Summary
がん免疫療法の時代、腫瘍微小環境ダイナミクスの解明への関心が飛躍的に高まっています。このプロトコルは、その染色およびイメージングステップに関して質量分析イメージング技術を詳述し、高度に多重化された空間分析を可能にする。
Abstract
免疫ベースの治療法の進歩は、がんの治療と研究に革命をもたらしました。これは、腫瘍免疫ランドスケープの特性評価に対する需要の高まりを引き起こしました。標準的な免疫組織化学は組織構造の研究には適しているが、少数のマーカーの分析に限定される。逆に、フローサイトメトリーなどの技術は、組織形態に関する情報は失われるが、複数のマーカーを同時に評価することができる。近年、表現型解析と空間解析を統合した多重化戦略が、腫瘍免疫ランドスケープの特性評価への包括的なアプローチとして浮上している。 ここでは、金属標識抗体と二次イオン質量分析を組み合わせた革新的な技術について、アッセイの開発と最適化、組織の準備、画像の取得と処理における技術的ステップに焦点を当てて説明します。染色する前に、金属標識抗体パネルを開発し、最適化する必要があります。このハイプレックス画像システムは、単一の組織切片で最大 40 個の金属タグ付き抗体をサポートします。注目すべきは、信号干渉のリスクは、パネルに含まれるマーカーの数とともに増加することです。パネル設計後、この干渉を最小限に抑えるために、抗体への金属同位体割り当てに特に注意を払う必要があります。予備パネル試験は、抗体の小さなサブセットおよび対照組織におけるパネル全体のその後の試験を用いて実施される。ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片が得られ、金コーティングされたスライドに取り付けられ、さらに染色される。染色には2日かかり、標準的な免疫組織化学染色とよく似ています。サンプルが染色されると、画像取得装置に入れられます。視野が選択され、画像が取得、アップロード、および保存されます。最終段階は、システムの画像処理ソフトウェアを使用した干渉のフィルタリングと除去のための画像準備です。このプラットフォームの欠点は、分析ソフトウェアの欠如です。しかし、生成された画像は、異なる計算病理学ソフトウェアによってサポートされています。
Introduction
クローン性腫瘍集団を取り巻く多数の細胞型の重要性は、発癌の分類において重要な要素である。この腫瘍微小環境(TME)組成と相互作用の解明への関心は、がん治療兵器の一部としての免疫ベースの治療法の確立に続いて継続的に高まっています。したがって、治療戦略は、腫瘍中心のアプローチからTME中心のアプローチに移行している1.
近年、腫瘍サーベイランスやがん発生における免疫細胞の役割を解明する取り組みが目覚ましく増加しています2,3.医学研究では、サイトメトリーベースの方法やシングルプレックスおよびマルチプレックスイメージング技術など、TMEの複数の要素のユニークな相互作用を解読するこの試みの一環として、多数の方法が生まれました。
フローサイトメトリー(1960年代に発明)、蛍光活性化細胞ソーティング、マスサイトメトリーなどの先駆的な方法は、主にTME成分4の同定と定量に焦点を当てています。サイトメトリーベースの定量的手法は免疫ランドスケープ表現型化を可能にするが、細胞空間分布を決定することは不可能である。逆に、標準的なシングルプレックス免疫組織化学などの方法は、組織アーキテクチャを保持し、研究者が細胞分布を分析することを可能にするが、単一の組織切片における標的の数の減少は、これらの方法の限界である5,6。過去数年間で、マルチプレックス免疫蛍光、バーコード蛍光イメージング、イメージング質量分析などの単一細胞分解能のための多重イメージング技術が、同じ組織セクション7を使用して同時マーカー染色に関する情報を取得するための包括的な戦略として浮上してきました。
ここでは、金属タグ付き抗体と二次イオン質量分析を結合し、ホルマリン固定、パラフィン包埋(FFPE)、および新鮮凍結(FF)組織サンプル8,9を用いた単一細胞分解能定量、マーカー共発現(表現型解析)、空間分析を可能にする技術を紹介します。FFPEサンプルは、組織アーカイブサンプルに最も広く使用されている材料であり、新鮮な凍結サンプル10よりも多重化イメージング技術のためにより容易に利用可能なリソースを表す。さらに、この技術は数ヶ月後に画像を再取得する可能性を提供します。ここでは、FFPE組織サンプルを用いた染色および画像処理プロトコルについて説明します。
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Protocol
組織サンプルは、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターの治験審査委員会に従って研究目的で取得され、サンプルはさらに脱同定された。
1. 抗体の選択
- 研究課題を定義して、利用可能な最良の抗体クローンを選択します。ヒトタンパク質アトラス、公開された研究、および抗体メーカーのウェブサイトを研究リソースとして使用します。
メモ:マーカーが正しく、適切な場所、および正しい細胞コンパートメントで染色されることを確認するために、適切なヒト組織コントロールと異なるステップで染色される同じヒト組織コントロールの選択が重要です。染色検証には、正常組織および腫瘍組織を含む小型組織マイクロアレイ(TMA)が常に推奨されます。 - キャリアフリー抗体のみを使用してパネルを設計します。
注:市販の担体フリー抗体が入手できない場合、キャリアフリー抗体製剤の使用が必要です。精製キットは、抗体を正しい製剤に調整するために使用することができる。ウシ血清アルブミンなどのタンパク質添加物は、コンジュゲーション能力を低下させることが知られている。 - 標準的な発色免疫組織化学を用いて各抗体を試験および滴定し、マーカーの発現の細胞内パターンを決定する。膜、細胞質、または核染色;および対照組織における特定の細胞における発現。
注:ただし、各抗体はpH6クエン酸塩およびpH9エチレンジアミン四酢酸(EDTA)で試験する必要があり、パネルをpH6クエン酸塩またはpH9EDTAで染色するかどうかを決定する必要があります。pH 9 EDTAの使用は、特にこの方法論で作業する場合に、良好なシグナルを得るために推奨される。 - ポジティブコントロールにおける発現パターンに応じて最適な染色濃度を選択します。
- 免疫組織化学的マーカーの存在量、細胞内局在、および他の標的との細胞共発現に従って、利用可能な金属同位体の1つに各抗体を割り当てます。
- 抗体を対応する割り当てられた金属で染色し、以前に使用したのと同じ対照組織における発現と比較する。
注:抗体金属コンジュゲーションは、抗体調製、還元、およびその後のコンジュゲーションから始まります(補足ファイル1)。各金属装填ポリマーチューブは、100μgの抗体を標識するのに十分である。
2. 抗体パネル設計
- 抗体染色の小さなバッチを作成します。カクテルで最大5つのマーカーをテストします。
注:免疫組織化学を使用してすでに結合および分析された抗体をバッチで検査すると、チャネル干渉の早期同定が容易になり、抗体を別の金属と再結合する機会が得られます。また、適切なマーカーの共発現を評価する機会も提供します。 - 各小バッチを4つの異なる抗体濃度(0.05 μg/mL、0.2 μg/mL、1 μg/mL、および4.0 μg/mL)で染色します。
注:異なる力価を比較し、最小限のバックグラウンド染色(最良のシグナル対ノイズ比)で正しい位置と最高の発現をもたらす抗体濃度を特定します。
3. FFPE組織切片化
- 金でコーティングされたスライド(この目的に固有のもの)を選択し、ミクロトームの近くに保管してください。新しいブレードをホルダーに挿入してミクロトームを準備します。断面の厚さを 4 ~ 5 μm に設定します。
- 切片化する前にFFPEブロックを氷の上に置きます。蒸留水または脱イオン水(diH2O)を40〜45°Cに加熱して組織浮上槽を作製する。
注:diH2Oまたは蒸留水を使用すると、汚染の可能性が低減されます。 - セクション化を開始します。ピンセットを使用して組織切片を水に入れ、平らにします。スライドを使用して、水から組織切片を除去します。
- スライドをスライドラックに入れ、室温で一晩乾燥させます。
4. FFPE抗体染色
注: 染色プロセスは 2 つの別々の日に行われます。
警告: このプロトコルで採用されているソリューションは腐食性の可能性があり、皮膚や目に危険をもたらします。手袋、白衣、保護用目と顔の機器を着用することは、私たちの機関のバイオセーフティポリシーの一部であり、推奨されています。
- 試薬調製(1日目)
- 50 mL の 20 x トリス緩衝生理食塩水を Tween (TBS-T) で 950 mL の diH2O に希釈し、1 L の TBS-T を作ります。
- 8 mL の 10x トリスエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を 72 mL のdiH2O に希釈して、1x 熱誘導エピトープ検索 (HIER) 溶液を作ります。
- ロバ血清を1x TBS-Tで最終濃度5%に希釈してブロッキングバッファーを作ります。使用できる状態になるまで溶液を4°Cで保存します。
- HIER調製:前処理(PT)モジュール
警告: PT モジュールで使用されている試薬や試薬に浸した部品を取り扱うときは、化学防護手袋を着用してください。- 140 mL の 10x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を 1,260 mL の diH2O に希釈して、1.4 L の 1x PBS を作ります。あるいは、7錠のPBS錠剤を1.4LのdiH2Oに希釈する。
- タンクを1.4LのPBSで満たし、100mLの1x HIER溶液を入れた調製したスライドチャンバー容器をタンクに入れます。
- PTモジュール内のタンクを75°Cに予熱します。
- 過剰なパラフィン除去
- 70°Cのオーブンで少なくとも20分間スライドを焼く。
メモ:一部の組織または切片は、より長いベーキング時間を必要とする場合があります。脳組織またはTMAの推奨ベーキング時間は1時間です。これは、16時間(一晩)またはラボの経験に応じて延長することができます。 - ベイクしたスライドをスライドホルダーに入れ、ヒュームフードの下のシェーカーで次の洗浄手順を実行します。スライドを次の溶液で洗浄します:30秒(メタルフリー)、30秒(メタルフリー)で100%アルコール2倍、30秒(メタルフリー)で95%アルコール2倍、30秒(メタルフリー)、30秒で70%アルコール(メタルフリー)、および30秒(メタルフリー)でdiH2O 2x。
- 抗原検索の準備ができるまで、スライドを新鮮なdiH2O容器に入れたままにします。
メモ: 手順が終了するまでスライドを乾燥させないでください。
- 70°Cのオーブンで少なくとも20分間スライドを焼く。
- 抗原検索
- PTモジュール内の1x HIERバッファを含む予熱されたスライドチャンバにスライドを置きます。タンクにカバーを置きます。蓋を閉じてラッチします。
- PTモジュールのメニューボタンを押してメイン メニュー を開き、 セットアップサイクル (時間と温度)ボタンを押してカスタムプログラムを作成します。
- PTモジュールを97°Cで40分間稼働させます。その後、PTモジュールは自動的に65°Cまで冷却されます。
- 65°Cの温度に達したら、PTモジュールからスライドを取り外します。スライドを室温で30分間保管してください。
メモ: PT モジュールは、温度が 65 °C (78 °F) になるまで開きません。 このプロセス中にスライドの金色の表面に触れず、常に手袋を使用してください。
- 抗体ブロッキング
- シェーカーを 70 rpm に設定します。
- スライドを1x TBS-Tに2x 5分間浸して洗い流します。
- 疎水性バリアペンを使用して、スライドエッジから少なくとも1mm離れた組織部分の周りに境界線を引き、15〜30秒間乾燥させます。
メモ:染色による組織の干渉を避けるために、ペン液が組織部分に触れないように注意してください。潜在的な漏れを避けるために、バリアを描画している間はペンを強く押しすぎないでください。最適な染色と画像取得の結果を得るために、組織切片を15 mm x 30 mm以下のフレームで金コーティングされたスライドの中央に配置し、スライドの外縁に配置された組織またはガイドドットに触れることなくバリアを描画するのに十分なスペースを確保します。 - ペンの残留物を取り除くには、スライドをTBS-Tに浸します。
- 室温の水分チャンバー内で、組織切片を100〜200μLのブロッキングバッファーと共に20分間インキュベートする。抗体マスターミックスの準備ができるまで、組織をブロッキングバッファー中でインキュベートしたままにします。
- 抗体パネル調製
注:抗体パネルカクテルの最終体積は、推定組織切片表面積によって異なります。20 mm x 20 mmの領域をカバーするには、カクテルを100〜200 μL用意します。
金属同位体結合抗体の抗体パネルカクテルを調製するために、以下を行う:- ブロッキングバッファー容量に追加された抗体カクテル容量に等しいカクテルの最終容量を確認します。
- すべての抗体、希釈液、および/または抗体濃度の仕様を、プロジェクトのパネルスプレッドシートで確認します。
- すべての抗体含有チューブを 10,000 x g で 5 分間スピンダウンします。個々の抗体をブロッキングバッファーに加え、非常によく混合します。ピペッティング時に抗体チューブの底を乱さないでください。
- 0.1 μm 遠心フィルター装置を 100 μL のブロッキングバッファーでプリウェットして、抗体パネルをろ過します。フィルターを 10,000 x g で 2 分間回転させ、ブロッキングバッファーフロースルーをピペットで取り外します。
- 抗体パネルをスピンカラムに移し、フィルターを10,000 x g で2分間回転させます。スピンカラムを廃棄し、フロースルーをろ過した抗体パネルとして使用します。
メモ:金属の交換を防ぐために、カクテルを作った直後に染色を行ってください。抗体カクテルの長期間の保存が必要な場合は、凍結乾燥に供することができる。
- 抗体染色
- 各スライドを横に傾け、タスクワイパーに対してエッジを軽く叩いて、スライドからブロッキングバッファを慎重に取り外します。
- スライドを水分チャンバーに入れ、100~200 μLの抗体マスターミックスを組織に加えます(組織との接触や気泡の発生を避けます)。
- 陽性および陰性コントロールスライドを染色バッチに追加します。
- スライドを4°Cで一晩(14〜16時間)インキュベートする。
- 試薬調製(2日目)
- 100 mL の 10x 低バリウム PBS、pH 7.4、900 mL の diH2O で希釈して、1x PBS を作ります。
- 低バリウムPBS(低バリウムPBSの340mL+70%グルタルアルデヒドの10mL)中の2%グルタルアルデヒドの作業原液350mLを調製する。
メモ: 希釈はフードの下で行ってください。グルタルアルデヒドは非常に粘性のある液体です。1 mL のピペットを使用し、1 mL の低バリウム PBS を、チューブから注ぐのに十分な液体になるまで毎回グルタルアルデヒドチューブに加えます。 - 10x Tris, pH 8.5, 900 mL の diH20 で希釈して 1x Tris を作る。
- 固定と脱水
- 各スライドから抗体マスターミックスを取り外すには、スライドを横に傾け、タスクワイパーに対してエッジを軽くタップします。
- 次のバッファーで軽くから適度な攪拌でスライドを洗浄します:1x TBS-T、それぞれ5分間3回(メタルフリー)。2%グルタルアルデヒドを5分間濾過した。ろ過された1xトリス、pH 8.5、30秒の3x;ろ過されたdiH2O 2x 30秒;30秒間の70%アルコール(メタルフリー)。30秒間の80%アルコール(メタルフリー)。30秒間の95%アルコール(メタルフリー)。30秒間(メタルフリー)の100%アルコール。
- 各スライドの端をタスクワイパーにそっと叩きつけて、余分なアルコールを取り除き、室温(〜5〜10分)で残留アルコールが蒸発するのを待ちます。
- 画像取得前に少なくとも1時間、デシケータ内でスライドを乾燥させるか、スライドを真空チャンバに保管して長期間保管します。
5. 画像取得
- スライドの設定
メモ:計測器を使用してスキャンする前に、以下の手順に従って、Webベースの画像管理アプリケーションを使用してスライドを定義し、設定する必要があります。- Web ベースの画像管理アプリケーションのスライド・ページで、「 アクセッションの新しい スライド」をクリックし、必要な詳細 (名前、スライド ID、場所、および説明) を入力します。
- スキャンセクションを作成するには、[ セクションの追加] をクリックします。各セクションの情報(プロジェクト名、スライド名、ブロック、位置)を入力します。作成した新しいスライド/セクションを保存するには、[ 送信] をクリックします。
- 「リソース」タブで、「パネル」ページを開き、使用するパネルを選択します。新規パネルの場合は、「 新規パネルの作成」をクリックします。
- パネルを選択したら、[ セクション]をクリックします。手順 2 で作成したセクションを追加します。をクリックして、「 セクション割り当ての編集」をクリックします。 [送信] をクリックして保存します。
- 計測器のセットアップ
注:この装置(材料 表を参照)は、特定の制御ソフトウェアプログラム( 材料表を参照)を使用して操作されます。- 制御ソフトウェアにログインします。計測器がスリープモードの場合は[ ウェイクアップ ]をクリックします。
注:操作の少なくとも1時間前に、ビームフォーカスの安定化に役立つ機器をウォームアップすることをお勧めします。 - スライドを読み込むには、[ Exchange サンプル ] をクリックし、[ 続行] をクリックしてドアを開きます。サンプルを上向きにし、ラベルを右側にして、スライドをローディングスロットに入れます。[ 続行] をクリックしてドアを閉じます。
メモ: スライドが正しく読み込まれていない場合は、警告音とスライドを調整するための通知が表示されます。 - プロジェクトを選択し、読み込まれたサンプルのスライド名を選択します。
- スライド光学画像ペインでパノラマ画像を視覚化します。
- 制御ソフトウェアにログインします。計測器がスリープモードの場合は[ ウェイクアップ ]をクリックします。
- 視野(FOV)の選択と取得
- モードメニューをクリックし、SED(二次電子検出器)を選択します。イメージングモードメニューをクリックし、QC −300μmを選択します。
- ジョグステージをクリックしてFOVの位置を制御し、矢印をクリックしてFOVの位置をナビゲートして選択します。
- [FOVを追加]をクリックし、フィールドサイズとして400 μm x 400 μmを設定し、イメージングモードとしてファインを選択し、1 msの滞留時間を選択します。「確認」をクリックします。
メモ: 設定された滞留時間は、希望する解像度によって異なります。ドウェル時間は、解像度が上がるにつれて増加します。集録時間は、検出器の慣らし期間や動作時間など、複数の要因によって異なる場合があります。1つのFOVの平均取得時間は約17分です。この装置を最大8時間ノンストップで使用し、約28FOVのスキャンを可能にします。取得した画像の品質は、何時間も連続して使用すると低下します。 - FOVリストを作成したら、画像フォーカスに進み、画像化されない組織領域にビームを移動してスティグメントを調整します。鮮明な中央画像が得られるまでパラメータを調整します。
メモ: 画像取得を最適化するには、組織断面をスライドの中央に揃えておくのが理想的です。ピントを合わせている間、中央領域のみの鮮明な画像が得られる。組織断面が大きすぎると、エッジの焦点が合わず、画像がぼやけます。 - [ 実行の開始]をクリックします。取得した画像は自動的にアップロードされ、Webベースの画像管理アプリケーションに保存されます。
6. 画像の準備
- 画像等圧補正
メモ:等圧補正の目的は、質量分析器を使用して質量の差を検出できない同等または非常に類似の質量の同位体の存在に起因するチャネル間のスピルオーバー信号を除去することです。- Webベースの画像管理アプリケーションで、 緑色のダウンロードアイコン をクリックしてFOV(TIFF画像)を保存します。
- Web ベースの画像管理アプリケーションの [バージョン情報] タブで利用可能な画像処理ソフトウェアの最新バージョン ( 資料表を参照) をダウンロードし、ファイルに保存します。.zipアーカイブ・ファイルを開き、インストール手順に従います。インストールが完了したら、ソフトウェアを開きます。
- 画像処理ソフトウェアの入力ペインにある ファイルアイコン をクリックして、修正する画像を含むフォルダを選択します。FOVリストがロードされます。
- 入力ペインの フィルターアイコン をクリックして、デフォルトの修正を適用します。チャンネルごとに、補正前後に取得した画像を画面右側に可視化します。
- 出力ペインの フロッピーディスクアイコン をクリックして、修正したイメージを保存します。
- 画像フィルタリング:ボロノイテッセレーション
注: ボロノイのテッセレーション図は、シード ポイントを含む空間をボロノイ セルに分割したものです。目的は、セル密度を推定し、セル境界を定義することです。ボロノイテッセレーション計算を使用して、マスクが生成され、フィルタリングのために元の画像に適用されます。- [フィルタリング]タブをクリックし、 フィルタリング パラメータメニューの [ボロノイテッセレーション ]を選択します。
- 入力ペインで、質量修正.tiff イメージを選択します。入力ペインの 「フィルター」アイコン をクリックします。
- 出力ペインの フロッピーディスクアイコン をクリックして、フィルタリングされたイメージを保存します。結果の 2 つのファイルには、サフィックス -Filtered.tiff と -Filtered.json が付きます。
メモ: MassCorrected-Filteredという名前の画像は.tiffサードパーティのデジタル解析ソフトウェアプログラムまたはオープンソースソフトウェアプログラムにアップロードできます。
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Representative Results
扁桃腺癌および肺腺癌TMA組織切片(厚さ5mm)を入手し、組織サイズおよびスライドの安全なマージンに関する仕様に従って、金コーティングされたスライドの中央に配置した。組織の縁とスライドガラスの側方および下側の境界との間の5mmおよび10mmの自由なガラスマージンは、それぞれ最適な染色に必要である。組織切片を染色前にオーブンで一晩焼成し、スライドへの切片の適切な付着を確実にした。抗体パネルは、23個のマーカーで構成されていた。同じ染色バッチにおいて、複数の組織を含む扁桃腺スライドおよびTMAスライドが含まれ、肺腺癌サンプルにおいてわずかに発現するマーカーの発現を評価した(図1)。ポジティブコントロールは、パネルで使用される抗体の標的に従って選択する必要があります。例えば、SOX10発現を評価するにはメラノーマサンプルが必要であり、GAFP発現を評価するには膠芽腫サンプルが必要です(図2)。
図1:同位体純度とチャネルクロストーク。 マトリックスは、プローブ純度と酸化物に由来するクロストークの割合を示しています(青いボックス、≥0.5%;クリアボックス、<0.5%)。マスタグの場合、少なくとも0.5%のクロストークに寄与したプローブが、チャネルなし(緑色)、1つまたは2つのチャネル(黄色)、または3つ以上のチャネル(オレンジ色)に表示されます。プローブなし(緑色)、1つまたは2つのプローブ(黄色)、または3つ以上のプローブ(オレンジ色)から少なくとも0.5%のクロストークを受信するマスチャネルも示される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:異なる組織における代表的な染色画像(A)肺腺癌。(B)非腫瘍性腎臓。(C)扁桃腺。CD20は黄色で、Ki67はマゼンタで、CD3は白で、CD11cは緑で、CD68は赤で、サイトケラチンはシアンで、二本鎖DNA(dsDNA)は青で示されている。倍率、200倍。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
この染色手順は、標準的な免疫組織化学染色によく似ており、2日間連続して行われました。染色プロトコールの5つの主要なステップは、1)過剰パラフィン除去、2)抗原検索、3)抗体ブロッキング、4)抗体染色、および5)固定および脱水である(図3)。染色手順の基本的なステップは、プラスチック製品に保管されている無金属試薬の使用や、機械的損傷を制限するためのサンプルの慎重な取り扱いなど、サンプルの金属汚染を回避するための予防措置を講じることです。染色の直前に抗体カクテルを調製することをお勧めします。これにより、金属交換が減少します。染色が完了したら、スライドを保存し、翌日にスキャンしました。画像を取得する前に、Webベースの画像管理アプリケーションを使用したスライドのセットアップが必要です(図4)。
図3:画像取得ワークフローと関連するスライド。(A)画像取得ワークフローの概要1)金属結合抗体で染色したFFPE組織切片を一次イオンガンを用いてラスタライズし、二次イオンを放出する。2)飛行時間質量分析計は、ピクセルレベルでの質量に基づいてイオンを分離し、測定します。3)二次イオンのピクセルベースの定量化。y軸は検出されたイオンの数(ピーク)に対応し、x軸は各金属の質量に対応します。4)各マススペクトルのピークに基づいて、多次元画像が再構成される。(B)この手順で使用するスライドの概略図。組織を最適に染色するには、スライドの側端から少なくとも5 mm、下端から10 mmの位置に切片を配置する必要があります。疎水性バリアを組織切片の周りに描く場合、スライドの端から少なくとも1mmの長方形の内側に保持する必要があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:Webベースの画像管理アプリケーションでのスライド設定 スライドをスキャンする前に、各スライドを設定する必要があります。スライドの識別に役立つ詳細情報を入力します。[ セクションの追加] (黒い矢印) をクリックして、ブロックと位置の情報を含めます。保存するには、[ 送信] (赤い矢印) をクリックします。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
スキャン当日は、制御ソフトウェアを使用して集録器の電源を入れます。Exchangeスライドをクリックすると、機器のドアが開き、 スライド をロードできます。スライドをローディングスロットの上に置き、右側にラベルを付けました。一度にスキャンできるスライドは 1 つだけです。次のステップは、FOVを選択し、プロトコルに記載されている手順に従ってフォーカスとスティグミーションを調整することでした。 [実行の開始]をクリックして画像を取得しました。集録時間は、FOVサイズと必要な分解能によって異なります。FOVサイズは200μm x 200 μmから800 μm x 800 μmの範囲で、128ピクセル x 128ピクセルから2048ピクセル x 2048ピクセルのフレームサイズ範囲に対応します。3つの標準解像度が利用可能です:粗い、細かい、そして超細かい。大きなFOVを超微細分解能でスキャンするには時間がかかり、1つのFOVの最終集録時間は25秒~4.7時間です(図5)。
図5:制御ソフトウェアを使用した画像取得 集録設定は必要に応じて調整できます。スキャン解像度を変更するには、 イメージングモード (黒い矢印)のドロップダウンメニューをクリックします。FOVサイズを変更するには、FOVサイズ(μm)フィールド(赤矢印)に数値を入力します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
スキャンが完了すると、すべてのFOVを含む画像セットがWebベースの画像管理アプリケーションに自動的にアップロードされました。画像の保存に加えて、このアプリケーションは、一緒にまたは別々にすべてのチャンネルの視覚化、画像調整、およびさらなる準備のための画像のダウンロードを可能にします。標準の視覚化された画像は、TIFF ファイルとして保存されます (図 6)。
図 6: Web ベースの画像管理アプリケーションを使用した画像の視覚化 取得した画像は、オンラインプラットフォームを使用して保存および視覚化されます。ビジュアライゼーションパラメータを調整し、各マーカーの色を変更することが可能です。 [画像チャンネルの追加 ](白い矢印)をクリックして、他のマーカーを視覚化します。倍率、200倍 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
金属干渉は、金属ラベリング方法に固有のものですが、最小限に抑える戦略が使用されています。抗体に結合した金属同位体から過剰なバックグラウンドシグナルを除去し、解析用の画像を準備するために、関連する画像処理ソフトウェアを使用しました( 材料表を参照)。画像準備手順には、1)チャンネル間の信号を除去する等圧補正と、2)画像上の凝集物によって引き起こされる信号を除去するフィルタリングの2つのステップがあります。
等圧補正を開始するには、保存したTIFF画像を含むファイルを、入力ペインの ファイルアイコン をクリックして選択しました。ソフトウェアは、ファイル内のすべてのアーカイブされたTIFF画像を自動的にロードし、バッチ分析を可能にします。次に、入力ペインの フィルターアイコン をクリックして画像を修正しました。サフィックス -MassCorrected が付いた 2 つの結果ファイルが自動的に生成されました (1 つは TIFF 形式でアーカイブされ、もう 1 つは JSON 形式でアーカイブされます)。デフォルトでは、結果のアーカイブは、初期イメージのロード元と同じファイルに保存されます(図7)。
図7:画像準備:補正ステップ。画像処理ソフトウェアに準備用の画像を読み込むには、入力ペインのファイルアイコン(黒い矢印)をクリックし、画像を選択します。デフォルトの修正手順を適用するには、入力ペインのフィルタアイコン(赤い矢印)をクリックします。更新された修正されたイメージを保存するには、出力ペインのフロッピーディスクアイコンをクリックします。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
画像準備の2番目のステップはフィルタリングで、ソフトウェアの上のタブで選択できます。入力ペインで補正された画像を選択しました。このステップでは、自動化されたボロノイテッセレーションがフィルタリングパラメータとして使用されました。入力パネルのフィルターアイコンをクリックすると、選択したフィルターがすべてのチャンネルに自動的に適用されます。画像準備ステップ(補正とフィルタリング)の両方で、処理前後の各チャンネルの画像と信号の違いが画面の右側に表示されます。
等圧補正ステップと同様に、TIFF 形式と JSON 形式の 2 つの新しいアーカイブが生成されました。このステップでは、ファイル名に続く接尾部は -Filter でした。したがって、得られた最終的な画像は、MassCorrected-Filtered.tiffという名前でした。これらのステップを完了することにより、好ましいデジタル病理ソフトウェア(図8および図9)を用いて解析用の画像を調製した。この技術を使用することにより、単一の組織切片における細胞下レベルでのチャネル間の干渉を最小限に抑えながら、抗体パネル中の23のマーカーすべてを分析できました。
図8:画像準備:フィルタリングステップ。画像処理ソフトウェアの上部タブ(黒い矢印)で[フィルタリング]を選択します。[パラメーターのフィルター処理] で、目的の方法を選択します (緑色の矢印)。入力ペインで、[質量補正された画像] を選択します。選択した手順を画像に適用するには、入力ペインのフィルタアイコン(赤い矢印)をクリックします。更新されたフィルタリングされたイメージを保存するには、出力ペインのフロッピーディスクアイコンをクリックします。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:染色前後の画像準備の代表画像。 (a)この技術を用いて染色された扁桃腺組織切片の画像は、フィルタリングおよび補正の前に、第三者のデジタル画像解析ソフトウェアプログラムを使用して視覚化される。(B)フィルタリングおよび補正ステップ後の同じ条件下での同じセクションの画像。CD20は黄色で、Ki67はマゼンタで、CD3は白で、CD11cは緑で、サイトケラチンはシアンで、二本鎖DNA(dsDNA)は青で示されている。倍率、200倍 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1: 抗体パネルリスト。 各抗体を、列挙したように異なる質量を有する特定の金属同位体にコンジュゲートした。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
TMEの複数の構成要素間の複雑で複雑な相互作用の包括的な解明は、依然としてがん研究の重要な目的である。メーカーは、この取り組みの一環として、特に過去5年間に多数の多重化アッセイを導入してきました。多重化空間解析は、腫瘍サンプルの構造形態を維持しながら、複数のターゲットの同時分類を容易にする汎用性と強力なツールです。空間分析技術は、本明細書11、12、13に記載の技術などの蛍光画像化または質量分析を用いて行うことができる。
染色の前に、抗体染色の再現性を標準化するために、通常の免疫組織化学プロトコルとそれに続く染色プロトコルを使用した抗体最適化が必要です。非常によく知られた事実は、異なる正規抗体クローンが異なる条件下で最適な発現を有し得ることである。しかしながら、抗体を金属タグと結合させるためには、パネルに組み込まれたすべての抗体について抗原検索のために同じpHを規定しているように、キャリアフリーの抗体が必要であり、これはこの方法の欠点である。この手順を完了しないと、低品質の画像が正常に分析できなくなる可能性があります。医学文献および抗体製造業者のウェブサイトの調査に時間を捧げて、市販されているものの中から最も検証された信頼性の高い抗体を選択することが不可欠です。抗体とパネルを検証するときは、より小さなパネルを構築するのが便利です。これは、可能性のあるチャネル干渉を特定し、マーカーの正しい表現を評価するのに役立ちます。
この技術の特徴の1つは、単一の組織切片上で最大40個の金属標識抗体を研究できることです。非常に有利であるにもかかわらず、金属標識質量分析技術は、等圧干渉などの困難な金属干渉の影響を受けやすい。等圧干渉は、金属標識質量分析法の特徴であり、質量の差が質量分析器の検出能力よりも小さい、同等または非常に類似した質量の同位体の存在の結果である。これらの干渉は、同位体汚染または多原子種によって引き起こされる可能性がある。同位体汚染は、元素の純度を指します。自然界では、ほとんどの元素は同位体の混合物中に存在する。濃縮を行っても、100%の純度は得られない。その結果、同じ質量を持つ複数の要素が生成され、チャンネル間でクロストークが生成されます。40個の利用可能な金属同位体の純度の中央値は98%である。多原子種による干渉は、水素化物、炭化物、窒化物、酸化物、水酸化物、シアン化物などの負に帯電した種への遊離金属結合に由来し、金属タグの最終質量に+1〜+26を加える。可能なノイズ源を最小限に抑えるための戦略を開発することは、良好な染色およびイメージングを達成するために不可欠です。パネル構築の最初の必要なステップは、金属同位体 - 抗体の割り当てを慎重に行うことです。サイトケラチンやCD45などの組織切片に一般的に普及しているマーカーは、多原子干渉の影響を最小限に抑えるために、質量の高い(160 Gdを超える)金属同位体に結合させる必要があり、わずかなマーカーを140 Ceから160Gdの範囲の質量の同位体に結合させる必要があります。覚えておくべきことは、マーカーの数が増えるにつれて金属干渉のリスクが高まることです。しかし、金属やマーカーを慎重に配置することで、画像処理ソフトウェアを使用したさらなる画像処理で残留干渉の影響を軽減することができます。
補完的な手順は、組織の切断および染色におけるサンプルの金属汚染を低減するためにも採用することができる。上記のプロトコールに記載されているように、ウォーターバスにおける蒸留水またはdiH2Oの使用は、この汚染を防止する。同様に、染色に使用する試薬は無金属でなければなりません。有用なヒントは、ガラス製品が金属汚染を促進するため、ガラス容器に試薬を保管しないようにすることです。最適な全体的な結果を得るために、染色ステップでは、スライドへの組織切片の良好な接着性を確保するために、スライドを一晩ベーキングすることをお勧めします。
他の多重化方法とは異なり、この方法はFFPEサンプル14を使用する。ホルマリン固定とパラフィン包埋の組み合わせは、依然としてサンプルの保存と調製の最も広く使用されている形態です。アーカイブされたブロックを使用することで、遡及的研究を含む新鮮な凍結サンプルの使用よりも広範な研究のパフォーマンスが可能になり、低コストになります。この方法では、スライド全体のイメージングとスライドの再スキャンも可能です。これにより、スライドの一部のみを選択するよりも広い分析領域がキャプチャされ、複数の倍率でスキャンが可能になります。
この技術には、機器の価格や、金でコーティングされたスライドなどの材料をメーカーから直接購入する要件に関連する制限があります。コーティングされていないスライド、金以外の材料でコーティングされたスライド、またはメーカー以外の企業から入手したスライドを使用しようとすると、信号の取得ができず、信号の干渉が広範囲に及び、最終的には機器が損傷する可能性があります。
この方法のもう1つの重要な欠点は、分析用の特定のソフトウェアがないことです。この方法は、広く使用されており、サードパーティのデジタル解析ソフトウェアに簡単にアップロードできるTIFF形式の画像を生成します。計算病理学ソフトウェアツールは、組織区画化、細胞セグメンテーション、任意の細胞区画におけるマーカー定量、最近傍および近接分析を含む包括的な分析を可能にします。使用のためにサードパーティのデジタル分析ソフトウェアを取得すると、すでに高価な技術のコストが増加する15,16。
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Disclosures
著者らは開示すべき矛盾はありません。
Acknowledgments
著者らは、この記事の編集のためにMDアンダーソンの研究医学図書館であるEditing ServicesのDon Norwoodと、MDアンダーソンの翻訳分子病理学部門のMultiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratoryを認めている。この出版物は、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターがん免疫モニタリングおよび分析センター(CIMAC)への国立がん研究所(NCI)協力協定(U24CA224285)を通じて提供されたがん免疫モニタリングおよび分析センター-がん免疫学的データコモンズネットワーク(CIMAC-CIDC)に対する科学的および財政的支援によって促進された研究から部分的にもたらされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
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