Summary
Kardiotorakiske kirurgiske modeller hos mus >7 dager gamle krever intubasjon, men dette er utfordrende for preadolescent (8-14 dager gamle) musevalper, og det er lite informasjon om bedøvelsesregimer for intubasjon. Her presenterer vi doseringsregimer av ketamin/xylazin/atropin hos 10 dager gamle C57BL/6J musevalper som tillater endotrakeal intubasjon, samtidig som dyredødeligheten minimeres.
Abstract
Murine kirurgiske modeller spiller en viktig rolle i preklinisk forskning. Mekanistisk innsikt i myokardregenerering etter hjerteskade kan oppnås fra kardiotorakiske kirurgimodeller hos 0-14 dager gamle mus, hvor kardiomyocytter, i motsetning til voksne, beholder proliferativ kapasitet. Musunger opptil 7 dager gamle immobiliseres effektivt av hypotermi og krever ikke intubasjon for kardiotorakisk kirurgi. Preadolescent (8-14 dager gamle) musevalper krever imidlertid intubasjon, men dette er utfordrende og det er lite informasjon om anestesi for å lette intubasjon. Her presenterer vi doseringsregimer av ketamin/xylazin/atropin hos 10 dager gamle C57BL/6J musevalper som tillater endotrakeal intubasjon, samtidig som dyredødeligheten minimeres. Empirisk titrering av doseringsregimene ketamin/xylazin/atropin til kroppsvekt indikerte at responsen på anestesi hos museavkom med ulik vekt var ikke-lineær, hvor doser på 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg og 50/6/0,18 mg/kg lettet intubasjon av avkom som veide mellom 3,15-4,49 g (n = 22), 4,50-5,49 g (n = 20) og 5,50-8,10 g (n = 20), henholdsvis. Avkom med lavere kroppsvekt krevde flere intubasjonsforsøk enn tyngre avkom (p < 0,001). Overlevelse etter intubasjon korrelerte med kroppsvekt (59 %, 70 % og 80 % for henholdsvis lav-, mellom- og høyvektige grupper, R2 = 0,995). Ved hjerteinfarktkirurgi etter intubasjon ble kirurgisk anestesiplan indusert med 4,5 % isofluran i 100 % oksygen og opprettholdt med 2 % isofluran i 100 % oksygen. Overlevelsen etter operasjonen var lik for de tre vektgruppene hos 92 %, 86 % og 88 % (p = 0,91). Sammen med forbedringer i dyrehåndteringspraksis for intubasjon og kirurgi, og minimering av kannibalisering av dammen etter kirurgi, korrelerte total overlevelse for hele prosedyren (intubasjon pluss kirurgi) med kroppsvekt (henholdsvis 55%, 60% og 70% for lav-, mellom- og høyvektsgrupper, R2 = 0,978). Gitt vanskelighetene med intubasjon av 10 dager gamle valper og tilhørende høy dødelighet, anbefaler vi at kardiotorakisk kirurgi hos 10 dager gamle valper begrenses til valper som veier minst 5,5 g.
Introduction
Murine modeller er uvurderlige verktøy i preklinisk kardiotorakisk forskning, særlig på grunn av hvor enkelt genetisk utviklede muselinjer kan genereres, og også hvor enkelt musene kan manipuleres kirurgisk for å gi patologiske sykdomsmodeller for å tillate for eksempel studiet av myokardregenerering etter hjerteskade1 . I denne forbindelse er det av interesse at, i motsetning til voksne mus der kardiomyocytter har trukket seg fra cellesyklusen, repareres 0-2 dager gamle neonatale musehjerter med minimal arrdannelse etter apikal reseksjon eller induksjon av hjerteinfarkt 2,3,4. I motsetning til dette regenererer 7 dager gamle neonatale hjerter ufullstendig med en høyere forekomst av arrdannelse 2,3. Siden kardiomyocytter i toppunktet i venstre ventrikkel beholder proliferativ kapasitet i opptil 2 uker etter fødselen, kan mekanistiske studier av regenerering etter hjerteskade hos 0-14 dager gamle mus være informative for å identifisere terapeutiske mål for regenerering av det skadede voksne hjertet5.
Utviklingen av musemodeller av hjerteskade innebærer kirurgisk manipulasjon under anestesi. Dette krever at thoraxen åpnes for å få tilgang til hjertet, som generelt krever intubasjon og mekanisk ventilasjon. Musens belastning, kroppsvekt og alder påvirker følsomheten for anestetika6. Voksne mus kan bedøves med et bredt spekter av midler, et vanlig regime for intubasjon er ketamin / xylazin / atropin ved 100/13/0,5 mg / kg 6,7. Neonatale mus (0-7 dager gamle) mangler en sentralisert smerterefleks, og kan effektivt immobiliseres på is og underkastes kirurgi uten intubasjon 6,8,9. Preadolescent (8-14 dager gamle) musevalper kan ikke bedøves med hypotermi 9,10; De krever intubasjon for kardiotorakisk kirurgi. Det er ingen tidligere studier på kardiotorakisk kirurgi hos preadolescent mus mindre enn 14 dager gammel. Vår erfaring er at intubasjon av isofluranbedøvede preadolescent mus under 14 dager er vanskelig. Anbefalt injiserbart bedøvelsesregime rapportert for mus eldre enn 7 dager er 50-150 mg / kg ketamin og 5-10 mg / kg xylazin10. Preadolescent mus utvikler seg fortsatt nevrologisk, og deres respons på narkotika og stoffskifte er svært forskjellig fra voksne dyr6. Dette utgjør økt risiko for ubalanse mellom væske, elektrolytt og syrebase, samt hypoglykemi og hypotermi på grunn av ikke bare deres høye metabolske hastighet, som raskt tømmer deres begrensede energilagre, men også på grunn av deres termoregulatoriske umodenhet 6,11,12. Dermed er det lite informasjon om bedøvelsesregimer som både letter intubasjon og maksimerer overlevelsen av preadolescent mus.
Her titrerte vi empirisk doseringsregimer av ketamin/xylazin/atropin hos 10 dager gamle C57BL/6J musevalper som varierte i vekt fra 3-8 g for å oppnå et anestesiplan som er tilstrekkelig til å muliggjøre endotrakeal intubasjon for påfølgende kardiotorakisk kirurgi, samtidig som dyredødeligheten ble minimert. Vi forbedret også dyrehåndteringspraksis for å redusere dødeligheten fra intubasjon, kirurgi og postoperativ mors kannibalisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk som er beskrevet ble godkjent av Garvan / St Vincent's Hospital Animal Ethics Committee i samsvar med den australske anbefalingen for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige formål og ARRIVE-retningslinjene, og alle eksperimenter ble utført av en erfaren smådyrkirurg (JW) med veiledning fra en pediatrisk anestesilege (JJS).
1. Forberedelse av instrumenter
- På operasjonsdagen, sett opp spesialutstyr for intubasjon av 10 dager gamle valper (figur 1A,B). Dette inkluderer en oppvarmingslampe, intubasjonsplattform, fiberoptisk lys, små tang, et laryngoskop laget av et stykke kobbertråd med en diameter på 0,02 mm (60 mm i lengde med enden av ledningen formet til en sirkel på 3 mm diameter i en vinkel på 175 °; Figur 1B), og en 24-gauge plast intravenøs (i.v.) kanyle, som brukes som et endotrakealt rør.
- Sørg for at kanylen består av et 19 mm langt plastrør (0,7 mm OD) festet til en 21 mm kvinnelig luerlåsadapter i plast (figur 1B). Avstiv slangen på kanylen ved å sette inn et stykke kobbertråd via luerlåsadapteren. Bruk en kanyle med et totalvolum på 130 μL for en mus med tidevannsvolum på ~8 μL/g13,14.
2. Anestesi av 10 dager gamle mus
- På operasjonsdagen fjerner du demningen fra et bur med 10 dager gamle C57BL/6J-valper og plasserer buret på en varmepute (37 °C).
- Bedøv avkom med 10 μL per g kroppsvekt intraperitoneal injeksjon ved bruk av en 0,5 ml insulinsprøyte og 29 G kanyle med ketamin/xylazin/atropin i forholdet beskrevet i tabell 1 for ulike vektgrupperinger.
- Umiddelbart etter injeksjon plasserer du valpen i et oppvarmet (37 °C) plexiglasskammer som er preoksygenert med 100 % oksygen.
3. Intubasjon av 10 dager gamle mus
- Etter 3-4 minutters oksygenering, overfør valpen til en plattform for intubasjon, hovedsakelig som for voksne mus. Utfør dette med valpen i liggende stilling (figur 1C) eller suspendert i 45° vinkel15. Oppretthold temperaturen med en varmelampe.
- Før intubasjon, vurder dybden av anestesi ved poteklemmerefleksen. For optimal intubasjon må poteklyperefleksen fortsatt være til stede, men markant redusert fra et bevisst dyrs.
- Etter å ha sikret den bedøvede valpen liggende til en intubasjonsplattform (figur 1C), hold tungen med små tang og bruk et laryngoskop laget av et stykke kobbertråd (figur 1B) for å eksponere glottis og stemmebånd. Hjelp visualisering av stemmebåndene ved trans-belysning med et fleksibelt fiberoptisk lys (figur 1D).
- Bruk en avstivet kanyle, vipp kanylen slik at luerlåsenden er litt lavere (~ 10 °) enn spissen, og så snart stemmebåndene skiller seg, sett inn kanylen og avanser den til luerlåsadapteren er like utenfor munnen. Fjern ledningen umiddelbart etter intubasjon.
MERK: Ingen motstand under intubasjon forventes hos mus i denne alderen med mindre kanylen er avansert for langt, og motstand er følt fra carina.- Vurder dybden av anestesi etter intubasjon av dyrets evne til å puste spontant. Bekreft vellykket trakeal intubasjon av spontant pustende valper ved å blokkere intubasjonskateteret kort for å kontrollere at dette forhindrer brystbevegelse.
- Overfør umiddelbart den intuberte valpen til en varmepute (37 °C) og koble endotrakeal kanyle til en ventilator som leverer 100% oksygen med en strømningshastighet på 1 l / min med henholdsvis 30 μL / slag, 40 μL / slag eller 50 μL / slag for 3,15-4,59 g, 4,50-5,49 g eller 5,50-8,10 g valper og 150 slag / min.
- Utfør disse prosedyrene raskt, innen <15 s for å minimere re-puste.
4. Hjerteinfarkt kirurgi av 10 dager gamle mus
- For å indusere et kirurgisk anestesiplan for kirurgi, bytt gassen som strømmer inn i ventilatoren fra 100% oksygen til 4,5% isofluran i oksygen (isoflurankonsentrasjonen bestemmes av en fordamper) i 4-5 minutter.
- Etter å ha byttet til isofluran, bekreft trakeal intubasjon igjen ved å kontrollere at frekvensen av brystveggbevegelse er lik ventilatorens. Tap av spontan pust etterfulgt av fravær av hale- eller poteklemmerefleks indikerer at et kirurgisk anestesiplan er nådd (etter 4-5 minutter).
- Oppretthold anestesi med 2% isofluran i oksygen.
- Utfør hjerteinfarktkirurgi under et kirurgisk mikroskop (10x og 16x objektivt) som beskrevet i16.
- Desinfiser huden i en sirkulær bevegelse flere ganger med vekslende runder av en jodbasert eller klorhexidinbasert skrubb og 70% alkohol. Bruk fin saks, lag et horisontalt hudinnsnitt mellom tredje og fjerde ribben (fjerde interkostale rom) i venstre sidevegg av brystet. Bruk fine tang, åpne thoraxen ved stump disseksjon av interkostalrommet og bruk en retractor for å holde rommet åpent.
- Indusere et hjerteinfarkt ved ligering av venstre koronararterie bare distalt til venstre atrievedheng med 9-0 polypropylen monofilament sutur. Etter ~ 10 min infarktoperasjon, lukk huden med 7-0 prolene og desinfiser snittet med betadin. Rengjør valpen av blod med 70% etanol eller saltvann.
MERK: Ligering av venstre koronararterie hos preadolescent valper er i hovedsak blodløs, som det er med voksne ligeringer. - Administrer den ene etter den andre med en 0,5 ml insulinsprøyte og 29 G kanyle: atipamezol (1-5 mg/kg, 10 μL, intraperitoneal) for rask bedring fra sedasjon, analgesi (buprenorfin, 0,075 mg/kg, 10 μL, subkutan) og saltvann (50 μL, intraperitoneal).
- La dyrene komme seg ved å seponere isofluranet. Sørg for at spontan pust gjenopptas innen få minutter etterpå.
- Returner valpen til det oppvarmede preoksygenerte kammeret og overvåk kontinuerlig under gjenoppretting til rettingsrefleksen er gjenvunnet, og utgrav deretter valpen.
- Gni valpen forsiktig med sengetøy i hjemmet, hold valpen varm, kontroller at pusten er regelmessig, og at valpen er i stand til spontan bevegelse. Dette vil redusere kannibalisme etter operasjonen ved dammen.
- Returner dammen til buret når alle valpene har fullstendig gjenopprettet fra anestesi.
MERK: Den totale tiden det tar for forberedelse, anestesi, intubasjon, kirurgi og gjenoppretting av en valp kan variere fra 40-60 minutter. - Husdam og valper over natten i bur plassert halvt på/halvt av en 37 °C varmepute.
5. Vurdering av infarktstørrelse etter kirurgi
- På den 3. dagen etter operasjonen, bedøve valper ved å plassere dem i et plexiglasskammer som er forhåndsutjevnet med 4,5% isofluran i oksygen ved 1 ml / min strømningshastighet.
- Når et kirurgisk anestesiplan er nådd (etter 4-5 minutter), vurdert av poteklyperefleksen, fjern valpen fra kammeret og fest i liggende stilling på en varmepute ved å teipe halen.
- Plasser en tråd over fortennene og tape på plass for å holde hodet forlenget og plasser hodet i en nesekegle koblet til en ventilator som leverer 4,5% isofluran i oksygen ved 200 μL / slag, 150 slag / min. Opprettholde et kirurgisk anestesiplan med 2% isofluran i oksygen.
- Desinfiser huden med 70% etanol. Bruk fin saks, gjør et 1 cm snitt i huden over den høyre vanlige halspulsåren langs luftrøret og kanyler det eksponerte karet ved hjelp av et enkelt lumenpolyetylenrør (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) for å administrere 0,2 ml heparinisert saltvann (200 U) i 1 minutt for å forhindre blodpropp.
- Øk isofluran til 4,5 % i oksygen i 1 min før du raskt administrerer 0,2 ml 3,3 M KCl innen 2 s for å arrestere hjertet i diastolen.
- Disseker vena jugularis til høyre via samme snitt og transekterer den. Perfuse hjertet med 0,2 ml fosfatbufret saltvann (PBS), og perfuse deretter med 0,1 ml 0,2% Alcian Blue for å flekke det ikke-infarkte fjernt myokard. Sjekk vellykket perfusjon, dokumentert ved utvasking av blod, PBS og deretter Alcian Blue via jugularvenen.
- Åpne thoraxen og excise hjertet ved å dissekere det omkringliggende bindevevet og karene for å frigjøre hjertet. Skyll hjertet i PBS, fjern atriene om ønskelig, og fotografer hjertet med et kamera montert på et kirurgisk mikroskop ved hjelp av et 10x mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anestesi av 10 dager gamle mus. De 10 dager gamle valpene kan bedøves med 4,5% isofluran på 4-5 minutter; Imidlertid gjenoppretter de fra anestesi i prosessen med forberedelse til intubasjon. På grunn av sin lille størrelse er intubasjon under isofluranbedøvelse levert av en standard nesekegle ikke mulig. Vi har tidligere brukt et ketamin/xylazin/atropinbedøvelsesregime på henholdsvis 100/13/0,5 mg/kg til kardiotorakisk kirurgi hos 15 og 21 dager gamle valper og voksne 4,7. I foreløpige eksperimenter, som inkluderte oksygentilskudd, ble det funnet at det anbefalte injiserbare regimet på 50-150 mg / kg ketamin og 5-10 mg / kg xylazin 10 resulterte i en uakseptabel dødelighet hos10 dager gamle valper. Gitt den inverse korrelasjonen mellom kroppsvekt og kullstørrelse på 10 dager gamle valper (R2 = 0,250, p < 0,0001; Figur 2), titrerte vi bedøvelsesregimet etter kroppsvektgrupperinger. Reduksjon av ketamin/xylazin/atropindosen til henholdsvis 50/6/0,18 mg/kg resulterte i tilstrekkelig anestesidybde til at endotrakeale intubasjoner av spontant pustende avkom veide 5,5-8,10 g (tabell 1), men denne dosen ble ikke tolerert av lettere avkom. Ved å redusere ketamin-/xylazin-/atropindosen til henholdsvis 30/4/0,12 mg/kg, muliggjorde intubasjon av avkom som veide 4,50-5,49 g, mens ytterligere reduksjon av ketamindosen til 20 mg/kg muliggjorde intubasjon av avkom som veide 3,15-4,49 g (tabell 1). Tabell 1 viser antall og prosentandel av intuberte valper som ble operert; Det er imidlertid vanskelig å trekke ut anestesirelatert dødelighet fra dødelighet forbundet med for mange intubasjonsforsøk. For å redusere dyresvinn kvantifiserte vi ikke spesifikt anestesirelatert dødelighet.
Intubasjon av 10 dager gamle mus. Resultatene var best når intubasjon ble oppnådd etter bare ett eller to forsøk. Valper med lavere kroppsvekt var vanskeligere å intubere enn tyngre avkom og krevde flere forsøk (p < 0,001; Tabell 1). Overlevelse etter intubasjon korrelerte med kroppsvekt med henholdsvis 59 %, 70 % og 80 % overlevelse for lav-, mellom- og høyvektige grupper (R2 = 0,995, p = 0,04; Tabell 1).
Myokardinfarktkirurgi av 10 dager gamle mus. Valper ble overvåket i 2 dager etter operasjonen. Det var ingen tegn til smerter etter operasjonen. Av valpene som ikke overlevde til oppfølging ved 48 timer (tabell 1), døde en fra lavvektsgruppen 6 timer etter operasjonen, en valp fra hver av midt- og høyvektsgruppene døde før de ble plassert tilbake med dammen, og en valp fra hver av midt- og høyvektsgruppene ble kannibalisert av dammen innen 16 timer etter operasjonen, med små kroppsdeler eller ingenting igjen neste morgen. Overlevelse 2 dager etter hjerteinfarktkirurgi var konsistent mellom de ulike vektgruppene ved 86%-92% (p = 0,91; Tabell 1). Infarktert myokard, vurdert 2 dager etter kirurgi ved Alcian-blå perfusjon av hjertet, ble påvist ved klar avgrensning av farget, ikke-infarkt (blått) fra iskemisk (ufarget) vev, distalt for ligasjonen (figur 1E).
Total overlevelse for hele prosedyren (intubasjon pluss kirurgi) korrelerte med valpens kroppsvekt på henholdsvis 55 %, 60 % og 70 % for lav-, mellom- og høyvektige grupper (R2 = 0,978, tabell 1), selv om denne korrelasjonen ikke oppnådde statistisk signifikans (p = 0,09).
Figur 1: Endotrakeal intubasjon av en 10 dager gammel C57BL/6J musevalp . (A) Intubasjonsoppsett som viser stor varmelampe (WL), intubasjonsplattform (IP) og fleksibel fiberoptisk belysning (FL) som brukes til å hjelpe visualisering av stemmebåndene på intubasjonstidspunktet. (B) Tang, laryngoskop, 24-gauge kanyle som brukes som et endotrakealt rør, og et stykke kobbertråd som settes inn i endotrakealrøret via luerlåsadapteren for å stive kanylen under intubasjon (skalabar = 1 cm). (C) Den bedøvede valpen festes liggende ved å teipe halen og fremre lemmer på intubasjonsplattformen (12 cm (L) x 8,5 cm (B) x 7,5 cm (H)). En tråd plassert over snittene brukes til å forlenge hodet og tapes på plass. (D) Det fiberoptiske lyset plasseres over nakken for å transbelyse luftrøret like under stemmebåndene. Tungen holdes med små tang, og deretter visualiseres bevegelse av stemmebåndene ved å eksponere glottis med laryngoskopet. Endotrakealrøret settes inn i luftrøret mens stemmebåndene er åpne. (E) Fotografi av et representativt musevalpehjerte perfundert med Alcian blå (frontal visning med bunnen av hjertet øverst og apex nederst, og atria fjernet) 48 h post-ligation (svart sutur, svart pil) av venstre koronararterie tatt under et kirurgisk mikroskop (10x objektiv) montert med et kamera. Ikke-infarkt myokard er farget blå, infarkt myokard ved toppunktet er ufarget og blek; skala bar = 100 μm. Dette tallet er endret fra17. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kroppsvekten til 10 dager gamle C57BL/6 valper er omvendt korrelert med kullstørrelse. Valper var fra kull som varierte i størrelse fra 4-10. Den gjennomsnittlige C57BL/6 kullstørrelsen er syv18. Data ble analysert ved enkel lineær regresjon, der p < 0,05 ble ansett som signifikant. Dette tallet er endret fra17. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Anestesi regime: ketamin / xylazin / atropin (mg / kg); gitt i 10 ml / g kroppsvekt, ip | Kroppsvekt, g | Antall unger studert | Intubasjonsforsøk (A, 1-2; B, 3-4 eller C, >4) og antall unger intubert, n (%) | Intuberte avkom går videre til operasjon, n (%) | Overlevelse to dager etter operasjon, n (%) | Total overlevelse etter intubasjon pluss kirurgi, n (%) | ||
| En | B | C | ||||||
| 20/4/0.12 | 3.15 - 4.49 | 22 | 8 (36) | 9 (41) | 5 (23) | 13 (59) | 12 (92) | 12 (55) |
| 30/4/0.12 | 4.50 - 5.49 | 20 | 13 (65) | 5 (25) | 2 (10) | 14 (70) | 12 (86) | 12 (60) |
| 50/6/0.18 | 5.50 - 7.30 | 20 | 13 (65) | 3 (15) | 4 (20) | 16 (80) | 14 (88) | 14 (70) |
| p (Khikvadrattest) | s<0.001 | p = 0,91 | ||||||
| R2 (Korrelasjonskoeffisient, | 0.995, | 0.978, | ||||||
| p verdi) | p = 0,04 | p = 0,09 | ||||||
Tabell 1: Anestesiregime, antall intubasjonsforsøk og overlevelse etter inngrep hos 10 dager gamle museunger. Data ble analysert med khikvadrattest, der p < 0,05 ble ansett som signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Foreløpig finnes det ingen veldokumenterte metoder for anestesi og intubasjon av 10 dager gamle mus for kardiotorakisk kirurgi. For dette formålet har vi titrert doseringsregimene ketamin/xylazin/atropin til kroppsvekt, hvor doser på henholdsvis 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg og 50/6/0,18 mg/kg gjorde det lettere å intubere avkom med lav (3,15-4,49 g), middels (4,50-5,49 g) og høy (5,50-8,10 g) kroppsvekt. Overlevelse etter intubasjon korrelerte med kroppsvekt (59 %, 70 % og 80 % for henholdsvis lav-, mellom- og høyvektsgrupper. Gitt vanskelighetene med intubasjon av 10 dager gamle valper og tilhørende høy dødelighet, anbefaler vi at kardiotorakisk kirurgi hos 10 dager gamle valper begrenses til dyr som veier minst 5,50 g. En begrensning ved denne intubasjonsteknikken er at den er avhengig av operatørens dyktighet og erfaring, og hvor raskt de kan lære. Det forventes imidlertid at en operatør med erfaring i voksne intubasjoner kan oppnå ferdigheter i preadolescent intubasjon etter å ha trent på 10 kull med syv til åtte valper. En annen begrensning er at den totale overlevelsen hos avkom etter intubasjon og hjerteinfarktkirurgi varierte fra 55 % (laveste kroppsvektgruppe) til 70 % (høyeste kroppsvektgruppe). Likevel ligner dette på 60% -70% overlevelse rapportert for 1 dag gamle valper, som ikke krever intubasjon når de blir utsatt for hjerteinfarkt etter immobilisering på is8.
Vi fant at 10 dager gamle musevalper med forskjellig vekt hadde en ikke-lineær respons på ketamin/xylazin/atropinbedøvelsesregimet. Dette kan gjenspeile utviklingsforskjellene på en rekke viktige områder. Basal metabolsk hastighet skalerer allometrisk til tre fjerdedels massekraft, fra enkeltceller til pattedyr19. Dette ville påvirke stoffets disposisjon hos dyrene i studien, som varierte i vekt med to og en halv gang. Modenheten i legemiddelmetabolismen eller avgiftningsmekanismene er en annen faktor som endrer seg raskt i den umiddelbare barselperioden, og det samme gjelder mekanismer som påvirker tilgjengeligheten av frie legemidler, som proteinbinding20. Farmakokinetiske forskjeller er kanskje ikke den eneste forklaringen på ikke-lineære legemiddel-effekt-relasjoner, da forskjeller i farmakodynamiske responser på beroligende midler også er mulige6. Bruk av oksygenering etter intraperitoneal injeksjon av anestetika og før intubasjon forbedret sannsynligvis sikkerheten ved prosedyren, som det nylig er observert for voksne21. Ytterligere justeringer i dosering, spesielt for den laveste kroppsvektgruppen, kan forbedre overlevelsen.
Anestesidybden var avgjørende for vellykket intubasjon. Intubasjon var vanskelig hvis anestesiplanet var for lett, og hvis det var for dypt, sluttet valpene å puste spontant, enten under intubasjon eller etter intubasjon mens de ble ventilert med oksygen. Håndtering av valper forårsaket også noen ganger pustholding, spesielt under intubasjon. Hvis pusten stoppet under intubasjon, var stimulering av foten eller halen, eller retur av valper til det oppvarmede oksygenfylte kammeret, avgjørende for å gjenopprette regelmessig pust. Intubasjon ble forsøkt på nytt da avkommet gjenopptok regelmessig pust. Hvis pusten stoppet etter intubasjon, ble dyrene ventilert i opptil 10 minutter med oksygen. Hvis spontan pust gjenopptok i løpet av denne tiden, fortsatte dyrene til kirurgi. Vi fant imidlertid at hvis spontan pust ikke ble gjenopprettet innen denne tiden, ble valper ikke gjenopprettet fra anestesi eller, hvis de ble utsatt for kirurgi, døde i gjenopprettingsperioden.
Gitt den høye metabolske hastigheten til 10 dager gamle valper, er det best å begrense uttømming av energilagre ved å skille dammen fra valpene i så kort tid som mulig og dermed begrense antall kirurgiske operasjoner til fire eller fem valper per kull per dag over en maksimal periode på 5-6 timer. For å redusere mors kannibalisme hos valper som hadde gjennomgått kirurgi, ble alle kullkamerater som ikke ble operert, fjernet til fostermødre eller kastet før dammen ble returnert til buret. Vår håndteringspraksis for å redusere dødeligheten av postoperativ mors kannibalisme var lik den som er rapportert for nyfødte9.
Avslutningsvis antyder vår mulighetsstudie at et injiserbart ketamin / xylazin / atropinbedøvelsesregime som er betydelig lavere enn det som brukes til eldre mus, er nødvendig for å minimere dødeligheten fra intubasjon av 10 dager gamle musevalper for påfølgende kardiotorakisk kirurgi, som er spesifikke håndteringspraksis for å redusere dødeligheten fra intubasjon, kirurgi og postoperativ mors kannibalisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NHMRC Program Grant [ID 1074386], et Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research-stipend [RMG], og et tilskudd fra RT Hall Trust [RMG & SEI].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole (Antisedan) | Provet (NSW) Pty Ltd | ATIP I | |
| Atropine 600 mcg/mL | Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd | 1957699 PFIZER-0143386 | |
| Betadine | Livingstone International | BU0520 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Provet (NSW) Pty Ltd | TEMG I | |
| Fiber-optic light | Leica | 3011350 | CLS 150X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 9.1.2 | |
| Intubation platform | - | - | Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H) |
| Isoflurane | Provet (NSW) Pty Ltd | ISOF 07 | |
| Ketamine 100 mg/mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | |
| Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety | BD Insyte | CE0086 | 19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL |
| Single lumen polyethylene tube | Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW | Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm | |
| Small forceps | F.S.T. | NO 11051-10 | |
| Surgical microscope (camera optional) | Leica | M651 (Leica IC80 HD camera) | 10x and 16x objective |
| Suture 7-0 prolene | Ethicon | 8708H | |
| Suture 9-0 polypropylene monofilament | Ethicon | 2813 | |
| V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm | VetEquip | 901820 | |
| Vented 2-Liter plexiglass induction chamber | VetQuip Pty Ltd | 942102 | 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H) |
| Warming lamp | Brilant Lighting | 99223 | |
| Xylazine | Provet (NSW) Pty Ltd | XYLA Z 2 |
References
- Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovascular Research. 74 (1), 29-38 (2007).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Bogush, N., et al. DUSP5 expression in left ventricular cardiomyocytes of young hearts regulates thyroid hormone (T3)-induced proliferative ERK1/2 signaling. Scientific Reports. 10 (1), 21918 (2020).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. Third edition. , Elsevier Inc. (2009).
- Iismaa, S. E., et al. Cardiac hypertrophy limits infarct expansion after myocardial infarction in mice. Scientific Reports. 8 (1), 6114 (2018).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Boston University Institutional Animal Care and Use Committee. Anesthesia and Analgesia: Neonatal Mice and Rats. , Available from: https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/anesthesia/anesthesia-and-analgesia-neonatal-mice-and-rats-iacuc/ (2019).
- University of Texas at Austin Animal Resources Center. Mouse-Specific Anesthesia Guidance. , Available from: https://research.utexas.edu/qpcontent/uploads/sites/7/2020/02/Mouse_Anesthesia_guidance_ARC_112519.pdf (2019).
- Paddleford, R. Manual of Small Animal Anaesthesia. Second edition. , Masson. (2000).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Daubenspeck, J. A., Li, A., Nattie, E. E. Acoustic plethysmography measures breathing in unrestrained neonatal mice. Journal of Applied Physiology. 104 (1), 262-268 (2008).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visulaized Experiments. (90), e51755 (2014).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Du, X. -J., Gao, X., Ramsey, D. Surgical methods of inducing transverse aortic stenosis and myocardial infarction in the mouse. Asia Pacific Heart Journal. 7 (3), 187-192 (1998).
- Wu, J., et al. Anesthesia and intubation of 10-Day old C57BL/6J mouse pups for cardiothoracic surgery. Research Square. , (2021).
- Silver, L. M. Mouse Genetics: Concepts and Applications. Mouse Genome Informatics, The Jackson Laboratory. , (2008).
- West, G. B., Woodruff, W. H., Brown, J. H. Allometric scaling of metabolic rate from molecules and mitochondria to cells and mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 1 2473-2478 (2002).
- Moscovitz, J. E., Aleksunes, L. M. Establishment of metabolism and transport pathways in the rodent and human fetal liver. International Journal of Molecular Science. 14 (12), 23801-23827 (2013).
- Blevins, C. E., Celeste, N. A., Marx, J. O. Effects of oxygen supplementation on injectable and inhalant anesthesia in C57BL/6 mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 60 (3), 289-297 (2021).
