Summary
Na era da imunoterapia contra o câncer, o interesse em elucidar a dinâmica do microambiente tumoral aumentou de forma impressionante. Este protocolo detalha uma técnica de imagem de espectrometria de massa em relação às suas etapas de coloração e imagem, que permitem uma análise espacial altamente multiplexada.
Abstract
Os avanços nas terapias imunológicas revolucionaram o tratamento e a pesquisa do câncer. Isso desencadeou uma demanda crescente pela caracterização da paisagem imunológica do tumor. Embora a imunohistoquímica padrão seja adequada para estudar a arquitetura tecidual, limita-se à análise de um pequeno número de marcadores. Por outro lado, técnicas como citometria de fluxo podem avaliar múltiplos marcadores simultaneamente, embora as informações sobre morfologia tecidual sejam perdidas. Nos últimos anos, estratégias multiplexadas que integram a análise fenotípica e espacial surgiram como abordagens abrangentes para a caracterização da paisagem imunológica tumoral. Aqui, discutimos uma tecnologia inovadora que combina anticorpos com rótulos metálicos e espectrometria de massa de íons secundários com foco nas etapas técnicas de desenvolvimento e otimização de ensaios, preparação de tecidos e aquisição e processamento de imagens. Antes da coloração, um painel de anticorpos com etiqueta metálica deve ser desenvolvido e otimizado. Este sistema de imagem hi-plex suporta até 40 anticorpos com etiqueta metálica em uma única seção de tecido. Note-se que o risco de interferência de sinal aumenta com o número de marcadores incluídos no painel. Após o desenho do painel, deve-se dar especial atenção à atribuição do isótopo metálico ao anticorpo para minimizar essa interferência. Testes preliminares do painel são realizados usando um pequeno subconjunto de anticorpos e testes subsequentes de todo o painel em tecidos de controle. Seções de tecido fixas em parafina são obtidas e montadas em lâminas revestidas de ouro e ainda mais manchadas. A coloração leva 2 dias e se assemelha muito à coloração imunohistoquímica padrão. Uma vez que as amostras são manchadas, elas são colocadas no instrumento de aquisição de imagens. Os campos de exibição são selecionados e as imagens são adquiridas, carregadas e armazenadas. O estágio final é a preparação de imagens para a filtragem e remoção de interferências usando o software de processamento de imagens do sistema. Uma desvantagem dessa plataforma é a falta de software analítico. No entanto, as imagens geradas são suportadas por diferentes softwares de patologia computacional.
Introduction
A importância dos numerosos tipos de células em torno das populações de tumores clonais é um elemento crucial na categorização da carcinogênese. O interesse em elucidar essa composição do microambiente tumoral (TME) e as interações tem aumentado continuamente após o estabelecimento de terapia de base imunológica como parte do arsenal de tratamento do câncer. Portanto, as estratégias de tratamento mudaram de uma abordagem centrada no tumor para uma centrada no TME1.
Os esforços para elucidar os papéis das células imunes na vigilância do tumor e no desenvolvimento do câncer aumentaram de forma impressionante nos últimos anos 2,3. Na pesquisa médica, uma infinidade de métodos, incluindo métodos baseados em citometria e tecnologias de imagem singleplex e multiplex, surgiu como parte dessa tentativa de decifrar as interações únicas de múltiplos elementos de TMEs.
Métodos pioneiros como citometria de fluxo (inventada na década de 1960), classificação celular ativada por fluorescência e citometria de massa são focados principalmente na identificação e quantificação dos componentes TME4. Embora as técnicas quantitativas baseadas em citometria permitam fenotipagem da paisagem imunológica, determinar a distribuição espacial celular é impossível. Por outro lado, métodos como a imunohistoquímica singleplex padrão preservam a arquitetura tecidual e permitem aos pesquisadores analisar a distribuição celular, embora um número reduzido de alvos em uma única seção de tecido seja uma limitação desses métodos 5,6. Nos últimos anos, tecnologias de imagem multiplexed para resolução unicelular, como imunofluorescência multiplex, imagem de fluorescência de codificação de barras e espectrometria de massa de imagem surgiram como estratégias abrangentes para a aquisição de informações sobre coloração simultânea de marcadores usando a mesma seçãode tecido 7.
Aqui apresentamos uma tecnologia que casa anticorpos com etiqueta metálica e espectrometria de massa de íons secundários e permite quantificação de resolução de células únicas, co-expressão de marcador (fenotipagem) e análise espacial usando amostras de tecido 8,9. As amostras de FFPE são os materiais mais utilizados para amostras de arquivamento de tecidos e representam um recurso mais facilmente disponível para tecnologias de imagem multiplexada do que amostras congeladas frescas10. Além disso, essa tecnologia oferece a possibilidade de readquirivelmente imagens meses depois. Aqui, discutimos nossos protocolos de coloração e processamento de imagens usando amostras de tecido FFPE.
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Protocol
Amostras de tecido foram obtidas para fins de pesquisa de acordo com o Conselho de Revisão Institucional do Centro de Câncer Anderson da Universidade do Texas, e as amostras foram ainda mais desidentificdas.
1. Seleção de anticorpos
- Defina as perguntas de pesquisa para escolher os melhores clones de anticorpos disponíveis. Use o Atlas de Proteína Humana, pesquisa publicada e sites de fabricantes de anticorpos como recursos de pesquisa.
NOTA: A seleção de controles adequados de tecido humano e os mesmos controles de tecido humano a serem manchados nas diferentes etapas é fundamental para garantir que os marcadores estejam manchados corretamente, no lugar certo e no compartimento celular correto. Uma microarray de tecido pequeno (TMA) incluindo tecido normal e tecidos neoplásicos é sempre recomendado para validação de manchas. - Use apenas anticorpos livres de portadores para projetar o painel.
NOTA: O uso de formulações de anticorpos sem portadores é necessário se um anticorpo comercial sem transporte não estiver disponível; Os kits de purificação podem ser usados para ajustar o anticorpo à formulação correta. Aditivos proteicos como a albumina de soro bovino são conhecidos por diminuir a capacidade de conjugação. - Teste e titule cada anticorpo usando imunohistoquímica cromogênica padrão para determinar o padrão subcelular da expressão de um marcador; membrana, citoplasmática ou coloração nuclear; e expressão em células específicas em tecidos de controle.
NOTA: No entanto, cada anticorpo deve ser testado em citrate pH 6 e pH 9 ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA), e se o painel será manchado com citrato pH 6 ou pH 9 EDTA deve ser determinado. Recomenda-se o uso do pH 9 EDTA para a obtenção de bons sinais, especialmente quando se trabalha com essa metodologia. - Escolha a concentração de coloração ideal de acordo com o padrão de expressão em controles positivos.
- Atribua cada anticorpo a um dos isótopos metálicos disponíveis de acordo com a abundância de marcadores imunohistoquímicos, localização subcelular e co-expressão celular com os outros alvos.
- Manche o anticorpo com o metal atribuído correspondente e compare com a expressão no mesmo tecido de controle utilizado anteriormente.
NOTA: A conjugação metálica de anticorpos começa com preparação de anticorpos, redução e conjugação subsequente (Arquivo Suplementar 1). Cada tubo de polímero carregado de metal é suficiente para rotular 100 μg de um anticorpo.
2. Design do painel de anticorpos
- Crie pequenos lotes de coloração de anticorpos. Teste até cinco marcadores em um coquetel.
NOTA: Testar anticorpos já conjugados e analisados usando imunohistoquímica em lotes facilita a identificação precoce de interferências de canais e proporciona a oportunidade de reconjugar os anticorpos com outro metal. Também oferece uma oportunidade de avaliar a co-expressão adequada do marcador. - Colora cada pequeno lote com quatro concentrações diferentes de anticorpos (0,05 μg/mL, 0,2 μg/mL, 1 μg/mL e 4,0 μg/mL).
NOTA: Comparando diferentes títulos, identifique a concentração de anticorpos que resulta na localização correta e na expressão mais alta com a coloração mínima de fundo (melhor relação sinal-ruído).
3. Seção de tecido FFPE
- Selecione slides revestidos de ouro (específicos para este fim) e mantenha-os perto do microtoma. Prepare o microtoma inserindo uma nova lâmina no suporte. Coloque a espessura da seção em 4-5 μm.
- Coloque blocos FFPE no gelo antes de seccionar. Prepare um banho de flutuação tecidual aquecendo água destilada ou água desionizada (diH2O) a 40-45 °C.
NOTA: O uso de diH2O ou água destilada reduz a possibilidade de contaminação. - Comece a seção. Coloque a seção de tecido na água usando pinças e deixe achatar. Use as lâminas para remover seções de tecido da água.
- Coloque os slides em um rack de slides e deixe-os secar à temperatura ambiente durante a noite.
4. Mancha de anticorpos FFPE
NOTA: O processo de coloração ocorre em dois dias separados.
ATENÇÃO: As soluções empregadas neste protocolo são potencialmente corrosivas e representam riscos para a pele e os olhos. O uso de luvas, um jaleco e equipamentos de proteção para os olhos e rostos é aconselhável e parte da política de biossegurança da nossa instituição.
- Preparação do reagente (dia 1)
- Diluir 50 mL de soro fisiológico 20x tris-tamponado com Tween (TBS-T) em 950 mL de diH2O para fazer 1 L de TBS-T.
- Diluir 8 mL de ácido tris-etilenodiaminetetraacético (EDTA) em 72 mL de diH2O para fazer uma solução de recuperação de epitope induzida pelo calor de 1x (HIER).
- Diluir o soro de burro em 1x TBS-T para uma concentração final de 5% para fazer tampão de bloqueio. Armazene a solução a 4 °C até estar pronta para uso.
- Preparação HIER: Módulo de pré-tratamento (PT)
ATENÇÃO: Use luvas de proteção químicas ao manusear quaisquer reagentes ou peças imersas em quaisquer reagentes usados no módulo PT.- Diluir 140 mL de salina tamponada com fosfato de 10x (PBS) em 1.260 mL de diH2O para fazer 1,4 L de 1x PBS. Alternativamente, dilui sete comprimidos PBS em 1,4 L de diH2O.
- Encha um tanque com 1,4 L de PBS e coloque o recipiente preparado de câmara de deslizamento com 100 mL de solução HIER 1x no tanque.
- Pré-aqueça o tanque em um módulo PT a 75 °C.
- Excesso de remoção de parafina
- Asse slides a 70 °C em forno por pelo menos 20 min.
NOTA: Alguns tecidos ou seções podem precisar de tempos de cozimento mais longos. O tempo recomendado de cozimento para tecido cerebral ou um TMA é de 1 h. Isso pode ser estendido para 16 h (durante a noite) ou de acordo com a experiência de laboratório. - Coloque lâminas assadas em um suporte de slides e realize as seguintes etapas de lavagem em um shaker sob um capô de fumaça. Lave os slides na seguinte solução: Xileno 2x para 30 s (sem metal), 100% álcool 2x para 30 s (sem metal), 95% álcool 2x para 30 s (sem metal), 80% álcool para 30 s (sem metal), 70% álcool para 30 s (sem metal) e diH2O 2x para 30 s (sem metal).
- Mantenha os slides em um recipiente diH2O fresco até estar pronto para recuperação de antígeno.
NOTA: Os slides não devem ser secos até o final do procedimento.
- Asse slides a 70 °C em forno por pelo menos 20 min.
- Recuperação de antígenos
- Coloque os slides em uma câmara de slides pré-aquecido contendo 1x tampão HIER dentro do módulo PT. Coloque a tampa no tanque. Feche e grue a tampa.
- Pressione o botão Menu no módulo PT para abrir o menu principal e pressione o botão Ciclo de configuração (tempo e temperatura) para criar um programa personalizado.
- Execute o módulo PT a 97 °C por 40 min. Depois, o módulo PT esfriará automaticamente para 65 °C.
- Remova os slides do módulo PT assim que a temperatura de 65 °C for atingida. Mantenha os slides em temperatura ambiente por 30 minutos.
NOTA: O módulo PT não abrirá até que a temperatura esfrie a 65 °C. Não toque na superfície dourada dos slides durante este processo, e use sempre luvas.
- Bloqueio de anticorpos
- Coloque um agitador a 70 rpm.
- Lave os slides mergulhando-os em 1x TBS-T por 5 min 2x.
- Usando uma caneta de barreira hidrofóbica, desenhe uma borda ao redor da seção de tecido a pelo menos 1 mm de distância das bordas de deslizamento e deixe-a secar por 15-30 s.
NOTA: Tome cuidado para evitar que o fluido da caneta toque na seção tecidual para evitar qualquer interferência tecidual com a coloração. Não pressione a caneta com muita força enquanto desenha a barreira para evitar possíveis vazamentos. Para obter resultados ideais de coloração e aquisição de imagens, as seções de tecido são colocadas no meio dos slides revestidos de ouro em uma estrutura não maior que 15 mm x 30 mm para permitir espaço suficiente para desenhar a barreira sem tocar no tecido ou nos pontos-guia colocados na borda externa do slide. - Para remover qualquer resíduo de caneta, mergulhe as lâminas em TBS-T.
- Em uma câmara de umidade à temperatura ambiente, incubar a seção de tecido com 100-200 μL de tampão de bloqueio por 20 minutos. Deixe o tecido incubando no tampão de bloqueio até que uma mistura mestre de anticorpos esteja pronta.
- Preparação do painel de anticorpos
NOTA: O volume final do coquetel do painel de anticorpos varia de acordo com a área estimada da superfície da seção tecidual. Para cobrir uma área de 20 mm x 20 mm, prepare 100-200 μL do coquetel.
Faça o seguinte para preparar um coquetel de painel de anticorpos de anticorpos conjugados por isótopos metálicos:- Confirme o volume final do coquetel que equivale ao volume do coquetel de anticorpos adicionado ao volume do buffer de bloqueio.
- Confirme as especificações de todos os anticorpos, diluições e/ou concentrações de anticorpos em uma planilha de painel para o projeto.
- Gire todos os tubos contendo anticorpos a 10.000 x g por 5 min. Adicione anticorpos individuais ao tampão de bloqueio e misture muito bem. Não perturbe a parte inferior do tubo de anticorpos ao cano-lo.
- Filtre o painel de anticorpos prewetting um dispositivo de filtro centrífugo de 0,1 μm com 100 μL de tampão de bloqueio. Gire o filtro a 10.000 x g por 2 min e remova o fluxo de tampão de bloqueio com uma pipeta.
- Transfira o painel de anticorpos para uma coluna de giro e gire o filtro a 10.000 x g por 2 min. Descarte a coluna de giro e use o fluxo através como o painel de anticorpos filtrado.
NOTA: Realize a coloração imediatamente após a realização do coquetel para evitar a troca de metais. Se for necessário o armazenamento do coquetel de anticorpos por um tempo prolongado, ele pode ser submetido à liofilização.
- Mancha de anticorpos
- Remova cuidadosamente o buffer de bloqueio dos slides, derrubando cada slide de lado e tocando suavemente as bordas contra um limpador de tarefas.
- Coloque os slides em uma câmara de umidade e adicione 100-200 μL de mistura mestre de anticorpos ao tecido (evite o contato com o tecido e a criação de bolhas de ar).
- Adicione slides de controle positivos e negativos ao lote de coloração.
- Incubar os slides a 4 °C durante a noite (14-16 h).
- Preparação do reagente (dia 2)
- Diluir 100 mL de 10x de baixo bário PBS, pH 7.4, em 900 mL de diH2O para fazer 1x PBS.
- Prepare 350 mL de uma solução de estoque de trabalho de 2% glutaraldeído em PBS de baixo bário (340 mL de pbs de baixo bário + 10 mL de 70% glutaraldeído).
NOTA: Realize a diluição sob um capô. Glutaraldeído é um líquido muito viscoso. Use uma pipeta de 1 mL e adicione 1 mL de PBS de baixo bário ao tubo de glutaraldeído toda vez até que se torne líquido o suficiente para sair do tubo. - Diluir 10x Tris, pH 8.5, em 900 mL de diH20 para fazer 1x Tris.
- Fixação e desidratação
- Remova a mistura mestre de anticorpos de cada slide derrubando o slide de lado e tocando suavemente a borda contra um limpador de tarefas.
- Lave os slides com agitação leve a moderada nos seguintes buffers: 1x TBS-T, 3x vezes por 5 min cada (sem metais); filtrado 2% glutaraldeído por 5 min; filtrado 1x tris, pH 8.5, 3x para 30 s; filtrado diH2O 2x para 30 s; 70% de álcool para 30 s (sem metal); 80% de álcool para 30 s (sem metal); 95% de álcool para 30 s (sem metal); e 100% álcool para 30 s (sem metal).
- Bata suavemente a borda de cada lâmina contra um limpador de tarefas para remover o excesso de álcool e permitir que o álcool residual evapore à temperatura ambiente (~5-10 min).
- Lâminas secas em um desiccator por pelo menos 1 h antes da aquisição de imagem ou mantenham os slides em uma câmara de vácuo para armazenamento a longo prazo.
5. Aquisição de imagens
- Configuração de slides
NOTA: Antes de digitalizar o instrumento, os slides devem ser definidos e configurados usando o aplicativo de gerenciamento de imagem baseado na Web seguindo as etapas descritas abaixo.- Na página de slides no aplicativo de gerenciamento de imagens baseado na Web, clique em Accession New Slide e digite os detalhes desejados (nome, identificação de slides, localização e descrição).
- Crie seções de digitalização clicando em Adicionar seção. Preencha as informações de cada seção (nome do projeto, nome do slide, bloco e posição). Para salvar os novos slides/seções criados, clique em Enviar.
- Na guia recursos, abra a página dos painéis e selecione o painel a ser usado. Para novos painéis, clique em Criar novo painel.
- Depois de selecionar o painel, clique em Seções. Adicione as seções criadas na etapa 2. clicando em Editar atribuição de seção. Salvar clicando em Enviar.
- Configuração do instrumento
NOTA: Este instrumento (ver Tabela de Materiais) é operado usando um programa de software de controle específico (ver Tabela de Materiais).- Faça login no software de controle. Clique em Acordar se o instrumento estiver em modo de sono.
NOTA: Pelo menos 1h antes da operação, recomenda-se o aquecimento do instrumento, o que ajuda na estabilização do foco do feixe. - Para carregar um slide, clique em Trocar amostras e clique em Continuar abrindo a porta. Coloque o slide no slot de carregamento com a amostra voltada para cima e a etiqueta à direita. Clique em Continuar fechando a porta.
NOTA: Se o slide não estiver carregado corretamente, um som de aviso e uma notificação para ajustar o slide aparecerão. - Selecione o projeto e selecione o nome de slides para a amostra carregada.
- Visualize a imagem panorâmica no painel óptico de slides.
- Faça login no software de controle. Clique em Acordar se o instrumento estiver em modo de sono.
- Seleção e aquisição do Campo de Visão (FOV)
- Clique no menu Modo e selecione SED (Detector de Elétrons Secundário). Clique no menu do modo de imagem e escolha QC −300 μm.
- Clique em Jog Stage para controlar o local FOV e clique nas setas para navegar e selecione a posição do FOV.
- Clique em Adicionar FOV, defina 400 μm x 400 μm como o tamanho do campo e selecione bem como o modo de imagem e 1 ms de tempo de moradia. Clique em Confirmar.
NOTA: O tempo definido dependerá da resolução desejada. O tempo de moradia aumenta à medida que a resolução aumenta. O tempo de aquisição pode variar dependendo de vários fatores, incluindo período de arrombamento do detector e duração da operação. Nosso tempo médio de aquisição para um FOV é de cerca de 17 minutos. Use o instrumento sem parar por até 8 h, o que permite a digitalização de cerca de 28 FOVs. A qualidade das imagens adquiridas diminui após muitas horas consecutivas de uso. - Depois de criar uma lista de ESPUMA, proceda ao foco da imagem e ajuste a estigma movendo o feixe para uma região de tecido que não será imageda. Ajuste os parâmetros até que uma imagem central clara seja obtida.
NOTA: Para otimizar a aquisição de imagens, manter a seção de tecido centralizada no slide é ideal. Ao se concentrar, uma imagem clara apenas da área central pode ser obtida. Se a seção tecidual for muito grande, as bordas estarão fora de foco, e a imagem será borrada. - Clique em Iniciar Run. As imagens adquiridas serão automaticamente carregadas e armazenadas no aplicativo de gerenciamento de imagens baseado na Web.
6. Preparação de imagens
- Correção isobárica de imagem
NOTA: O objetivo da correção isobárica é remover o sinal de derramamento entre os canais resultantes da presença de isótopos de massa igual ou muito semelhante cujas diferenças de massa não podem ser detectadas usando o analisador de massa.- No aplicativo de gerenciamento de imagens baseado na Web, clique no ícone green Download para salvar as imagens FOVs (TIFF).
- Baixe a versão mais atualizada do software de processamento de imagens (ver Tabela de Materiais) disponível na guia sobre no aplicativo de gerenciamento de imagens baseado na Web e salve-o em um arquivo. Abra o arquivo de arquivo .zip e siga as etapas de instalação. Abra o software assim que a instalação estiver concluída.
- Selecione a pasta que contém as imagens a serem corrigidas clicando no ícone Arquivo no painel de entrada do software de processamento de imagens. Uma lista FOV será carregada.
- Clique no ícone Filtro no painel de entrada para aplicar correções padrão. Para cada canal, visualize imagens obtidas antes e depois da correção no lado direito da tela.
- Clique no ícone disquete no painel de saída para salvar a imagem corrigida.
- Filtragem de imagem: Tessellation Voronoi
NOTA: Os diagramas de tessellation voronoi ilustram uma divisão do espaço contendo pontos de sementes nas células Voronoi. O objetivo é estimar a densidade celular e definir limites celulares. Usando o cálculo de tessellation Voronoi, uma máscara é gerada e aplicada à imagem original para filtragem.- Clique na guia Filtragem e selecione Voronoi Tesselation no menu de parâmetros de filtragem.
- No painel de entrada, selecione a imagem masscorrected.tiff. Clique no ícone Filtro no painel de entrada.
- Clique no ícone disquete no painel de saída para salvar a imagem filtrada. Os dois arquivos resultantes terão os sufixos -Filtrados.tiff e -Filtrados.json.
NOTA: A imagem chamada MassCorrected-Filtered.tiff então pode ser enviada para um programa de software de análise digital de terceiros ou um programa de software de código aberto.
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Representative Results
As seções de tecido TMA de amígdalas e pulmonares (5 mm de espessura) foram obtidas e colocadas no meio de lâminas revestidas de ouro seguindo as especificações relativas ao tamanho do tecido e margens seguras dos slides. As margens de vidro livres de 5 mm e 10 mm entre a borda do tecido e as bordas laterais e inferiores das lâminas de vidro, respectivamente, são necessárias para uma coloração ideal. As seções de tecido foram assadas durante a noite em um forno antes da coloração para garantir a adequada adesão da seção ao slide. O painel de anticorpos era composto por 23 marcadores. No mesmo lote de coloração, foram incluídos um slide de amígdalas e um slide de TMA contendo múltiplos tecidos para avaliar a expressão de marcadores pouco expressos em amostras de adenocarcinoma pulmonar (Figura 1). Controles positivos precisam ser escolhidos de acordo com os alvos dos anticorpos utilizados nos painéis; por exemplo, para avaliar a expressão SOX10, são necessárias amostras de melanoma e, para avaliar a expressão gafp, são necessárias amostras de glioblastoma (Figura 2).
Figura 1: Pureza isotópica e cross-talk de canal. A matriz mostra o percentual de conversa cruzada derivada da pureza da sonda e óxidos (caixas azuis, ≥0,5%; caixas claras, <0,5%). Para as tags de massa, são mostrados testes que contribuíram com pelo menos 0,5% de conversa cruzada em nenhum canal (verde), um ou dois canais (amarelo) ou mais de dois canais (laranja). Também são mostrados canais de massa que recebem pelo menos 0,5% de conversa cruzada de nenhuma sonda (verde), uma ou duas sondas (amarela) ou mais de duas sondas (laranja). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas de coloração em diferentes tecidos. (A) Adenocarcinoma pulmonar. (B) Rim nonneoplástico. (C) Amígdala. CD20 é mostrado em amarelo, Ki67 é mostrado em magenta, CD3 é mostrado em branco, CD11c é mostrado em verde, CD68 é mostrado em vermelho, cytokeratin é mostrado em ciano, e DNA de duplaridade (dsDNA) é mostrado em azul. Ampliação, 200x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Este procedimento de coloração se assemelha muito à coloração imunohistoquímica padrão e ocorreu em dois dias consecutivos. As cinco etapas principais do protocolo de coloração são 1) remoção em excesso de parafina, 2) recuperação de antígeno, 3) bloqueio de anticorpos, 4) coloração de anticorpos e 5) fixação e desidratação (Figura 3). Um passo fundamental no procedimento de coloração é tomar precauções para evitar a contaminação metálica das amostras, incluindo o uso de reagentes sem metal armazenados em plásticos e manuseio cuidadoso das amostras para limitar danos mecânicos. Preparar o coquetel de anticorpos imediatamente antes da coloração ser recomendada. Isso reduz a troca de metais. Uma vez que a mancha estava completa, armazenamos os slides e escaneamos-os no dia seguinte. Antes da aquisição de imagens, uma etapa necessária é a configuração de slides usando um aplicativo de gerenciamento de imagem baseado na Web (Figura 4).
Figura 3: Fluxo de trabalho de aquisição de imagens e o resumo do fluxo de trabalho de aquisição de imagens associado. 1) Uma seção de tecido FFPE manchada com anticorpos conjugados com metal é rasterizada usando uma arma de íons primária, liberando íons secundários. 2) Um espectrômetro de massa de tempo de voo se separa e mede íons com base em sua massa no nível do pixel. 3) Quantificação baseada em pixels de íons secundários. O eixo y corresponde ao número de íons detectados (pico), e o eixo x corresponde à massa de cada metal. 4) Com base no pico de cada espectro de massa, imagens multidimensionais são reconstruídas. (B) Esquema do slide utilizado neste procedimento. Para o tecido de coloração ideal, a seção deve ser posicionada pelo menos 5 mm da borda lateral do slide e 10 mm de sua borda inferior. Ao desenhar a barreira hidrofóbica ao redor da seção tecidual, ela deve ser mantida dentro do retângulo pelo menos 1 mm da borda do slide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Configuração de slides no aplicativo de gerenciamento de imagens baseado na Web. Antes da varredura de slides, é necessário configurar cada slide. Digite os detalhes desejados que podem ajudar na identificação do slide. Clique em Adicionar seção (seta preta) para incluir as informações de bloco e posição. Para salvar, clique em Enviar (seta vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No dia da digitalização, ligue o instrumento de aquisição usando o software de controle. Clicar em Troca slide abriu a porta do instrumento, permitindo o carregamento de um slide. Posicionamos o slide no slot de carregamento voltado para cima com a etiqueta no lado direito. Apenas um slide pode ser escaneado ao mesmo tempo. O passo seguinte foi selecionar os FOVs e ajustar o foco e a estigma seguindo as etapas descritas no protocolo. Nós adquirimos imagens clicando em Start Run. O tempo de aquisição varia dependendo do tamanho fov e resolução desejada. O tamanho do FOV varia de 200 μm x 200 μm a 800 μm x 800 μm, o que corresponde a uma faixa de tamanho de quadro de 128 pixels x 128 pixels a 2048 pixels x 2048 pixels. Três resoluções padrão estão disponíveis: grosseira, fina e superfina. Digitalizar FOVs maiores na resolução de superfinas é demorado, com o tempo final de aquisição para um FOV variando de 25 s a 4,7 h (Figura 5).
Figura 5: Aquisição de imagens usando o software de controle. As configurações de aquisição podem ser ajustadas conforme desejado. Para modificar a resolução de digitalização, clique no menu suspenso pelo Modo de Imagem (seta preta). Para modificar o tamanho fov, digite um número no campo FOV Size (μm) (seta vermelha). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Depois que a digitalização foi concluída, um conjunto de imagens, incluindo todos os FOVs, foi automaticamente carregado para o aplicativo de gerenciamento de imagens baseado na Web. Além do armazenamento de imagens, este aplicativo permite a visualização de todos os canais em conjunto ou separadamente, ajustes de imagem e download de imagens para posterior preparação. A imagem visualizada padrão é salva como um arquivo TIFF (Figura 6).
Figura 6: Visualização de imagem usando o aplicativo de gerenciamento de imagem baseado na Web. As imagens adquiridas são armazenadas e visualizadas usando a plataforma online. Ajustar os parâmetros de visualização e alterar a cor de cada marcador é possível. Clique em Adicionar canal de imagem (seta branca) para visualizar outros marcadores. Ampliação, 200x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As interferências metálicas são inerentes aos métodos de rotulagem metálica, apesar do uso de estratégias para minimizá-las. Para remover o excesso de sinais de fundo do isótopo metálico conjugado aos anticorpos e preparar imagens para análise, utilizamos o software de processamento de imagem associado (ver Tabela de Materiais). O procedimento de preparação da imagem tem duas etapas: 1) correção isobárica, que remove sinais entre canais, e 2) filtragem, que remove sinais causados por agregados na imagem.
Para iniciar a correção isobárica, o arquivo contendo a imagem TIFF salva foi selecionado clicando no ícone Arquivo do painel de entrada. O software carrega automaticamente todas as imagens TIFF arquivadas no arquivo, permitindo a análise em lote. Em seguida, corrigimos a imagem clicando no ícone Filtro do painel de entrada. Dois arquivos resultantes com o sufixo -MassCorrected foram gerados automaticamente: um arquivado no formato TIFF e outro arquivado no formato JSON. Por padrão, os arquivos resultantes foram salvos no mesmo arquivo do qual a imagem inicial foi carregada (Figura 7).
Figura 7: Preparação da imagem: etapa de correção. Para carregar uma imagem para preparação no software de processamento de imagens, clique no ícone Arquivo no painel de entrada (seta preta) e selecione a imagem. Para aplicar o procedimento de correção padrão, clique no ícone Filtro no painel de entrada (seta vermelha). Para salvar a imagem atualizada e corrigida, clique no ícone disquete no painel de saída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O segundo passo da preparação da imagem é a filtragem, que pode ser selecionada na guia superior do software. Selecionamos a imagem corrigida no painel de entrada. Nesta etapa, a tessellação Voronoi automatizada foi utilizada como parâmetro de filtragem. Clicar no ícone do filtro no painel de entrada aplicou automaticamente o filtro selecionado em todos os canais. Em ambas as etapas de preparação da imagem (correção e filtragem), as imagens de cada canal antes e depois do processamento e diferenças de sinal são exibidas no lado direito da tela.
Semelhante à etapa de correção isobárica, foram gerados dois novos arquivos, um no formato TIFF e outro no formato JSON. Nesta etapa, o sufixo que seguia o nome do arquivo foi -Filtrado. Portanto, a imagem final obtida foi chamada MassCorrected-Filtered.tiff. Ao completar essas etapas, preparamos a imagem para a análise utilizando o software de patologia digital preferido (Figura 8 e Figura 9). Usando esta técnica, pudemos analisar todos os 23 marcadores no painel de anticorpos com interferências mínimas entre os canais no nível subcelular em uma única seção de tecido.
Figura 8: Preparação da imagem: etapa de filtragem. Selecione Filtragem na guia superior (seta preta) no software de processamento de imagens. Em Parâmetros de Filtragem, selecione o método desejado (arqueiro verde). No painel de entrada, selecione Imagem MassCorrected. Para aplicar o procedimento selecionado à imagem, clique no ícone Filtro no painel de entrada (seta vermelha). Para salvar a imagem filtrada atualizada, clique no ícone disquete disquete no painel de saída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Imagens representativas da coloração antes e depois da preparação da imagem. (A) Imagem de uma seção de tecido de amígdalas manchada usando essa técnica e visualizada usando um programa de software de análise de imagem digital de terceiros antes da filtragem e correção. (B) Imagem da mesma seção sob as mesmas condições após as etapas de filtragem e correção. CD20 é mostrado em amarelo, Ki67 é mostrado em magenta, CD3 é mostrado em branco, CD11c é mostrado em verde, cytokeratin é mostrado em ciano, e DNA de dupla fita (dsDNA) é mostrado em azul. Ampliação, 200x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1: Lista de painel de anticorpos. Cada anticorpo foi conjugado a um isótopo metálico específico com uma massa diferente como listado. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
A elucidação abrangente das interações complexas e intrincadas entre os múltiplos componentes de um TME continua sendo um objetivo crucial da pesquisa do câncer. Os fabricantes introduziram inúmeros ensaios multiplexados como parte desse esforço, especialmente nos últimos 5 anos. A análise espacial multiplexada é uma ferramenta versátil e poderosa que facilita a categorização simultânea de vários alvos, preservando a morfologia estrutural em amostras de tumores. Técnicas de análise espacial podem ser realizadas utilizando imagens de fluorescência ou espectrometria de massa, como a técnica aqui descrita 11,12,13.
Antes da coloração, a otimização de anticorpos usando um protocolo regular de imunohistoquímica seguido pelo protocolo de coloração é necessária para padronizar a reprodutibilidade da coloração de anticorpos. Um fato muito conhecido é que diferentes clones regulares de anticorpos podem ter uma expressão ótima em diferentes condições. No entanto, para conjugar anticorpos com etiquetas metálicas, anticorpos livres de portadores são necessários, assim como definir o mesmo pH para recuperação de antígeno para todos os anticorpos integrados ao painel, o que é uma desvantagem deste método. A não conclusão desta etapa pode resultar em imagens de baixa qualidade que não podem ser analisadas com sucesso. Dedicar tempo à investigação dos sites dos fabricantes de literatura médica e anticorpos para selecionar os melhores anticorpos bem validados e confiáveis entre aqueles que estão disponíveis comercialmente é imperativo. Ao validar os anticorpos e os painéis, a construção de painéis menores é útil. Isso ajuda na identificação de possíveis interferências de canal e na avaliação da expressão correta dos marcadores.
Uma das características distintas desta técnica é a capacidade de estudar até 40 anticorpos rotulados por metal em uma única seção de tecido. Apesar de serem altamente vantajosas, as técnicas de espectrometria de massa com rótulos metálicos estão sujeitas a interferências metálicas desafiadoras, como interferências isobáricas. As interferências isobáricas são características dos métodos de espectrometria de massa de rotulagem metálica e são o resultado da existência de isótopos de massa igual ou muito semelhante cuja diferença em massa é menor do que a capacidade de detecção do analisador de massa. Essas interferências podem ser causadas por contaminação isotópica ou espécies poliatômicas. Contaminação isotópica refere-se à pureza de um elemento. Na natureza, a maioria dos elementos estão presentes em uma mistura de isótopos. Mesmo quando submetida ao enriquecimento, 100% de pureza não pode ser obtida. Resulta em mais de um elemento com a mesma massa e produz conversa cruzada entre os canais. A pureza mediana dos 40 isótopos metálicos disponíveis é de 98%. As interferências decorrentes de espécies poliatômicas originam-se da ligação metálica livre a espécies negativamente carregadas, como hidretos, carbonetos, nitretos, óxidos, hidróxidos e cianetos, adicionando de +1 a +26 à massa final da etiqueta metálica. Desenvolver estratégias para minimizar possíveis fontes de ruído é crucial para alcançar uma boa coloração e imagem. O primeiro passo necessário na construção do painel é a tarefa cuidadosa de isótopo-anticorpo metálico. Marcadores que geralmente são difundidos em seções de tecido, como citokeratina e CD45, devem ser conjugados a isótopos metálicos com uma massa alta (maior que a de 160Gd) para minimizar os efeitos das interferências poliatômicas, e marcadores escassos devem ser conjugados a isótopos com massas que variam de 140Ce a 160Gd. Algo a ter em mente é que o risco de interferência metálica aumenta à medida que o número de marcadores aumenta. No entanto, com a colocação cuidadosa de metais e marcadores, o impacto das interferências residuais pode ser reduzido com mais processamento de imagem usando o software de processamento de imagem.
Procedimentos complementares também podem ser utilizados para reduzir a contaminação metálica das amostras em corte e coloração de tecidos. Como descrito no protocolo acima, o uso de água destilada ou diH2O no banho de água evita essa contaminação. Da mesma forma, os reagentes utilizados na coloração devem ser livres de metal. Uma dica útil é evitar armazenar reagentes em recipientes de vidro, pois os vidros facilitam a contaminação metálica. Para obter resultados gerais ideais, na etapa de coloração, recomendamos assar lâminas durante a noite para garantir uma boa adesão das seções teciduais aos slides.
Ao contrário de outros métodos multiplexados, este método utiliza amostrasFFPE 14. A fixação combinada de formalina e a incorporação de parafinas continua sendo a forma mais utilizada de preservação e preparação da amostra. O uso de blocos arquivados permite a realização de estudos mais extensos do que o uso de amostras congeladas frescas, incluindo pesquisas retrospectivas, e tem um custo menor. Este método também permite imagens de slides inteiros e rescanagem de slides. Isso captura uma área de análise mais ampla do que selecionar apenas partes do slide e permite a varredura em múltiplas ampliações.
Esta técnica tem limitações relacionadas ao preço do instrumento e à exigência de compra de materiais como slides revestidos de ouro diretamente dos fabricantes. Tentativas de uso de slides não revestidos, slides revestidos com um material diferente do ouro, ou slides obtidos de empresas que não sejam os fabricantes podem resultar em nenhuma aquisição de sinal e interferência extensiva de sinal e podem, em última instância, danificar o instrumento.
Outra desvantagem significativa deste método é a ausência de software específico para análise. Este método gera imagens no formato TIFF, que é amplamente utilizado e pode ser prontamente carregado para software de análise digital de terceiros. As ferramentas de software de patologia computacional permitem análise abrangente, incluindo compartimentação de tecidos, segmentação celular, quantificação de marcadores em qualquer compartimento celular e análise de vizinha e proximidade mais próxima. A aquisição de um software de análise digital de terceiros para uso, aumenta o custo de uma técnica já cara15,16.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos para revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem Don Norwood dos Serviços de Edição, Biblioteca Médica de Pesquisa na MD Anderson para edição deste artigo e o Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory no Departamento de Patologia Molecular Translacional da MD Anderson. Esta publicação resultou em parte de pesquisas facilitadas pelo apoio científico e financeiro para os Centros de Monitoramento e Análise imune do Câncer-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) fornecidos através do National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) para o Centro de Monitoramento e Análise De Câncer do Centro de Câncer da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Institute (CIMAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
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