Summary
À l’ère de l’immunothérapie du cancer, l’intérêt pour l’élucidation de la dynamique du microenvironnement tumoral a augmenté de manière frappante. Ce protocole détaille une technique d’imagerie par spectrométrie de masse en ce qui concerne ses étapes de coloration et d’imagerie, qui permettent une analyse spatiale hautement multiplexée.
Abstract
Les progrès des thérapies immunitaires ont révolutionné le traitement et la recherche sur le cancer. Cela a déclenché une demande croissante pour la caractérisation du paysage immunitaire tumoral. Bien que l’immunohistochimie standard soit adaptée à l’étude de l’architecture tissulaire, elle se limite à l’analyse d’un petit nombre de marqueurs. Inversement, des techniques telles que la cytométrie en flux peuvent évaluer plusieurs marqueurs simultanément, bien que les informations sur la morphologie des tissus soient perdues. Au cours des dernières années, les stratégies multiplexées qui intègrent l’analyse phénotypique et spatiale ont émergé comme des approches globales pour la caractérisation du paysage immunitaire tumoral. Ici, nous discutons d’une technologie innovante combinant des anticorps marqués par des métaux et la spectrométrie de masse d’ions secondaires en se concentrant sur les étapes techniques du développement et de l’optimisation des tests, de la préparation des tissus, ainsi que de l’acquisition et du traitement des images. Avant la coloration, un panel d’anticorps marqués en métal doit être développé et optimisé. Ce système d’image hi-plex prend en charge jusqu’à 40 anticorps marqués au métal dans une seule section de tissu. Il convient de noter que le risque d’interférence du signal augmente avec le nombre de marqueurs inclus dans le panneau. Après la conception du panel, une attention particulière doit être accordée à l’affectation de l’isotope métallique à l’anticorps afin de minimiser cette interférence. Les tests préliminaires par panel sont effectués à l’aide d’un petit sous-ensemble d’anticorps et les tests ultérieurs de l’ensemble du panel dans les tissus témoins. Des coupes de tissu fixées au formol et incorporées à la paraffine sont obtenues et montées sur des lames recouvertes d’or et tachées davantage. La coloration prend 2 jours et ressemble beaucoup à la coloration immunohistochimique standard. Une fois les échantillons colorés, ils sont placés dans l’instrument d’acquisition d’images. Les champs de vision sont sélectionnés et les images sont acquises, téléchargées et stockées. La dernière étape est la préparation de l’image pour le filtrage et la suppression des interférences à l’aide du logiciel de traitement d’image du système. Un inconvénient de cette plate-forme est le manque de logiciels analytiques. Cependant, les images générées sont prises en charge par différents logiciels de pathologie computationnelle.
Introduction
L’importance des nombreux types de cellules entourant les populations de tumeurs clonales est un élément crucial dans la catégorisation de la cancérogenèse. L’intérêt pour l’élucidation de la composition et des interactions de ce microenvironnement tumoral (TME) n’a cessé d’augmenter après la mise en place d’une thérapie immunitaire dans le cadre de l’arsenal de traitement du cancer. Par conséquent, les stratégies de traitement sont passées d’une approche centrée sur la tumeur à une approche centrée sur le TME1.
Les efforts visant à élucider les rôles des cellules immunitaires dans la surveillance tumorale et le développement du cancer se sont multipliés de façon frappante ces dernières années 2,3. Dans la recherche médicale, une pléthore de méthodes, y compris des méthodes basées sur la cytométrie et des technologies d’imagerie singleplex et multiplex, sont apparues dans le cadre de cette tentative de déchiffrer les interactions uniques de multiples éléments des ETM.
Des méthodes pionnières telles que la cytométrie en flux (inventée dans les années 1960), le tri cellulaire activé par fluorescence et la cytométrie de masse se concentrent principalement sur l’identification et la quantification des composants du TME4. Même si les techniques quantitatives basées sur la cytométrie permettent le phénotypage du paysage immunitaire, la détermination de la distribution spatiale cellulaire est impossible. Inversement, des méthodes telles que l’immunohistochimie singleplex standard préservent l’architecture tissulaire et permettent aux chercheurs d’analyser la distribution cellulaire, bien qu’un nombre réduit de cibles dans une seule section tissulaire soit une limitation de ces méthodes 5,6. Au cours des dernières années, les technologies d’imagerie multiplexées pour la résolution unicellulaire, telles que l’immunofluorescence multiplexe, l’imagerie par fluorescence à code-barres et la spectrométrie de masse par imagerie, sont apparues comme des stratégies complètes pour acquérir des informations sur la coloration simultanée des marqueurs à l’aide de la même sectionde tissu 7.
Nous présentons ici une technologie qui associe des anticorps marqués par des métaux et la spectrométrie de masse d’ions secondaires et permet la quantification de la résolution unicellulaire, la co-expression de marqueurs (phénotypage) et l’analyse spatiale à l’aide d’échantillons de tissus fixés au formol, incorporés à la paraffine (FFPE) et frais congelés (FF) 8,9. Les échantillons FFPE sont les matériaux les plus largement utilisés pour l’archivage des échantillons tissulaires et représentent une ressource plus facilement disponible pour les technologies d’imagerie multiplexée que les échantillons frais congelés10. De plus, cette technologie offre la possibilité de réacquérir des images des mois après. Ici, nous discutons de nos protocoles de coloration et de traitement d’image utilisant des échantillons de tissus FFPE.
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Protocol
Des échantillons de tissus ont été prélevés à des fins de recherche conformément au comité d’examen institutionnel du MD Anderson Cancer Center de l’Université du Texas, et les échantillons ont été anonymisés.
1. Sélection des anticorps
- Définir les questions de recherche pour choisir les meilleurs clones d’anticorps disponibles. Utilisez l’Atlas des protéines humaines, les recherches publiées et les sites Web des fabricants d’anticorps comme ressources de recherche.
REMARQUE: La sélection de contrôles de tissus humains adéquats et les mêmes contrôles de tissus humains à colorer dans les différentes étapes est essentielle pour s’assurer que les marqueurs sont colorés correctement, au bon endroit et dans le bon compartiment cellulaire. Un petit microréseau tissulaire (TMA) comprenant des tissus normaux et des tissus néoplasiques est toujours recommandé pour la validation de la coloration. - Utilisez uniquement des anticorps sans porteur pour concevoir le panneau.
REMARQUE : L’utilisation de formulations d’anticorps sans porteur est requise si un anticorps commercial sans porteur n’est pas disponible; Des kits de purification peuvent être utilisés pour ajuster l’anticorps à la formulation correcte. Les additifs protéiques tels que l’albumine sérique bovine sont connus pour diminuer la capacité de conjugaison. - Tester et titrer chaque anticorps à l’aide de l’immunohistochimie chromogène standard pour déterminer le profil subcellulaire de l’expression d’un marqueur; coloration membranaire, cytoplasmique ou nucléaire; et l’expression dans des cellules spécifiques dans les tissus témoins.
REMARQUE : Cependant, chaque anticorps doit être testé dans le citrate de pH 6 et l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de pH 9, et il faut déterminer si le panneau sera coloré avec du citrate de pH 6 ou de l’EDTA de pH 9. L’utilisation de pH 9 EDTA est recommandée pour obtenir de bons signaux, en particulier lorsque vous travaillez avec cette méthodologie. - Choisir la concentration optimale de coloration en fonction du mode d’expression chez les témoins positifs.
- Attribuer chaque anticorps à l’un des isotopes métalliques disponibles en fonction de l’abondance du marqueur immunohistochimique, de la localisation subcellulaire et de la co-expression cellulaire avec les autres cibles.
- Colorer l’anticorps avec le métal assigné correspondant et comparer avec l’expression dans le même tissu témoin utilisé précédemment.
REMARQUE : La conjugaison des anticorps métalliques commence par la préparation des anticorps, la réduction et la conjugaison subséquente (dossier supplémentaire 1). Chaque tube en polymère chargé de métal est suffisant pour marquer 100 μg d’un anticorps.
2. Conception du panel d’anticorps
- Créez de petits lots de coloration d’anticorps. Testez jusqu’à cinq marqueurs dans un cocktail.
REMARQUE : L’analyse d’anticorps déjà conjugués et analysés à l’aide de l’immunohistochimie par lots facilite l’identification précoce des interférences des canaux et offre la possibilité de reconjuguer les anticorps avec un autre métal. C’est aussi l’occasion d’évaluer la co-expression adéquate des marqueurs. - Colorer chaque petit lot avec quatre concentrations d’anticorps différentes (0,05 μg/mL, 0,2 μg/mL, 1 μg/mL et 4,0 μg/mL).
REMARQUE: En comparant différents titres, identifiez la concentration d’anticorps qui se traduit par l’emplacement correct et l’expression la plus élevée avec une coloration minimale du fond (meilleur rapport signal sur bruit).
3. Sectionnement des tissus FFPE
- Sélectionnez des lames dorées (spécifiques à cet effet) et gardez-les près du microtome. Préparez le microtome en insérant une nouvelle lame dans le support. Réglez l’épaisseur de la section à 4-5 μm.
- Mettez les blocs FFPE sur la glace avant de les sectionner. Préparer un bain de flottaison de tissus en chauffant de l’eau distillée ou de l’eau désionisée (diH2O) à 40-45 °C.
NOTE: L’utilisation de diH2O ou d’eau distillée réduit le risque de contamination. - Commencez le sectionnement. Placez la section de tissu dans l’eau à l’aide d’une pince à épiler et laissez-la s’aplatir. Utilisez les lames pour retirer des sections de tissu de l’eau.
- Placez les lames dans un support à glissières et laissez-les sécher à température ambiante pendant la nuit.
4. Coloration des anticorps FFPE
REMARQUE: Le processus de coloration a lieu sur deux jours distincts.
ATTENTION : Les solutions employées dans ce protocole sont potentiellement corrosives et représentent des dangers pour la peau et les yeux. Le port de gants, d’une blouse de laboratoire et d’un équipement de protection des yeux et du visage est conseillé et fait partie de la politique de biosécurité de notre établissement.
- Préparation du réactif (jour 1)
- Diluer 50 mL de 20x solution saline tamponnée Tris avec Tween (TBS-T) dans 950 mL de diH2O pour obtenir 1 L de TBS-T.
- Diluer 8 mL de 10x acide tris-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans 72 mL dediH2Opour obtenir une solution 1x de récupération d’épitopes induite par la chaleur (HIER).
- Diluer le sérum d’ânesse dans 1x TBS-T jusqu’à une concentration finale de 5% pour faire un tampon de blocage. Conserver la solution à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à être utilisée.
- Préparation HIER : Module de prétraitement (PT)
ATTENTION : Portez des gants de protection chimique lorsque vous manipulez des réactifs ou des pièces immergés dans des réactifs utilisés dans le module de ressuage.- Diluer 140 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 10x dans 1 260 mL de diH2O pour obtenir 1,4 L de 1x PBS. Alternativement, diluer sept comprimés de PBS dans 1,4 L de diH2O.
- Remplissez un réservoir avec 1,4 L de PBS et placez le récipient préparé de la chambre coulissante avec 100 ml de 1x solution HIER dans le réservoir.
- Préchauffez le réservoir dans un module de ressuage à 75 °C.
- Élimination excessive de la paraffine
- Cuire les lames à 70 °C dans un four pendant au moins 20 min.
REMARQUE: Certains tissus ou sections peuvent nécessiter des temps de cuisson plus longs. Le temps de cuisson recommandé pour le tissu cérébral ou une AMT est de 1 h. Cela peut être prolongé jusqu’à 16 h (pendant la nuit) ou selon l’expérience du laboratoire. - Placez les lames cuites dans un support à glissière et effectuez les étapes de lavage suivantes sur un agitateur sous une hotte. Lavez les lames dans la solution suivante: Xylène 2x pendant 30 s (sans métal), 100% alcool 2x pendant 30 s (sans métal), 95% alcool 2x pendant 30 s (sans métal), 80% d’alcool pendant 30 s (sans métal), 70% d’alcool pendant 30 s (sans métal) et diH2O 2x pendant 30 s (sans métal).
- Conservez les lames dans un récipient diH2O frais jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour le prélèvement de l’antigène.
REMARQUE: Les lames ne doivent pas être séchées avant la fin de la procédure.
- Cuire les lames à 70 °C dans un four pendant au moins 20 min.
- Récupération d’antigènes
- Placez les lames dans une chambre de glissière préchauffée contenant 1x tampon HIER à l’intérieur du module PT. Placez le couvercle sur le réservoir. Fermez et verrouillez le couvercle.
- Appuyez sur le bouton Menu du module PT pour ouvrir le menu principal et appuyez sur le bouton Cycle d’installation (temps et température) pour créer un programme personnalisé.
- Faites fonctionner le module PT à 97 °C pendant 40 min. Ensuite, le module PT refroidit automatiquement à 65 °C.
- Retirez les lames du module PT une fois la température de 65 °C atteinte. Conserver les lames à température ambiante pendant 30 min.
REMARQUE: Le module PT ne s’ouvrira pas tant que la température n’aura pas refroidi à 65 ° C. Ne touchez pas la surface dorée des lames pendant ce processus et utilisez toujours des gants.
- Blocage des anticorps
- Réglez un shaker à 70 tr/min.
- Lavez les lames en les trempant dans 1x TBS-T pendant 5 min 2x.
- À l’aide d’un stylo barrière hydrophobe, tracez une bordure autour de la section de tissu à au moins 1 mm des bords de la glissière et laissez-la sécher pendant 15 à 30 s.
REMARQUE: Prenez soin d’empêcher le liquide du stylo de toucher la section de tissu pour éviter toute interférence tissulaire avec la coloration. N’appuyez pas trop fort sur le stylo tout en tirant la barrière pour éviter les fuites potentielles. Pour des résultats optimaux de coloration et d’acquisition d’images, les sections de tissu sont placées au milieu des lames recouvertes d’or dans un cadre ne dépassant pas 15 mm x 30 mm pour laisser suffisamment d’espace pour dessiner la barrière sans toucher le tissu ou les points guides placés sur le bord extérieur de la lame. - Pour enlever tout résidu de stylo, trempez les lames dans TBS-T.
- Dans une chambre d’humidité à température ambiante, incuber la section de tissu avec 100-200 μL de tampon de blocage pendant 20 min. Laissez le tissu en incubation dans le tampon bloquant jusqu’à ce qu’un mélange principal d’anticorps soit prêt.
- Préparation du panel d’anticorps
REMARQUE: Le volume final du cocktail du panel d’anticorps varie en fonction de la surface estimée de la section tissulaire. Pour couvrir une surface de 20 mm x 20 mm, préparez 100-200 μL du cocktail.
Procédez comme suit pour préparer un cocktail d’anticorps conjugués aux isotopes métalliques :- Confirmez le volume final du cocktail qui correspond au volume du cocktail d’anticorps ajouté au volume du tampon bloquant.
- Confirmez les spécifications de tous les anticorps, dilutions et/ou concentrations d’anticorps dans une feuille de calcul de panel pour le projet.
- Faire tourner tous les tubes contenant des anticorps à 10 000 x g pendant 5 min. Ajoutez des anticorps individuels au tampon bloquant et mélangez très bien. Ne pas déranger le fond du tube d’anticorps lorsque vous le pipetez.
- Filtrer le panneau d’anticorps en prémouillant un dispositif de filtration centrifuge de 0,1 μm avec 100 μL de tampon de blocage. Faites tourner le filtre à 10 000 x g pendant 2 min et retirez le tampon de blocage à l’aide d’une pipette.
- Transférez le panneau d’anticorps dans une colonne de rotation et faites tourner le filtre à 10 000 x g pendant 2 min. Jetez la colonne de rotation et utilisez le flux continu comme panneau d’anticorps filtrés.
REMARQUE: Effectuez la coloration immédiatement après avoir fait le cocktail pour éviter l’échange de métal. Si le stockage du cocktail d’anticorps pendant une période prolongée est nécessaire, il peut être soumis à une lyophilisation.
- Coloration des anticorps
- Retirez délicatement la mémoire tampon de blocage des diapositives en basculant chaque lame sur le côté et en tapotant doucement les bords contre un essuie-glace.
- Placez les lames dans une chambre d’humidité et ajoutez 100 à 200 μL de mélange principal d’anticorps dans le tissu (éviter tout contact avec les tissus et la création de bulles d’air).
- Ajouter des lames de contrôle positives et négatives au lot de coloration.
- Incuber les toboggans à 4 °C pendant la nuit (14-16 h).
- Préparation du réactif (jour 2)
- Diluer 100 mL de 10x PBS à faible teneur en baryum, pH 7,4, dans 900 mL dediH2Opour obtenir 1x PBS.
- Préparer 350 mL d’une solution mère de travail de glutaraldéhyde à 2 % dans du PBS à faible teneur en baryum (340 mL de PBS à faible teneur en baryum + 10 mL de glutaraldéhyde à 70 %).
NOTA: Effectuer la dilution sous un capot. Le glutaraldéhyde est un liquide très visqueux. Utilisez une pipette de 1 mL et ajoutez 1 mL de PBS à faible teneur en baryum dans le tube de glutaraldéhyde chaque fois jusqu’à ce qu’il devienne suffisamment liquide pour s’écouler hors du tube. - Diluer 10x Tris, pH 8,5, dans 900 mL dediH200pour obtenir 1x Tris.
- Fixation et déshydratation
- Retirez le mélange principal d’anticorps de chaque lame en basculant la lame sur le côté et en tapotant doucement le bord contre un essuie-glace.
- Laver les lames avec une agitation légère à modérée dans les tampons suivants: 1x TBS-T, 3x fois pendant 5 minutes chacune (sans métal); filtré 2% de glutaraldéhyde pendant 5 min; filtré 1x tris, pH 8,5, 3x pendant 30 s; diH2Ofiltré pendant 30 s; 70% d’alcool pendant 30 s (sans métal); 80% d’alcool pendant 30 s (sans métal); 95% d’alcool pendant 30 s (sans métal); et 100% alcool pendant 30 s (sans métal).
- Tapotez doucement le bord de chaque glissière contre un essuie-glace de tâche pour éliminer l’excès d’alcool et permettre à l’alcool résiduel de s’évaporer à température ambiante (~5-10 min).
- Sécher les lames dans un dessiccateur pendant au moins 1 h avant l’acquisition de l’image ou conserver les lames dans une chambre à vide pour un stockage à long terme.
5. Acquisition d’images
- Configuration des diapositives
REMARQUE : Avant de numériser à l’aide de l’instrument, les diapositives doivent être définies et configurées à l’aide de l’application Web de gestion d’images en suivant les étapes décrites ci-dessous.- Sur la page des diapositives de l’application Web de gestion des images, cliquez sur Nouvelle diapositive d’acquisition et entrez les détails souhaités (nom, identification de la diapositive, emplacement et description).
- Créez des sections de numérisation en cliquant sur Ajouter une section. Renseignez les informations pour chaque section (nom du projet, nom de la diapositive, bloc et position). Pour enregistrer les nouvelles diapositives/sections créées, cliquez sur Envoyer.
- Sous l’onglet Ressources, ouvrez la page des panneaux et sélectionnez le panneau à utiliser. Pour les nouveaux panneaux, cliquez sur Créer un nouveau panneau.
- Après avoir sélectionné le panneau, cliquez sur Sections. Ajoutez les sections créées à l’étape 2. en cliquant sur Modifier l’affectation de section. Enregistrez en cliquant sur Soumettre.
- Configuration de l’instrument
NOTA : Cet instrument (voir le tableau des matières) est utilisé à l’aide d’un logiciel de contrôle spécifique (voir le tableau des matières).- Connectez-vous au logiciel de contrôle. Cliquez sur Réveiller si l’instrument est en mode veille.
REMARQUE: Au moins 1 h avant l’opération, il est recommandé de réchauffer l’instrument, ce qui facilite la stabilisation de la mise au point du faisceau. - Pour charger une diapositive, cliquez sur Exemple Exchange , puis sur Continuer pour ouvrir la porte. Placez la lame dans la fente de chargement avec l’échantillon vers le haut et l’étiquette à droite. Cliquez sur Continuer pour fermer la porte.
REMARQUE: Si la diapositive n’est pas chargée correctement, un son d’avertissement et une notification pour ajuster la diapositive apparaîtront. - Sélectionnez le projet, puis sélectionnez le nom de la diapositive pour l’exemple chargé.
- Visualisez l’image panoramique dans le volet d’image optique de la diapositive.
- Connectez-vous au logiciel de contrôle. Cliquez sur Réveiller si l’instrument est en mode veille.
- Sélection et acquisition du champ de vision (FOV)
- Cliquez sur le menu Mode et sélectionnez SED (Secondary Electron Detector). Cliquez sur le menu du mode d’imagerie et choisissez QC −300 μm.
- Cliquez sur Jog Stage pour contrôler l’emplacement du champ de vision, puis cliquez sur les flèches pour naviguer et sélectionner la position du FOV.
- Cliquez sur Ajouter un champ de vision, définissez 400 μm x 400 μm comme taille de champ, puis sélectionnez fin comme mode d’imagerie et 1 ms de temps d’arrêt. Cliquez sur Confirmer.
REMARQUE: Le temps d’arrêt défini dépendra de la résolution souhaitée. Le temps d’arrêt augmente à mesure que la résolution augmente. Le temps d’acquisition peut varier en fonction de plusieurs facteurs, y compris la période de rodage du détecteur et la durée de fonctionnement. Notre temps d’acquisition moyen pour un champ de vision est d’environ 17 min. Utilisez l’instrument sans arrêt jusqu’à 8 h, ce qui permet de balayer environ 28 FOV. La qualité des images acquises diminue après de nombreuses heures consécutives d’utilisation. - Après avoir créé une liste de champ de vision, passez à la mise au point de l’image et ajustez la stigmatisation en déplaçant le faisceau vers une région tissulaire qui ne sera pas imagée. Ajustez les paramètres jusqu’à ce qu’une image centrale claire soit obtenue.
REMARQUE: Pour optimiser l’acquisition d’image, garder la section de tissu centralisée sur la lame est idéal. Lors de la mise au point, une image claire de la zone centrale peut être obtenue. Si la section de tissu est trop grande, les bords seront flous et l’image sera floue. - Cliquez sur Démarrer l’exécution. Les images acquises seront automatiquement téléchargées et stockées dans l’application Web de gestion des images.
6. Préparation de l’image
- Correction isobare de l’image
NOTE: Le but de la correction isobare est d’éliminer le signal de débordement entre les canaux résultant de la présence d’isotopes de masse égale ou très similaire dont les différences de masse ne peuvent pas être détectées à l’aide de l’analyseur de masse.- Dans l’application Web de gestion d’images, cliquez sur l’icône verte Télécharger pour enregistrer les FOV (images TIFF).
- Téléchargez la version la plus récente du logiciel de traitement d’image (voir le tableau des matériaux) disponible dans l’onglet À propos de l’application Web de gestion d’images et enregistrez-la dans un fichier. Ouvrez le fichier d’archive .zip et suivez les étapes d’installation. Ouvrez le logiciel une fois l’installation terminée.
- Sélectionnez le dossier contenant les images à corriger en cliquant sur l’icône Fichier dans le volet de saisie du logiciel de traitement d’image. Une liste FOV sera chargée.
- Cliquez sur l’icône Filtre dans le volet de saisie pour appliquer les corrections par défaut. Pour chaque canal, visualisez les images obtenues avant et après correction sur le côté droit de l’écran.
- Cliquez sur l’icône de disquette dans le volet de sortie pour enregistrer l’image corrigée.
- Filtrage d’image: Voronoi tessellation
REMARQUE: Les diagrammes de pavage de Voronoï illustrent une partition de l’espace contenant des points de départ dans les cellules de Voronoï. L’objectif est d’estimer la densité cellulaire et de définir les limites cellulaires. À l’aide du calcul de tessellation de Voronoï, un masque est généré et appliqué à l’image d’origine pour le filtrage.- Cliquez sur l’onglet Filtrage et sélectionnez Voronoi Tesselation dans le menu des paramètres de filtrage.
- Dans le volet de saisie, sélectionnez l’image MassCorrigé.tiff. Cliquez sur l’icône Filtre dans le volet de saisie.
- Cliquez sur l’icône de disquette dans le volet de sortie pour enregistrer l’image filtrée. Les deux fichiers résultants auront les suffixes -Filtered.tiff et -Filtered.json.
REMARQUE: L’image nommée MassCorrectd-Filtered.tiff peut ensuite être téléchargée vers un logiciel d’analyse numérique tiers ou un logiciel open source.
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Representative Results
Des coupes de tissu TMA d’amygdale et d’adénocarcinome pulmonaire (5 mm d’épaisseur) ont été obtenues et placées au milieu de lames recouvertes d’or conformément aux spécifications concernant la taille des tissus et les marges sécurisées des lames. Des marges de verre libres de 5 mm et 10 mm entre le bord du tissu et les bordures latérales et inférieures des lames de verre, respectivement, sont nécessaires pour une coloration optimale. Les sections de tissu ont été cuites pendant la nuit dans un four avant la coloration pour assurer une bonne adhérence de la section à la lame. Le panel d’anticorps était composé de 23 marqueurs. Dans le même lot de coloration, une lame d’amygdale et une lame TMA contenant plusieurs tissus ont été incluses pour évaluer l’expression de marqueurs faiblement exprimés dans les échantillons d’adénocarcinome pulmonaire (Figure 1). Les témoins positifs doivent être choisis en fonction des cibles des anticorps utilisés dans les panels; par exemple, pour évaluer l’expression de SOX10, des échantillons de mélanome sont nécessaires, et pour évaluer l’expression de GAFP, des échantillons de glioblastome sont nécessaires (Figure 2).
Figure 1 : Pureté isotopique et diaphonie des canaux. La matrice montre le pourcentage de diaphonie dérivé de la pureté de la sonde et des oxydes (cases bleues, ≥0,5%; cases claires, <0,5%). Pour les étiquettes de masse, les sondes qui ont contribué à au moins 0,5 % de diaphonie dans aucun canal (vert), un ou deux canaux (jaune) ou plus de deux canaux (orange) sont affichées. Les canaux de masse recevant au moins 0,5 % de diaphonie provenant de l’absence de sondes (vert), d’une ou deux sondes (jaune) ou de plus de deux sondes (orange) sont également affichés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Images de coloration représentatives dans différents tissus. (A) Adénocarcinome pulmonaire. (B) Rein non néoplasique. c) Amygdale. CD20 est montré en jaune, Ki67 est montré en magenta, CD3 est montré en blanc, CD11c est montré en vert, CD68 est montré en rouge, la cytokératine est montré en cyan et l’ADN double brin (ADNds) est montré en bleu. Grossissement, 200x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Cette procédure de coloration ressemble beaucoup à la coloration immunohistochimique standard et s’est produite sur deux jours consécutifs. Les cinq principales étapes du protocole de coloration sont 1) l’élimination excessive de la paraffine, 2) la récupération de l’antigène, 3) le blocage des anticorps, 4) la coloration des anticorps et 5) la fixation et la déshydratation (Figure 3). Une étape fondamentale de la procédure de coloration consiste à prendre des précautions pour éviter la contamination métallique des échantillons, notamment en utilisant des réactifs sans métal stockés dans des articles en plastique et en manipulant soigneusement les échantillons pour limiter les dommages mécaniques. Il est recommandé de préparer le cocktail d’anticorps immédiatement avant la coloration. Cela réduit l’échange de métaux. Une fois la coloration terminée, nous avons stocké les lames et les avons scannées le lendemain. Avant l’acquisition d’images, une étape nécessaire consiste à configurer les diapositives à l’aide d’une application Web de gestion d’images (Figure 4).
Figure 3 : Flux de travail d’acquisition d’images et diapositive associée. (A) Résumé du flux de travail d’acquisition d’images. 1) Une coupe de tissu FFPE colorée avec des anticorps conjugués au métal est pixellisée à l’aide d’un pistolet à ions primaires, libérant des ions secondaires. 2) Un spectromètre de masse à temps de vol sépare et mesure les ions en fonction de leur masse au niveau des pixels. 3) Quantification des ions secondaires basée sur les pixels. L’axe des y correspond au nombre d’ions détectés (pic) et l’axe des x correspond à la masse de chaque métal. 4) Sur la base du pic de chaque spectre de masse, des images multidimensionnelles sont reconstruites. (B) Schéma de la diapositive utilisée dans cette procédure. Pour une coloration optimale du tissu, la section doit être positionnée à au moins 5 mm du bord latéral de la lame et à 10 mm de son bord inférieur. Lors du dessin de la barrière hydrophobe autour de la section de tissu, elle doit être maintenue à l’intérieur du rectangle à au moins 1 mm du bord de la lame. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Configuration des diapositives dans l’application Web de gestion des images. Avant la numérisation des diapositives, la configuration de chaque diapositive est nécessaire. Entrez les détails souhaités qui peuvent aider à l’identification des diapositives. Cliquez sur Ajouter une section (flèche noire) pour inclure les informations de bloc et de position. Pour enregistrer, cliquez sur Envoyer (flèche rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Le jour de la numérisation, allumez l’instrument d’acquisition à l’aide du logiciel de contrôle. Cliquer sur Exchange Slide a ouvert la porte de l’instrument, permettant le chargement d’une diapositive. Nous avons positionné la glissière sur la fente de chargement vers le haut avec l’étiquette sur le côté droit. Une seule diapositive peut être numérisée à la fois. L’étape suivante consistait à sélectionner les VOV et à ajuster l’orientation et la stigmatisation en suivant les étapes décrites dans le protocole. Nous avons acquis des images en cliquant sur Démarrer l’exécution. Le temps d’acquisition varie en fonction de la taille et de la résolution du champ de vision souhaité. La taille du champ de vision varie de 200 μm x 200 μm à 800 μm x 800 μm, ce qui correspond à une plage de taille d’image de 128 pixels x 128 pixels à 2048 pixels x 2048 pixels. Trois résolutions standard sont disponibles : grossière, fine et superfine. Le balayage de plus grands FOV à une résolution ultrafine prend beaucoup de temps, le temps d’acquisition final pour un champ de vision allant de 25 s à 4,7 h (Figure 5).
Figure 5 : Acquisition d’images à l’aide du logiciel de contrôle. Les paramètres d’acquisition peuvent être ajustés comme vous le souhaitez. Pour modifier la résolution de numérisation, cliquez sur le menu déroulant par Mode d’imagerie (flèche noire). Pour modifier la taille du champ de vision, entrez un nombre dans le champ Taille du champ de champ de vision (μm) (flèche rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Une fois la numérisation terminée, un ensemble d’images comprenant tous les FOV a été automatiquement téléchargé sur l’application Web de gestion des images. Outre le stockage des images, cette application permet la visualisation de tous les canaux ensemble ou séparément, les ajustements d’image et le téléchargement d’images pour une préparation ultérieure. L’image visualisée standard est enregistrée sous forme de fichier TIFF (Figure 6).
Figure 6 : Visualisation d’images à l’aide de l’application Web de gestion d’images. Les images acquises sont stockées et visualisées à l’aide de la plate-forme en ligne. Il est possible d’ajuster les paramètres de visualisation et de changer la couleur de chaque marqueur. Cliquez sur Ajouter un canal d’image (flèche blanche) pour visualiser d’autres marqueurs. Grossissement, 200x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les interférences métalliques sont inhérentes aux méthodes d’étiquetage des métaux malgré l’utilisation de stratégies pour les minimiser. Pour éliminer les signaux de fond excédentaires de l’isotope métallique conjugué aux anticorps et préparer les images pour l’analyse, nous avons utilisé le logiciel de traitement d’image associé (voir le tableau des matériaux). La procédure de préparation de l’image comporte deux étapes : 1) la correction isobare, qui supprime les signaux entre les canaux, et 2) le filtrage, qui supprime les signaux causés par les agrégats sur l’image.
Pour lancer la correction isobare, le fichier contenant l’image TIFF enregistrée a été sélectionné en cliquant sur l’icône Fichier du volet de saisie. Le logiciel charge automatiquement toutes les images TIFF archivées dans le fichier, ce qui permet une analyse par lots. Ensuite, nous avons corrigé l’image en cliquant sur l’icône Filtre du volet de saisie. Deux fichiers résultants avec le suffixe -MassCorrected ont été générés automatiquement : l’un archivé au format TIFF et l’autre archivé au format JSON. Par défaut, les archives résultantes étaient enregistrées dans le même fichier à partir duquel l’image initiale avait été chargée (Figure 7).
Figure 7 : Préparation de l’image : étape de correction. Pour charger une image à préparer dans le logiciel de traitement d’image, cliquez sur l’icône Fichier dans le volet de saisie (flèche noire) et sélectionnez l’image. Pour appliquer la procédure de correction par défaut, cliquez sur l’icône Filtre dans le volet de saisie (flèche rouge). Pour enregistrer l’image corrigée mise à jour, cliquez sur l’icône de disquette dans le volet de sortie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La deuxième étape de la préparation de l’image est le filtrage, qui peut être sélectionné sur l’onglet supérieur du logiciel. Nous avons sélectionné l’image corrigée dans le volet de saisie. Dans cette étape, la tessellation automatisée de Voronoï a été utilisée comme paramètre de filtrage. En cliquant sur l’icône de filtre dans le panneau de saisie, le filtre sélectionné a été automatiquement appliqué à tous les canaux. Dans les deux étapes de préparation de l’image (correction et filtrage), les images de chaque canal avant et après le traitement et les différences de signal sont affichées sur le côté droit de l’écran.
Comme pour l’étape de correction isobare, deux nouvelles archives, l’une au format TIFF et l’autre au format JSON, ont été générées. Dans cette étape, le suffixe suivant le nom de fichier était -Filtered. Par conséquent, l’image finale obtenue a été nommée MassCorrectd-Filtered.tiff. En suivant ces étapes, nous avons préparé l’image pour l’analyse à l’aide du logiciel de pathologie numérique préféré (Figure 8 et Figure 9). En utilisant cette technique, nous avons pu analyser les 23 marqueurs du panel d’anticorps avec un minimum d’interférences entre les canaux au niveau subcellulaire dans une seule section de tissu.
Figure 8 : Préparation de l’image : étape de filtrage. Sélectionnez Filtrage dans l’onglet supérieur (flèche noire) du logiciel de traitement d’image. Sous Paramètres de filtrage, sélectionnez la méthode souhaitée (flèche verte). Dans le volet de saisie, sélectionnez Image MassCorrigée. Pour appliquer la procédure sélectionnée à l’image, cliquez sur l’icône Filtre dans le volet de saisie (flèche rouge). Pour enregistrer l’image filtrée mise à jour, cliquez sur l’icône de disquette dans le volet de sortie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Images représentatives de la coloration avant et après la préparation de l’image. (A) Image d’une coupe de tissu amygdale colorée à l’aide de cette technique et visualisée à l’aide d’un logiciel tiers d’analyse d’images numériques avant le filtrage et la correction. (B) Image de la même section dans les mêmes conditions après les étapes de filtrage et de correction. CD20 est représenté en jaune, Ki67 en magenta, CD3 en blanc, CD11c en vert, la cytokératine en cyan et l’ADN double brin (ADNds) en bleu. Grossissement, 200x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Fichier supplémentaire 1 : Liste des panels d’anticorps. Chaque anticorps a été conjugué à un isotope métallique spécifique avec une masse différente comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’élucidation complète des interactions complexes et complexes entre les multiples composantes d’un ETM demeure un objectif central de la recherche sur le cancer. Les fabricants ont introduit de nombreux tests multiplexés dans le cadre de cet effort, en particulier au cours des 5 dernières années. L’analyse spatiale multiplexée est un outil polyvalent et puissant qui facilite la catégorisation simultanée de plusieurs cibles tout en préservant la morphologie structurelle dans les échantillons tumoraux. Les techniques d’analyse spatiale peuvent être réalisées en utilisant l’imagerie par fluorescence ou la spectrométrie de masse, telles que la technique décrite ici11,12,13.
Avant la coloration, l’optimisation des anticorps à l’aide d’un protocole d’immunohistochimie régulier suivi du protocole de coloration est nécessaire pour normaliser la reproductibilité de la coloration des anticorps. Un fait très connu est que différents clones d’anticorps réguliers peuvent avoir une expression optimale dans différentes conditions. Cependant, pour conjuguer des anticorps avec des marqueurs métalliques, des anticorps sans porteur sont nécessaires, tout comme la définition du même pH pour le prélèvement d’antigènes pour tous les anticorps intégrés dans le panel, ce qui est un inconvénient de cette méthode. Si vous n’effectuez pas cette étape, vous obtiendrez des images de mauvaise qualité qui ne peuvent pas être analysées avec succès. Il est impératif de consacrer du temps à l’étude de la littérature médicale et des sites Web des fabricants d’anticorps afin de sélectionner les meilleurs anticorps fiables et bien validés parmi ceux qui sont disponibles dans le commerce. Lors de la validation des anticorps et des panels, il est utile de construire des panels plus petits. Cela aide à identifier les interférences possibles des canaux et à évaluer l’expression correcte des marqueurs.
L’une des caractéristiques distinctives de cette technique est la possibilité d’étudier jusqu’à 40 anticorps marqués au métal sur une seule section de tissu. Bien qu’elles soient très avantageuses, les techniques de spectrométrie de masse marquées par des métaux sont soumises à des interférences métalliques difficiles, telles que les interférences isobares. Les interférences isobares sont caractéristiques des méthodes de spectrométrie de masse par marquage des métaux et résultent de l’existence d’isotopes de masse égale ou très similaire dont la différence de masse est inférieure à la capacité de détection de l’analyseur de masse. Ces interférences peuvent être causées par une contamination isotopique ou des espèces polyatomiques. La contamination isotopique fait référence à la pureté d’un élément. Dans la nature, la plupart des éléments sont présents dans un mélange d’isotopes. Même lorsqu’il est soumis à un enrichissement, une pureté de 100% ne peut être obtenue. Il en résulte plus d’un élément de la même masse et produit une diaphonie entre les canaux. La pureté médiane des 40 isotopes métalliques disponibles est de 98 %. Les interférences dues aux espèces polyatomiques proviennent de la liaison du métal libre aux espèces chargées négativement telles que les hydrures, les carbures, les nitrures, les oxydes, les hydroxydes et les cyanures, ajoutant de +1 à +26 à la masse finale de l’étiquette métallique. L’élaboration de stratégies visant à minimiser les sources de bruit possibles est cruciale pour obtenir une bonne coloration et une bonne imagerie. La première étape nécessaire dans la construction du panneau est l’affectation minutieuse des isotopes métalliques et des anticorps. Les marqueurs qui sont généralement répandus dans les coupes de tissus, tels que la cytokératine et CD45, devraient être conjugués à des isotopes métalliques ayant une masse élevée (supérieure à celle de 160 Gd) pour minimiser les effets des interférences polyatomiques, et des marqueurs rares devraient être conjugués à des isotopes avec des masses allant de 140 CE à 160Gd. Il faut garder à l’esprit que le risque d’interférence métallique augmente à mesure que le nombre de marqueurs augmente. Cependant, avec un placement soigneux du métal et des marqueurs, l’impact des interférences résiduelles peut être réduit avec un traitement d’image supplémentaire à l’aide du logiciel de traitement d’image.
Des procédures complémentaires peuvent également être utilisées pour réduire la contamination métallique des échantillons lors de la coupe et de la coloration des tissus. Comme décrit dans le protocole ci-dessus, l’utilisation d’eau distillée oudiH2Oau bain-marie prévient cette contamination. De même, les réactifs utilisés pour la coloration doivent être exempts de métaux. Un conseil utile est d’éviter de stocker les réactifs dans des récipients en verre, car la verrerie facilite la contamination des métaux. Pour obtenir des résultats globaux optimaux, à l’étape de coloration, nous recommandons de cuire les lames pendant la nuit pour assurer une bonne adhérence des sections de tissu aux lames.
Contrairement à d’autres méthodes multiplexées, cette méthode utilise des échantillons FFPE14. La fixation combinée du formol et l’incorporation à la paraffine restent la forme la plus largement utilisée de conservation et de préparation des échantillons. L’utilisation de blocs archivés permet la réalisation d’études plus approfondies que l’utilisation d’échantillons frais congelés, y compris la recherche rétrospective, et a un coût moindre. Cette méthode permet également l’imagerie de lames entières et la renumérisation de lames. Cela capture un domaine d’analyse plus large que la sélection de parties de la diapositive et permet de numériser à plusieurs grossissements.
Cette technique a des limites liées au prix de l’instrument et à l’exigence d’acheter des matériaux tels que des lames revêtues d’or directement auprès des fabricants. Les tentatives d’utilisation de glissières non revêtues, de glissières revêtues d’un matériau autre que l’or ou de glissières obtenues auprès de sociétés autres que les fabricants peuvent entraîner l’absence d’acquisition de signaux et d’importantes interférences de signal et peuvent, en fin de compte, endommager l’instrument.
Un autre inconvénient important de cette méthode est l’absence de logiciels spécifiques pour l’analyse. Cette méthode génère des images au format TIFF, qui est largement utilisé et peut être facilement téléchargé sur un logiciel d’analyse numérique tiers. Les outils logiciels de pathologie computationnelle permettent une analyse complète, y compris la compartimentation des tissus, la segmentation cellulaire, la quantification des marqueurs dans n’importe quel compartiment cellulaire et l’analyse du plus proche voisin et de la proximité. L’acquisition d’un logiciel d’analyse numérique tiers pour l’utilisation augmente le coût d’une technique déjà coûteuse15,16.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Don Norwood de Editing Services, Research Medical Library at MD Anderson pour la rédaction de cet article et le Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory du Département de pathologie moléculaire translationnelle de MD Anderson. Cette publication résulte en partie de la recherche facilitée par le soutien scientifique et financier du Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) fourni dans le cadre de l’accord de coopération du National Cancer Institute (NCI) (U24CA224285) au Centre de surveillance et d’analyse immunitaire du cancer MD Anderson Cancer Center (CIMAC) de l’Université du Texas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
- Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T.
- Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).
- Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
- Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
- Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
- Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).
- Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98 (2021).
- Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
- Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Rad, H. S., et al. The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).
