = 20) e 5,50-8,10 g (n = 20), rispettivamente. I cuccioli con peso corporeo inferiore richiedevano più tentativi di intubazione rispetto ai cuccioli più pesanti (p < 0,001). La sopravvivenza post-intubazione è correlata al peso corporeo (59%, 70% e 80% per i gruppi di basso, medio e alto peso, rispettivamente, R2 = 0,995). Per la chirurgia dell'infarto miocardico dopo l'intubazione, è stato indotto un piano chirurgico di anestesia con isoflurano al 4,5% in ossigeno al 100% e mantenuto con isoflurano al 2% in ossigeno al 100%. La sopravvivenza post-operatoria è stata simile per i tre gruppi di peso al 92%, 86% e 88% (p = 0,91). Insieme ai perfezionamenti nelle pratiche di manipolazione degli animali per l'intubazione e la chirurgia, e riducendo al minimo la cannibalizzazione da parte della madre post-operatoria, la sopravvivenza globale per l'intera procedura (intubazione più chirurgia) è correlata al peso corporeo (55%, 60% e 70% per i gruppi di basso, medio e alto peso, rispettivamente, R2 = 0,978). Data la difficoltà incontrata con l'intubazione di cuccioli di 10 giorni e l'elevata mortalità associata, raccomandiamo che la chirurgia cardiotoracica nei cuccioli di 10 giorni sia limitata ai cuccioli di peso di almeno 5,5 g.
Introduction
I modelli murini sono strumenti preziosi nella ricerca cardiotoracica preclinica, in particolare per la facilità con cui possono essere generate linee di topo geneticamente modificate, e anche la facilità con cui i topi possono essere manipolati chirurgicamente per fornire modelli patologici di malattia per consentire, ad esempio, lo studio della rigenerazione miocardica dopo lesione cardiaca1 . A questo proposito, è interessante che, a differenza dei topi adulti in cui i cardiomiociti si sono ritirati dal ciclo cellulare, i cuori di topo neonatale di 0-2 giorni si riparano con cicatrici minime dopo resezione apicale o induzione di infarto miocardico 2,3,4. Al contrario, i cuori neonatali di 7 giorni si rigenerano in modo incompleto con una maggiore incidenza di cicatrici 2,3. Poiché i cardiomiociti all'apice del ventricolo sinistro mantengono la capacità proliferativa fino a 2 settimane dopo la nascita, gli studi meccanicistici sulla rigenerazione dopo lesione cardiaca nei topi di 0-14 giorni possono essere informativi per identificare obiettivi terapeutici per la rigenerazione del cuore adulto danneggiato5.
Lo sviluppo di modelli murini di lesioni cardiache comporta la manipolazione chirurgica in anestesia. Ciò richiede che il torace sia aperto per accedere al cuore, che generalmente richiede l'intubazione e la ventilazione meccanica. Lo sforzo del topo, il peso corporeo e l'età influenzano la sensibilità agli anestetici6. I topi adulti possono essere anestetizzati con una vasta gamma di agenti, un regime comune per l'intubazione è chetamina/xilazina/atropina a 100/13/0,5 mg/kg 6,7. I topi neonatali (0-7 giorni) mancano di un riflesso del dolore centralizzato e possono essere efficacemente immobilizzati sul ghiaccio e sottoposti a chirurgia senza intubazione 6,8,9. I cuccioli di topo preadolescenti (8-14 giorni) non possono essere anestetizzati con ipotermia 9,10; Richiedono l'intubazione per la chirurgia cardiotoracica. Non ci sono studi precedenti sulla chirurgia cardiotoracica in topi preadolescenti di età inferiore a 14 giorni. Nella nostra esperienza, l'intubazione di topi preadolescenti anestetizzati con isoflurano sotto i 14 giorni di età è difficile. Il regime anestetico iniettabile raccomandato riportato per i topi di età superiore ai 7 giorni è 50-150 mg/kg di ketamina e 5-10 mg/kg di xilazina10. I topi preadolescenti sono ancora in via di sviluppo neurologicamente e le loro risposte ai farmaci e al metabolismo dei farmaci sono molto diverse dagli animali adulti6. Ciò comporta un aumento del rischio di squilibrio di liquidi, elettroliti e acido-base, nonché ipoglicemia e ipotermia a causa non solo del loro alto tasso metabolico, che esaurisce rapidamente le loro limitate riserve di energia, ma anche a causa della loro immaturità termoregolatrice 6,11,12. Pertanto, ci sono poche informazioni sui regimi anestetici che facilitano l'intubazione e massimizzano la sopravvivenza dei topi preadolescenti.
Qui abbiamo titolato empiricamente regimi di dosaggio di ketamina / xilazina / atropina in cuccioli di topo C57BL / 6J di 10 giorni di peso compreso tra 3-8 g per ottenere un piano di anestesia sufficiente a consentire l'intubazione endotracheale per la successiva chirurgia cardiotoracica, riducendo al minimo la mortalità animale. Abbiamo anche perfezionato le pratiche di gestione degli animali per ridurre la mortalità da intubazione, chirurgia e cannibalismo materno post-chirurgico.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal Garvan/St Vincent's Hospital Animal Ethics Committee in conformità con il Codice di condotta australiano per la cura e l'uso di animali per scopi scientifici e le linee guida ARRIVE, e tutti gli esperimenti sono stati eseguiti da un chirurgo esperto di piccoli animali (JW) con la guida di un anestesista pediatrico (JJS).
1. Preparazione degli strumenti
- Il giorno dell'intervento, installare attrezzature specializzate per l'intubazione di cuccioli di 10 giorni (Figura 1A, B). Ciò include una lampada riscaldante, una piattaforma di intubazione, luce a fibre ottiche, piccole pinze, un laringoscopio ricavato da un pezzo di filo di rame di 0,02 mm di diametro (60 mm di lunghezza con l'estremità del filo modellata in un cerchio di 3 mm di diametro con un angolo di 175°; Figura 1B) e una cannula endovenosa di plastica (e.v.) calibro 24, che viene utilizzata come tubo endotracheale.
- Assicurarsi che la cannula sia costituita da un tubo di plastica lungo 19 mm (OD 0,7 mm) collegato a un adattatore luer lock femmina di plastica da 21 mm (Figura 1B). Irrigidire il tubo della cannula inserendo un pezzo di filo di rame tramite l'adattatore luer lock. Utilizzare una cannula con un volume totale di 130 μL per un topo con volume corrente di ~8 μL/g13,14.
2. Anestesia di topi di 10 giorni
- Il giorno dell'intervento, rimuovere la diga da una gabbia di cuccioli C57BL/6J di 10 giorni e posizionare la gabbia su una piastra riscaldante (37 °C).
- Anestetizzare i cuccioli di 10 μL per g di iniezione intraperitoneale di peso corporeo utilizzando una siringa da insulina da 0,5 ml e un ago da 29 G con ketamina/xilazina/atropina nei rapporti dettagliati nella Tabella 1 per diversi gruppi di peso.
- Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare il cucciolo in una camera di plexiglass riscaldata (37 °C) pre-ossigenata con ossigeno al 100%.
3. Intubazione di topi di 10 giorni
- Dopo 3-4 minuti di ossigenazione, trasferire il cucciolo su una piattaforma per l'intubazione essenzialmente come per i topi adulti. Eseguire questa operazione con il cucciolo in posizione supina (Figura 1C) o sospeso con un angolo di 45°15. Mantenere la temperatura con una lampada riscaldante.
- Prima dell'intubazione, valutare la profondità dell'anestesia dal riflesso del pizzicamento della zampa. Per un'intubazione ottimale, il riflesso del pizzico della zampa deve essere ancora presente ma notevolmente ridotto rispetto a quello di un animale cosciente.
- Dopo aver assicurato il cucciolo anestetizzato supino a una piattaforma di intubazione (Figura 1C), tenere la lingua con una piccola pinza e utilizzare un laringoscopio ricavato da un pezzo di filo di rame (Figura 1B) per esporre la glottide e le corde vocali. Aiuta la visualizzazione delle corde vocali mediante trans-illuminazione con una luce flessibile a fibre ottiche (Figura 1D).
- Utilizzando una cannula irrigidita, inclinare la cannula in modo che l'estremità del luer lock sia leggermente più bassa (~ 10°) rispetto alla punta e, non appena le corde vocali si separano, inserire la cannula e farla avanzare fino a quando l'adattatore luer lock è appena fuori dalla bocca. Rimuovere il filo immediatamente dopo l'intubazione.
NOTA: Non è prevista alcuna resistenza durante l'intubazione nei topi di questa età a meno che la cannula non sia troppo avanzata e la resistenza sia avvertita dalla carena.- Valutare la profondità dell'anestesia dopo l'intubazione dalla capacità dell'animale di respirare spontaneamente. Confermare il successo dell'intubazione tracheale dei cuccioli che respirano spontaneamente bloccando brevemente il catetere di intubazione per verificare che ciò impedisca il movimento del torace.
- Trasferire immediatamente il cucciolo intubato su un cuscinetto riscaldante (37 °C) e collegare la cannula endotracheale a un ventilatore che fornisca ossigeno al 100% a una portata di 1 L/min con 30 μL/corsa, 40 μL/corsa o 50 μL/corsa per 3,15-4,59 g, 4,50-5,49 g, o 5,50-8,10 g di cuccioli, rispettivamente, e 150 colpi/min.
- Eseguire queste procedure rapidamente, entro <15 s per ridurre al minimo la ri-respirazione.
4. Chirurgia dell'infarto miocardico di topi di 10 giorni
- Per indurre un piano chirurgico di anestesia per la chirurgia, commutare il gas che scorre nel ventilatore dal 100% di ossigeno al 4,5% di isoflurano nell'ossigeno (la concentrazione di isoflurano è determinata da un vaporizzatore) per 4-5 minuti.
- Dopo il passaggio all'isoflurano, confermare nuovamente l'intubazione tracheale controllando che la frequenza del movimento della parete toracica sia uguale a quella del ventilatore. La perdita della respirazione spontanea seguita dall'assenza di un riflesso della coda o della zampa indica che è stato raggiunto un piano chirurgico di anestesia (dopo 4-5 minuti).
- Mantenere l'anestesia con isoflurano al 2% in ossigeno.
- Eseguire un intervento chirurgico di infarto miocardico al microscopio chirurgico (obiettivo 10x e 16x) come descritto alpunto 16.
- Disinfettare la pelle con un movimento circolare più volte con giri alternati di uno scrub a base di iodio o clorexidina e alcool al 70%. Usando le forbici sottili, fai un'incisione cutanea orizzontale tra la terza e la quarta costola (quarto spazio intercostale) nella parete laterale sinistra del torace. Usando una pinza fine, apri il torace mediante dissezione smussata dello spazio intercostale e usa un divaricatore per mantenere lo spazio aperto.
- Indurre un infarto miocardico mediante legatura dell'arteria coronaria sinistra appena distale all'appendice atriale sinistra con sutura monofilamento in polipropilene 9-0. Dopo l'intervento chirurgico di infarto di ~ 10 minuti, chiudere la pelle con prolene 7-0 e disinfettare l'incisione con betadine. Pulire il cucciolo di sangue con etanolo o soluzione salina al 70%.
NOTA: La legatura dell'arteria coronaria sinistra nei cuccioli preadolescenti è essenzialmente senza sangue, come lo è con le legature adulte. - Somministrare uno dopo l'altro con una siringa da insulina da 0,5 ml e ago da 29 G: atipamezolo (1-5 mg/kg, 10 μL, intraperitoneale) per un rapido recupero da sedazione, analgesia (buprenorfina, 0,075 mg/kg, 10 μL, sottocutanea) e soluzione salina (50 μL, intraperitoneale).
- Consentire agli animali di riprendersi interrompendo l'isoflurano. Assicurarsi che la respirazione spontanea riprenda entro pochi minuti dopo.
- Riportare il cucciolo nella camera pre-ossigenata riscaldata e monitorare continuamente durante il recupero fino a quando il riflesso raddrizzante non viene recuperato, a quel punto estubare il cucciolo.
- Strofinare delicatamente il cucciolo con la lettiera della gabbia domestica, tenerlo al caldo, controllare che la respirazione sia regolare e che il cucciolo sia in grado di muoversi spontaneamente. Ciò ridurrà il cannibalismo post-operatorio da parte della diga.
- Riportare la diga nella gabbia quando tutti i cuccioli si sono completamente ripresi dall'anestesia.
NOTA: Il tempo complessivo impiegato per la preparazione, l'anestesia, l'intubazione, la chirurgia e il recupero di un cucciolo può variare da 40 a 60 minuti. - Diga domestica e cuccioli durante la notte in una gabbia posta metà sopra / metà fuori da un cuscinetto riscaldante a 37 ° C.
5. Valutazione post-operatoria delle dimensioni dell'infarto
- Il 3° giorno dopo l'intervento, anestetizzare i cuccioli mettendoli in una camera di plexiglass pre-equilibrata con isoflurano al 4,5% in ossigeno a 1 ml/min di portata.
- Una volta raggiunto un piano chirurgico di anestesia (dopo 4-5 minuti), valutato dal riflesso del pizzicamento della zampa, rimuovere il cucciolo dalla camera e fissarlo in posizione supina su un pad riscaldante tappando la coda.
- Posizionare un filo sopra gli incisivi e il nastro adesivo in posizione per mantenere la testa estesa e posizionare la testa in un cono nasale collegato a un ventilatore che fornisce isoflurano al 4,5% in ossigeno a 200 μL / corsa, 150 colpi / min. Mantenere un piano chirurgico di anestesia con isoflurano al 2% in ossigeno.
- Disinfettare la pelle con etanolo al 70%. Usando forbici sottili, praticare un'incisione di 1 cm nella pelle sopra l'arteria carotide comune destra lungo la trachea e cannulare il vaso esposto utilizzando un tubo di polietilene a lume singolo (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) per somministrare 0,2 ml di soluzione salina eparinizzata (200 U) per 1 minuto per prevenire la coagulazione del sangue.
- Aumentare l'isoflurano al 4,5% in ossigeno per 1 minuto prima di somministrare rapidamente 0,2 mL di 3,3 M KCl entro 2 s per arrestare il cuore in diastole.
- Sezionare la vena giugulare destra attraverso la stessa incisione e transetto. Perfondere il cuore con 0,2 ml di soluzione salina tamponata fosfato (PBS), quindi perfondere con 0,1 ml di blu di Alcian allo 0,2% per colorare il miocardio remoto non infartuato. Controllare la perfusione riuscita, evidenziata dal lavaggio del sangue, PBS e poi Alcian Blue attraverso la vena giugulare.
- Apri il torace e asporta il cuore sezionando il tessuto connettivo circostante e i vasi per rilasciare il cuore. Risciacquare il cuore in PBS, rimuovere gli atri se lo si desidera e fotografare il cuore con una fotocamera montata su un microscopio chirurgico utilizzando un obiettivo 10x.
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Representative Results
Anestesia di topi di 10 giorni. I cuccioli di 10 giorni possono essere anestetizzati con isoflurano al 4,5% in 4-5 minuti; Tuttavia, si riprendono dall'anestesia nel processo di preparazione per l'intubazione. A causa delle loro piccole dimensioni, l'intubazione in anestesia isoflurana erogata da un cono nasale standard non è fattibile. In precedenza abbiamo utilizzato un regime anestetico di ketamina / xilazina / atropina di 100/13 / 0,5 mg / kg, rispettivamente, per la chirurgia cardiotoracica in cuccioli di 15 e 21 giorni e adulti 4,7. Negli esperimenti preliminari, che includevano l'integrazione di ossigeno, è stato riscontrato che il regime iniettabile raccomandato di 50-150 mg / kg di ketamina e 5-10 mg / kg di xilazina 10 ha provocato una mortalità inaccettabile nei cuccioli di10 giorni. Data la correlazione inversa tra peso corporeo e dimensioni della cucciolata di 10 giorni (R2 = 0,250, p < 0,0001; Figura 2), abbiamo titolato il regime anestetico in base ai gruppi di peso corporeo. La riduzione del dosaggio di ketamina / xilazina / atropina a 50/6 / 0,18 mg / kg, rispettivamente, ha portato a una profondità sufficiente dell'anestesia per consentire l'intubazione endotracheale di cuccioli che respirano spontaneamente del peso di 5,5-8,10 g (Tabella 1), ma questa dose non è stata tollerata dai cuccioli più leggeri. La riduzione del dosaggio di ketamina / xilazina / atropina a 30/4 / 0,12 mg / kg, rispettivamente, ha permesso l'intubazione di cuccioli di peso 4,50-5,49 g, mentre un'ulteriore riduzione del dosaggio di ketamina a 20 mg / kg ha permesso l'intubazione di cuccioli di peso 3,15-4,49 g (Tabella 1). La tabella 1 mostra il numero e la percentuale di cuccioli intubati che hanno subito un intervento chirurgico; Tuttavia, è difficile estrarre da questi dati la mortalità correlata all'anestesia dalla mortalità associata a troppi tentativi di intubazione. Nell'interesse di ridurre gli sprechi di animali, non abbiamo quantificato specificamente la mortalità correlata all'anestesia.
Intubazione di topi di 10 giorni. I risultati sono stati migliori quando l'intubazione è stata raggiunta dopo solo uno o due tentativi. I cuccioli con un peso corporeo inferiore erano più difficili da intubare rispetto ai cuccioli più pesanti e richiedevano più tentativi (p < 0,001; Tabella 1). La sopravvivenza post-intubazione è correlata al peso corporeo con una sopravvivenza del 59%, 70% e 80% rispettivamente per i gruppi di peso basso, medio e alto (R2 = 0,995, p = 0,04; Tabella 1).
Chirurgia dell'infarto miocardico di topi di 10 giorni. I cuccioli sono stati monitorati per 2 giorni dopo l'intervento. Non c'erano segni di dolore post-operatorio. Dei cuccioli che non sono sopravvissuti al follow-up a 48 ore (Tabella 1), uno del gruppo di peso basso è morto 6 ore dopo l'intervento chirurgico, un cucciolo di ciascuno dei gruppi di peso medio e alto è morto prima di essere rimesso con la madre e un cucciolo di ciascuno dei gruppi di peso medio e alto è stato cannibalizzato dalla madre entro 16 ore dall'intervento, con piccole parti del corpo o nulla rimanente la mattina successiva. La sopravvivenza 2 giorni dopo l'intervento chirurgico di infarto miocardico è stata coerente tra i diversi gruppi di peso all'86% -92% (p = 0,91; Tabella 1). Il miocardio infartuato, valutato 2 giorni dopo l'intervento chirurgico mediante perfusione di Alcian-blu del cuore, era evidente dalla chiara demarcazione del tessuto colorato, non infartuato (blu) dal tessuto ischemico (non colorato), distale alla legatura (Figura 1E).
La sopravvivenza globale per l'intera procedura (intubazione più chirurgia) è correlata al peso corporeo del cucciolo al 55%, 60% e 70% rispettivamente per i gruppi di basso, medio e alto peso (R2 = 0,978, Tabella 1), sebbene questa correlazione non abbia raggiunto la significatività statistica (p = 0,09).
Figura 1: Intubazione endotracheale di un cucciolo di topo C57BL/6J di 10 giorni . (A) Configurazione dell'intubazione che mostra una grande lampada riscaldante (WL), una piattaforma di intubazione (IP) e un'illuminazione flessibile a fibre ottiche (FL) utilizzata per facilitare la visualizzazione delle corde vocali al momento dell'intubazione. (B) Forcipe, laringoscopio, cannula calibro 24 utilizzata come tubo endotracheale e un pezzo di filo di rame che viene inserito nel tubo endotracheale tramite l'adattatore luer lock per irrigidire la cannula durante l'intubazione (barra della scala = 1 cm). (C) Il cucciolo anestetizzato viene assicurato supino fissando la coda e gli arti anteriori sulla piattaforma di intubazione (12 cm (L) x 8,5 cm (L) x 7,5 cm (A)). Un filo posto sopra gli incisivi viene utilizzato per estendere la testa e viene fissato con nastro adesivo in posizione. (D) La luce a fibre ottiche è posizionata sopra il collo per trans-illuminare la trachea appena sotto le corde vocali. La lingua viene tenuta con una piccola pinza, quindi il movimento delle corde vocali viene visualizzato esponendo la glottide con il laringoscopio. Il tubo endotracheale viene inserito nella trachea mentre le corde vocali sono aperte. (E) Fotografia di un cuore rappresentativo di un cucciolo di topo perfuso con blu di Alcian (vista frontale con la base del cuore in alto e l'apice in basso e atri rimossi) 48 ore dopo la legatura (sutura nera, freccia nera) dell'arteria coronaria sinistra presa al microscopio chirurgico (obiettivo 10x) montato con una fotocamera. Il miocardio non infartuato è colorato di blu, il miocardio infartuato all'apice è non colorato e pallido; barra di scala = 100 μm. Questa cifra è stata modificata da17. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Il peso corporeo dei cuccioli di C57BL/6 di 10 giorni è inversamente correlato alle dimensioni della cucciolata. I cuccioli provenivano da cucciolate di dimensioni variabili da 4 a 10. La dimensione media della cucciolata C57BL/6 è di sette18. I dati sono stati analizzati mediante semplice regressione lineare, con p < 0,05 considerati significativi. Questa cifra è stata modificata da17. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Regime di anestesia: ketamina / xilazina / atropina (mg / kg); somministrato in 10 ml/g di peso corporeo, ip | Peso corporeo, g | Numero di cuccioli studiati | Tentativi di intubazione (A, 1-2; B, 3-4 o C, >4) e numero di cuccioli intubati, n (%) | Cuccioli intubati sottoposti a intervento chirurgico, n (%) | Sopravvivenza due giorni dopo l'intervento, n (%) | Sopravvivenza globale dopo intubazione più intervento chirurgico, n (%) | ||
| Un | B | C | ||||||
| 20/4/0.12 | 3.15 - 4.49 | 22 | 8 (36) | 9 (41) | 5 (23) | 13 (59) | 12 (92) | 12 (55) |
| 30/4/0.12 | 4.50 - 5.49 | 20 | 13 (65) | 5 (25) | 2 (10) | 14 (70) | 12 (86) | 12 (60) |
| 50/6/0.18 | 5.50 - 7.30 | 20 | 13 (65) | 3 (15) | 4 (20) | 16 (80) | 14 (88) | 14 (70) |
| p (Test del chi quadrato) | S<0.001 | p=0,91 | ||||||
| R2 (Coefficiente di correlazione, | 0.995, | 0.978, | ||||||
| Valore P) | p=0,04 | p=0,09 | ||||||
Tabella 1: Regime di anestesia, numero di tentativi di intubazione e sopravvivenza post-procedura di cuccioli di topo di 10 giorni. I dati sono stati analizzati mediante test del Chi quadrato, con p < 0,05 considerato significativo.
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Discussion
Attualmente, non ci sono metodi ben documentati per l'anestesia e l'intubazione di topi di 10 giorni per la chirurgia cardiotoracica. A tal fine, abbiamo titolato i regimi di dosaggio di ketamina / xilazina / atropina al peso corporeo, in base ai quali dosi di 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg e 50/6/0,18 mg/kg hanno facilitato l'intubazione di cuccioli con peso corporeo basso (3,15-4,49 g), medio (4,50-5,49 g) e alto (5,50-8,10 g), rispettivamente. La sopravvivenza post-intubazione è correlata al peso corporeo (59%, 70% e 80% per i gruppi di basso, medio e alto peso, rispettivamente. Data la difficoltà incontrata con l'intubazione di cuccioli di 10 giorni e l'elevata mortalità associata, raccomandiamo che la chirurgia cardiotoracica nei cuccioli di 10 giorni sia limitata agli animali di peso minimo di 5,50 g. Un limite di questa tecnica di intubazione è che dipende dall'abilità e dall'esperienza dell'operatore e dalla velocità con cui possono imparare. Tuttavia, si prevede che un operatore esperto in intubazioni adulte possa raggiungere la competenza nell'intubazione preadolescenziale dopo aver praticato su 10 cucciolate da sette a otto cuccioli. Un'altra limitazione è che la sopravvivenza complessiva del cucciolo dopo l'intubazione e la chirurgia dell'infarto miocardico variava dal 55% (gruppo con il peso corporeo più basso) al 70% (gruppo con il peso corporeo più alto). Tuttavia, questo è simile alla sopravvivenza del 60% -70% riportata per i cuccioli di 1 giorno, che non richiedono intubazione se sottoposti a infarto miocardico dopo l'immobilizzazione sul ghiaccio8.
Abbiamo scoperto che cuccioli di topo di 10 giorni di peso diverso avevano una risposta non lineare al regime anestetico ketamina / xilazina / atropina. Ciò può riflettere le differenze di sviluppo in una serie di settori importanti. Il metabolismo basale scala allometricamente alla potenza di tre quarti della massa, dalle singole cellule ai mammiferi19. Ciò influenzerebbe la disposizione dei farmaci negli animali nello studio, che variavano in peso di due volte e mezzo. La maturità del metabolismo dei farmaci o dei meccanismi di disintossicazione è un altro fattore che cambia rapidamente nell'immediato periodo postnatale, così come i meccanismi che influenzano la disponibilità di farmaci liberi, come il legame proteico20. Le differenze farmacocinetiche potrebbero non essere l'unica spiegazione per le relazioni non lineari farmaco-effetto, poiché sono possibili anche differenze nelle risposte farmacodinamiche agli agenti sedativi6. L'uso dell'ossigenazione dopo l'iniezione intraperitoneale di anestetici e prima dell'intubazione probabilmente ha migliorato la sicurezza della procedura, come è stato notato di recente per gli adulti21. Ulteriori aggiustamenti nel dosaggio, in particolare per il gruppo di peso corporeo più basso, possono migliorare la sopravvivenza.
La profondità dell'anestesia era fondamentale per il successo dell'intubazione. L'intubazione era difficile se il piano dell'anestesia era troppo leggero e, se troppo profondo, i cuccioli smettevano di respirare spontaneamente, sia durante l'intubazione che dopo l'intubazione mentre venivano ventilati con ossigeno. Anche la manipolazione dei cuccioli a volte causava il respiro, specialmente durante l'intubazione. Se la respirazione si fermava durante l'intubazione, la stimolazione del piede o della coda, o il ritorno dei cuccioli nella camera riscaldata piena di ossigeno, era fondamentale per ripristinare la respirazione regolare. L'intubazione è stata ritentata quando il cucciolo ha ripreso la respirazione regolare. Se la respirazione si fermava dopo l'intubazione, gli animali venivano ventilati per un massimo di 10 minuti con ossigeno. Se la respirazione spontanea riprendeva durante questo periodo, gli animali procedevano all'intervento chirurgico. Tuttavia, abbiamo scoperto che se la respirazione spontanea non veniva ripristinata entro questo periodo, i cuccioli non si riprendevano dall'anestesia o, se sottoposti a intervento chirurgico, morivano durante il periodo di recupero.
Dato l'alto tasso metabolico dei cuccioli di 10 giorni, è meglio limitare l'esaurimento delle riserve di energia separando la madre dai suoi cuccioli per il più breve tempo possibile e, quindi, limitando il numero di operazioni chirurgiche a quattro o cinque cuccioli per cucciolata al giorno per un periodo massimo di 5-6 ore. Per ridurre il cannibalismo materno dei cuccioli che avevano subito un intervento chirurgico, tutti i compagni di cucciolata che non hanno subito un intervento chirurgico sono stati rimossi per le madri adottive o abbattuti prima del ritorno della diga nella gabbia. Le nostre pratiche di manipolazione per ridurre la mortalità da cannibalismo materno post-chirurgico erano simili a quelle che sono state riportate per i neonati9.
In conclusione, il nostro studio di fattibilità suggerisce che è necessario un regime anestetico iniettabile di ketamina / xilazina / atropina considerevolmente inferiore a quello utilizzato per i topi più anziani per ridurre al minimo la mortalità da intubazione di cuccioli di topo di 10 giorni per la successiva chirurgia cardiotoracica, così come sono pratiche di manipolazione specifiche per ridurre la mortalità da intubazione, chirurgia e cannibalismo materno post-chirurgico.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal NHMRC Program Grant [ID 1074386], da una sovvenzione Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research [RMG] e da una sovvenzione del RT Hall Trust [RMG & SEI].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole (Antisedan) | Provet (NSW) Pty Ltd | ATIP I | |
| Atropine 600 mcg/mL | Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd | 1957699 PFIZER-0143386 | |
| Betadine | Livingstone International | BU0520 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Provet (NSW) Pty Ltd | TEMG I | |
| Fiber-optic light | Leica | 3011350 | CLS 150X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 9.1.2 | |
| Intubation platform | - | - | Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H) |
| Isoflurane | Provet (NSW) Pty Ltd | ISOF 07 | |
| Ketamine 100 mg/mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | |
| Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety | BD Insyte | CE0086 | 19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL |
| Single lumen polyethylene tube | Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW | Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm | |
| Small forceps | F.S.T. | NO 11051-10 | |
| Surgical microscope (camera optional) | Leica | M651 (Leica IC80 HD camera) | 10x and 16x objective |
| Suture 7-0 prolene | Ethicon | 8708H | |
| Suture 9-0 polypropylene monofilament | Ethicon | 2813 | |
| V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm | VetEquip | 901820 | |
| Vented 2-Liter plexiglass induction chamber | VetQuip Pty Ltd | 942102 | 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H) |
| Warming lamp | Brilant Lighting | 99223 | |
| Xylazine | Provet (NSW) Pty Ltd | XYLA Z 2 |
References
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