Summary
Los modelos quirúrgicos cardiotorácicos en ratones de >7 días de edad requieren intubación, pero esto es un desafío para las crías de ratón preadolescentes (8-14 días de edad) y hay poca información sobre los regímenes anestésicos para la intubación. Aquí, presentamos regímenes de dosificación de ketamina / xilazina / atropina en crías de ratón C57BL / 6J de 10 días de edad que permiten la intubación endotraqueal, al tiempo que minimizan la mortalidad animal.
Abstract
Los modelos quirúrgicos murinos juegan un papel importante en la investigación preclínica. Los conocimientos mecanicistas sobre la regeneración miocárdica después de una lesión cardíaca se pueden obtener de modelos de cirugía cardiotorácica en ratones de 0 a 14 días de edad, cuyos cardiomiocitos, a diferencia de los adultos, conservan la capacidad proliferativa. Las crías de ratón de hasta 7 días de edad son efectivamente inmovilizadas por hipotermia y no requieren intubación para cirugía cardiotorácica. Sin embargo, los cachorros de ratón preadolescentes (8-14 días de edad) requieren intubación, pero esto es un desafío y hay poca información sobre la anestesia para facilitar la intubación. Aquí, presentamos regímenes de dosificación de ketamina / xilazina / atropina en crías de ratón C57BL / 6J de 10 días de edad que permiten la intubación endotraqueal, al tiempo que minimizan la mortalidad animal. La titulación empírica de los regímenes de dosificación de ketamina/xilazina/atropina al peso corporal indicó que la respuesta a la anestesia de crías de ratón de diferentes pesos no fue lineal, por lo que dosis de 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg y 50/6/0,18 mg/kg facilitaron la intubación de crías que pesaban entre 3,15-4,49 g (n = 22), 4,50-5,49 g (n = 20) y 5,50-8,10 g (n = 20), respectivamente. Los cachorros de menor peso corporal requirieron más intentos de intubación que los cachorros más pesados (p < 0,001). La supervivencia después de la intubación se correlacionó con el peso corporal (59%, 70% y 80% para los grupos de bajo, medio y alto peso, respectivamente, R2 = 0,995). Para la cirugía de infarto de miocardio después de la intubación, se indujo un plano quirúrgico de anestesia con isoflurano al 4,5% en oxígeno al 100% y mantenido con isoflurano al 2% en oxígeno al 100%. La supervivencia después de la cirugía fue similar para los tres grupos de peso al 92%, 86% y 88% (p = 0,91). Junto con los refinamientos en las prácticas de manejo de animales para la intubación y la cirugía, y la minimización de la canibalización por la madre después de la cirugía, la supervivencia general para todo el procedimiento (intubación más cirugía) se correlacionó con el peso corporal (55%, 60% y 70% para los grupos de bajo, medio y alto peso, respectivamente, R2 = 0.978). Dada la dificultad encontrada con la intubación de cachorros de 10 días de edad y la alta mortalidad asociada, recomendamos que la cirugía cardiotorácica en cachorros de 10 días se limite a cachorros que pesen al menos 5,5 g.
Introduction
Los modelos murinos son herramientas invaluables en la investigación cardiotorácica preclínica, en particular debido a la facilidad con la que se pueden generar líneas de ratón genéticamente modificadas, y también la facilidad con la que los ratones pueden ser manipulados quirúrgicamente para proporcionar modelos patológicos de enfermedades que permitan, por ejemplo, el estudio de la regeneración miocárdica después de una lesión cardíaca1 . En este sentido, es interesante que, a diferencia de los ratones adultos en los que los cardiomiocitos se han retirado del ciclo celular, los corazones de ratón neonato de 0-2 días de edad se reparan con cicatrices mínimas después de la resección apical o la inducción del infarto de miocardio 2,3,4. En contraste, los corazones neonatales de 7 días de edad se regeneran de manera incompleta con una mayor incidencia de cicatrices 2,3. Dado que los cardiomiocitos en el ápice del ventrículo izquierdo conservan la capacidad proliferativa hasta 2 semanas después del nacimiento, los estudios mecanicistas de regeneración después de una lesión cardíaca en ratones de 0 a 14 días de edad pueden ser informativos para identificar objetivos terapéuticos para la regeneración del corazón adulto lesionado5.
El desarrollo de modelos de ratón de lesión cardíaca implica la manipulación quirúrgica bajo anestesia. Esto requiere que el tórax se abra para acceder al corazón, lo que generalmente requiere intubación y ventilación mecánica. La cepa del ratón, el peso corporal y la edad influyen en la sensibilidad a los anestésicos6. Los ratones adultos pueden ser anestesiados con una amplia gama de agentes, siendo un régimen común para la intubación la ketamina/xilazina/atropina a 100/13/0,5 mg/kg 6,7. Los ratones neonatos (0-7 días de edad) carecen de un reflejo de dolor centralizado, y pueden ser efectivamente inmovilizados en hielo y sometidos a cirugía sin intubación 6,8,9. Las crías de ratón preadolescentes (8-14 días de edad) no pueden ser anestesiadas con hipotermia 9,10; Requieren intubación para cirugía cardiotorácica. No existen estudios previos sobre cirugía cardiotorácica en ratones preadolescentes de menos de 14 días de edad. En nuestra experiencia, la intubación de ratones preadolescentes anestesiados con isoflurano menores de 14 días de edad es difícil. El régimen anestésico inyectable recomendado para ratones mayores de 7 días es de 50-150 mg/kg de ketamina y 5-10 mg/kg de xilazina10. Los ratones preadolescentes todavía se están desarrollando neurológicamente y sus respuestas a los medicamentos y al metabolismo de los medicamentos son muy diferentes de las de los animales adultos6. Esto plantea un mayor riesgo de desequilibrio de líquidos, electrolitos y ácido-base, así como hipoglucemia e hipotermia debido no solo a su alta tasa metabólica, que agota rápidamente sus limitadas reservas de energía, sino también debido a su inmadurez termorreguladora 6,11,12. Por lo tanto, hay poca información sobre los regímenes anestésicos que facilitan la intubación y maximizan la supervivencia de los ratones preadolescentes.
Aquí titulamos empíricamente los regímenes de dosificación de ketamina / xilazina / atropina en cachorros de ratón C57BL / 6J de 10 días de edad que varían en peso de 3-8 g para lograr un plano de anestesia suficiente para permitir la intubación endotraqueal para la cirugía cardiotorácica posterior, al tiempo que minimizamos la mortalidad animal. También refinamos las prácticas de manejo de animales para reducir la mortalidad por intubación, cirugía y canibalismo materno posquirúrgico.
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Protocol
Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Hospital Garvan/St Vincent de acuerdo con el Código Australiano de Prácticas para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos y las pautas ARRIVE, y todos los experimentos fueron realizados por un cirujano experimentado en animales pequeños (JW) con la guía de un anestesista pediátrico (JJS).
1. Preparación de instrumentos
- El día de la cirugía, instale un equipo especializado para la intubación de cachorros de 10 días de edad (Figura 1A, B). Esto incluye una lámpara de calentamiento, una plataforma de intubación, luz de fibra óptica, pinzas pequeñas, un laringoscopio formado por una pieza de alambre de cobre de 0,02 mm de diámetro (60 mm de longitud con el extremo del cable formado en un círculo de 3 mm de diámetro en un ángulo de 175°; Figura 1B), y una cánula intravenosa de plástico (i.v.) calibre 24, que se utiliza como tubo endotraqueal.
- Asegúrese de que la cánula consiste en un tubo de plástico de 19 mm de largo (0,7 mm de diámetro exterior) conectado a un adaptador de bloqueo luer hembra de plástico de 21 mm (Figura 1B). Endurezca el tubo de la cánula insertando un trozo de alambre de cobre a través del adaptador de bloqueo luer. Utilice una cánula con un volumen total de 130 μL para un ratón con un volumen corriente de ~8 μL/g13,14.
2. Anestesia de ratones de 10 días de edad
- El día de la cirugía, retire la presa de una jaula de cachorros C57BL/6J de 10 días de edad y coloque la jaula en una almohadilla de calentamiento (37 °C).
- Anestesiar a las crías con 10 μL por g de peso corporal en inyección intraperitoneal utilizando una jeringa de insulina de 0,5 ml y una aguja de 29 G con ketamina/xilazina/atropina en las proporciones detalladas en la Tabla 1 para diferentes grupos de peso.
- Inmediatamente después de la inyección, coloque el cachorro en una cámara de plexiglás calentada (37 °C) que haya sido preoxigenada con oxígeno al 100%.
3. Intubación de ratones de 10 días de edad
- Después de 3-4 minutos de oxigenación, transfiera el cachorro a una plataforma para la intubación esencialmente como para ratones adultos. Realice esto con el cachorro en posición supina (Figura 1C) o suspendido en un ángulo de 45 °15. Mantenga la temperatura con una lámpara de calentamiento.
- Antes de la intubación, evalúe la profundidad de la anestesia por el reflejo de pellizco de la pata. Para una intubación óptima, el reflejo de pellizco de la pata debe estar presente, pero notablemente reducido del de un animal consciente.
- Después de asegurar el cachorro anestesiado en decúbito supino a una plataforma de intubación (Figura 1C), sostenga la lengua con pequeños fórceps y use un laringoscopio hecho de un trozo de alambre de cobre (Figura 1B) para exponer la glotis y las cuerdas vocales. Ayuda a la visualización de las cuerdas vocales mediante transiluminación con una luz flexible de fibra óptica (Figura 1D).
- Usando una cánula rígida, incline la cánula de modo que el extremo de bloqueo luer sea ligeramente más bajo (~ 10 °) que la punta, y tan pronto como las cuerdas vocales se separen, inserte la cánula y avance hasta que el adaptador de bloqueo luer esté justo fuera de la boca. Retire el alambre inmediatamente después de la intubación.
NOTA: No se espera resistencia durante la intubación en ratones de esta edad a menos que la cánula esté demasiado avanzada y se sienta resistencia de la carina.- Evaluar la profundidad de la anestesia después de la intubación por la capacidad del animal para respirar espontáneamente. Confirme la intubación traqueal exitosa de las crías que respiran espontáneamente bloqueando brevemente el catéter de intubación para verificar que esto impida el movimiento del pecho.
- Transfiera inmediatamente el cachorro intubado a una almohadilla de calentamiento (37 °C) y conecte la cánula endotraqueal a un ventilador que suministre oxígeno al 100% a un caudal de 1 L/min con 30 μL/carrera, 40 μL/carrera o 50 μL/carrera para 3,15-4,59 g, 4,50-5,49 g o 5,50-8,10 g cachorros, respectivamente, y 150 golpes/min.
- Realice estos procedimientos rápidamente, dentro de <15 s para minimizar la reinhalación.
4. Cirugía de infarto de miocardio en ratones de 10 días de edad
- Para inducir un plano quirúrgico de anestesia para la cirugía, cambie el gas que fluye hacia el ventilador de 100% de oxígeno a 4.5% de isoflurano en oxígeno (la concentración de isoflurano está determinada por un vaporizador) durante 4-5 minutos.
- Después de cambiar a isoflurano, confirme nuevamente la intubación traqueal verificando que la frecuencia de movimiento de la pared torácica sea igual a la del ventilador. La pérdida de la respiración espontánea seguida de la ausencia de un reflejo de pellizco de la cola o la pata indica que se ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia (después de 4-5 min).
- Mantener la anestesia con isoflurano al 2% en oxígeno.
- Realizar cirugía de infarto de miocardio bajo un microscopio quirúrgico (objetivo 10x y 16x) como se describe en16.
- Desinfecte la piel con movimientos circulares varias veces con rondas alternas de un exfoliante a base de yodo o clorhexidina y alcohol al 70%. Con unas tijeras finas, haga una incisión horizontal en la piel entre la tercera y cuarta costilla (cuarto espacio intercostal) en la pared lateral izquierda del tórax. Usando fórceps finos, abra el tórax mediante una disección roma del espacio intercostal y use un retractor para mantener el espacio abierto.
- Inducir un infarto de miocardio mediante ligadura de la arteria coronaria izquierda justo distal al apéndice auricular izquierdo con sutura de monofilamento de polipropileno 9-0. Después de la cirugía de infarto de ~ 10 minutos, cierre la piel con prolene 7-0 y desinfecte la incisión con betadine. Limpie el cachorro de sangre con 70% de etanol o solución salina.
NOTA: La ligadura de la arteria coronaria izquierda en cachorros preadolescentes es esencialmente sin sangre, como lo es con las ligaduras de adultos. - Administrar uno tras otro con una jeringa de insulina de 0,5 ml y una aguja de 29 G: atipamezol (1-5 mg/kg, 10 μL, intraperitoneal) para una rápida recuperación de la sedación, analgesia (buprenorfina, 0,075 mg/kg, 10 μL, subcutánea) y solución salina (50 μL, intraperitoneal).
- Permita que los animales se recuperen suspendiendo el isoflurano. Asegúrese de que la respiración espontánea se reanude dentro de unos minutos después.
- Devuelva al cachorro a la cámara preoxigenada calentada y monitoree continuamente durante la recuperación hasta que se recupere el reflejo de enderezamiento, momento en el que extube al cachorro.
- Frote suavemente al cachorro con ropa de cama de jaula casera, mantenga al cachorro caliente, verifique que la respiración sea regular y que el cachorro sea capaz de moverse espontáneamente. Esto reducirá el canibalismo postoperatorio por parte de la presa.
- Devuelva la presa a la jaula cuando todos los cachorros se hayan recuperado completamente de la anestesia.
NOTA: El tiempo total necesario para la preparación, anestesia, intubación, cirugía y recuperación de un cachorro puede variar de 40 a 60 minutos. - La presa doméstica y los cachorros durante la noche en una jaula colocada mitad encendida / mitad fuera de una almohadilla de calentamiento a 37 ° C.
5. Evaluación postoperatoria del tamaño del infarto
- En el3er día después de la cirugía, anestesiar a los cachorros colocándolos en una cámara de plexiglás preequilibrada con isoflurano al 4,5% en oxígeno a una tasa de flujo de 1 ml / min.
- Una vez que se haya alcanzado un plano quirúrgico de anestesia (después de 4-5 min), evaluado por el reflejo de pellizco de la pata, retire al cachorro de la cámara y asegúrelo en posición supina en una almohadilla de calentamiento con cinta adhesiva en la cola.
- Coloque un hilo sobre los incisivos y cinta adhesiva en su posición para mantener la cabeza extendida y coloque la cabeza en un cono nasal conectado a un ventilador que suministre isoflurano al 4,5% en oxígeno a 200 μL / carrera, 150 golpes / min. Mantener un plano quirúrgico de anestesia con isoflurano al 2% en oxígeno.
- Desinfectar la piel con etanol al 70%. Con tijeras finas, haga una incisión de 1 cm en la piel sobre la arteria carótida común derecha a lo largo de la tráquea y cannule el vaso expuesto con un tubo de polietileno de un solo lumen (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) para administrar 0.2 ml de solución salina heparinizada (200 U) durante 1 minuto para prevenir la coagulación de la sangre.
- Aumentar el isoflurano al 4,5% en oxígeno durante 1 minuto antes de administrar rápidamente 0,2 ml de 3,3 M KCl en 2 s para detener el corazón en la diástole.
- Diseccionar la vena yugular derecha a través de la misma incisión y transectarla. Perfundir el corazón con 0,2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), y luego perfundir con 0,1 ml de azul alciano al 0,2% para teñir el miocardio remoto no infartado. Verifique la perfusión exitosa, evidenciada por el lavado de sangre, PBS y luego Alcian Blue a través de la vena yugular.
- Abra el tórax y extirpe el corazón diseccionando el tejido conectivo circundante y los vasos para liberar el corazón. Enjuague el corazón en PBS, retire las aurículas si lo desea y fotografíe el corazón con una cámara montada en un microscopio quirúrgico utilizando un objetivo 10x.
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Representative Results
Anestesia de ratones de 10 días de edad. Los cachorros de 10 días pueden ser anestesiados con isoflurano al 4,5% en 4-5 min; sin embargo, se recuperan de la anestesia en el proceso de preparación para la intubación. Debido a su pequeño tamaño, la intubación bajo anestesia con isoflurano administrada por un cono nasal estándar no es factible. Anteriormente hemos utilizado un régimen anestésico ketamina/xilazina/atropina de 100/13/0,5 mg/kg, respectivamente, para cirugía cardiotorácica en cachorros de 15 y 21 días y adultos 4,7. En experimentos preliminares, que incluyeron suplementos de oxígeno, se encontró que el régimen inyectable recomendado de 50-150 mg / kg de ketamina y 5-10 mg / kg de xilazina 10 resultó en una mortalidad inaceptable en cachorros de10 días de edad. Dada la correlación inversa entre el peso corporal y el tamaño de la camada de las crías de 10 días de edad (R2 = 0,250, p < 0,0001; Figura 2), se tituló el régimen anestésico según las agrupaciones de peso corporal. La reducción de la dosis de ketamina/xilazina/atropina a 50/6/0,18 mg/kg, respectivamente, resultó en una profundidad suficiente de anestesia para permitir la intubación endotraqueal de cachorros que respiran espontáneamente pesando 5,5-8,10 g (Tabla 1), pero esta dosis no fue tolerada por los cachorros más ligeros. La reducción de la dosis de ketamina/xilazina/atropina a 30/4/0,12 mg/kg, respectivamente, permitió la intubación de cachorros que pesaban 4,50-5,49 g, mientras que la reducción adicional de la dosis de ketamina a 20 mg/kg permitió la intubación de cachorros que pesaban 3,15-4,49 g (Tabla 1). La Tabla 1 muestra el número y porcentaje de cachorros intubados que procedieron a la cirugía; Sin embargo, es difícil extraer de estos datos la mortalidad relacionada con la anestesia de la mortalidad asociada con demasiados intentos de intubación. Con el interés de reducir el desperdicio animal, no cuantificamos específicamente la mortalidad relacionada con la anestesia.
Intubación de ratones de 10 días de edad. Los resultados fueron mejores cuando la intubación se logró después de sólo uno o dos intentos. Los cachorros con menor peso corporal fueron más difíciles de intubar que los cachorros más pesados y requirieron más intentos (p < 0,001; Tabla 1). La supervivencia después de la intubación se correlacionó con el peso corporal con una supervivencia del 59%, 70% y 80% para los grupos de bajo, medio y alto peso, respectivamente (R2 = 0,995, p = 0,04; Tabla 1).
Cirugía de infarto de miocardio de ratones de 10 días de edad. Los cachorros fueron monitoreados durante 2 días después de la cirugía. No hubo signos de dolor después de la cirugía. De las crías que no sobrevivieron al seguimiento a las 48 h (Tabla 1), una del grupo de bajo peso murió 6 h después de la cirugía, una cría de cada uno de los grupos de peso medio y alto murió antes de ser colocada de nuevo con la madre, y una cría de cada uno de los grupos de peso medio y alto fue canibalizada por la madre dentro de las 16 h de la cirugía, con pequeñas partes del cuerpo o nada restante a la mañana siguiente. La supervivencia 2 días después de la cirugía de infarto de miocardio fue consistente entre los diferentes grupos de peso en 86%-92% (p = 0,91; Tabla 1). El miocardio infartado, evaluado 2 días después de la cirugía por perfusión del corazón con azul de Alciano, fue evidente por la clara demarcación del tejido teñido, no infartado (azul) del isquémico (no teñido), distal a la ligadura (Figura 1E).
La supervivencia global para todo el procedimiento (intubación más cirugía) se correlacionó con el peso corporal de las crías en 55%, 60% y 70% para los grupos de bajo, medio y alto peso, respectivamente (R2 = 0,978, Tabla 1), aunque esta correlación no alcanzó significación estadística (p = 0,09).
Figura 1: Intubación endotraqueal de una cría de ratón C57BL/6J de 10 días de edad . (A) Configuración de intubación que muestra una lámpara de calentamiento grande (WL), una plataforma de intubación (IP) y una iluminación flexible de fibra óptica (FL) utilizada para ayudar a la visualización de las cuerdas vocales en el momento de la intubación. (B) Fórceps, laringoscopio, cánula de calibre 24 que se utiliza como tubo endotraqueal y un trozo de alambre de cobre que se inserta en el tubo endotraqueal a través del adaptador de bloqueo luer para endurecer la cánula durante la intubación (barra de escala = 1 cm). (C) El cachorro anestesiado se asegura en decúbito supino pegando la cola y las extremidades delanteras en la plataforma de intubación (12 cm (L) x 8,5 cm (A) x 7,5 cm (H)). Se utiliza un hilo colocado sobre los incisivos para extender la cabeza y se pega con cinta adhesiva en su posición. (D) La luz de fibra óptica se coloca sobre el cuello para transiluminar la tráquea justo debajo de las cuerdas vocales. La lengua se sostiene con pequeños fórceps, y luego se visualiza el movimiento de las cuerdas vocales exponiendo la glotis con el laringoscopio. El tubo endotraqueal se inserta en la tráquea mientras las cuerdas vocales están abiertas. (E) Fotografía de un corazón de cachorro de ratón representativo perfundido con azul alciano (vista frontal con la base del corazón en la parte superior y el ápice en la parte inferior, y aurículas eliminadas) 48 h después de la ligadura (sutura negra, flecha negra) de la arteria coronaria izquierda tomada bajo un microscopio quirúrgico (objetivo 10x) montado con una cámara. El miocardio no infartado se tiñe de azul, el miocardio infartado en el ápice no está teñido y es pálido; barra de escala = 100 μm. Esta cifra se ha modificado de17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El peso corporal de las crías C57BL / 6 de 10 días de edad se correlaciona inversamente con el tamaño de la camada. Los cachorros eran de camadas que variaban en tamaño de 4 a 10. El tamaño promedio de la camada C57BL / 6 es siete18. Los datos fueron analizados por regresión lineal simple, siendo p < 0,05 considerados significativos. Esta cifra se ha modificado de17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Régimen de anestesia: ketamina/xilazina/atropina (mg/kg); administrado en 10 ml/g de peso corporal, ip | Peso corporal, g | Número de cachorros estudiados | Intentos de intubación (A, 1-2; B, 3-4 o C, >4) y número de cachorros intubados, n (%) | Cachorros intubados que proceden a cirugía, n (%) | Supervivencia dos días después de la cirugía, n (%) | Supervivencia global después de la intubación más cirugía, n (%) | ||
| Un | B | C | ||||||
| 20/4/0.12 | 3.15 - 4.49 | 22 | 8 (36) | 9 (41) | 5 (23) | 13 (59) | 12 (92) | 12 (55) |
| 30/4/0.12 | 4.50 - 5.49 | 20 | 13 (65) | 5 (25) | 2 (10) | 14 (70) | 12 (86) | 12 (60) |
| 50/6/0.18 | 5.50 - 7.30 | 20 | 13 (65) | 3 (15) | 4 (20) | 16 (80) | 14 (88) | 14 (70) |
| p (prueba de Chi-cuadrado) | p<0,001 | p=0,91 | ||||||
| R2 (Coeficiente de correlación, | 0.995, | 0.978, | ||||||
| valor p) | p=0,04 | p=0,09 | ||||||
Tabla 1: Régimen de anestesia, número de intentos de intubación y supervivencia posterior al procedimiento de cachorros de ratón de 10 días de edad. Los datos fueron analizados por la prueba de Chi-cuadrado, siendo p < 0,05 considerados significativos.
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Discussion
Actualmente, no existen métodos bien documentados para la anestesia y la intubación de ratones de 10 días de edad para cirugía cardiotorácica. Con este fin, hemos titulado los regímenes de dosificación de ketamina / xilazina / atropina al peso corporal, por lo que las dosis de 20/4/0.12 mg / kg, 30/4/0.12 mg / kg y 50/6/0.18 mg / kg facilitaron la intubación de cachorros con bajo (3.15-4.49 g), medio (4.50-5.49 g) y alto (5.50-8.10 g) peso corporal, respectivamente. La supervivencia después de la intubación se correlacionó con el peso corporal (59%, 70% y 80% para los grupos de bajo, medio y alto peso, respectivamente). Dada la dificultad encontrada con la intubación de cachorros de 10 días de edad y la alta mortalidad asociada, recomendamos que la cirugía cardiotorácica en cachorros de 10 días se restrinja a animales que pesen al menos 5,50 g. Una limitación de esta técnica de intubación es que depende de la habilidad y experiencia del operador, y de la rapidez con que pueden aprender. Sin embargo, se anticipa que un operador con experiencia en intubaciones de adultos puede lograr la competencia en la intubación preadolescente después de practicar en 10 camadas de siete a ocho cachorros. Otra limitación es que la supervivencia general de las crías después de la intubación y la cirugía de infarto de miocardio varió del 55% (grupo de peso corporal más bajo) al 70% (grupo de peso corporal más alto). Sin embargo, esto es similar a la supervivencia del 60%-70% reportada para los cachorros de 1 día de edad, que no requieren intubación cuando se someten a infarto de miocardio después de la inmovilización en hielo8.
Encontramos que las crías de ratón de 10 días de edad de diferentes pesos tuvieron una respuesta no lineal al régimen anestésico de ketamina / xilazina / atropina. Esto puede reflejar las diferencias de desarrollo en una serie de áreas importantes. La tasa metabólica basal escala alométricamente a las tres cuartas partes de potencia de masa, desde células individuales hasta mamíferos19. Esto influiría en la disposición del fármaco en los animales en el estudio, que varió en peso dos veces y media. La madurez del metabolismo de los fármacos o de los mecanismos de desintoxicación es otro factor que cambia rápidamente en el período postnatal inmediato, al igual que los mecanismos que influyen en la disponibilidad libre de fármacos, como la unión a proteínas20. Las diferencias farmacocinéticas pueden no ser la única explicación para las relaciones no lineales fármaco-efecto, ya que las diferencias en las respuestas farmacodinámicas a los agentes sedantes también son posibles6. El uso de oxigenación después de la inyección intraperitoneal de anestésicos y antes de la intubación probablemente mejoró la seguridad del procedimiento, como se ha observado recientemente para adultos21. Los ajustes adicionales en la dosis, particularmente para el grupo de peso corporal más bajo, pueden mejorar la supervivencia.
La profundidad de la anestesia fue crítica para el éxito de la intubación. La intubación era difícil si el plano de anestesia era demasiado ligero, y si era demasiado profundo, los cachorros dejaban de respirar espontáneamente, ya sea durante la intubación o después de la intubación mientras estaban ventilados con oxígeno. El manejo de los cachorros a veces también causaba contención de la respiración, especialmente durante la intubación. Si la respiración se detenía durante la intubación, la estimulación del pie o la cola, o el regreso de los cachorros a la cámara llena de oxígeno calentado, era fundamental para restaurar la respiración regular. La intubación se volvió a intentar cuando el cachorro reanudó la respiración regular. Si la respiración se detenía después de la intubación, los animales eran ventilados hasta 10 minutos con oxígeno. Si la respiración espontánea se reanudaba durante este tiempo, los animales procedieron a la cirugía. Sin embargo, encontramos que si la respiración espontánea no se restableció dentro de este tiempo, los cachorros no se recuperaron de la anestesia o, si se sometieron a cirugía, murieron durante el período de recuperación.
Dada la alta tasa metabólica de los cachorros de 10 días de edad, es mejor limitar el agotamiento de las reservas de energía separando la madre de sus cachorros durante el menor tiempo posible y, por lo tanto, restringir el número de operaciones quirúrgicas a cuatro o cinco cachorros por camada por día durante un período máximo de 5-6 h. Para reducir el canibalismo materno de los cachorros que se habían sometido a cirugía, cualquier compañero de camada que no se sometió a cirugía fue retirado a madres adoptivas o sacrificado antes de regresar la madre a la jaula. Nuestras prácticas de manejo para reducir la mortalidad por canibalismo materno postquirúrgico fueron similares a las que se han descrito para neonatos9.
En conclusión, nuestro estudio de factibilidad sugiere que se requiere un régimen anestésico inyectable de ketamina / xilazina / atropina considerablemente más bajo que el utilizado para ratones más viejos para minimizar la mortalidad por intubación de cachorros de ratón de 10 días de edad para cirugía cardiotorácica posterior, al igual que prácticas de manejo específicas para reducir la mortalidad por intubación, cirugía y canibalismo materno posquirúrgico.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por NHMRC Program Grant [ID 1074386], una subvención de Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research [RMG] y una subvención de RT Hall Trust [RMG & SEI].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole (Antisedan) | Provet (NSW) Pty Ltd | ATIP I | |
| Atropine 600 mcg/mL | Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd | 1957699 PFIZER-0143386 | |
| Betadine | Livingstone International | BU0520 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Provet (NSW) Pty Ltd | TEMG I | |
| Fiber-optic light | Leica | 3011350 | CLS 150X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 9.1.2 | |
| Intubation platform | - | - | Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H) |
| Isoflurane | Provet (NSW) Pty Ltd | ISOF 07 | |
| Ketamine 100 mg/mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | |
| Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety | BD Insyte | CE0086 | 19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL |
| Single lumen polyethylene tube | Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW | Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm | |
| Small forceps | F.S.T. | NO 11051-10 | |
| Surgical microscope (camera optional) | Leica | M651 (Leica IC80 HD camera) | 10x and 16x objective |
| Suture 7-0 prolene | Ethicon | 8708H | |
| Suture 9-0 polypropylene monofilament | Ethicon | 2813 | |
| V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm | VetEquip | 901820 | |
| Vented 2-Liter plexiglass induction chamber | VetQuip Pty Ltd | 942102 | 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H) |
| Warming lamp | Brilant Lighting | 99223 | |
| Xylazine | Provet (NSW) Pty Ltd | XYLA Z 2 |
References
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