Summary
I en tid med kræftimmunterapi er interessen for at belyse tumormikromiljødynamikken steget markant. Denne protokol beskriver en massespektrometribilleddannelsesteknik med hensyn til dens farvnings- og billeddannelsestrin, som giver mulighed for stærkt multiplekset rumlig analyse.
Abstract
Fremskridt inden for immunbaserede terapier har revolutioneret kræftbehandling og forskning. Dette har udløst stigende efterspørgsel efter karakterisering af tumorimmunlandskabet. Selvom standard immunhistokemi er egnet til at studere vævsarkitektur, er den begrænset til analysen af et lille antal markører. Omvendt kan teknikker som flowcytometri evaluere flere markører samtidigt, selvom information om vævsmorfologi går tabt. I de senere år er multiplexede strategier, der integrerer fænotypisk og rumlig analyse, opstået som omfattende tilgange til karakterisering af tumorimmunlandskabet. Heri diskuterer vi en innovativ teknologi, der kombinerer metalmærkede antistoffer og sekundær ionmassespektrometri med fokus på de tekniske trin i analyseudvikling og optimering, vævsforberedelse og billedoptagelse og -behandling. Før farvning skal et metalmærket antistofpanel udvikles og optimeres. Dette hi-plex billedsystem understøtter op til 40 metalmærkede antistoffer i en enkelt vævssektion. Bemærk, at risikoen for signalinterferens øges med antallet af markører, der er inkluderet i panelet. Efter paneldesign skal der lægges særlig vægt på metalisotoptildelingen til antistoffet for at minimere denne interferens. Indledende paneltest udføres ved hjælp af en lille delmængde af antistoffer og efterfølgende test af hele panelet i kontrolvæv. Formalinfikserede, paraffinindlejrede vævssektioner opnås og monteres på guldbelagte dias og farves yderligere. Farvningen tager 2 dage og ligner meget standard immunohistokemisk farvning. Når prøverne er farvet, placeres de i billedoptagelsesinstrumentet. Synsfelter vælges, og billeder hentes, uploades og gemmes. Det sidste trin er billedforberedelse til filtrering og fjernelse af interferens ved hjælp af systemets billedbehandlingssoftware. En ulempe ved denne platform er manglen på analytisk software. De genererede billeder understøttes dog af forskellige beregningspatologisoftware.
Introduction
Betydningen af de mange celletyper omkring klonale tumorpopulationer er et afgørende element i kategoriseringen af carcinogenese. Interessen for at belyse denne tumormikromiljø (TME) sammensætning og interaktioner er steget kontinuerligt efter etableringen af immunbaseret terapi som en del af kræftbehandlingsarsenalet. Derfor er behandlingsstrategier skiftet fra en tumorcentreret tilgang til en TME-centreret1.
Indsatsen for at belyse immuncellernes rolle i tumorovervågning og kræftudvikling er steget markant i de senere år 2,3. I medicinsk forskning opstod en overflod af metoder, herunder cytometribaserede metoder og singleplex- og multiplexbilleddannelsesteknologier, som en del af dette forsøg på at dechiffrere de unikke interaktioner mellem flere elementer af TME'er.
Banebrydende metoder såsom flowcytometri (opfundet i 1960'erne), fluorescensaktiveret cellesortering og massecytometri er primært fokuseret på at identificere og kvantificere TME-komponenter4. Selvom cytometribaserede kvantitative teknikker giver mulighed for immunlandskabsfænotypning, er det umuligt at bestemme den cellulære rumlige fordeling. Omvendt bevarer metoder som standard singleplex immunohistokemi vævsarkitekturen og gør det muligt for forskere at analysere cellulær fordeling, selvom et reduceret antal mål i et enkelt vævsafsnit er en begrænsning af disse metoder 5,6. I løbet af de sidste mange år er multipleksede billeddannelsesteknologier til enkeltcelleopløsning såsom multiplex immunfluorescens, stregkodning af fluorescensbilleddannelse og billeddannelsesmassespektrometri opstået som omfattende strategier til erhvervelse af information om samtidig markørfarvning ved hjælp af det samme vævsafsnit7.
Her præsenterer vi en teknologi, der kobler metalmærkede antistoffer og sekundær ionmassespektrometri og muliggør kvantificering af enkeltcelleopløsning, markør co-ekspression (fænotypning) og rumlig analyse ved hjælp af formalinfikseret, paraffinindlejret (FFPE) og friske frosne (FF) vævsprøver 8,9. FFPE-prøver er de mest anvendte materialer til vævsarkiveringsprøver og repræsenterer en lettere tilgængelig ressource til multipleksede billeddannelsesteknologier end friske frosne prøver10. Derudover giver denne teknologi mulighed for at generhverve billeder måneder efter. Heri diskuterer vi vores farvnings- og billedbehandlingsprotokoller ved hjælp af FFPE-vævsprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vævsprøver blev opnået til forskningsformål i overensstemmelse med Institutional Review Board ved University of Texas MD Anderson Cancer Center, og prøver blev yderligere afidentificeret.
1. Valg af antistof
- Definer forskningsspørgsmålene for at vælge de bedste tilgængelige antistofkloner. Brug Human Protein Atlas, offentliggjort forskning og antistofproducentwebsteder som forskningsressourcer.
BEMÆRK: Valget af passende humane vævskontroller og de samme humane vævskontroller, der skal farves i de forskellige trin, er afgørende for at sikre, at markørerne er farvet korrekt, på det rigtige sted og i det korrekte cellulære rum. En lille vævsmikroarray (TMA), herunder normalt væv og neoplastisk væv, anbefales altid til farvningsvalidering. - Brug kun bærerfrie antistoffer til at designe panelet.
BEMÆRK: Anvendelse af bærerfrie antistofformuleringer er påkrævet, hvis et kommercielt bærerfrit antistof ikke er tilgængeligt; oprensningssæt kan bruges til at justere antistoffet til den korrekte formulering. Proteintilsætningsstoffer såsom bovint serumalbumin er kendt for at mindske konjugeringskapaciteten. - Test og titrer hvert antistof ved hjælp af standard kromogen immunhistokemi for at bestemme det subcellulære mønster af en markørs ekspression; membran, cytoplasmisk eller nuklear farvning; og ekspression i specifikke celler i kontrolvæv.
BEMÆRK: Hvert antistof skal dog testes i pH6 citrat og pH9 ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), og om panelet vil blive farvet med pH 6 citrat eller pH9 EDTA skal bestemmes. Brug af pH 9 EDTA anbefales for at opnå gode signaler, især når man arbejder med denne metode. - Vælg den optimale farvningskoncentration i henhold til ekspressionsmønsteret i positive kontroller.
- Tildel hvert antistof til en af de tilgængelige metalisotoper i henhold til den immunohistokemiske markør overflod, subcellulær lokalisering og cellulær co-ekspression med de andre mål.
- Farv antistoffet med det tilsvarende tildelte metal og sammenlign med ekspressionen i det samme kontrolvæv, der tidligere blev anvendt.
BEMÆRK: Konjugering af antistofmetal starter med antistofforberedelse, reduktion og efterfølgende konjugation (supplerende fil 1). Hvert metalbelastet polymerrør er tilstrækkeligt til mærkning af 100 μg af et antistof.
2. Design af antistofpanel
- Opret små partier af antistoffarvning. Test op til fem markører i en cocktail.
BEMÆRK: Test af antistoffer, der allerede er konjugeret og analyseret ved anvendelse af immunohistokemi i batcher, letter den tidlige identifikation af kanalinterferenser og giver mulighed for at rekonstruere antistofferne med et andet metal. Det giver også mulighed for at evaluere passende markør co-udtryk. - Pletter hvert lille parti med fire forskellige antistofkoncentrationer (0,05 μg/ml, 0,2 μg/ml, 1 μg/ml og 4,0 μg/ml).
BEMÆRK: Sammenligning af forskellige titere skal du identificere den antistofkoncentration, der resulterer i den korrekte placering og højeste ekspression med minimal baggrundsfarvning (bedste signal/støj-forhold).
3. FFPE-vævssektion
- Vælg guldbelagte dias (specifikke til dette formål) og hold dem tæt på mikrotomet. Forbered mikrotomet ved at indsætte et nyt blad i holderen. Indstil sektionstykkelsen til 4-5 μm.
- Læg FFPE-blokke på is inden sektionering. Forbered et vævsflådningsbad ved opvarmning af destilleret vand eller deioniseret vand (diH2O) til 40-45 °C.
BEMÆRK: Brug af diH2O eller destilleret vand reducerer muligheden for forurening. - Start sektionering. Placer vævssektionen i vandet ved hjælp af en pincet og lad den flade ud. Brug diasene til at fjerne vævssektioner fra vandet.
- Læg diasene i et diasstativ, og lad dem tørre ved stuetemperatur natten over.
4. FFPE antistof farvning
BEMÆRK: Farvningsprocessen finder sted på to separate dage.
FORSIGTIG: De løsninger, der anvendes i denne protokol, er potentielt ætsende og udgør farer for hud og øjne. Brug af handsker, laboratoriefrakke og beskyttende øjen- og ansigtsudstyr anbefales og en del af vores institutions biosikkerhedspolitik.
- Reagensforberedelse (dag 1)
- Fortynd 50 ml 20x Tris-bufferet saltvand med Tween (TBS-T) til 950 ml diH2O for at fremstille 1 liter TBS-T.
- 8 ml 10x Tris-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) fortyndes til 72 ml diH2O for at fremstille en 1x varmeinduceret epitophentningsopløsning (HIER).
- Fortynd æselserum i 1x TBS-T til en endelig koncentration på 5% for at gøre blokerende buffer. Opløsningen opbevares ved 4 °C, indtil den er klar til brug.
- HIER-forberedelse: Forbehandlingsmodul (PT)
FORSIGTIG: Brug kemiske beskyttelseshandsker, når du håndterer reagenser eller dele nedsænket i reagenser, der anvendes i PT-modulet.- 140 ml 10x phosphatbufferet saltvand (PBS) fortyndes til 1,260 ml diH2O for at fremstille 1,4 liter 1x PBS. Alternativt fortyndes syv PBS-tabletter til 1,4 liter diH2O.
- Fyld en tank med 1,4 liter PBS, og anbring den forberedte glidekammerbeholder med 100 ml 1x HIER-opløsning i tanken.
- Forvarm tanken i et PT-modul til 75 °C.
- Fjernelse af overskydende paraffin
- Bag dias ved 70 °C i en ovn i mindst 20 min.
BEMÆRK: Nogle væv eller sektioner kan have brug for længere bagetider. Den anbefalede bagetid for hjernevæv eller en TMA er 1 time. Dette kan forlænges til 16 timer (natten over) eller i henhold til laboratorieerfaring. - Placer bagte dias i en glideholder, og udfør følgende vasketrin på en ryster under en røghætte. Vask gliderne i følgende opløsning: Xylen 2x til 30 s (metalfri), 100% alkohol 2x til 30 s (metalfri), 95% alkohol 2x til 30 s (metalfri), 80% alkohol til 30 s (metalfri), 70% alkohol til 30 s (metalfri) og diH2O 2x til 30 s (metalfri).
- Opbevar diasene i en frisk diH2O beholder, indtil de er klar til antigenudtagning.
BEMÆRK: Diasene må ikke tørres før afslutningen af proceduren.
- Bag dias ved 70 °C i en ovn i mindst 20 min.
- Hentning af antigen
- Placer diasene i et forvarmet diaskammer indeholdende 1x HIER-buffer inde i PT-modulet. Placer dækslet på tanken. Luk og lås låget.
- Tryk på Menu-knappen på PT-modulet for at åbne hovedmenuen, og tryk på knappen Opsætningscyklus (tid og temperatur) for at oprette et brugerdefineret program.
- Kør PT-modulet ved 97 °C i 40 min. Derefter afkøles PT-modulet automatisk til 65 °C.
- Fjern diasene fra PT-modulet, når temperaturen på 65 °C er nået. Opbevar diasene ved stuetemperatur i 30 min.
BEMÆRK: PT-modulet åbnes ikke, før temperaturen er afkølet til 65 °C. Rør ikke ved den gyldne overflade af diasene under denne proces, og brug altid handsker.
- Antistof blokering
- Indstil en ryster til 70 o / min.
- Vask diasene ved at dyppe dem i 1x TBS-T i 5 min 2x.
- Brug en hydrofob barrierepen til at tegne en kant rundt om vævssektionen mindst 1 mm væk fra glidekanterne og lad den tørre i 15-30 s.
BEMÆRK: Sørg for at forhindre penvæsken i at røre vævssektionen for at undgå vævsinterferens med farvningen. Tryk ikke pennen for hårdt ned, mens du trækker barrieren for at undgå potentielle lækager. For optimale farvnings- og billedoptagelsesresultater placeres vævssektionerne midt på de guldbelagte dias i en ramme, der ikke er større end 15 mm x 30 mm for at give tilstrækkelig plads til at tegne barrieren uden at røre vævet eller styrepunkterne placeret på ydersiden af diaset. - For at fjerne eventuelle penrester dyppes diasene i TBS-T.
- I et fugtkammer ved stuetemperatur inkuberes vævssektionen med 100-200 μL blokerende buffer i 20 minutter. Lad vævet inkubere i den blokerende buffer, indtil en antistofmasterblanding er klar.
- Forberedelse af antistofpanel
BEMÆRK: Det endelige volumen af antistofpanelcocktailen varierer afhængigt af det estimerede vævssektionsoverfladeareal. For at dække et areal på 20 mm x 20 mm skal du forberede 100-200 μL af cocktailen.
Gør følgende for at forberede en antistofpanelcocktail af metalisotopkonjugerede antistoffer:- Bekræft det endelige volumen af cocktailen, der svarer til antistofcocktailvolumenet tilsat det blokerende buffervolumen.
- Bekræft specifikationerne for alle antistoffer, fortyndinger og/eller antistofkoncentrationer i et panelregneark for projektet.
- Spin alle antistofholdige rør ned ved 10.000 x g i 5 min. Tilsæt individuelle antistoffer til blokeringsbufferen og bland meget godt. Forstyr ikke bunden af antistofrøret, når du pipetterer det.
- Antistofpanelet filtreres ved at forfugte en 0,1 μm centrifugalfilteranordning med 100 μL blokerende buffer. Centrifuger filteret ved 10.000 x g i 2 minutter, og fjern den blokerende buffergennemstrømning med en pipette.
- Overfør antistofpanelet til en spinkolonne, og drej filteret ved 10.000 x g i 2 min. Kassér spinkolonnen, og brug gennemstrømningen som det filtrerede antistofpanel.
BEMÆRK: Udfør farvningen umiddelbart efter fremstilling af cocktailen for at forhindre metaludveksling. Hvis der er behov for opbevaring af antistofcocktailen i længere tid, kan den udsættes for frysetørring.
- Antistoffarvning
- Fjern forsigtigt blokeringsbufferen fra diasene ved at vippe hvert dias på siden og forsigtigt banke kanterne mod en opgavevisker.
- Placer gliderne i et fugtkammer og tilsæt 100-200 μL antistofmasterblanding til vævet (undgå kontakt med væv og dannelse af luftbobler).
- Føj positive og negative kontrolslides til farvningsbatchen.
- Diassene inkuberes ved 4 °C natten over (14-16 timer).
- Reagensforberedelse (dag 2)
- Fortynd 100 ml 10x lavbarium PBS, pH 7,4, i 900 ml diH2O for at fremstille 1x PBS.
- Der fremstilles 350 ml arbejdsbestandsopløsning af 2% glutaraldehyd i pbs med lavt barium (340 ml lavbarium PBS + 10 ml 70% glutaraldehyd).
BEMÆRK: Udfør fortyndingen under en hætte. Glutaraldehyd er en meget viskøs væske. Brug en 1 ml pipette og tilsæt 1 ml lavbarium PBS til glutaraldehydrøret hver gang, indtil det bliver flydende nok til at hælde ud af røret. - Fortynd 10x Tris, pH 8,5, i 900 ml diH20 for at fremstille 1x Tris.
- Fiksering og dehydrering
- Fjern antistofmasterblandingen fra hvert dias ved at vippe diaset på siden og forsigtigt banke kanten mod en opgavevisker.
- Vask diasene med let til moderat omrøring i følgende buffere: 1x TBS-T, 3x gange i 5 minutter hver (metalfri); filtreret 2% glutaraldehyd i 5 minutter; filtreret 1x tris, pH 8,5, 3x for 30 s; filtreret diH2O 2x i 30 s; 70% alkohol i 30 s (metalfri); 80% alkohol i 30 s (metalfri); 95% alkohol i 30 s (metalfri); og 100% alkohol i 30 s (metalfri).
- Bank forsigtigt kanten af hvert objektglas mod en vinduesvisker for at fjerne overskydende alkohol og lade resterende alkohol fordampe ved stuetemperatur (~ 5-10 min).
- Tør glider i en ekssikkator i mindst 1 time før billedoptagelse, eller opbevar diasene i et vakuumkammer til langtidsopbevaring.
5. Erhvervelse af billeder
- Opsætning af slide
BEMÆRK: Før scanning ved hjælp af instrumentet skal diasene defineres og konfigureres ved hjælp af det webbaserede billedstyringsprogram ved at følge nedenstående trin.- På slidesiden i det webbaserede billedstyringsprogram skal du klikke på Tiltrædelse ny slide og indtaste de ønskede oplysninger (navn, slideidentifikation, placering og beskrivelse).
- Opret scanningssektioner ved at klikke på Tilføj sektion. Udfyld oplysningerne for hver sektion (projektets navn, slidenavn, blok og placering). Hvis du vil gemme de nye slides/sektioner, der er oprettet, skal du klikke på Send.
- Åbn panelsiden under fanen Ressourcer, og vælg det panel, der skal bruges. For nye paneler skal du klikke på Opret nyt panel.
- Når du har valgt panelet, skal du klikke på Sektioner. Tilføj de sektioner, der blev oprettet i trin 2. ved at klikke på Rediger sektionstildeling. Gem ved at klikke på Send.
- Opsætning af instrument
BEMÆRK: Dette instrument (se Materialetabel) betjenes ved hjælp af et specifikt styringssoftwareprogram (se Materialetabel).- Log ind på kontrolsoftwaren. Klik på Væk fra, hvis instrumentet er i dvaletilstand.
BEMÆRK: Mindst 1 time før operationen anbefales opvarmning af instrumentet, hvilket hjælper med strålefokusstabilisering. - For at indlæse en slide skal du klikke på Exchange Sample og derefter klikke på Fortsæt for at åbne døren. Sæt diaset i indlæsningsåbningen med prøven opad og etiketten til højre. Klik på Fortsæt for at lukke døren.
BEMÆRK: Hvis diaset ikke er indlæst korrekt, vises en advarselslyd og meddelelse om justering af diaset. - Vælg projektet, og vælg derefter slidenavnet for det indlæste eksempel.
- Visualiser panoramabilledet i den optiske billedrude.
- Log ind på kontrolsoftwaren. Klik på Væk fra, hvis instrumentet er i dvaletilstand.
- Udvælgelse og anskaffelse af synsfelt (FOV)
- Klik på menuen Tilstand, og vælg SED (Sekundær elektrondetektor). Klik på billedtilstandsmenuen , og vælg QC -300 μm.
- Klik på Jog Stage for at kontrollere FOV-placeringen, og klik derefter på pilene for at navigere og vælge placeringen af FOV.
- Klik på Tilføj FOV, indstil 400 μm x 400 μm som feltstørrelse, og vælg fin som billeddannelsestilstand og 1 ms opholdstid. Klik på Bekræft.
BEMÆRK: Den indstillede opholdstid afhænger af den ønskede opløsning. Opholdstiden øges, når opløsningen øges. Anskaffelsestiden kan variere afhængigt af flere faktorer, herunder detektorindbrudsperiode og driftslængde. Vores gennemsnitlige anskaffelsestid for en FOV er ca. 17 min. Brug instrumentet nonstop i op til 8 timer, hvilket giver mulighed for scanning af ca. 28 FOV'er. Kvaliteten af de erhvervede billeder falder efter mange på hinanden følgende timers brug. - Når du har oprettet en FOV-liste, skal du fortsætte til billedfokus og justere stigmatiseringen ved at flytte strålen til et vævsområde, der ikke vil blive afbildet. Juster parametrene, indtil der opnås et klart centralt billede.
BEMÆRK: For at optimere billedoptagelsen er det ideelt at holde vævssektionen centraliseret på diaset. Under fokusering kan der opnås et klart billede af kun det centrale område. Hvis vævssektionen er for stor, vil kanterne være ude af fokus, og billedet bliver sløret. - Klik på Start Kør. Erhvervede billeder uploades automatisk og gemmes i den webbaserede billedstyringsapplikation.
6. Forberedelse af billede
- Billede isobarisk korrektion
BEMÆRK: Formålet med isobarisk korrektion er at fjerne spilloversignal mellem kanaler som følge af tilstedeværelsen af isotoper med samme eller meget lignende masse, hvis masseforskelle ikke kan detekteres ved hjælp af masseanalysatoren.- I den webbaserede billedstyringsapplikation skal du klikke på det grønne downloadikon for at gemme FOV'erne (TIFF-billeder).
- Download den mest opdaterede version af billedbehandlingssoftwaren (se Materialetabel), der er tilgængelig på fanen Om i det webbaserede billedstyringsprogram, og gem den i en fil. Åbn .zip arkivfilen, og følg installationstrinnene. Åbn softwaren, når installationen er fuldført.
- Vælg den mappe, der indeholder de billeder, der skal rettes, ved at klikke på ikonet Filer i inputruden i billedbehandlingssoftwaren. En FOV-liste indlæses.
- Klik på filterikonet i inputruden for at anvende standardrettelser. For hver kanal skal du visualisere billeder opnået før og efter korrektion på højre side af skærmen.
- Klik på disketteikonet i outputruden for at gemme det korrigerede billede.
- Billedfiltrering: Voronoi tessellation
BEMÆRK: Voronoi tessellationsdiagrammer illustrerer en opdeling af rummet, der indeholder frøpunkter i Voronoi-celler. Målet er at estimere celletætheden og definere cellegrænser. Ved hjælp af Voronoi tessellationsberegningen genereres en maske og påføres det originale billede til filtrering.- Klik på fanen Filtrering , og vælg Voronoi Tesselation i menuen filtreringsparametre.
- I inputruden skal du vælge billedet MassCorrected.tiff. Klik på filterikonet i inputruden.
- Klik på disketteikonet i outputruden for at gemme det filtrerede billede. De to resulterende filer vil have suffikserne -Filtered.tiff og -Filtered.json.
BEMÆRK: Billedet med navnet MassCorrected-Filtered.tiff kan derefter uploades til et tredjeparts softwareprogram til digital analyse eller open source-softwareprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tonsil og lungeadenocarcinom TMA vævssektioner (5 mm tykke) blev opnået og anbragt på midten af guldbelagte dias efter specifikationerne vedrørende vævsstørrelse og sikre margener af diasene. Frie glasmargener på henholdsvis 5 mm og 10 mm mellem kanten af vævet og glasglasglassets laterale og ringere grænser er nødvendige for optimal farvning. Vævssektionerne blev bagt natten over i en ovn inden farvning for at sikre korrekt overholdelse af sektionen til diaset. Antistofpanelet bestod af 23 markører. I samme farvningsbatch blev et tonsillglas og et TMA-dias indeholdende flere væv inkluderet for at evaluere ekspressionen af markører, der er ringe udtrykt i lungeadenocarcinomprøver (figur 1). Positive kontroller skal vælges i henhold til målene for antistofferne, der anvendes i panelerne; for eksempel for at evaluere SOX10-ekspression er melanomprøver nødvendige, og for at evaluere GAFP-ekspression er glioblastomprøver nødvendige (figur 2).
Figur 1: Isotoprenhed og kanalkrydstale. Matrixen viser procenten krydstale afledt af sonderenhed og oxider (blå kasser, ≥0,5%; klare bokse, <0,5%). For massetags vises sonder, der bidrog med mindst 0,5% krydstale til ingen kanaler (grøn), en eller to kanaler (gul) eller mere end to kanaler (orange). Massekanaler, der modtager mindst 0,5% krydstale fra ingen sonder (grøn), en eller to sonder (gul) eller mere end to sonder (orange) vises også. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative farvningsbilleder i forskellige væv. (A) Lungeadenocarcinom. (B) Ikke-neoplastisk nyre. (C) Mandler. CD20 er vist i gult, Ki67 er vist i magenta, CD3 er vist i hvidt, CD11c er vist i grønt, CD68 er vist i rødt, cytokeratin er vist i cyan, og dobbeltstrenget DNA (dsDNA) er vist i blåt. Forstørrelse, 200x. Klik her for at se en større version af denne figur.
Denne farvningsprocedure ligner meget standard immunohistokemisk farvning og fandt sted to på hinanden følgende dage. De fem hovedtrin i farvningsprotokollen er 1) overskydende paraffinfjernelse, 2) antigenudtagning, 3) antistofblokering, 4) antistoffarvning og 5) fiksering og dehydrering (figur 3). Et grundlæggende trin i farvningsproceduren er at tage forholdsregler for at undgå metalkontaminering af prøverne, herunder brug af metalfrie reagenser opbevaret i plastvarer og omhyggelig håndtering af prøverne for at begrænse mekaniske skader. Forberedelse af antistofcocktailen umiddelbart før farvning anbefales. Dette reducerer metaludvekslingen. Når farvningen var færdig, gemte vi diasene og scannede dem den næste dag. Før billedoptagelse er et nødvendigt trin diasopsætning ved hjælp af et webbaseret billedstyringsprogram (Figur 4).
Figur 3: Arbejdsproces for billedoptagelse og den tilhørende slide. (A) Oversigt over arbejdsproces for billedoptagelse. 1) En FFPE-vævssektion farvet med metalkonjugerede antistoffer rasteriseres ved hjælp af en primær ionpistol, der frigiver sekundære ioner. 2) Et time-of-flight massespektrometer adskiller og måler ioner baseret på deres masse på pixelniveau. 3) Pixelbaseret kvantificering af sekundære ioner. Y-aksen svarer til antallet af detekterede ioner (top), og x-aksen svarer til massen af hvert metal. 4) Baseret på toppen af hvert massespektrum rekonstrueres flerdimensionelle billeder. (B) Skematisk over det dias, der anvendes i denne procedure. For at opnå optimal farvning af væv skal sektionen placeres mindst 5 mm fra diasets sidekant og 10 mm fra dens nedre kant. Når du tegner den hydrofobe barriere omkring vævssektionen, skal den holdes inde i rektanglet mindst 1 mm fra diasets kant. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Slideopsætning i det webbaserede program til administration af afbildninger. Før diasscanning er det nødvendigt at konfigurere hvert dias. Indtast de ønskede detaljer, der kan hjælpe med diasidentifikation. Klik på Tilføj sektion (sort pil) for at inkludere blok- og positionsoplysningerne. Hvis du vil gemme, skal du klikke på Send (rød pil). Klik her for at se en større version af denne figur.
På scanningsdagen skal du tænde for anskaffelsesinstrumentet ved hjælp af kontrolsoftwaren. Ved at klikke på Exchange Slide åbnede instrumentets dør, hvilket tillod indlæsning af et dias. Vi placerede diaset på læsseåbningen opad med etiketten på højre side. Kun ét dias kan scannes på én gang. Det næste trin var at vælge FOV'erne og justere fokus og stigmatisering ved at følge de trin, der er beskrevet i protokollen. Vi erhvervede billeder ved at klikke på Start Kør. Anskaffelsestiden varierer afhængigt af den ønskede FOV-størrelse og opløsning. FOV-størrelsen varierer fra 200 μm x 200 μm til 800 μm x 800 μm, hvilket svarer til et rammestørrelsesområde på 128 pixels x 128 pixels til 2048 pixels x 2048 pixels. Tre standardopløsninger er tilgængelige: grov, fin og superfin. Scanning af større FOV'er i superfin opløsning er tidskrævende, med den endelige anskaffelsestid for en FOV fra 25 s til 4,7 timer (figur 5).
Figur 5: Billedoptagelse ved hjælp af kontrolsoftwaren. Anskaffelsesindstillingerne kan justeres efter ønske. For at ændre scanningsopløsningen skal du klikke på rullemenuen ved Billedbehandlingstilstand (sort pil). Hvis du vil ændre FOV-størrelsen, skal du indtaste et tal i feltet FOV-størrelse (μm) (rød pil). Klik her for at se en større version af denne figur.
Efter scanningen var fuldført, blev et billedsæt, der omfattede alle FOV'er, automatisk uploadet til det webbaserede billedstyringsprogram. Udover lagring af billeder muliggør denne applikation visualisering af alle kanaler sammen eller separat, billedjusteringer og download af billeder til yderligere forberedelse. Det visualiserede standardbillede gemmes som en TIFF-fil (Figur 6).
Figur 6: Billedvisualisering ved hjælp af det webbaserede billedstyringsprogram. Erhvervede billeder gemmes og visualiseres ved hjælp af online platformen. Det er muligt at justere visualiseringsparametrene og ændre farven på hver markør. Klik på Tilføj billedkanal (hvid pil) for at visualisere andre markører. Forstørrelse, 200x. Klik her for at se en større version af denne figur.
Metalinterferenser er iboende for metalmærkningsmetoderne på trods af brugen af strategier for at minimere dem. For at fjerne de overskydende baggrundssignaler fra metalisotop konjugeret med antistofferne og forberede billeder til analyse brugte vi den tilhørende billedbehandlingssoftware (se Materialetabel). Billedforberedelsesproceduren har to trin: 1) isobarisk korrektion, som fjerner signaler mellem kanaler, og 2) filtrering, som fjerner signaler forårsaget af aggregater på billedet.
For at starte den isobariske korrektion blev filen, der indeholder det gemte TIFF-billede, valgt ved at klikke på ikonet Filer i inputruden. Softwaren indlæser automatisk alle arkiverede TIFF-billeder i filen, hvilket muliggør batchanalyse. Dernæst rettede vi billedet ved at klikke på filterikonet i inputruden. To resulterende filer med suffikset -MassCorrected blev automatisk genereret: den ene arkiveret i TIFF-format og den anden arkiveret i JSON-format. Som standard blev de resulterende arkiver gemt i den samme fil, hvorfra det oprindelige billede blev indlæst (figur 7).
Figur 7: Billedforberedelse: korrektionstrin. For at indlæse et billede til forberedelse i billedbehandlingssoftwaren skal du klikke på filikonet i inputruden (sort pil) og vælge billedet. For at anvende standardkorrektionsproceduren skal du klikke på filterikonet i inputruden (rød pil). For at gemme det opdaterede, korrigerede billede skal du klikke på disketteikonet i outputruden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Det andet trin i billedforberedelse er filtrering, som kan vælges på den øverste fane i softwaren. Vi valgte det korrigerede billede i inputruden. I dette trin blev automatiseret Voronoi tessellation brugt som filtreringsparameter. Ved at klikke på filterikonet på inputpanelet anvendte man automatisk det valgte filter på alle kanaler. I begge billedforberedelsestrin (korrektion og filtrering) vises billederne af hver kanal før og efter behandling og signalforskelle i højre side af skærmen.
I lighed med det isobariske korrektionstrin blev der genereret to nye arkiver, et i TIFF og et i JSON-format. I dette trin var suffikset efter filnavnet -Filtreret. Derfor blev det endelige billede opnået navngivet MassCorrected-Filtered.tiff. Ved at gennemføre disse trin forberedte vi billedet til analysen ved hjælp af den foretrukne digitale patologisoftware (figur 8 og figur 9). Ved at bruge denne teknik var vi i stand til at analysere alle 23 markører i antistofpanelet med minimale interferenser mellem kanaler på subcellulært niveau i en enkelt vævssektion.
Figur 8: Billedforberedelse: filtreringstrin. Vælg Filtrering i den øverste fane (sort pil) i billedbehandlingssoftwaren. Under Filtreringsparametre skal du vælge den ønskede metode (grøn pil). I inputruden skal du vælge Massekorrigeret billede. For at anvende den valgte procedure på billedet skal du klikke på filterikonet i inputruden (rød pil). For at gemme det opdaterede filtrerede billede skal du klikke på disketteikonet i outputruden. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Repræsentative billeder af farvningen før og efter billedforberedelse. (A) Billede af en tonsilvævssektion farvet ved hjælp af denne teknik og visualiseret ved hjælp af et tredjeparts softwareprogram til digital billedanalyse før filtrering og korrektion. (B) Billede af det samme afsnit under de samme betingelser efter filtrerings- og korrektionstrin. CD20 er vist i gult, Ki67 er vist i magenta, CD3 er vist i hvidt, CD11c er vist i grønt, cytokeratin er vist i cyan, og dobbeltstrenget DNA (dsDNA) er vist i blåt. Forstørrelse, 200x. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Liste over antistofpaneler. Hvert antistof blev konjugeret til en specifik metalisotop med en anden masse som angivet. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den omfattende belysning af de komplekse, indviklede interaktioner mellem de mange komponenter i en TME forbliver et centralt mål for kræftforskning. Producenter har introduceret adskillige multipleksede assays som en del af denne indsats, især i løbet af de sidste 5 år. Multiplekset rumlig analyse er et alsidigt og kraftfuldt værktøj, der letter samtidig kategorisering af flere mål, samtidig med at strukturel morfologi bevares i tumorprøver. Rumlige analyseteknikker kan udføres ved hjælp af fluorescensbilleddannelse eller massespektrometri, såsom den teknik, der er beskrevet heri 11,12,13.
Før farvning kræves antistofoptimering ved hjælp af en regelmæssig immunohistokemiprotokol efterfulgt af farvningsprotokollen for at standardisere antistoffarvningsreproduktion reproducerbarhed. Et meget velkendt faktum er, at forskellige regelmæssige antistofkloner kan have optimal ekspression under forskellige forhold. For at konjugere antistoffer med metalmærker kræves der imidlertid bærerfrie antistoffer, ligesom det er at definere den samme pH til antigenudtagning for alle antistoffer integreret i panelet, hvilket er en ulempe ved denne metode. Manglende gennemførelse af dette trin kan resultere i billeder af lav kvalitet, der ikke kan analyseres med succes. Det er bydende nødvendigt at afsætte tid til undersøgelse af den medicinske litteratur og antistofproducenternes websteder for at vælge de bedste velvaliderede, pålidelige antistoffer blandt dem, der er kommercielt tilgængelige. Ved validering af antistofferne og panelerne er det nyttigt at konstruere mindre paneler. Dette hjælper med at identificere mulige kanalinterferenser og evaluere korrekt udtryk for markørerne.
Et af de karakteristiske træk ved denne teknik er evnen til at studere op til 40 metalmærkede antistoffer på en enkelt vævssektion. På trods af at det er meget fordelagtigt, er metalmærkede massespektrometriteknikker udsat for udfordrende metalinterferenser, såsom isobariske interferenser. Isobariske interferenser er karakteristiske for metalmærkningsmassespektrometrimetoder og er resultatet af eksistensen af isotoper med samme eller meget lignende masse, hvis masseforskel er mindre end masseanalysatordetekteringskapaciteten. Disse interferenser kan være forårsaget af isotopforurening eller polyatomiske arter. Isotopforurening refererer til et elements renhed. I naturen er de fleste elementer til stede i en blanding af isotoper. Selv når den udsættes for tilsætning, kan der ikke opnås 100% renhed. Det resulterer i mere end et element med samme masse og producerer krydstale mellem kanaler. Median renheden af de 40 tilgængelige metalisotoper er 98%. Interferenserne på grund af polyatomiske arter stammer fra fri metalbinding til negativt ladede arter såsom hydrider, carbider, nitrider, oxider, hydroxider og cyanider, der tilsættes fra +1 til +26 til den endelige masse af metalmærket. Udvikling af strategier til minimering af mulige støjkilder er afgørende for at opnå god farvning og billeddannelse. Det første nødvendige trin i panelkonstruktion er omhyggelig metalisotop-antistoftildeling. Markører, der generelt er udbredt i vævssektioner, såsom cytokeratin og CD45, bør konjugeres til metalisotoper med en høj masse (større end 160Gd) for at minimere virkningerne af polyatomiske interferenser, og ringe markører skal konjugeres til isotoper med masser fra 140Ce til 160Gd. Noget at huske på er, at risikoen for metalinterferens stiger, når antallet af markører stiger. Men med omhyggelig placering af metal og markører kan virkningen af resterende interferenser reduceres med yderligere billedbehandling ved hjælp af billedbehandlingssoftwaren.
Supplerende procedurer kan også anvendes til at reducere metalkontaminering af prøverne i vævsskæring og farvning. Som beskrevet i protokollen ovenfor forhindrer brugen af destilleret vand eller diH2O i vandbadet denne forurening. Ligeledes skal reagenserne, der anvendes til farvning, være metalfrie. Et nyttigt tip er at undgå opbevaring af reagenser i glasbeholdere, da glasvarer letter metalkontaminering. For at opnå optimale samlede resultater anbefaler vi i farvningstrinnet at bage dias natten over for at sikre god vedhæftning af vævssektioner til diasene.
I modsætning til andre multipleksede metoder bruger denne metode FFPE-prøver14. Kombineret formalinfiksering og paraffinindlejring er fortsat den mest anvendte form for prøvebevarelse og -forberedelse. Brugen af arkiverede blokke giver mulighed for udførelse af mere omfattende undersøgelser end brugen af friske frosne prøver, herunder retrospektiv forskning, og har lavere omkostninger. Denne metode giver også mulighed for hel-slide billeddannelse og dias genscanning. Dette fanger et bredere analyseområde end kun at vælge dele af diaset og muliggør scanning ved flere forstørrelser.
Denne teknik har begrænsninger relateret til instrumentets pris og kravet om at købe materialer såsom guldbelagte dias direkte fra producenterne. Forsøg på at bruge ubestrøgne dias, dias belagt med et andet materiale end guld eller dias opnået fra andre virksomheder end producenterne kan resultere i ingen signaloptagelse og omfattende signalinterferens og kan i sidste ende beskadige instrumentet.
En anden væsentlig ulempe ved denne metode er fraværet af specifik software til analyse. Denne metode genererer billeder i TIFF-format, som er meget udbredt og let kan uploades til tredjeparts digital analysesoftware. Computational pathology softwareværktøjer muliggør omfattende analyse, herunder vævsrumsdeling, cellesegmentering, markørkvantificering i ethvert cellulært rum og nærmeste nabo- og nærhedsanalyse. Erhvervelse af en tredjeparts digital analysesoftware til brug øger omkostningerne ved en allerede dyr teknik15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Don Norwood fra Editing Services, Research Medical Library på MD Anderson for at redigere denne artikel og Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory ved Institut for Translationel Molekylær Patologi ved MD Anderson. Denne publikation resulterede delvist fra forskning lettet af den videnskabelige og økonomiske støtte til Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC), der blev leveret gennem National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) til University of Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
- Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T.
- Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).
- Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
- Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
- Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
- Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).
- Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98 (2021).
- Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
- Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Rad, H. S., et al. The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).
