Summary
تتطلب النماذج الجراحية القلبية الصدرية في الفئران التي يبلغ عمرها >7 أيام التنبيب ، ولكن هذا يمثل تحديا لجراء الفئران قبل المراهقة (8-14 يوما) وهناك القليل من المعلومات حول أنظمة التخدير للتنبيب. هنا ، نقدم أنظمة جرعات الكيتامين / الزيلازين / الأتروبين في جراء الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 10 أيام والتي تسمح بالتنبيب الرغامي ، مع تقليل وفيات الحيوانات.
Abstract
تلعب النماذج الجراحية للفئران دورا مهما في الأبحاث قبل السريرية. يمكن الحصول على رؤى ميكانيكية حول تجديد عضلة القلب بعد إصابة القلب من نماذج جراحة القلب والصدر في الفئران التي تتراوح أعمارها بين 0 و 14 يوما ، والتي تحتفظ خلايا عضلة القلب فيها ، على عكس خلايا البالغين ، بالقدرة التكاثرية. يتم تجميد صغار الفئران حتى عمر 7 أيام بشكل فعال عن طريق انخفاض حرارة الجسم ولا تتطلب التنبيب لجراحة القلب والصدر. ومع ذلك ، فإن صغار الفئران قبل سن المراهقة (8-14 يوما) يحتاجون إلى التنبيب ، لكن هذا يمثل تحديا وهناك القليل من المعلومات المتعلقة بالتخدير لتسهيل التنبيب. هنا ، نقدم أنظمة جرعات الكيتامين / الزيلازين / الأتروبين في جراء الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 10 أيام والتي تسمح بالتنبيب الرغامي ، مع تقليل وفيات الحيوانات. أشارت المعايرة التجريبية لنظم جرعات الكيتامين / الزيلازين / الأتروبين إلى وزن الجسم إلى أن الاستجابة لتخدير صغار الفئران ذات الأوزان المختلفة كانت غير خطية ، حيث سهلت الجرعات 20/4 / 0.12 مجم / كجم ، 30/4 / 0.12 مجم / كجم ، و 50/6 / 0.18 مجم / كجم التنبيب للجراء التي يتراوح وزنها بين 3.15-4.49 جم (ن = 22) ، 4.50-5.49 جم (ن = 20) ، و 5.50-8.10 جم (ن = 20) ، على التوالي. تتطلب الجراء ذات وزن الجسم المنخفض محاولات تنبيب أكثر من الجراء الأثقل (p < 0.001). ارتبط البقاء على قيد الحياة بعد التنبيب بوزن الجسم (59٪ و 70٪ و 80٪ للمجموعات منخفضة ومتوسطة وعالية الوزن ، على التوالي ، R2 = 0.995). بالنسبة لجراحة احتشاء عضلة القلب بعد التنبيب ، تم تحفيز مستوى جراحي للتخدير بنسبة 4.5٪ إيزوفلوران في أكسجين 100٪ والحفاظ عليه بنسبة 2٪ إيزوفلوران في أكسجين 100٪. كان البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة مشابها لمجموعات الوزن الثلاث بنسبة 92٪ و 86٪ و 88٪ (p = 0.91). جنبا إلى جنب مع التحسينات في ممارسات التعامل مع الحيوانات للتنبيب والجراحة ، وتقليل أكل لحوم البشر من قبل السد بعد الجراحة ، فإن البقاء على قيد الحياة بشكل عام للإجراء بأكمله (التنبيب بالإضافة إلى الجراحة) يرتبط بوزن الجسم (55٪ و 60٪ و 70٪ للمجموعات منخفضة ومتوسطة وعالية الوزن ، على التوالي ، R2 = 0.978). نظرا للصعوبة التي تواجهها مع تنبيب الجراء البالغة من العمر 10 أيام وما يرتبط بها من ارتفاع معدل الوفيات ، نوصي بأن تقتصر جراحة القلب والصدر في الجراء البالغة من العمر 10 أيام على الجراء التي لا يقل وزنها عن 5.5 جرام.
Introduction
تعد نماذج الفئران أدوات لا تقدر بثمن في أبحاث القلب والصدر قبل السريرية ، لا سيما بسبب السهولة التي يمكن بها إنشاء خطوط الفئران المعدلة وراثيا ، وكذلك السهولة التي يمكن بها التلاعب بالفئران جراحيا لتوفير نماذج الأمراض المرضية للسماح ، على سبيل المثال ، بدراسة تجديد عضلة القلب بعد إصابة القلب1 . في هذا الصدد ، من المثير للاهتمام أنه على عكس الفئران البالغة التي انسحبت فيها خلايا عضلة القلب من دورة الخلية ، يتم إصلاح قلوب الفئران حديثي الولادة البالغة من العمر 0-2 يوم مع الحد الأدنى من الندوب بعد الاستئصال القمي أو تحريض احتشاء عضلة القلب2،3،4. في المقابل ، تتجدد قلوب الأطفال حديثي الولادة البالغة من العمر 7 أيام بشكل غير كامل مع ارتفاع معدل التندب 2,3. نظرا لأن خلايا عضلة القلب في قمة البطين الأيسر تحتفظ بالقدرة التكاثرية لمدة تصل إلى أسبوعين بعد الولادة ، فقد تكون الدراسات الميكانيكية للتجديد بعد إصابة القلب في الفئران البالغة من العمر 0-14 يوما مفيدة لتحديد الأهداف العلاجية لتجديد القلب البالغ المصاب5.
تطوير نماذج الماوس من إصابة القلب ينطوي على التلاعب الجراحي تحت التخدير. وهذا يتطلب فتح الصدر للوصول إلى القلب، الأمر الذي يفرض عموما التنبيب والتهوية الميكانيكية. تؤثر إجهاد الفأر ووزن الجسم والعمر على الحساسية للتخدير6. يمكن تخدير الفئران البالغة بمجموعة واسعة من العوامل ، ونظام شائع للتنبيب هو الكيتامين / الزيلازين / الأتروبين عند 100/13 / 0.5 مجم / كجم 6,7. تفتقر الفئران حديثي الولادة (0-7 أيام) إلى منعكس الألم المركزي ، ويمكن تجميدها بشكل فعال على الجليد وإخضاعها لعملية جراحية دون تنبيب6،8،9. لا يمكن تخدير جراء الفئران قبل المراهقة (8-14 يوما) بانخفاض حرارة الجسم 9,10 ؛ أنها تتطلب التنبيب لجراحة القلب والصدر. لا توجد دراسات سابقة حول جراحة القلب والصدر في الفئران قبل المراهقة أقل من 14 يوما. في تجربتنا ، من الصعب تنبيب الفئران قبل المراهقة المخدرة إيزوفلوران تحت سن 14 يوما. نظام التخدير عن طريق الحقن الموصى به للفئران التي يزيد عمرها عن 7 أيام هو 50-150 مغ/كغ كيتامين و5-10 مغ/كغ زيلازين10. لا تزال الفئران قبل المراهقة تتطور عصبيا وتختلف استجاباتها للأدوية واستقلاب المخدرات اختلافا كبيرا عن الحيوانات البالغة6. هذا يشكل خطرا متزايدا من اختلال توازن السوائل والكهارل والحمض القاعدي ، بالإضافة إلى نقص السكر في الدم وانخفاض حرارة الجسم ليس فقط بسبب ارتفاع معدل الأيض ، مما يؤدي إلى استنفاد مخازن الطاقة المحدودة بسرعة ، ولكن أيضا بسبب عدم نضجها الحراري6،11،12. وبالتالي ، هناك القليل من المعلومات حول أنظمة التخدير التي تسهل التنبيب وتزيد من بقاء الفئران قبل المراهقة.
هنا قمنا بمعايرة أنظمة جرعات تجريبية من الكيتامين / الزيلازين / الأتروبين في جراء الفئران C57BL / 6J البالغة من العمر 10 أيام والتي يتراوح وزنها من 3-8 جم لتحقيق مستوى من التخدير يكفي للسماح بالتنبيب الرغامي لجراحة القلب والصدر اللاحقة ، مع تقليل وفيات الحيوانات. قمنا أيضا بتحسين ممارسات التعامل مع الحيوانات لتقليل الوفيات الناجمة عن التنبيب والجراحة وأكل لحوم البشر بعد الجراحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات الموصوفة من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في مستشفى غارفان / سانت فنسنت وفقا لمدونة الممارسات الأسترالية لرعاية واستخدام الحيوانات للأغراض العلمية وإرشادات REACH ، وتم إجراء جميع التجارب من قبل جراح صغير متمرس (JW) بتوجيه من طبيب تخدير الأطفال (JJS).
1. إعداد الأدوات
- في يوم الجراحة ، قم بإعداد معدات متخصصة لتنبيب الجراء البالغة من العمر 10 أيام (الشكل 1 أ ، ب). ويشمل ذلك مصباح تدفئة ، ومنصة تنبيب ، وضوء ألياف بصرية ، وملقط صغير ، ومنظار حنجري مصنوع من قطعة من سلك نحاسي قطره 0.02 مم (طوله 60 مم مع نهاية السلك على شكل دائرة قطرها 3 مم بزاوية 175 درجة ؛ الشكل 1B) ، وقنية بلاستيكية في الوريد (IV) قياس 24 ، والتي تستخدم كأنبوب القصبة الهوائية.
- تأكد من أن القنية تتكون من أنبوب بلاستيكي بطول 19 مم (0.7 مم OD) متصل بمحول قفل بلاستيكي أنثى مقاس 21 مم (الشكل 1 ب). قم بتقوية أنبوب القنية عن طريق إدخال قطعة من الأسلاك النحاسية عبر محول قفل luer. استخدم قنية بحجم إجمالي 130 ميكرولتر للماوس بحجم المد والجزر ~ 8 ميكرولتر / جم13,14.
2. تخدير الفئران البالغة من العمر 10 أيام
- في يوم الجراحة ، أخرج السد من قفص من جراء C57BL / 6J البالغ من العمر 10 أيام وضع القفص على وسادة تدفئة (37 درجة مئوية).
- تخدير الجراء بمقدار 10 ميكرولتر لكل غرام من وزن الجسم الحقن داخل الصفاق باستخدام حقنة أنسولين 0.5 مل وإبرة 29 جم مع الكيتامين / الزيلازين / الأتروبين بالنسب المفصلة في الجدول 1 لمجموعات الوزن المختلفة.
- مباشرة بعد الحقن ، ضع الجرو في غرفة زجاجية دافئة (37 درجة مئوية) تم أكسجتها مسبقا بأكسجين 100٪.
3. التنبيب من الفئران البالغة من العمر 10 أيام
- بعد 3-4 دقائق من الأوكسجين ، انقل الجرو إلى منصة للتنبيب بشكل أساسي كما هو الحال بالنسبة للفئران البالغة. قم بإجراء ذلك مع الجرو في وضع الاستلقاء (الشكل 1C) أو معلقا بزاوية 45 درجة15. الحفاظ على درجة الحرارة مع مصباح الاحترار.
- قبل التنبيب ، قم بتقييم عمق التخدير بواسطة منعكس قرصة مخلب. للحصول على التنبيب الأمثل ، يجب أن يظل منعكس قرصة المخلب موجودا ولكن يتم تقليله بشكل ملحوظ عن منعكس الحيوان الواعي.
- بعد تثبيت جرو مخدر مستلق على منصة التنبيب (الشكل 1C) ، أمسك اللسان بملقط صغير واستخدم منظار الحنجرة المصنوع من قطعة من الأسلاك النحاسية (الشكل 1 ب) لفضح المزمار والحبال الصوتية. ساعد في تصور الحبال الصوتية عن طريق الإضاءة العابرة باستخدام ضوء ألياف بصرية مرن (الشكل 1 د).
- باستخدام قنية صلبة ، قم بإمالة القنية بحيث تكون نهاية قفل luer أقل قليلا (~ 10 درجات) من الطرف ، وبمجرد فصل الحبال الصوتية ، أدخل القنية وقدمها حتى يصبح محول قفل luer خارج الفم مباشرة. قم بإزالة السلك مباشرة بعد التنبيب.
ملاحظة: لا يتوقع حدوث مقاومة أثناء التنبيب في الفئران في هذا العمر ما لم تكن القنية متقدمة جدا ، وتشعر بالمقاومة من الكارينا.- تقييم عمق التخدير بعد التنبيب من خلال قدرة الحيوان على التنفس تلقائيا. تأكد من نجاح التنبيب الرغامي للجراء الذين يتنفسون تلقائيا عن طريق منع قسطرة التنبيب لفترة وجيزة للتحقق من أن هذا يمنع حركة الصدر.
- انقل الجرو المجفف على الفور إلى وسادة تدفئة (37 درجة مئوية) وقم بتوصيل قنية القصبة الهوائية بجهاز التنفس الصناعي الذي يوفر الأكسجين بنسبة 100٪ بمعدل تدفق 1 لتر / دقيقة مع 30 ميكرولتر / شوط ، 40 ميكرولتر / شوط ، أو 50 ميكرولتر / شوط ل 3.15-4.59 جم ، 4.50-5.49 جم ، أو 5.50-8.10 جم جراء ، على التوالي ، و 150 ضربة / دقيقة.
- نفذ هذه الإجراءات بسرعة ، في غضون <15 ثانية لتقليل إعادة التنفس.
4. جراحة احتشاء عضلة القلب للفئران البالغة من العمر 10 أيام
- للحث على مستوى جراحي للتخدير للجراحة ، قم بتبديل الغاز المتدفق إلى جهاز التنفس الصناعي من 100٪ أكسجين إلى 4.5٪ إيزوفلوران في الأكسجين (يتم تحديد تركيز الأيزوفلوران بواسطة المرذاذ) لمدة 4-5 دقائق.
- بعد التبديل إلى إيزوفلوران ، تأكد من التنبيب الرغامي مرة أخرى عن طريق التحقق من أن وتيرة حركة جدار الصدر تساوي تردد جهاز التنفس الصناعي. يشير فقدان التنفس التلقائي متبوعا بغياب منعكس قرصة الذيل أو المخلب إلى أنه تم الوصول إلى مستوى جراحي للتخدير (بعد 4-5 دقائق).
- الحفاظ على التخدير مع 2 ٪ إيزوفلوران في الأكسجين.
- إجراء جراحة احتشاء عضلة القلب تحت المجهر الجراحي (هدف 10x و 16x) كما هو موضح في16.
- تطهير الجلد في حركة دائرية عدة مرات مع جولات متناوبة من فرك أساسه اليود أو الكلورهيكسيدين و 70 ٪ من الكحول. باستخدام مقص ناعم ، قم بعمل شق أفقي للجلد بين الضلع الثالث والرابع (الفضاء الوربي الرابع) في الجدار الجانبي الأيسر للصدر. باستخدام ملقط ناعم ، افتح الصدر عن طريق تشريح حاد للمساحة الوربية واستخدم مبعدة لإبقاء المساحة مفتوحة.
- إحداث احتشاء عضلة القلب عن طريق ربط الشريان التاجي الأيسر فقط إلى الزائدة الأذينية اليسرى مع خياطة 9-0 من البولي بروبلين أحادي الشعيرات. بعد جراحة الاحتشاء ~ 10 دقائق ، أغلق الجلد ب 7-0 برولين وقم بتطهير الشق باستخدام البيتادين. تنظيف جرو الدم مع 70 ٪ من الإيثانول أو المالحة.
ملاحظة: ربط الشريان التاجي الأيسر في الجراء قبل سن المراهقة هو في الأساس غير دموي ، كما هو الحال مع ربط البالغين. - يتم تطبيق الدواء واحدا تلو الآخر باستخدام حقنة أنسولين سعة 0.5 مل وإبرة بوزن 29 غ: أتيباميزول (1-5 ملغ/كغ، 10 ميكرولتر، داخل الصفاق) للتعافي السريع من التخدير، تسكين الألم (البوبرينورفين، 0.075 ملغ/كغ، 10 ميكرولتر، تحت الجلد)، والمحلول الملحي (50 ميكرولتر، داخل الصفاق).
- السماح للحيوانات بالتعافي عن طريق التوقف عن الأيزوفلوران. تأكد من استئناف التنفس التلقائي في غضون بضع دقائق بعد ذلك.
- أعد الجرو إلى غرفة التسخين المؤكسج مسبقا وراقبه باستمرار أثناء التعافي حتى يتم استعادة المنعكس الصحيح ، وعند هذه النقطة قم بإخراج الجرو.
- افرك الجرو برفق بفراش القفص المنزلي ، وحافظ على دفء الجرو ، وتأكد من أن التنفس منتظم ، وأن الجرو قادر على الحركة التلقائية. هذا سوف يقلل من أكل لحوم البشر بعد الجراحة عن طريق السد.
- أعد السد إلى القفص عندما يتعافى جميع الجراء تماما من التخدير.
ملاحظة: يمكن أن يتراوح الوقت الإجمالي المستغرق للتحضير والتخدير والتنبيب والجراحة واستعادة جرو واحد من 40-60 دقيقة. - سد المنزل والجراء بين عشية وضحاها في قفص وضعت نصف على / نصف قبالة وسادة التدفئة 37 درجة مئوية.
5. تقييم حجم الاحتشاء بعد الجراحة
- فياليوم الثالث بعد الجراحة ، قم بتخدير الجراء عن طريق وضعهم في غرفة زجاجية متوازنة مسبقا مع 4.5٪ إيزوفلوران في الأكسجين بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة.
- بمجرد الوصول إلى المستوى الجراحي للتخدير (بعد 4-5 دقائق) ، يتم تقييمه بواسطة منعكس قرصة المخلب ، قم بإزالة الجرو من الغرفة وثبته في وضع الاستلقاء على وسادة تدفئة عن طريق لصق الذيل.
- ضع خيطا فوق القواطع والشريط في موضعه لإبقاء الرأس ممتدا وضع الرأس في مخروط أنف متصل بجهاز تهوية يوفر 4.5٪ إيزوفلوران في الأكسجين عند 200 ميكرولتر / شوط ، 150 ضربة / دقيقة. الحفاظ على مستوى جراحي للتخدير مع 2 ٪ إيزوفلوران في الأكسجين.
- تطهير الجلد مع 70 ٪ من الإيثانول. باستخدام مقص دقيق ، قم بعمل شق 1 سم في الجلد فوق الشريان السباتي المشترك الأيمن على طول القصبة الهوائية وقم بتنظيف الوعاء المكشوف باستخدام أنبوب بولي إيثيلين أحادي التجويف (OD 0.61 مم ، معرف 0.28 مم) لإدارة 0.2 مل من محلول ملحي هيبارين (200 يو) لمدة دقيقة واحدة لمنع تخثر الدم.
- زيادة إيزوفلوران إلى 4.5٪ في الأكسجين لمدة 1 دقيقة قبل إعطاء 0.2 مل بسرعة من 3.3 M KCl في غضون 2 ثانية لإيقاف القلب في الانبساط.
- تشريح الوريد الوداجي الأيمن عبر نفس الشق ونقله. قم بتخلل القلب ب 0.2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم قم بترشيح 0.1 مل من 0.2٪ Alcian Blue لتلطيخ عضلة القلب البعيدة غير المحتشة. تحقق من التروية الناجحة ، كما يتضح من غسل الدم ، PBS ، ثم Alcian Blue عبر الوريد الوداجي.
- افتح الصدر واستأصل القلب عن طريق تشريح النسيج الضام المحيط والأوعية لتحرير القلب. اشطف القلب في برنامج تلفزيوني ، وقم بإزالة الأذينين إذا رغبت في ذلك ، وقم بتصوير القلب بكاميرا مثبتة على مجهر جراحي باستخدام هدف 10x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تخدير الفئران البالغة من العمر 10 أيام. يمكن تخدير الجراء البالغة من العمر 10 أيام بنسبة 4.5٪ إيزوفلوران في 4-5 دقائق ؛ ومع ذلك ، فإنها تتعافى من التخدير في عملية التحضير للتنبيب. نظرا لصغر حجمها ، فإن التنبيب تحت تخدير إيزوفلوران الذي يتم توصيله بواسطة مخروط الأنف القياسي غير ممكن. لقد استخدمنا سابقا نظام مخدر كيتامين / زيلازين / أتروبين 100/13 / 0.5 مجم / كجم ، على التوالي ، لجراحة القلب والصدر في الجراء الذين تتراوح أعمارهم بين 15 و 21 يوما والبالغين 4,7. وفي التجارب الأولية، التي شملت مكملات الأكسجين، تبين أن النظام الموصى به عن طريق الحقن الذي يتراوح بين 50 و150 مغ/كغ من الكيتامين و5-10 مغ/كغ من الزيلازين 10 أدى إلى نفوق غير مقبول في صغار يبلغون من العمر10 أيام. بالنظر إلى العلاقة العكسية بين وزن الجسم وحجم القمامة للجراء البالغة من العمر 10 أيام (R2 = 0.250 ، p < 0.0001 ؛ الشكل 2) ، قمنا بمعايرة نظام التخدير وفقا لمجموعات وزن الجسم. أدى تقليل جرعة الكيتامين / الزيلازين / الأتروبين إلى 50/6 / 0.18 مجم / كجم ، على التوالي ، إلى عمق كاف من التخدير للسماح بالتنبيب الرغامي للجراء التي تتنفس تلقائيا والتي تزن 5.5-8.10 جم (الجدول 1) ، ولكن لم يتم تحمل هذه الجرعة من قبل الجراء الأخف. أدى تقليل جرعة الكيتامين / الزيلازين / الأتروبين إلى 30/4 / 0.12 مجم / كجم ، على التوالي ، إلى تمكين التنبيب للجراء الذين يزنون 4.50-5.49 جم ، مع زيادة تقليل جرعة الكيتامين إلى 20 مجم / كجم من التنبيب للجراء الذين يزنون 3.15-4.49 جم (الجدول 1). يوضح الجدول 1 عدد ونسبة الجراء التنبيب الذين شرعوا في الجراحة. ومع ذلك ، من الصعب استخراج الوفيات المرتبطة بالتخدير من هذه البيانات من الوفيات المرتبطة بالعديد من محاولات التنبيب. من أجل الحد من هدر الحيوانات ، لم نقم بتحديد الوفيات المرتبطة بالتخدير على وجه التحديد.
التنبيب للفئران البالغة من العمر 10 أيام. كانت النتائج أفضل عندما تم تحقيق التنبيب بعد محاولة واحدة أو محاولتين فقط. كان التنبيب أكثر صعوبة في التنبيب من الجراء الأثقل وزنا وتطلب المزيد من المحاولات (p < 0.001; الجدول 1). ارتبط البقاء على قيد الحياة بعد التنبيب بوزن الجسم بنسبة 59٪ و 70٪ و 80٪ للبقاء على قيد الحياة للمجموعات ذات الوزن المنخفض والمتوسط والعالي ، على التوالي (R2 = 0.995 ، p = 0.04 ؛ الجدول 1).
جراحة احتشاء عضلة القلب للفئران البالغة من العمر 10 أيام. تمت مراقبة الجراء لمدة 2 أيام بعد الجراحة. لم تكن هناك علامات على الألم بعد الجراحة. من بين الجراء الذين لم ينجوا للمتابعة في 48 ساعة (الجدول 1) ، توفي واحد من المجموعة منخفضة الوزن بعد 6 ساعات من الجراحة ، وتوفي جرو واحد من كل من المجموعتين المتوسطة والعالية الوزن قبل إعادته مع السد ، وتم تفكيك جرو واحد من كل من المجموعات ذات الوزن المتوسط والعالي بواسطة السد في غضون 16 ساعة من الجراحة ، مع أجزاء صغيرة من الجسم أو لا شيء متبقي في صباح اليوم التالي. البقاء على قيد الحياة 2 أيام بعد جراحة احتشاء عضلة القلب كان ثابتا بين مجموعات الوزن المختلفة في 86٪ -92٪ (p = 0.91; الجدول 1). احتشاء عضلة القلب ، كما تم تقييمه بعد يومين من الجراحة عن طريق التروية الزرقاء Alcian للقلب ، كان واضحا من خلال ترسيم واضح للأنسجة الملطخة وغير المحتشدة (الزرقاء) من الأنسجة الإقفارية (غير الملوثة) ، البعيدة عن الربط (الشكل 1E).
ارتبط البقاء على قيد الحياة بشكل عام للإجراء بأكمله (التنبيب بالإضافة إلى الجراحة) بوزن جسم الجرو بنسبة 55٪ و 60٪ و 70٪ للمجموعات منخفضة ومتوسطة وعالية الوزن ، على التوالي (R2 = 0.978 ، الجدول 1) ، على الرغم من أن هذا الارتباط لم يحقق دلالة إحصائية (p = 0.09).
الشكل 1: التنبيب الرغامي لجرو فأر C57BL / 6J يبلغ من العمر 10 أيام . (أ) إعداد التنبيب الذي يظهر مصباح تدفئة كبير (WL) ، ومنصة تنبيب (IP) ، وإضاءة مرنة من الألياف الضوئية (FL) تستخدم للمساعدة في تصور الحبال الصوتية في وقت التنبيب. (ب) ملقط، منظار الحنجرة، قنية قياس 24 تستخدم كأنبوب داخل القصبة الهوائية، وقطعة من الأسلاك النحاسية يتم إدخالها في الأنبوب الرغامي عبر محول قفل اللوير لتقوية القنية أثناء التنبيب (شريط المقياس = 1 سم). (ج) يتم تأمين الجرو المخدر مستلقا عن طريق لصق الذيل والأطراف الأمامية على منصة التنبيب (12 سم (طول) × 8.5 سم (عرض) × 7.5 سم (ارتفاع)). يتم استخدام خيط يوضع فوق القواطع لتمديد الرأس ويتم تسجيله في موضعه. (د) يوضع ضوء الألياف الضوئية على الرقبة لإضاءة القصبة الهوائية أسفل الأحبال الصوتية مباشرة. يتم تثبيت اللسان بملقط صغير ، ثم يتم تصور حركة الحبال الصوتية عن طريق تعريض المزمار باستخدام منظار الحنجرة. يتم إدخال الأنبوب الرغامي في القصبة الهوائية بينما تكون الحبال الصوتية مفتوحة. (ه) صورة لقلب جرو فأر تمثيلي تتخلله أزرق ألسيان (منظر أمامي مع قاعدة القلب في الأعلى والقمة في الأسفل ، وإزالة الأذينين) بعد 48 ساعة من الربط (خياطة سوداء ، سهم أسود) للشريان التاجي الأيسر مأخوذة تحت مجهر جراحي (هدف 10x) مثبت بكاميرا. عضلة القلب غير المحتشدة ملطخة باللون الأزرق ، وعضلة القلب المحتشدة في القمة غير ملوثة وشاحبة ؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من17. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: يرتبط وزن جسم جراء C57BL / 6 البالغة من العمر 10 أيام عكسيا بحجم القمامة. كانت الجراء من الفضلات التي يتراوح حجمها من 4-10. متوسط حجم القمامة C57BL / 6 هو سبعة18. تم تحليل البيانات عن طريق الانحدار الخطي البسيط ، مع اعتبار p < 0.05 مهما. تم تعديل هذا الرقم من17. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| نظام التخدير: الكيتامين / الزيلازين / الأتروبين (ملغم / كغم); معطى في 10 مل / غرام من وزن الجسم ، IP | وزن الجسم ، ز | عدد الجراء التي تمت دراستها | محاولات التنبيب (أ ، 1-2 ؛ B ، 3-4 أو C ، >4) وعدد الجراء الذين تم تنبيبهم ، n (٪) | الجراء التنبيب الشروع في الجراحة ، ن (٪) | البقاء على قيد الحياة يومين بعد الجراحة ، ن (٪) | البقاء على قيد الحياة بشكل عام بعد التنبيب بالإضافة إلى الجراحة ، n (٪) | ||
| A | B | C | ||||||
| 20/4/0.12 | 3.15 - 4.49 | 22 | 8 (36) | 9 (41) | 5 (23) | 13 (59) | 12 (92) | 12 (55) |
| 30/4/0.12 | 4.50 - 5.49 | 20 | 13 (65) | 5 (25) | 2 (10) | 14 (70) | 12 (86) | 12 (60) |
| 50/6/0.18 | 5.50 - 7.30 | 20 | 13 (65) | 3 (15) | 4 (20) | 16 (80) | 14 (88) | 14 (70) |
| p (اختبار مربع كاي) | ص<0.001 | ع = 0.91 | ||||||
| R2 (معامل الارتباط ، | 0.995, | 0.978, | ||||||
| قيمة p) | ع = 0.04 | ع = 0.09 | ||||||
الجدول 1: نظام التخدير ، وعدد محاولات التنبيب ، والبقاء على قيد الحياة بعد الإجراء لجراء الفئران البالغة من العمر 10 أيام. تم تحليل البيانات عن طريق اختبار كاي تربيع ، مع اعتبار p < 0.05 مهما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حاليا ، لا توجد طرق موثقة جيدا للتخدير والتنبيب للفئران البالغة من العمر 10 أيام لجراحة القلب والصدر. تحقيقا لهذه الغاية ، قمنا بمعايرة أنظمة جرعات الكيتامين / الزيلازين / الأتروبين لوزن الجسم ، حيث سهلت جرعات 20/4 / 0.12 مجم / كجم ، 30/4 / 0.12 مجم / كجم ، و 50/6 / 0.18 مجم / كجم التنبيب للجراء ذات الوزن المنخفض (3.15-4.49 جم) ، المتوسط (4.50-5.49 جم) ، والوزن المرتفع (5.50-8.10 جم) ، على التوالي. ارتبط البقاء على قيد الحياة بعد التنبيب بوزن الجسم (59٪ و 70٪ و 80٪ للمجموعات ذات الوزن المنخفض والمتوسط والعالي على التوالي. نظرا للصعوبة التي تواجهها مع تنبيب الجراء البالغة من العمر 10 أيام وما يرتبط بها من ارتفاع معدل الوفيات ، نوصي بقصر جراحة القلب والصدر في الجراء البالغة من العمر 10 أيام على الحيوانات التي لا يقل وزنها عن 5.50 جم. تتمثل إحدى قيود تقنية التنبيب هذه في أنها تعتمد على مهارة وخبرة المشغل ، ومدى سرعة تعلمه. ومع ذلك ، من المتوقع أن يتمكن المشغل المتمرس في التنبيب البالغ من تحقيق الكفاءة في التنبيب قبل المراهقة بعد التدرب على 10 لترات من سبعة إلى ثمانية جراء. قيد آخر هو أن البقاء على قيد الحياة بشكل عام بعد التنبيب وجراحة احتشاء عضلة القلب تراوح من 55٪ (أدنى مجموعة وزن الجسم) إلى 70٪ (أعلى مجموعة وزن الجسم). ومع ذلك ، فإن هذا مشابه للبقاء على قيد الحياة بنسبة 60٪ -70٪ الذي تم الإبلاغ عنه للجراء البالغة من العمر يوما واحدا ، والتي لا تتطلب أي تنبيب عند تعرضها لاحتشاء عضلة القلب بعد الشلل على الجليد8.
وجدنا أن جراء الفئران البالغة من العمر 10 أيام ذات الأوزان المختلفة لديها استجابة غير خطية لنظام التخدير الكيتامين / الزيلازين / الأتروبين. وقد يعكس ذلك الاختلافات الإنمائية في عدد من المجالات الهامة. يتدرج معدل الأيض الأساسي بشكل رمزي إلى ثلاثة أرباع قوة الكتلة ، من الخلايا المفردة إلى الثدييات19. هذا من شأنه أن يؤثر على التخلص من المخدرات في الحيوانات في الدراسة ، والتي تباينت في الوزن مرتين ونصف. يعد نضج استقلاب الدواء أو آليات إزالة السموم عاملا آخر يتغير بسرعة في فترة ما بعد الولادة مباشرة ، وكذلك الآليات التي تؤثر على توافر الأدوية مجانا ، مثل ربط البروتين20. قد لا تكون الاختلافات الدوائية هي التفسير الوحيد للعلاقات غير الخطية بين تأثير الدواء ، حيث أن الاختلافات في الاستجابات الدوائية للعوامل المهدئة ممكنة أيضا6. من المحتمل أن يؤدي استخدام الأوكسجين بعد الحقن داخل الصفاق للتخدير وقبل التنبيب إلى تحسين سلامة الإجراء ، كما لوحظ مؤخرا للبالغين21. قد تؤدي التعديلات الإضافية في الجرعة ، خاصة بالنسبة لمجموعة وزن الجسم الأدنى ، إلى تحسين البقاء على قيد الحياة.
كان عمق التخدير أمرا بالغ الأهمية لنجاح التنبيب. كان التنبيب صعبا إذا كان مستوى التخدير خفيفا جدا ، وإذا كان عميقا جدا ، توقف الجراء عن التنفس تلقائيا ، إما أثناء التنبيب أو بعد التنبيب أثناء التهوية بالأكسجين. تسبب التعامل مع الجراء أيضا في بعض الأحيان في حبس النفس ، خاصة أثناء التنبيب. إذا توقف التنفس أثناء التنبيب ، فإن تحفيز القدم أو الذيل ، أو إعادة الجراء إلى الغرفة الدافئة المليئة بالأكسجين ، أمر بالغ الأهمية لاستعادة التنفس المنتظم. تمت إعادة محاولة التنبيب عندما استأنف الجرو التنفس المنتظم. إذا توقف التنفس بعد التنبيب ، تم تهوية الحيوانات لمدة تصل إلى 10 دقائق بالأكسجين. إذا استؤنف التنفس التلقائي خلال هذا الوقت ، شرعت الحيوانات في الجراحة. ومع ذلك ، وجدنا أنه إذا لم يتم استعادة التنفس التلقائي خلال هذا الوقت ، فإن الجراء لم يتعافوا من التخدير أو ، إذا تعرضوا لعملية جراحية ، ماتوا خلال فترة التعافي.
نظرا لارتفاع معدل الأيض للجراء البالغة من العمر 10 أيام ، فمن الأفضل الحد من استنزاف مخازن الطاقة عن طريق فصل السد عن صغاره لأقصر وقت ممكن ، وبالتالي تقييد عدد العمليات الجراحية إلى أربعة أو خمسة جراء لكل فضلة يوميا على مدى فترة أقصاها 5-6 ساعات. للحد من أكل لحوم البشر الأمهات من الجراء التي خضعت لعملية جراحية ، تمت إزالة أي رفيق القمامة التي لم تخضع لعملية جراحية لرعاية الأمهات أو إعدامها قبل عودة السد إلى القفص. كانت ممارسات المناولة لدينا للحد من الوفيات الناجمة عن أكل لحوم البشر بعد الجراحة مماثلة لتلك التي تم الإبلاغ عنها لحديثي الولادة9.
في الختام ، تشير دراسة الجدوى الخاصة بنا إلى أن نظام مخدر الكيتامين / الزيلازين / الأتروبين عن طريق الحقن أقل بكثير من النظام المستخدم للفئران الأكبر سنا مطلوب لتقليل الوفيات الناجمة عن التنبيب لصغار الفئران البالغة من العمر 10 أيام لجراحة القلب والصدر اللاحقة ، وكذلك ممارسات المناولة المحددة لتقليل الوفيات الناجمة عن التنبيب والجراحة وأكل لحوم البشر بعد الجراحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل منحة برنامج NHMRC [ID 1074386] ، وشبكة Leducq عبر الأطلسي للتميز في منحة أبحاث القلب والأوعية الدموية [RMG] ، ومنحة من RT Hall Trust [RMG & SEI].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole (Antisedan) | Provet (NSW) Pty Ltd | ATIP I | |
| Atropine 600 mcg/mL | Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd | 1957699 PFIZER-0143386 | |
| Betadine | Livingstone International | BU0520 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Provet (NSW) Pty Ltd | TEMG I | |
| Fiber-optic light | Leica | 3011350 | CLS 150X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 9.1.2 | |
| Intubation platform | - | - | Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H) |
| Isoflurane | Provet (NSW) Pty Ltd | ISOF 07 | |
| Ketamine 100 mg/mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | |
| Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety | BD Insyte | CE0086 | 19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL |
| Single lumen polyethylene tube | Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW | Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm | |
| Small forceps | F.S.T. | NO 11051-10 | |
| Surgical microscope (camera optional) | Leica | M651 (Leica IC80 HD camera) | 10x and 16x objective |
| Suture 7-0 prolene | Ethicon | 8708H | |
| Suture 9-0 polypropylene monofilament | Ethicon | 2813 | |
| V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm | VetEquip | 901820 | |
| Vented 2-Liter plexiglass induction chamber | VetQuip Pty Ltd | 942102 | 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H) |
| Warming lamp | Brilant Lighting | 99223 | |
| Xylazine | Provet (NSW) Pty Ltd | XYLA Z 2 |
References
- Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovascular Research. 74 (1), 29-38 (2007).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Bogush, N., et al. DUSP5 expression in left ventricular cardiomyocytes of young hearts regulates thyroid hormone (T3)-induced proliferative ERK1/2 signaling. Scientific Reports. 10 (1), 21918 (2020).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. Third edition. , Elsevier Inc. (2009).
- Iismaa, S. E., et al. Cardiac hypertrophy limits infarct expansion after myocardial infarction in mice. Scientific Reports. 8 (1), 6114 (2018).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Boston University Institutional Animal Care and Use Committee. Anesthesia and Analgesia: Neonatal Mice and Rats. , Available from: https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/anesthesia/anesthesia-and-analgesia-neonatal-mice-and-rats-iacuc/ (2019).
- University of Texas at Austin Animal Resources Center. Mouse-Specific Anesthesia Guidance. , Available from: https://research.utexas.edu/qpcontent/uploads/sites/7/2020/02/Mouse_Anesthesia_guidance_ARC_112519.pdf (2019).
- Paddleford, R. Manual of Small Animal Anaesthesia. Second edition. , Masson. (2000).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Daubenspeck, J. A., Li, A., Nattie, E. E. Acoustic plethysmography measures breathing in unrestrained neonatal mice. Journal of Applied Physiology. 104 (1), 262-268 (2008).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visulaized Experiments. (90), e51755 (2014).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Du, X. -J., Gao, X., Ramsey, D. Surgical methods of inducing transverse aortic stenosis and myocardial infarction in the mouse. Asia Pacific Heart Journal. 7 (3), 187-192 (1998).
- Wu, J., et al. Anesthesia and intubation of 10-Day old C57BL/6J mouse pups for cardiothoracic surgery. Research Square. , (2021).
- Silver, L. M. Mouse Genetics: Concepts and Applications. Mouse Genome Informatics, The Jackson Laboratory. , (2008).
- West, G. B., Woodruff, W. H., Brown, J. H. Allometric scaling of metabolic rate from molecules and mitochondria to cells and mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 1 2473-2478 (2002).
- Moscovitz, J. E., Aleksunes, L. M. Establishment of metabolism and transport pathways in the rodent and human fetal liver. International Journal of Molecular Science. 14 (12), 23801-23827 (2013).
- Blevins, C. E., Celeste, N. A., Marx, J. O. Effects of oxygen supplementation on injectable and inhalant anesthesia in C57BL/6 mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 60 (3), 289-297 (2021).
