Summary
I en tid med kreftimmunterapi har interessen for å belyse tumormikromiljødynamikken økt påfallende. Denne protokollen beskriver en massespektrometri-avbildningsteknikk med hensyn til dens fargings- og avbildningstrinn, noe som muliggjør svært multiplekset romlig analyse.
Abstract
Fremskritt innen immunbaserte terapier har revolusjonert kreftbehandling og forskning. Dette har utløst økende etterspørsel etter karakterisering av tumorimmunlandskapet. Selv om standard immunhistokjemi er egnet for å studere vevsarkitektur, er den begrenset til analyse av et lite antall markører. Omvendt kan teknikker som flowcytometri evaluere flere markører samtidig, selv om informasjon om vevsmorfologi går tapt. I de senere år har multipleksede strategier som integrerer fenotypisk og romlig analyse dukket opp som omfattende tilnærminger til karakterisering av tumorimmunlandskapet. Her diskuterer vi en innovativ teknologi som kombinerer metallmerkede antistoffer og sekundær ionmassespektrometri med fokus på de tekniske trinnene i analyseutvikling og optimalisering, vevsforberedelse og bildeoppkjøp og prosessering. Før farging må et metallmerket antistoffpanel utvikles og optimaliseres. Dette hi-plex-bildesystemet støtter opptil 40 metallmerkede antistoffer i en enkelt vevsseksjon. Merk at risikoen for signalforstyrrelser øker med antall markører som er inkludert i panelet. Etter paneldesign bør spesiell oppmerksomhet rettes mot metallisotoptilordningen til antistoffet for å minimere denne forstyrrelsen. Foreløpig paneltesting utføres ved hjelp av en liten delmengde av antistoffer og påfølgende testing av hele panelet i kontrollvev. Formalinfikserte, parafininnstøpte vevsseksjoner oppnås og monteres på gullbelagte lysbilder og ytterligere farget. Fargingen tar 2 dager og ligner på standard immunhistokjemisk farging. Når prøvene er farget, plasseres de i bildeopptaksinstrumentet. Synsfelt velges, og bilder hentes, lastes opp og lagres. Den siste fasen er bildeforberedelse for filtrering og fjerning av forstyrrelser ved hjelp av systemets bildebehandlingsprogramvare. En ulempe med denne plattformen er mangelen på analytisk programvare. Bildene som genereres støttes imidlertid av forskjellig beregningspatologiprogramvare.
Introduction
Betydningen av de mange celletypene som omgir klonale tumorpopulasjoner er et avgjørende element i kategoriseringen av karsinogenese. Interessen for å belyse denne tumormikromiljøet (TME) sammensetning og interaksjoner har økt kontinuerlig etter etableringen av immunbasert terapi som en del av kreftbehandlingsarsenalet. Derfor har behandlingsstrategier skiftet fra en tumor-sentrisk tilnærming til en TME-sentrisk en1.
Arbeidet med å belyse immuncellenes roller i tumorovervåking og kreftutvikling har økt påfallende de siste årene 2,3. I medisinsk forskning oppsto en mengde metoder, inkludert cytometribaserte metoder og singleplex- og multiplex-bildebehandlingsteknologier, som en del av dette forsøket på å dechiffrere de unike interaksjonene mellom flere elementer i TME.
Banebrytende metoder som flowcytometri (oppfunnet på 1960-tallet), fluorescensaktivert cellesortering og massecytometri er hovedsakelig fokusert på å identifisere og kvantifisere TME-komponenter4. Selv om cytometribaserte kvantitative teknikker tillater fenotyping av immunlandskap, er det umulig å bestemme den cellulære romlige fordelingen. Omvendt bevarer metoder som standard singleplex immunhistokjemi vevsarkitekturen og gjør det mulig for forskere å analysere cellulær distribusjon, selv om et redusert antall mål i en enkelt vevsseksjon er en begrensning av disse metodene 5,6. I løpet av de siste årene har multipleksede bildebehandlingsteknologier for enkeltcelleoppløsning som multipleksimmunfluorescens, strekkoding av fluorescensbilder og avbildning av massespektrometri dukket opp som omfattende strategier for å skaffe informasjon om samtidig markørfarging ved bruk av samme vevsseksjon7.
Her presenterer vi en teknologi som kobler metallmerkede antistoffer og sekundær ionmassespektrometri og muliggjør kvantifisering av enkeltcelleoppløsning, markør-kopresjon (fenotyping) og romlig analyse ved hjelp av formalinfiksert, parafin-innebygd (FFPE) og ferske frosne (FF) vevsprøver 8,9. FFPE-prøver er de mest brukte materialene for vevsarkiveringsprøver og representerer en lettere tilgjengelig ressurs for multipleksede bildebehandlingsteknologier enn ferske frosne prøver10. I tillegg gir denne teknologien muligheten til å anskaffe bilder på nytt måneder etter. Her diskuterer vi våre farge- og bildebehandlingsprotokoller ved hjelp av FFPE-vevsprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vevsprøver ble innhentet for forskningsformål i samsvar med Institutional Review Board ved University of Texas MD Anderson Cancer Center, og prøver ble ytterligere avidentifisert.
1. Valg av antistoff
- Definer forskningsspørsmålene for å velge de beste tilgjengelige antistoffklonene. Bruk Human Protein Atlas, publisert forskning og antistoff produsent nettsteder som forskningsressurser.
MERK: Valget av tilstrekkelige humane vevskontroller og de samme menneskelige vevskontrollene som skal farges i de forskjellige trinnene, er avgjørende for å sikre at markørene er farget riktig, på rett sted og i riktig cellekammer. En liten vevsmikromatrise (TMA) inkludert normalt vev og neoplastisk vev anbefales alltid for fargevalidering. - Bruk bare bærerfrie antistoffer for å designe panelet.
MERK: Bruk av bærerfrie antistoffformuleringer er nødvendig hvis et kommersielt bærerfritt antistoff ikke er tilgjengelig; Rensesett kan brukes til å justere antistoffet til riktig formulering. Proteintilsetninger som bovint serumalbumin er kjent for å redusere konjugeringskapasiteten. - Test og titrere hvert antistoff ved hjelp av standard kromogen immunhistokjemi for å bestemme det subcellulære mønsteret til en markørs uttrykk; membran, cytoplasmatisk eller nukleær farging; og uttrykk i bestemte celler i kontrollvev.
MERK: Hvert antistoff må imidlertid testes i pH 6-sitrat og pH 9-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), og om panelet vil bli farget med pH 6-sitrat eller pH 9 EDTA må bestemmes. Bruk av pH 9 EDTA anbefales for å oppnå gode signaler, spesielt når du arbeider med denne metoden. - Velg den optimale fargekonsentrasjonen i henhold til uttrykksmønsteret i positive kontroller.
- Tilordne hvert antistoff til en av de tilgjengelige metallisotoper i henhold til immunohistokjemisk markør overflod, subcellulær lokalisering, og cellulære co-uttrykk med de andre målene.
- Flekk antistoffet med det tilsvarende tildelte metallet og sammenlign med uttrykket i samme kontrollvev som tidligere ble brukt.
MERK: Antistoffmetallkonjugering starter med antistoffpreparasjon, reduksjon og påfølgende konjugering (tilleggsfil 1). Hvert metallbelastet polymerrør er tilstrekkelig til å merke 100 μg av et antistoff.
2. Antistoffpanel design
- Lag små partier med antistofffarging. Test opptil fem markører i en cocktail.
MERK: Testing av antistoffer som allerede er konjugert og analysert ved hjelp av immunhistokjemi i batcher, letter tidlig identifisering av kanalinterferens og gir mulighet til å rekonjugere antistoffene med et annet metall. Det gir også en mulighet til å evaluere tilstrekkelig markør co-uttrykk. - Flekk hver liten batch med fire forskjellige antistoffkonsentrasjoner (0,05 μg / ml, 0,2 μg / ml, 1 μg / ml og 4,0 μg / ml).
MERK: Sammenligning av forskjellige titere, identifiser antistoffkonsentrasjonen som resulterer i riktig sted og høyeste uttrykk med minimal bakgrunnsfarging (beste signal-til-støy-forhold).
3. FFPE vev seksjonering
- Velg gullbelagte lysbilder (spesifikke for dette formålet) og hold dem nær mikrotomet. Forbered mikrotomet ved å sette inn et nytt blad i holderen. Sett seksjonstykkelsen til 4-5 μm.
- Legg FFPE-blokker på is før du seksjonerer. Forbered et vevsflytebad ved oppvarming av destillert vann eller avionisert vann (diH2O) til 40-45 °C.
MERK: Bruk av diH2O eller destillert vann reduserer muligheten for forurensning. - Begynn å seksjonere. Plasser vevsseksjonen i vannet ved hjelp av pinsett og la den flate ut. Bruk lysbildene til å fjerne vevsseksjoner fra vannet.
- Plasser lysbildene i et lysbildestativ og la dem tørke ved romtemperatur over natten.
4. FFPE antistoff farging
MERK: Fargingsprosessen foregår på to separate dager.
FORSIKTIG: Løsningene som brukes i denne protokollen er potensielt etsende og representerer farer for hud og øyne. Bruk av hansker, laboratoriefrakk og beskyttende øye- og ansiktsutstyr anbefales og er en del av institusjonens biosikkerhetspolitikk.
- Tilberedning av reagens (dag 1)
- Fortynn 50 ml 20x Tris-bufret saltvann med Tween (TBS-T) til 950 ml diH2O for å lage 1 liter TBS-T.
- Fortynn 8 ml 10x Tris-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) til 72 ml diH2O for å lage en 1x varmeindusert epitopinnhenting (HIER) løsning.
- Fortynn eselserum i 1x TBS-T til en endelig konsentrasjon på 5% for å lage blokkeringsbuffer. Oppbevar oppløsningen ved 4 °C til den er klar til bruk.
- HIER forberedelse: Forbehandling (PT) modul
FORSIKTIG: Bruk kjemiske vernehansker ved håndtering av reagenser eller deler nedsenket i reagenser som brukes i PT-modulen.- Fortynn 140 ml 10x fosfatbufret saltvann (PBS) til 1,260 ml diH2O for å lage 1,4 L 1x PBS. Alternativt kan du fortynne syv PBS-tabletter til 1,4 liter diH2O.
- Fyll en tank med 1,4 L PBS og plasser den forberedte skyvekammerbeholderen med 100 ml 1x HHIER-løsning i tanken.
- Forvarm tanken i en PT-modul til 75 °C.
- Overflødig fjerning av parafin
- Stek sklier ved 70 °C i en ovn i minst 20 minutter.
MERK: Noen vev eller seksjoner kan trenge lengre steketider. Den anbefalte steketiden for hjernevev eller en TMA er 1 time. Dette kan utvides til 16 timer (over natten) eller i henhold til laboratorieerfaring. - Plasser bakte lysbilder i en lysbildeholder og utfør følgende vasketrinn på en shaker under en avtrekkshette. Vask lysbildene i følgende løsning: Xylen 2x i 30 s (metallfri), 100% alkohol 2x i 30 s (metallfri), 95% alkohol 2x i 30 s (metallfri), 80% alkohol i 30 s (metallfri), 70% alkohol i 30 s (metallfri) og diH2O 2x i 30 s (metallfri).
- Oppbevar lysbildene i en ny diH2O-beholder til de er klare for antigenuthenting.
MERK: Lysbildene skal ikke tørkes før slutten av prosedyren.
- Stek sklier ved 70 °C i en ovn i minst 20 minutter.
- Uthenting av antigen
- Plasser lysbildene i et forvarmet glidekammer som inneholder 1x HIER-buffer inne i PT-modulen. Plasser dekselet på tanken. Lukk og lås lokket.
- Trykk på menyknappen på PT-modulen for å åpne hovedmenyen og trykk på Oppsettsyklus (tid og temperatur) -knappen for å lage et tilpasset program.
- Kjør PT-modulen ved 97 °C i 40 minutter. Etterpå kjøles PT-modulen automatisk ned til 65 °C.
- Fjern lysbildene fra PT-modulen når temperaturen på 65 °C er nådd. Hold lysbildene i romtemperatur i 30 min.
MERK: PT-modulen åpnes ikke før temperaturen er avkjølt til 65 °C. Ikke berør den gyldne overflaten av lysbildene under denne prosessen, og bruk alltid hansker.
- Blokkering av antistoffer
- Sett en shaker til 70 o / min.
- Vask lysbildene ved å dyppe dem i 1x TBS-T i 5 min 2x.
- Bruk en hydrofob barrierepenn til å tegne en kant rundt vevsseksjonen minst 1 mm fra glidekantene og la den tørke i 15-30 s.
MERK: Pass på at pennevæsken berører vevsdelen for å unngå vevsinterferens med fargingen. Ikke trykk pennen for hardt ned mens du trekker barrieren for å unngå potensielle lekkasjer. For optimale farge- og bildeinnsamlingsresultater plasseres vevsseksjonene midt i de gullbelagte lysbildene i en ramme som ikke er større enn 15 mm x 30 mm for å gi nok plass til å tegne barrieren uten å berøre vevet eller føringsprikkene som er plassert på ytterkanten av lysbildet. - Hvis du vil fjerne eventuelle pennerester, dypper du lysbildene i TBS-T.
- I et fuktighetskammer ved romtemperatur, inkuber vevsseksjonen med 100-200 μL blokkeringsbuffer i 20 minutter. La vevet inkubere i blokkeringsbufferen til en antistoffmasterblanding er klar.
- Forberedelse av antistoffpanel
MERK: Det endelige volumet av antistoffpanelcocktailen varierer i henhold til estimert vevsseksjonsoverflate. For å dekke et område på 20 mm x 20 mm, tilbered 100-200 μL av cocktailen.
Gjør følgende for å tilberede en antistoffpanelcocktail av metallisotopkonjugerte antistoffer:- Bekreft det endelige volumet av cocktailen som tilsvarer antistoffcocktailvolumet som er lagt til blokkeringsbuffervolumet.
- Bekreft spesifikasjonene for alle antistoffer, fortynninger og/eller antistoffkonsentrasjoner i et panelregneark for prosjektet.
- Spinn ned alle antistoffholdige rør ved 10.000 x g i 5 minutter. Tilsett individuelle antistoffer til blokkeringsbufferen og bland veldig bra. Ikke forstyrr bunnen av antistoffrøret når du pipetterer det.
- Filtrer antistoffpanelet ved å forfukte en 0,1 μm sentrifugalfilterenhet med 100 μL blokkeringsbuffer. Spinn filteret på 10 000 x g i 2 minutter og fjern blokkeringsbuffergjennomstrømningen med en pipette.
- Overfør antistoffpanelet til en spinnsøyle og spinn filteret på 10 000 x g i 2 minutter. Kast spinnsøylen og bruk gjennomstrømningen som det filtrerte antistoffpanelet.
MERK: Utfør fargingen umiddelbart etter at du har laget cocktailen for å forhindre metallutveksling. Hvis lagring av antistoffcocktailen i lengre tid er nødvendig, kan den bli utsatt for lyofilisering.
- Antistofffarging
- Fjern blokkeringsbufferen forsiktig fra lysbildene ved å tippe hvert lysbilde på siden og forsiktig trykke kantene mot en oppgavevisker.
- Plasser lysbildene i et fuktkammer og tilsett 100-200 μL antistoffmasterblanding til vevet (unngå kontakt med vev og dannelse av luftbobler).
- Legg til positive og negative kontrolllysbilder i fargebunken.
- Inkuber skliene ved 4 °C over natten (14-16 timer).
- Tilberedning av reagens (dag 2)
- Fortynn 100 ml 10x lavbarium PBS, pH 7,4, i 900 ml diH2O for å lage 1x PBS.
- Forbered 350 ml av en arbeidsmaterialeløsning med 2% glutaraldehyd i lavbarium PBS (340 ml lavbarium PBS + 10 ml 70% glutaraldehyd).
MERK: Utfør fortynningen under en hette. Glutaraldehyd er en veldig viskøs væske. Bruk en 1 ml pipette og tilsett 1 ml lavbarium PBS til glutaraldehydrøret hver gang til det blir flytende nok til å helles ut av røret. - Fortynn 10x Tris, pH 8,5, i 900 ml diH20 for å lage 1x Tris.
- Fiksering og dehydrering
- Fjern antistoffmalblandingen fra hvert lysbilde ved å tippe lysbildet på siden og forsiktig banke kanten mot en oppgavevisker.
- Vask lysbildene med lett til moderat omrøring i følgende buffere: 1x TBS-T, 3x ganger i 5 minutter hver (metallfri); filtrert 2% glutaraldehyd i 5 minutter; filtrert 1x tris, pH 8,5, 3x for 30 s; filtrert diH2O 2x for 30 s; 70% alkohol i 30 s (metallfri); 80% alkohol i 30 s (metallfri); 95% alkohol i 30 s (metallfri); og 100% alkohol i 30 s (metallfri).
- Bank forsiktig på kanten av hvert lysbilde mot en oppgavevisker for å fjerne overflødig alkohol og la gjenværende alkohol fordampe ved romtemperatur (~ 5-10 min).
- Tørk lysbilder i en tørkemiddel i minst 1 time før bildeopptak, eller hold lysbildene i et vakuumkammer for langtidslagring.
5. Bildeoppkjøp
- Oppsett av lysbilde
MERK: Før du skanner med instrumentet, må lysbildene defineres og konfigureres ved hjelp av det nettbaserte bildebehandlingsprogrammet ved å følge trinnene som er beskrevet nedenfor.- På lysbildesiden i det nettbaserte bildebehandlingsprogrammet klikker du Tiltredelse nytt lysbilde og skriver inn de ønskede detaljene (navn, lysbildeidentifikasjon, plassering og beskrivelse).
- Opprett skanneseksjoner ved å klikke Legg til seksjon. Fyll ut informasjonen for hver del (navn på prosjektet, lysbildenavn, blokk og plassering). Hvis du vil lagre de nye lysbildene/inndelingene som er opprettet, klikker du Send.
- Under ressursfanen åpner du panelsiden og velger panelet som skal brukes. For nye paneler klikker du på Opprett nytt panel.
- Etter å ha valgt panelet, klikk på Seksjoner. Legg til inndelingene som ble opprettet i trinn 2. ved å klikke på Rediger seksjonsoppgave. Lagre ved å klikke Send.
- Instrument oppsett
MERK: Dette instrumentet (se Materialfortegnelse) betjenes ved hjelp av et spesifikt kontrollprogram (se Materialfortegnelse).- Logg på kontrollprogramvaren. Klikk på Vekk hvis instrumentet er i hvilemodus.
MERK: Minst 1 time før operasjonen anbefales oppvarming av instrumentet, noe som hjelper med stabilisering av strålefokus. - For å laste inn et lysbilde, klikk på Exchange Sample og klikk deretter Fortsett for å åpne døren. Sett lysbildet i lastesporet med prøven vendt opp og etiketten til høyre. Klikk Fortsett for å lukke døren.
MERK: Hvis lysbildet ikke er lastet inn riktig, vises en advarselslyd og et varsel om å justere lysbildet. - Velg prosjektet, og velg deretter lysbildenavnet for det lastede eksemplet.
- Visualiser panoramabildet i ruten med optisk bilde på lysbildet.
- Logg på kontrollprogramvaren. Klikk på Vekk hvis instrumentet er i hvilemodus.
- Valg og anskaffelse av synsfelt (FOV)
- Klikk på Mode-menyen og velg SED (Secondary Electron Detector). Klikk på bildemodusmenyen og velg QC -300 μm.
- Klikk på Jog Stage for å kontrollere FOV-plasseringen, og klikk deretter på pilene for å navigere og velge posisjonen til FOV.
- Klikk på Legg til FOV, angi 400 μm x 400 μm som feltstørrelse, og velg fin som bildemodus og 1 ms oppholdstid. Klikk på Bekreft.
MERK: Den innstilte oppholdstiden vil avhenge av ønsket oppløsning. Oppholdstiden øker etter hvert som oppløsningen øker. Anskaffelsestiden kan variere avhengig av flere faktorer, inkludert detektorinnbruddsperiode og driftslengde. Vår gjennomsnittlige anskaffelsestid for en FOV er ca 17 min. Bruk instrumentet nonstop i opptil 8 timer, noe som gjør det mulig å skanne ca. 28 FOV-er. Kvaliteten på de anskaffede bildene reduseres etter mange påfølgende timers bruk. - Etter å ha opprettet en FOV-liste, fortsett til bildefokus og juster stigmasjonen ved å flytte strålen til et vevsområde som ikke vil bli avbildet. Juster parametrene til et klart sentralt bilde er oppnådd.
MERK: For å optimalisere bildeopptak er det ideelt å holde vevsdelen sentralisert på lysbildet. Mens du fokuserer, kan du få et klart bilde av bare det sentrale området. Hvis vevsseksjonen er for stor, vil kantene være ute av fokus, og bildet blir uskarpt. - Klikk på Start Kjør. Innhentede bilder blir automatisk lastet opp og lagret i det nettbaserte bildebehandlingsprogrammet.
6. Forberedelse av bilder
- Bilde isobarisk korreksjon
MERK: Formålet med isobarisk korreksjon er å fjerne spilloversignal mellom kanaler som følge av tilstedeværelsen av isotoper med lik eller svært lik masse hvis forskjeller i masse ikke kan oppdages ved hjelp av masseanalysatoren.- I det nettbaserte bildebehandlingsprogrammet klikker du på det grønne Last ned-ikonet for å lagre FOV-ene (TIFF-bilder).
- Last ned den mest oppdaterte versjonen av bildebehandlingsprogramvaren (se Materialfortegnelse) som er tilgjengelig på om-fanen i det nettbaserte bildebehandlingsprogrammet, og lagre den i en fil. Åpne .zip arkivfilen og følg installasjonstrinnene. Åpne programvaren når installasjonen er fullført.
- Velg mappen som inneholder bildene som skal korrigeres ved å klikke på Fil-ikonet i inndataruten til bildebehandlingsprogramvaren. En FOV-liste vil bli lastet inn.
- Klikk på Filter-ikonet i inndataruten for å bruke standardkorrigeringer. For hver kanal, visualiser bilder oppnådd før og etter korreksjon på høyre side av skjermen.
- Klikk på diskettikonet i utdataruten for å lagre det korrigerte bildet.
- Bildefiltrering: Voronoi tessellation
MERK: Voronoi tessellation diagrammer illustrerer en partisjon av plass som inneholder frø poeng i Voronoi celler. Målet er å estimere celletettheten og definere cellegrenser. Ved hjelp av Voronoi-tessellasjonsberegningen genereres en maske og brukes på originalbildet for filtrering.- Klikk på Filtrering-fanen og velg Voronoi Tesselation på menyen for filtreringsparametere.
- I inndataruten velger du MassCorrected.tiff-bildet. Klikk på Filter-ikonet i inndataruten.
- Klikk på diskettikonet i utdataruten for å lagre det filtrerte bildet. De to resulterende filene vil ha suffiksene -Filtered.tiff og -Filtered.json.
MERK: Bildet heter MassCorrected-Filtered.tiff kan deretter lastes opp til et tredjeparts digitalt analyseprogram eller programvare med åpen kildekode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tonsil- og lungeadenokarsinom TMA-vevsseksjoner (5 mm tykke) ble oppnådd og plassert på midten av gullbelagte lysbilder etter spesifikasjonene for vevsstørrelse og sikre marginer av lysbildene. Frie glassmarginer på 5 mm og 10 mm mellom kanten av vevet og henholdsvis laterale og nedre grenser av glassglassene er nødvendige for optimal farging. Vevseksjonene ble bakt over natten i en ovn før farging for å sikre riktig festing av seksjonen til lysbildet. Antistoffpanelet var sammensatt av 23 markører. I samme fargeparti ble et tonsilleglass og et TMA-lysbilde med flere vev inkludert for å evaluere uttrykket av markører som var lite uttrykt i lungeadenokarsinomprøver (figur 1). Positive kontroller må velges i henhold til målene for antistoffene som brukes i panelene; For eksempel, for å evaluere SOX10-uttrykk, er det nødvendig med melanomprøver, og for å evaluere GAFP-uttrykk er det nødvendig med glioblastomprøver (figur 2).
Figur 1: Isotopisk renhet og kanalkryss. Matrisen viser prosentvis krysstale avledet fra sondens renhet og oksider (blå bokser, ≥0,5%; klare bokser, <0,5%). For massetaggene vises sonder som bidro med minst 0,5 % kryssprat i ingen kanaler (grønn), én eller to kanaler (gul) eller mer enn to kanaler (oransje). Massekanaler som mottar minst 0,5% kryssprat fra ingen sonder (grønn), en eller to sonder (gul) eller mer enn to sonder (oransje) vises også. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative fargebilder i ulike vev . (A) Lungeadenokarsinom. (B) Nonneoplastic nyre. (C) Mandel. CD20 er vist i gult, Ki67 er vist i magenta, CD3 er vist i hvitt, CD11c er vist i grønt, CD68 er vist i rødt, cytokeratin er vist i cyan, og dobbeltstrenget DNA (dsDNA) er vist i blått. Forstørrelse, 200x. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Denne fargeprosedyren ligner på standard immunhistokjemisk farging og skjedde to påfølgende dager. De fem hovedtrinnene i fargeprotokollen er 1) overflødig parafinfjerning, 2) antigenuthenting, 3) antistoffblokkering, 4) antistofffarging og 5) fiksering og dehydrering (figur 3). Et grunnleggende skritt i fargeprosedyren er å ta forholdsregler for å unngå metallkontaminering av prøvene, inkludert bruk av metallfrie reagenser lagret i plastutstyr og forsiktig håndtering av prøvene for å begrense mekanisk skade. Det anbefales å tilberede antistoffcocktailen umiddelbart før farging. Dette reduserer metallutvekslingen. Når fargingen var fullført, lagret vi lysbildene og skannet dem neste dag. Før bildeopptak er et nødvendig trinn lysbildeoppsett ved hjelp av et nettbasert bildebehandlingsprogram (figur 4).
Figur 3: Arbeidsflyt for bildeinnhenting og tilhørende lysbilde. (A) Sammendrag av arbeidsflyten for bildeinnhenting. 1) En FFPE-vevsseksjon farget med metallkonjugerte antistoffer rasteriseres ved hjelp av en primærionpistol, og frigjør sekundære ioner. 2) Et time-of-flight massespektrometer separerer, og måler ioner basert på deres masse på pikselnivå. 3) Pikselbasert kvantifisering av sekundære ioner. Y-aksen tilsvarer antall ioner oppdaget (topp), og x-aksen tilsvarer massen av hvert metall. 4) Basert på toppen av hvert massespektrum rekonstrueres flerdimensjonale bilder. (B) Skjematisk av lysbildet som brukes i denne prosedyren. For optimal farging av vevet må seksjonen plasseres minst 5 mm fra lysbildets sidekant og 10 mm fra underkanten. Når du tegner den hydrofobe barrieren rundt vevsseksjonen, må den holdes inne i rektangelet minst 1 mm fra lysbildets kant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Skyveoppsett i det nettbaserte bildebehandlingsprogrammet. Før lysbildeskanning er det nødvendig å konfigurere hvert lysbilde. Skriv inn de ønskede detaljene som kan hjelpe med lysbildeidentifikasjon. Klikk på Legg til seksjon (svart pil) for å inkludere blokk- og posisjonsinformasjon. Hvis du vil lagre, klikker du Send (rød pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
På skannedagen slår du på anskaffelsesinstrumentet ved hjelp av kontrollprogramvaren. Ved å klikke på Exchange Slide åpnet døren til instrumentet, slik at lasting av et lysbilde. Vi plasserte lysbildet på lastesporet vendt opp med etiketten på høyre side. Bare ett lysbilde kan skannes samtidig. Det neste trinnet var å velge FOV-ene og justere fokus og stigmasjon ved å følge trinnene beskrevet i protokollen. Vi kjøpte bilder ved å klikke på Start Run. Anskaffelsestiden varierer avhengig av ønsket FOV-størrelse og oppløsning. FOV-størrelsen varierer fra 200 μm x 200 μm til 800 μm x 800 μm, noe som tilsvarer et rammestørrelsesområde på 128 piksler x 128 piksler til 2048 piksler x 2048 piksler. Tre standardoppløsninger er tilgjengelige: grove, fine og superfine. Skanning av større FOV-er med superfin oppløsning er tidkrevende, med den endelige anskaffelsestiden for en FOV fra 25 s til 4,7 timer (figur 5).
Figur 5: Bildeinnhenting ved hjelp av kontrollprogramvaren. Brukeranskaffelsesinnstillingene kan justeres etter ønske. For å endre skanneoppløsningen, klikk på rullegardinmenyen ved bildemodus (svart pil). Hvis du vil endre FOV-størrelsen, skriver du inn et tall i feltet FOV-størrelse (μm) (rød pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Etter at skanningen var fullført, ble et bildesett som inkluderte alle FOV-er automatisk lastet opp til det nettbaserte bildebehandlingsprogrammet. I tillegg til lagring av bilder, muliggjør dette programmet visualisering av alle kanaler sammen eller separat, bildejusteringer og nedlasting av bilder for videre forberedelse. Standard visualisert bilde lagres som en TIFF-fil (figur 6).
Figur 6: Bildevisualisering ved hjelp av det nettbaserte bildebehandlingsprogrammet. Ervervede bilder lagres og visualiseres ved hjelp av den elektroniske plattformen. Det er mulig å justere visualiseringsparametrene og endre fargen på hver markør. Klikk på Legg til bildekanal (hvit pil) for å visualisere andre markører. Forstørrelse, 200x. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Metallforstyrrelser er iboende i metallmerkingsmetodene til tross for bruk av strategier for å minimere dem. For å fjerne overflødige bakgrunnssignaler fra metallisotop konjugert til antistoffene og forberede bilder for analyse, brukte vi tilhørende bildebehandlingsprogramvare (se materialtabell). Bildeprepareringsprosedyren har to trinn: 1) isobarisk korreksjon, som fjerner signaler mellom kanaler, og 2) filtrering, som fjerner signaler forårsaket av aggregater på bildet.
For å starte isobarisk korreksjon ble filen som inneholder det lagrede TIFF-bildet valgt ved å klikke på Fil-ikonet i inndataruten. Programvaren laster automatisk alle arkiverte TIFF-bilder i filen, slik at batchanalyse. Deretter korrigerte vi bildet ved å klikke på Filter-ikonet i inndataruten. To resulterende filer med suffikset -MassCorrected ble automatisk generert: en arkivert i TIFF-format og den andre arkivert i JSON-format. Som standard ble de resulterende arkivene lagret i samme fil som det opprinnelige bildet ble lastet fra (figur 7).
Figur 7: Bildeforberedelse: korreksjonstrinn. For å laste inn et bilde for klargjøring i bildebehandlingsprogramvaren, klikk på Fil-ikonet i inndataruten (svart pil) og velg bildet. For å bruke standard korreksjonsprosedyre, klikk på Filter-ikonet i inndataruten (rød pil). For å lagre det oppdaterte, korrigerte bildet, klikk på diskettikonet i utdataruten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Det andre trinnet med bildeforberedelse er filtrering, som kan velges på den øvre fanen i programvaren. Vi valgte det korrigerte bildet i inndataruten. I dette trinnet ble automatisert Voronoi-tessellasjon brukt som filtreringsparameter. Ved å klikke på filterikonet på inndatapanelet ble det valgte filteret automatisk brukt på alle kanaler. I begge bildeforberedelsestrinnene (korrigering og filtrering) vises bildene av hver kanal før og etter behandling og signalforskjeller på høyre side av skjermen.
I likhet med isobarisk korreksjonstrinn ble to nye arkiver, en i TIFF og en i JSON-format, generert. I dette trinnet var suffikset etter filnavnet -Filtrert. Derfor ble det endelige bildet som ble oppnådd kalt MassCorrected-Filtered.tiff. Ved å fullføre disse trinnene forberedte vi bildet for analysen ved hjelp av den foretrukne digitale patologiprogramvaren (figur 8 og figur 9). Ved å bruke denne teknikken var vi i stand til å analysere alle 23 markørene i antistoffpanelet med minimale forstyrrelser mellom kanaler på subcellulært nivå i en enkelt vevsseksjon.
Figur 8: Bildeforberedelse: filtreringstrinn. Velg Filtrering i den øvre fanen (svart pil) i bildebehandlingsprogramvaren. Under Filtreringsparametere velger du ønsket metode (grønn pil). I inndataruten velger du MassCorrected image. For å bruke den valgte prosedyren på bildet, klikk på Filter-ikonet i inndataruten (rød pil). For å lagre det oppdaterte filtrerte bildet, klikk på diskettikonet i utdataruten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Representative bilder av fargingen før og etter bildefremstilling. (A) Bilde av en mandelvevsseksjon farget ved hjelp av denne teknikken og visualisert ved hjelp av et tredjeparts digitalt bildeanalyseprogram før filtrering og korreksjon. (B) Bilde av samme seksjon under de samme forholdene etter filtrerings- og korrigeringstrinn. CD20 er vist i gult, Ki67 er vist i magenta, CD3 er vist i hvitt, CD11c er vist i grønt, cytokeratin er vist i cyan, og dobbeltstrenget DNA (dsDNA) er vist i blått. Forstørrelse, 200x. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Antistoffpanelliste. Hvert antistoff ble konjugert til en bestemt metallisotop med en annen masse som oppført. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den omfattende belysningen av de komplekse, intrikate interaksjonene mellom de mange komponentene i en TME er fortsatt et sentralt mål for kreftforskning. Produsenter har introdusert mange multipleksede analyser som en del av denne innsatsen, spesielt de siste 5 årene. Multiplexed romlig analyse er et allsidig og kraftig verktøy som letter samtidig kategorisering av flere mål samtidig som strukturell morfologi i tumorprøver bevares. Romlige analyseteknikker kan utføres ved hjelp av fluorescensavbildning eller massespektrometri, slik som teknikken beskrevet her i11,12,13.
Før farging er antistoffoptimalisering ved bruk av en vanlig immunhistokjemiprotokoll etterfulgt av fargeprotokollen nødvendig for å standardisere antistofffargingsreproduserbarhet. Et veldig kjent faktum er at forskjellige vanlige antistoffkloner kan ha optimalt uttrykk under forskjellige forhold. For å konjugere antistoffer med metallmerker er det imidlertid nødvendig med bærerfrie antistoffer, som definerer samme pH for antigeninnhenting for alle antistoffene integrert i panelet, noe som er en ulempe ved denne metoden. Hvis du ikke fullfører dette trinnet, kan det føre til bilder av lav kvalitet som ikke kan analyseres. Det er viktig å bruke tid på å undersøke medisinsk litteratur og antistoffprodusentenes nettsteder for å velge de beste godt validerte, pålitelige antistoffene blant de som er kommersielt tilgjengelige. Når du validerer antistoffene og panelene, er det nyttig å konstruere mindre paneler. Dette hjelper til med å identifisere mulige kanalinterferenser og evaluere riktig uttrykk for markørene.
En av de karakteristiske egenskapene til denne teknikken er evnen til å studere opptil 40 metallmerkede antistoffer på en enkelt vevsseksjon. Til tross for at de er svært fordelaktige, er metallmerkede massespektrometriteknikker utsatt for utfordrende metallinterferenser, for eksempel isobariske forstyrrelser. Isobariske interferenser er karakteristiske for massespektrometrimetoder for metallmerking og er resultatet av eksistensen av isotoper med lik eller svært lik masse hvis masseforskjell er mindre enn masseanalysatorens deteksjonskapasitet. Disse forstyrrelsene kan være forårsaket av isotopisk forurensning eller polyatomiske arter. Isotopisk forurensning refererer til et elements renhet. I naturen er de fleste elementer til stede i en blanding av isotoper. Selv når de blir utsatt for anrikning, kan 100% renhet ikke oppnås. Det resulterer i mer enn ett element med samme masse og produserer kryssprat mellom kanaler. Median renhet av de 40 tilgjengelige metallisotoper er 98%. Forstyrrelsene på grunn av polyatomiske arter stammer fra fri metallbinding til negativt ladede arter som hydrider, karbider, nitrider, oksider, hydroksider og cyanider, og legger fra +1 til +26 til den endelige massen av metallmerket. Utvikling av strategier for å minimere mulige støykilder er avgjørende for å oppnå god farging og avbildning. Det første nødvendige trinnet i panelkonstruksjon er forsiktig metallisotop-antistoffoppdrag. Markører som generelt er utbredt i vevsseksjoner, som cytokeratin og CD45, bør konjugeres til metallisotoper med høy masse (større enn 160 Gd) for å minimere effekten av polyatomiske forstyrrelser, og knappe markører bør konjugeres til isotoper med masser fra 140 Ce til 160Gd. Noe å huske på er at risikoen for metallinterferens øker etter hvert som antall markører øker. Men med forsiktig plassering av metall og markører kan virkningen av gjenværende forstyrrelser reduseres med ytterligere bildebehandling ved hjelp av bildebehandlingsprogramvaren.
Komplementære prosedyrer kan også brukes til å redusere metallkontaminering av prøvene i vevskjæring og farging. Som beskrevet i protokollen ovenfor, forhindrer bruk av destillert vann eller diH2O i vannbadet denne forurensningen. På samme måte må reagensene som brukes i farging være metallfrie. Et nyttig tips er å unngå å lagre reagenser i glassbeholdere, da glassvarer letter metallkontaminering. For å oppnå optimale samlede resultater, anbefaler vi i fargetrinnet å bake lysbilder over natten for å sikre god festing av vevsseksjoner til lysbildene.
I motsetning til andre multipleksede metoder bruker denne metoden FFPE-prøver14. Kombinert formalinfiksering og parafininnstøping er fortsatt den mest brukte formen for bevaring og forberedelse av prøver. Bruken av arkiverte blokker gjør det mulig å utføre mer omfattende studier enn bruk av ferske frosne prøver, inkludert retrospektiv forskning, og har lavere kostnader. Denne metoden tillater også hel-slide imaging og lysbilde rescanning. Dette fanger opp et bredere analyseområde enn å velge bare deler av lysbildet og muliggjør skanning med flere forstørrelser.
Denne teknikken har begrensninger knyttet til instrumentets pris og kravet om å kjøpe materialer som gullbelagte lysbilder direkte fra produsenter. Forsøk på å bruke ubestrøkne lysbilder, lysbilder belagt med et annet materiale enn gull, eller lysbilder hentet fra andre selskaper enn produsentene, kan ikke føre til signalinnhenting og omfattende signalinterferens og kan til slutt skade instrumentet.
En annen betydelig ulempe ved denne metoden er fraværet av spesifikk programvare for analyse. Denne metoden genererer bilder i TIFF-format, som er mye brukt og lett kan lastes opp til tredjeparts digital analyseprogramvare. Programvareverktøy for beregningspatologi muliggjør omfattende analyse, inkludert vevsinndeling, cellesegmentering, markørkvantifisering i et hvilket som helst cellulært rom og nærmeste nabo- og nærhetsanalyse. Anskaffe en tredjeparts digital analyseprogramvare for bruk, øker kostnadene for en allerede dyr teknikk15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Don Norwood fra Editing Services, Research Medical Library ved MD Anderson for redigering av denne artikkelen og Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory ved Department of Translational Molecular Pathology ved MD Anderson. Denne publikasjonen resulterte delvis fra forskning tilrettelagt av den vitenskapelige og økonomiske støtten til Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) gitt gjennom National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) til University of Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
- Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T.
- Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).
- Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
- Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
- Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
- Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).
- Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98 (2021).
- Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
- Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Rad, H. S., et al. The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).
