Summary
I en tid av cancerimmunterapi har intresset för att belysa tumörmikromiljödynamiken ökat slående. Detta protokoll beskriver en masspektrometriavbildningsteknik med avseende på dess färgnings- och avbildningssteg, vilket möjliggör mycket multiplexerad rumslig analys.
Abstract
Framsteg inom immunbaserade terapier har revolutionerat cancerbehandling och forskning. Detta har utlöst en växande efterfrågan på karakterisering av tumörimmunlandskapet. Även om standardimmunhistokemi är lämplig för att studera vävnadsarkitektur, är den begränsad till analys av ett litet antal markörer. Omvänt kan tekniker som flödescytometri utvärdera flera markörer samtidigt, även om information om vävnadsmorfologi går förlorad. Under de senaste åren har multiplexerade strategier som integrerar fenotypisk och rumslig analys framkommit som omfattande tillvägagångssätt för karakterisering av tumörimmunlandskapet. Häri diskuterar vi en innovativ teknik som kombinerar metallmärkta antikroppar och sekundär jonmasspektrometri med fokus på de tekniska stegen i analysutveckling och optimering, vävnadsberedning och bildförvärv och bearbetning. Före färgning måste en metallmärkt antikroppspanel utvecklas och optimeras. Detta hi-plex-bildsystem stöder upp till 40 metallmärkta antikroppar i en enda vävnadssektion. Observera att risken för signalstörningar ökar med antalet markörer som ingår i panelen. Efter paneldesign bör särskild uppmärksamhet ägnas åt metallisotoptilldelningen till antikroppen för att minimera denna interferens. Preliminär paneltestning utförs med hjälp av en liten delmängd av antikroppar och efterföljande testning av hela panelen i kontrollvävnader. Formalinfixerade, paraffinbäddade vävnadssektioner erhålls och monteras på guldbelagda glidbanor och färgas ytterligare. Färgningen tar 2 dagar och liknar standard immunohistokemisk färgning. När proverna är färgade placeras de i bildförvärvsinstrumentet. Vyfält väljs och bilder hämtas, laddas upp och lagras. Det sista steget är bildförberedelser för filtrering och borttagning av störningar med hjälp av systemets bildbehandlingsprogram. En nackdel med denna plattform är bristen på analytisk programvara. De genererade bilderna stöds dock av olika beräkningspatologiprogram.
Introduction
Betydelsen av de många celltyper som omger klonala tumörpopulationer är ett avgörande element i kategoriseringen av cancerframkallande. Intresset för att belysa denna tumörmikromiljö (TME) sammansättning och interaktioner har ökat kontinuerligt efter etableringen av immunbaserad terapi som en del av cancerbehandlingsarsenalen. Därför har behandlingsstrategier skiftat från ett tumörcentrerat tillvägagångssätt till ett TME-centrerat1.
Arbetet med att belysa immuncellernas roll i tumörövervakning och cancerutveckling har ökat påfallande de senaste åren 2,3. Inom medicinsk forskning uppstod en uppsjö av metoder, inklusive cytometribaserade metoder och singleplex- och multiplexavbildningsteknik, som en del av detta försök att dechiffrera de unika interaktionerna mellan flera element i TME.
Banbrytande metoder som flödescytometri (uppfunnen på 1960-talet), fluorescensaktiverad cellsortering och masscytometri fokuserar främst på att identifiera och kvantifiera TME-komponenter4. Även om cytometribaserade kvantitativa tekniker möjliggör fenotypning av immunlandskap, är det omöjligt att bestämma den cellulära rumsliga fördelningen. Omvänt bevarar metoder som standard singleplex immunohistokemi vävnadsarkitekturen och gör det möjligt för forskare att analysera cellulär fördelning, även om ett minskat antal mål i en enda vävnadssektion är en begränsning av dessa metoder 5,6. Under de senaste åren har multiplexerad bildteknik för encellsupplösning såsom multiplex immunofluorescens, streckkodning av fluorescensavbildning och avbildning av masspektrometri framkommit som omfattande strategier för att få information om samtidig markörfärgning med samma vävnadssektion7.
Här presenterar vi en teknik som kopplar ihop metallmärkta antikroppar och sekundär jonmasspektrometri och möjliggör kvantifiering av encellsupplösning, markörsamuttryck (fenotypning) och rumslig analys med hjälp av formalinfixerade, paraffinbäddade (FFPE) och färskfrysta (FF) vävnadsprover 8,9. FFPE-prover är de mest använda materialen för vävnadsarkivering av prover och utgör en mer lättillgänglig resurs för multiplexerad bildteknik än färska frysta prover10. Dessutom erbjuder denna teknik möjligheten att återta bilder månader efter. Häri diskuterar vi våra färgnings- och bildbehandlingsprotokoll med hjälp av FFPE-vävnadsprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vävnadsprover erhölls för forskningsändamål i enlighet med Institutional Review Board vid University of Texas MD Anderson Cancer Center, och prover avidentifierades ytterligare.
1. Antikroppsval
- Definiera forskningsfrågorna för att välja de bästa tillgängliga antikroppsklonerna. Använd Human Protein Atlas, publicerad forskning och antikroppstillverkares webbplatser som forskningsresurser.
OBS: Valet av adekvata mänskliga vävnadskontroller och samma mänskliga vävnadskontroller som ska färgas i de olika stegen är avgörande för att se till att markörerna är färgade korrekt, på rätt plats och i rätt cellulärt fack. En liten vävnadsmikroarray (TMA) inklusive normal vävnad och neoplastiska vävnader rekommenderas alltid för färgningsvalidering. - Använd endast bärarfria antikroppar för att designa panelen.
OBS: Användning av bärarfria antikroppsformuleringar krävs om en kommersiell bärarfri antikropp inte är tillgänglig. Reningssatser kan användas för att justera antikroppen till rätt formulering. Proteintillsatser såsom bovint serumalbumin är kända för att minska konjugeringskapaciteten. - Testa och titrera varje antikropp med hjälp av standardkromogen immunohistokemi för att bestämma det subcellulära mönstret för en markörs uttryck; membran, cytoplasmatisk eller kärnfärgning; och uttryck i specifika celler i kontrollvävnader.
OBS: Varje antikropp måste dock testas i pH 6-citrat och pH 9-etylendiamintetraättiksyra (EDTA), och om panelen kommer att färgas med pH 6-citrat eller pH 9 EDTA måste bestämmas. Användning av pH 9 EDTA rekommenderas för att få bra signaler, särskilt när man arbetar med denna metod. - Välj den optimala färgningskoncentrationen enligt uttrycksmönstret i positiva kontroller.
- Tilldela varje antikropp till en av de tillgängliga metallisotoperna enligt den immunohistokemiska markörens överflöd, subcellulär lokalisering och cellulärt samuttryck med de andra målen.
- Färga antikroppen med motsvarande tilldelade metall och jämför med uttrycket i samma kontrollvävnad som tidigare använts.
OBS: Antikroppsmetallkonjugering börjar med antikroppsberedning, reduktion och efterföljande konjugering (tilläggsfil 1). Varje metallbelastat polymerrör är tillräckligt för märkning av 100 μg av en antikropp.
2. Antikroppspanelens design
- Skapa små satser av antikroppsfärgning. Testa upp till fem markörer i en cocktail.
OBS: Testning av antikroppar som redan är konjugerade och analyserade med hjälp av immunhistokemi i satser underlättar tidig identifiering av kanalinterferenser och ger möjlighet att rekonjugera antikropparna med en annan metall. Det ger också en möjlighet att utvärdera adekvat markörsamuttryck. - Färga varje liten sats med fyra olika antikroppskoncentrationer (0,05 μg/ml, 0,2 μg/ml, 1 μg/ml och 4,0 μg/ml).
OBS: Jämför olika titrar, identifiera antikroppskoncentrationen som resulterar i rätt plats och högsta uttryck med minimal bakgrundsfärgning (bästa signal-brusförhållande).
3. FFPE-vävnadssektionering
- Välj guldbelagda bilder (specifika för detta ändamål) och håll dem nära mikrotomet. Förbered mikrotomen genom att sätta in ett nytt blad i hållaren. Ställ in sektionstjockleken på 4-5 μm.
- Lägg FFPE-block på is innan du delar upp dem. Bered ett vävnadsflytande bad genom att värma destillerat vatten eller avjoniserat vatten (diH2O) till 40-45 °C.
OBS: Användning av diH2O eller destillerat vatten minskar risken för kontaminering. - Börja sektionera. Placera vävnadsdelen i vattnet med pincett och låt den platta till. Använd bilderna för att ta bort vävnadssektioner från vattnet.
- Placera rutschkanorna i ett glidställ och låt dem torka i rumstemperatur över natten.
4. FFPE-antikroppsfärgning
OBS: Färgningsprocessen sker på två separata dagar.
VARNING: Lösningarna som används i detta protokoll är potentiellt frätande och utgör faror för hud och ögon. Att bära handskar, en labbrock och skyddande ögon- och ansiktsutrustning rekommenderas och en del av vår institutions biosäkerhetspolicy.
- Reagensberedning (dag 1)
- Späd 50 ml 20x Tris-buffrad saltlösning med Tween (TBS-T) i 950 ml diH2O för att göra 1 liter TBS-T.
- Späd 8 ml 10x Tris-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) i 72 ml diH2O-lösning för att göraen 1x värmeinducerad epitophämtningslösning (HIER).
- Späd åsneserum i 1x TBS-T till en slutlig koncentration på 5% för att göra blockerande buffert. Förvara lösningen vid 4 °C tills den är klar att användas.
- HIER-beredning: Förbehandlingsmodul (PT)
VARNING: Använd kemiska skyddshandskar vid hantering av reagenser eller delar nedsänkta i reagens som används i PT-modulen.- Späd 140 ml 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 1 260 ml diH2Oför att göra 1,4 L 1x PBS. Alternativt späd sju PBS-tabletter i 1,4 LdiH2O.
- Fyll en tank med 1,4 L PBS och placera den förberedda glidkammarbehållaren med 100 ml 1x HIER-lösning i tanken.
- Förvärm tanken i en PT-modul till 75 °C.
- Överskott av paraffinavlägsnande
- Grädda rutschkanorna vid 70 °C i ugn i minst 20 min.
OBS: Vissa vävnader eller sektioner kan behöva längre baktider. Den rekommenderade baktiden för hjärnvävnad eller en TMA är 1 h. Detta kan förlängas till 16 timmar (över natten) eller enligt laboratorieerfarenhet. - Placera bakade bilder i en glidhållare och utför följande tvättsteg på en shaker under en rökhuv. Tvätta bilderna i följande lösning: Xylen 2x för 30 s (metallfri), 100% alkohol 2x för 30 s (metallfri), 95% alkohol 2x för 30 s (metallfri), 80% alkohol för 30 s (metallfri), 70% alkohol i 30 s (metallfri) och diH2O 2x för 30 s (metallfri).
- Förvara objektglasen i en ny diH2O-behållaretills de är klara för antigenhämtning.
OBS: Bilderna ska inte torkas förrän proceduren är slut.
- Grädda rutschkanorna vid 70 °C i ugn i minst 20 min.
- Antigen hämtning
- Placera objektglasen i en förvärmd slidkammare som innehåller 1x HIER-buffert inuti PT-modulen. Placera locket på tanken. Stäng och lås locket.
- Tryck på menyknappen på PT-modulen för att öppna huvudmenyn och tryck på knappen Inställningscykel (tid och temperatur) för att skapa ett anpassat program.
- Kör PT-modulen vid 97 °C i 40 min. Därefter svalnar PT-modulen automatiskt till 65 °C.
- Ta bort objektglasen från PT-modulen när temperaturen på 65 °C har uppnåtts. Håll bilderna i rumstemperatur i 30 minuter.
PT-modulen öppnas inte förrän temperaturen svalnar till 65 °C. Rör inte vid den gyllene ytan på bilderna under denna process och använd alltid handskar.
- Blockering av antikroppar
- Ställ in en shaker på 70 rpm.
- Tvätta bilderna genom att doppa dem i 1x TBS-T i 5 min 2x.
- Använd en hydrofob barriärpenna, dra en kant runt vävnadssektionen minst 1 mm från glidkanterna och låt den torka i 15-30 s.
OBS: Var noga med att förhindra att pennvätskan vidrör vävnadsdelen för att undvika vävnadsstörningar med färgningen. Tryck inte ner pennan för hårt när du drar i barriären för att undvika potentiella läckor. För optimala färgnings- och bildförvärvsresultat placeras vävnadssektionerna i mitten av de guldbelagda objektglasen i en ram som inte är större än 15 mm x 30 mm för att ge tillräckligt med utrymme för att dra barriären utan att vidröra vävnaden eller styrpunkterna placerade på bildens ytterkant. - För att ta bort eventuella pennrester, doppa bilderna i TBS-T.
- I en fuktkammare vid rumstemperatur inkubera vävnadssektionen med 100-200 μL blockerande buffert i 20 min. Låt vävnaden ruva i blockeringsbufferten tills en antikroppsblandning är klar.
- Förberedelse av antikroppspanel
OBS: Den slutliga volymen av antikroppspanelcocktailen varierar beroende på den uppskattade vävnadssektionens yta. För att täcka ett område på 20 mm x 20 mm, förbered 100-200 μL av cocktailen.
Gör följande för att förbereda en antikroppspanelcocktail av metallisotopkonjugerade antikroppar:- Bekräfta den slutliga volymen av cocktailen som är lika med antikroppscocktailvolymen som läggs till den blockerande buffertvolymen.
- Bekräfta specifikationerna för alla antikroppar, utspädningar och/eller antikroppskoncentrationer i ett panelkalkylblad för projektet.
- Snurra ner alla antikroppsinnehållande rör vid 10 000 x g i 5 minuter. Tillsätt enskilda antikroppar till blockeringsbufferten och blanda mycket väl. Stör inte botten av antikroppsröret när du pipetterar det.
- Filtrera antikroppspanelen genom att förväta en 0,1 μm centrifugalfilteranordning med 100 μl blockerande buffert. Snurra filtret på 10 000 x g i 2 minuter och ta bort den blockerande buffertgenomströmningen med en pipett.
- Överför antikroppspanelen till en spinnkolonn och snurra filtret vid 10 000 x g i 2 minuter. Kasta spinnkolonnen och använd genomströmningen som filtrerad antikroppspanel.
OBS: Utför färgningen omedelbart efter att du har gjort cocktailen för att förhindra metallbyte. Om lagring av antikroppscocktailen under en längre tid behövs kan den utsättas för lyofilisering.
- Antikroppsfärgning
- Ta försiktigt bort blockeringsbufferten från bilderna genom att tippa varje bild på sidan och försiktigt knacka kanterna mot en uppgiftstorkare.
- Placera bilderna i en fuktkammare och tillsätt 100-200 μL antikroppshuvudblandning till vävnaden (undvik kontakt med vävnad och skapande av luftbubblor).
- Lägg till positiva och negativa kontrollglas i färgningssatsen.
- Inkubera objektsglasen vid 4 °C över natten (14–16 timmar).
- Reagensberedning (dag 2)
- Späd 100 ml 10x PBS med låg bariumhalt, pH 7,4, i 900 ml diH2Oför att göra 1x PBS.
- Förbered 350 ml av en arbetsstamlösning av 2% glutaraldehyd i PBS med låg barium (340 ml lågbarium PBS + 10 ml 70% glutaraldehyd).
OBS: Utför utspädningen under en huva. Glutaraldehyd är en mycket viskös vätska. Använd en 1 ml pipett och tillsätt 1 ml PBS med låg barium till glutaraldehydröret varje gång tills det blir tillräckligt flytande för att hälla ut ur röret. - Späd 10x Tris, pH 8,5, i 900 ml diH20 för att göra 1x Tris.
- Fixering och uttorkning
- Ta bort antikroppsmasterblandningen från varje bild genom att tippa bilden på sidan och försiktigt knacka kanten mot en uppgiftstorkare.
- Tvätta bilderna med lätt till måttlig omrörning i följande buffertar: 1x TBS-T, 3x gånger i 5 minuter vardera (metallfri); filtrerad 2% glutaraldehyd i 5 min; filtrerad 1x tris, pH 8,5, 3x för 30 s; filtreratdiH2O2xi 30 s; 70% alkohol i 30 s (metallfri); 80% alkohol i 30 s (metallfri); 95% alkohol i 30 s (metallfri); och 100% alkohol i 30 s (metallfri).
- Tryck försiktigt på kanten på varje bild mot en uppgiftstorkare för att ta bort överflödig alkohol och låt kvarvarande alkohol avdunsta vid rumstemperatur (~ 5-10 min).
- Torka objektglas i en exsickator i minst 1 timme före bildinsamling eller förvara objektglasen i en vakuumkammare för långvarig lagring.
5. Bildförvärv
- Inställning av bild
OBS: Innan du skannar med instrumentet måste bilderna definieras och ställas in med hjälp av det webbaserade bildhanteringsprogrammet enligt stegen som beskrivs nedan.- På bildsidan i det webbaserade bildhanteringsprogrammet klickar du på Accession New Slide och anger önskad information (namn, bildidentifiering, plats och beskrivning).
- Skapa skanningsavsnitt genom att klicka på Lägg till avsnitt. Fyll i informationen för varje avsnitt (projektets namn, bildnamn, block och position). Om du vill spara de nya bilderna/avsnitten som skapats klickar du på Skicka.
- Under fliken resurser öppnar du panelsidan och väljer den panel som ska användas. För nya paneler klickar du på Skapa ny panel.
- När du har valt panelen klickar du på Sektioner. Lägg till avsnitten som skapades i steg 2. genom att klicka på Redigera avsnittsuppgift. Spara genom att klicka på Skicka.
- Inställning av instrument
OBS: Detta instrument (se materialförteckning) drivs med hjälp av ett specifikt kontrollprogram (se materialförteckning).- Logga in på kontrollprogrammet. Klicka på Vakna om instrumentet är i viloläge.
OBS: Minst 1 h före operationen rekommenderas uppvärmning av instrumentet, vilket hjälper till med strålfokusstabilisering. - För att ladda en bild, klicka på Exchange-prov och klicka sedan på Fortsätt för att öppna dörren. Sätt bilden i lastplatsen med provet uppåt och etiketten till höger. Klicka på Fortsätt för att stänga dörren.
OBS: Om bilden inte laddas korrekt visas ett varningsljud och ett meddelande om att justera bilden. - Markera projektet och välj sedan bildnamnet för det inlästa exemplet.
- Visualisera panoramabilden i det optiska bildfönstret.
- Logga in på kontrollprogrammet. Klicka på Vakna om instrumentet är i viloläge.
- Synfält (FOV) urval och förvärv
- Klicka på menyn Läge och välj SED (Secondary Electron Detector). Klicka på bildlägesmenyn och välj QC −300 μm.
- Klicka på Jog Stage för att styra synfältets plats och klicka sedan på pilarna för att navigera och välja positionen för synfältet.
- Klicka på Lägg till FOV, ställ in 400 μm x 400 μm som fältstorlek och välj bra som bildläge och 1 ms uppehållstid. Klicka på Bekräfta.
OBS: Den inställda uppehållstiden beror på önskad upplösning. Bortiden ökar när upplösningen ökar. Förvärvstiden kan variera beroende på flera faktorer, inklusive detektorns inbrottsperiod och driftstid. Vår genomsnittliga förvärvstid för ett synfält är ca 17 min. Använd instrumentet nonstop i upp till 8 timmar, vilket möjliggör skanning av cirka 28 FOV. Kvaliteten på de förvärvade bilderna minskar efter många på varandra följande timmars användning. - När du har skapat en FOV-lista, fortsätt till bildfokus och justera stigmationen genom att flytta strålen till ett vävnadsområde som inte kommer att avbildas. Justera parametrarna tills en tydlig central bild erhålls.
OBS: För att optimera bildförvärvet är det perfekt att hålla vävnadssektionen centraliserad på bilden. Under fokusering kan en tydlig bild av endast det centrala området erhållas. Om vävnadssektionen är för stor kommer kanterna att vara ur fokus och bilden blir suddig. - Klicka på Starta körning. Förvärvade bilder laddas upp automatiskt och lagras i det webbaserade bildhanteringsprogrammet.
6. Förberedelse av bilder
- Isobar korrigering av bild
OBS: Syftet med isobarisk korrigering är att avlägsna spridningssignal mellan kanaler som härrör från närvaron av isotoper med lika eller mycket liknande massa vars skillnader i massa inte kan detekteras med hjälp av massanalysatorn.- I det webbaserade bildhanteringsprogrammet klickar du på den gröna nedladdningsikonen för att spara FOV: erna (TIFF-bilder).
- Ladda ner den mest uppdaterade versionen av bildbehandlingsprogrammet (se Materialförteckning) som finns på fliken Om i det webbaserade bildhanteringsprogrammet och spara det i en fil. Öppna .zip arkivfilen och följ installationsstegen. Öppna programvaran när installationen är klar.
- Välj mappen som innehåller bilderna som ska korrigeras genom att klicka på filikonen i inmatningsfönstret i bildbehandlingsprogrammet. En FOV-lista kommer att laddas.
- Klicka på filterikonen i inmatningsfönstret för att tillämpa standardkorrigeringar. För varje kanal, visualisera bilder som erhållits före och efter korrigering på höger sida av skärmen.
- Klicka på diskettikonen i utdatafönstret för att spara den korrigerade bilden.
- Bildfiltrering: Voronoi tessellation
OBS: Voronoi tessellationsdiagram illustrerar en partition av rymden som innehåller fröpunkter i Voronoi-celler. Syftet är att uppskatta celltätheten och definiera cellgränser. Med hjälp av Voronoi-tessellationsberäkningen genereras en mask och appliceras på originalbilden för filtrering.- Klicka på fliken Filtrering och välj Voronoi Tesselation på menyn för filtreringsparametrar.
- I indatafönstret väljer du bilden MassCorrected.tiff. Klicka på filterikonen i inmatningsfönstret.
- Klicka på diskettikonen i utdatafönstret för att spara den filtrerade avbildningen. De två resulterande filerna har suffixen -Filtered.tiff och -Filtered.json.
OBS: Bilden med namnet MassCorrected-Filtered.tiff kan sedan laddas upp till ett tredjepartsprogram för digital analys eller programvara med öppen källkod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tonsill- och lungadenokarcinom TMA-vävnadssektioner (5 mm tjocka) erhölls och placerades på mitten av guldbelagda objektglas enligt specifikationerna för vävnadsstorlek och säkra marginaler på objektglasen. Fria glasmarginaler på 5 mm och 10 mm mellan vävnadens kant respektive glasskivornas laterala och underlägsna gränser är nödvändiga för optimal färgning. Vävnadssektionerna bakades över natten i en ugn före färgning för att säkerställa korrekt vidhäftning av sektionen till bilden. Antikroppspanelen bestod av 23 markörer. I samma färgningssats inkluderades en tonsillglas och en TMA-bild innehållande flera vävnader för att utvärdera uttrycket av markörer som knappt uttrycktes i lungadenokarcinomprover (figur 1). Positiva kontroller måste väljas i enlighet med målen för de antikroppar som används i panelerna. till exempel för att utvärdera SOX10-uttryck behövs melanomprover och för att utvärdera GAFP-uttryck behövs glioblastomprover (figur 2).
Figur 1: Isotoprenhet och kanalkorsprat. Matrisen visar procentandelen korsprat som härrör från sondrenhet och oxider (blå rutor, ≥0,5%; tydliga rutor, <0,5%). För masstaggarna visas sonder som bidrog med minst 0,5% korsprat till inga kanaler (grön), en eller två kanaler (gul) eller mer än två kanaler (orange). Masskanaler som tar emot minst 0,5% korsprat från inga sonder (gröna), en eller två sonder (gul) eller mer än två sonder (orange) visas också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativa färgningsbilder i olika vävnader . (A) Lung adenokarcinom. (B) Nonneoplastisk njure. c) Tonsill. CD20 visas i gult, Ki67 visas i magenta, CD3 visas i vitt, CD11c visas i grönt, CD68 visas i rött, cytokeratin visas i cyan och dubbelsträngat DNA (dsDNA) visas i blått. Förstoring, 200x. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Denna färgningsprocedur liknar standard immunohistokemisk färgning och inträffade två på varandra följande dagar. De fem huvudstegen i färgningsprotokollet är 1) överskott av paraffinavlägsnande, 2) antigenhämtning, 3) antikroppsblockering, 4) antikroppsfärgning och 5) fixering och uttorkning (figur 3). Ett grundläggande steg i färgningsförfarandet är att vidta försiktighetsåtgärder för att undvika metallförorening av proverna, inklusive användning av metallfria reagenser lagrade i plastvaror och noggrann hantering av proverna för att begränsa mekanisk skada. Att förbereda antikroppscocktailen omedelbart före färgning rekommenderas. Detta minskar metallutbytet. När färgningen var klar lagrade vi bilderna och skannade dem nästa dag. Innan avbildningsförvärv är ett nödvändigt steg bildinställning med hjälp av ett webbaserat bildhanteringsprogram (bild 4).
Bild 3: Arbetsflöde för bildförvärv och tillhörande bild . (A) Arbetsflödessammanfattning för bildförvärv. 1) En FFPE-vävnadssektion färgad med metallkonjugerade antikroppar rastreras med hjälp av en primär jonpistol och frigör sekundära joner. 2) En flygtidsmasspektrometer separerar och mäter joner baserat på deras massa på pixelnivå. 3) Pixelbaserad kvantifiering av sekundära joner. Y-axeln motsvarar antalet detekterade joner (topp) och x-axeln motsvarar massan av varje metall. 4) Baserat på toppen av varje massspektrum rekonstrueras flerdimensionella bilder. (B) Schematisk bild som används i detta förfarande. För optimal färgningsvävnad måste sektionen placeras minst 5 mm från bildens sidokant och 10 mm från dess underlägsna kant. När du drar den hydrofoba barriären runt vävnadssektionen måste den hållas inuti rektangeln minst 1 mm från bildens kant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Bildinställningar i det webbaserade bildhanteringsprogrammet. Innan du skannar bilden är det nödvändigt att ställa in varje bild. Ange önskad information som kan hjälpa till med bildidentifiering. Klicka på Lägg till avsnitt (svart pil) för att inkludera block- och positionsinformationen. Om du vill spara klickar du på Skicka (röd pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
På skanningsdagen, slå på förvärvsinstrumentet med hjälp av kontrollprogramvaran. Genom att klicka på Exchange Slide öppnades instrumentets dörr, vilket möjliggjorde laddning av en bild. Vi placerade bilden på lastplatsen uppåt med etiketten på höger sida. Endast en bild kan skannas samtidigt. Nästa steg var att välja FOV och justera fokus och stigmatisering enligt stegen som beskrivs i protokollet. Vi skaffade bilder genom att klicka på Start Run. Förvärvstiden varierar beroende på synfältets storlek och önskade upplösning. Synfältets storlek varierar från 200 μm x 200 μm till 800 μm x 800 μm, vilket motsvarar ett ramstorleksintervall på 128 pixlar x 128 pixlar till 2048 pixlar x 2048 pixlar. Tre standardupplösningar finns tillgängliga: grov, fin och superfin. Att skanna större FOV med superfin upplösning är tidskrävande, med den slutliga förvärvstiden för ett synfält som sträcker sig från 25 s till 4,7 h (figur 5).
Bild 5: Bildförvärv med hjälp av kontrollprogramvaran. Förvärvsinställningarna kan justeras efter önskemål. För att ändra skanningsupplösningen, klicka på rullgardinsmenyn efter bildläge (svart pil). Om du vill ändra synfältets storlek anger du ett tal i fältet Synfältsstorlek (μm) (röd pil). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
När skanningen var klar laddades en bilduppsättning med alla FOV:er automatiskt upp till det webbaserade bildhanteringsprogrammet. Förutom lagring av bilder möjliggör denna applikation visualisering av alla kanaler tillsammans eller separat, bildjusteringar och nedladdning av bilder för vidare förberedelse. Den visualiserade standardbilden sparas som en TIFF-fil (bild 6).
Bild 6: Bildvisualisering med hjälp av det webbaserade bildhanteringsprogrammet. Förvärvade bilder lagras och visualiseras med hjälp av onlineplattformen. Det är möjligt att justera visualiseringsparametrarna och ändra färgen på varje markör. Klicka på Lägg till bildkanal (vit pil) för att visualisera andra markörer. Förstoring, 200x. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Metallstörningar är inneboende i metallmärkningsmetoderna trots användningen av strategier för att minimera dem. För att ta bort de överflödiga bakgrundssignalerna från metallisotoper konjugerade till antikropparna och förbereda bilder för analys använde vi tillhörande bildbehandlingsprogramvara (se materialförteckning). Bildförberedelseproceduren har två steg: 1) isobarisk korrigering, som tar bort signaler mellan kanaler, och 2) filtrering, som tar bort signaler orsakade av aggregat på bilden.
För att starta den isobariska korrigeringen valdes filen som innehåller den sparade TIFF-bilden genom att klicka på filikonen i inmatningsfönstret. Programvaran laddar automatiskt alla arkiverade TIFF-bilder i filen, vilket möjliggör batchanalys. Därefter korrigerade vi bilden genom att klicka på filterikonen i inmatningsfönstret. Två resulterande filer med suffixet -MassCorrected genererades automatiskt: en arkiverad i TIFF-format och den andra arkiverad i JSON-format. Som standard sparades de resulterande arkiven i samma fil som den ursprungliga bilden laddades från (figur 7).
Bild 7: Bildförberedelse: korrigeringssteg. För att ladda en bild för förberedelse i bildbehandlingsprogrammet, klicka på filikonen i inmatningsfönstret (svart pil) och välj bilden. För att tillämpa standardkorrigeringsproceduren, klicka på filterikonen i inmatningsfönstret (röd pil). För att spara den uppdaterade, korrigerade bilden, klicka på diskettikonen i utdatafönstret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det andra steget i bildförberedelsen är filtrering, som kan väljas på den övre fliken i programvaran. Vi valde den korrigerade bilden i inmatningsfönstret. I detta steg användes automatiserad Voronoi-tessellation som filtreringsparameter. Genom att klicka på filterikonen på inmatningspanelen tillämpades automatiskt det valda filtret på alla kanaler. I båda bildförberedelsestegen (korrigering och filtrering) visas bilderna för varje kanal före och efter bearbetning och signalskillnader på höger sida av skärmen.
I likhet med isobariskt korrigeringssteg genererades två nya arkiv, ett i TIFF och ett i JSON-format. I det här steget var suffixet efter filnamnet -Filtered. Därför fick den slutliga bilden som erhölls namnet MassCorrected-Filtered.tiff. Genom att slutföra dessa steg förberedde vi bilden för analysen med hjälp av den föredragna programvaran för digital patologi (figur 8 och figur 9). Genom att använda denna teknik kunde vi analysera alla 23 markörer i antikroppspanelen med minimala störningar mellan kanaler på subcellulär nivå i en enda vävnadssektion.
Bild 8: Bildförberedelse: filtreringssteg. Välj Filtrering på den övre fliken (svart pil) i bildbehandlingsprogrammet. Under Filtreringsparametrar väljer du önskad metod (grön pil). I indatafönstret väljer du Masskorrigerad bild. För att tillämpa den valda proceduren på bilden, klicka på filterikonen i inmatningsfönstret (röd pil). För att spara den uppdaterade filtrerade bilden, klicka på diskettikonen i utdatafönstret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Representativa bilder av färgningen före och efter bildförberedelserna. (A) Bild av en tonsillvävnadssektion färgad med denna teknik och visualiserad med hjälp av ett tredjepartsprogram för digital bildanalys före filtrering och korrigering. (B) Bild av samma avsnitt under samma förhållanden efter filtrerings- och korrigeringssteg. CD20 visas i gult, Ki67 visas i magenta, CD3 visas i vitt, CD11c visas i grönt, cytokeratin visas i cyan och dubbelsträngat DNA (dsDNA) visas i blått. Förstoring, 200x. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: Antikroppspanellista. Varje antikropp konjugerades till en specifik metallisotop med en annan massa enligt listan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den omfattande belysningen av de komplexa, invecklade interaktionerna mellan de många komponenterna i en TME är fortfarande ett centralt mål för cancerforskning. Tillverkare har introducerat många multiplexerade analyser som en del av denna ansträngning, särskilt under de senaste 5 åren. Multiplexerad rumslig analys är ett mångsidigt och kraftfullt verktyg som underlättar samtidig kategorisering av flera mål samtidigt som strukturell morfologi i tumörprover bevaras. Rumsliga analystekniker kan utföras med hjälp av fluorescensavbildning eller masspektrometri, såsom den teknik som beskrivs häri11,12,13.
Före färgning krävs antikroppsoptimering med hjälp av ett regelbundet immunhistokemiprotokoll följt av färgningsprotokollet för att standardisera reproducerbarheten för antikroppsfärgning. Ett mycket välkänt faktum är att olika vanliga antikroppskloner kan ha optimalt uttryck under olika förhållanden. För att konjugera antikroppar med metalltaggar krävs emellertid bärarfria antikroppar, liksom att definiera samma pH för antigenhämtning för alla antikroppar integrerade i panelen, vilket är en nackdel med denna metod. Om det här steget inte slutförs kan det leda till bilder av låg kvalitet som inte kan analyseras. Att ägna tid åt att undersöka den medicinska litteraturen och antikroppstillverkarnas webbplatser för att välja de bästa välvaliderade, pålitliga antikropparna bland de som är kommersiellt tillgängliga är absolut nödvändigt. Vid validering av antikropparna och panelerna är det användbart att konstruera mindre paneler. Detta hjälper till att identifiera möjliga kanalstörningar och utvärdera korrekt uttryck av markörerna.
En av de särdragen hos denna teknik är förmågan att studera upp till 40 metallmärkta antikroppar på en enda vävnadssektion. Trots att de är mycket fördelaktiga är metallmärkta masspektrometritekniker föremål för utmanande metallstörningar, såsom isobariska störningar. Isobariska störningar är karakteristiska för metallmärkning av masspektrometrimetoder och är resultatet av förekomsten av isotoper med lika eller mycket liknande massa vars skillnad i massa är mindre än massanalysatorns detektionskapacitet. Dessa störningar kan orsakas av isotopförorening eller polyatomiska arter. Isotopförorening avser ett elements renhet. I naturen är de flesta element närvarande i en blandning av isotoper. Även när de utsätts för anrikning kan 100% renhet inte erhållas. Det resulterar i mer än ett element med samma massa och producerar korsprat mellan kanaler. Medianrenheten för de 40 tillgängliga metallisotoperna är 98%. Störningarna på grund av polyatomiska arter härrör från fri metallbindning till negativt laddade arter som hydrider, karbider, nitrider, oxider, hydroxider och cyanider, vilket tillsätter från +1 till +26 till metallmärkets slutliga massa. Att utveckla strategier för att minimera möjliga bullerkällor är avgörande för att uppnå god färgning och avbildning. Det första nödvändiga steget i panelkonstruktionen är noggrann metallisotop-antikroppstilldelning. Markörer som i allmänhet är utbredda i vävnadssektioner, såsom cytokeratin och CD45, bör konjugeras till metallisotoper med hög massa (större än 160 Gd) för att minimera effekterna av polyatomiska störningar, och knappa markörer bör konjugeras till isotoper med massor från 140 Ce till 160Gd. Något att tänka på är att risken för metallstörningar ökar när antalet markörer ökar. Men med noggrann placering av metall och markörer kan effekten av kvarvarande störningar minskas med ytterligare bildbehandling med hjälp av bildbehandlingsprogramvaran.
Kompletterande förfaranden kan också användas för att minska metallkontaminering av proverna vid vävnadsskärning och färgning. Som beskrivits i protokollet ovan förhindrar användningen av destillerat vatten eller diH2O i vattenbadet denna förorening. På samma sätt måste reagenserna som används vid färgning vara metallfria. Ett användbart tips är att undvika att lagra reagens i glasbehållare, eftersom glasvaror underlättar metallförorening. För att uppnå optimala övergripande resultat, i färgningssteget, rekommenderar vi att baka glasrutschbanor över natten för att säkerställa god vidhäftning av vävnadssektioner till objektglasen.
Till skillnad från andra multiplexerade metoder använder denna metod FFPE-prover14. Kombinerad formalinfixering och paraffinbäddning är fortfarande den mest använda formen av provkonservering och beredning. Användningen av arkiverade block möjliggör utförandet av mer omfattande studier än användningen av färska frysta prover, inklusive retrospektiv forskning, och har en lägre kostnad. Denna metod möjliggör också helbildsavbildning och bildskanning. Detta fångar ett bredare analysområde än att bara välja delar av bilden och möjliggör skanning vid flera förstoringar.
Denna teknik har begränsningar relaterade till instrumentets pris och kravet på att köpa material som guldbelagda glidbanor direkt från tillverkare. Försök att använda obelagda objektglas, diabilder belagda med ett annat material än guld eller diabilder som erhållits från andra företag än tillverkarna kan leda till ingen signalinhämtning och omfattande signalstörningar och kan i slutändan skada instrumentet.
En annan signifikant nackdel med denna metod är frånvaron av specifik programvara för analys. Denna metod genererar bilder i TIFF-format, som används ofta och enkelt kan laddas upp till programvara för digital analys från tredje part. Programvaruverktyg för beräkningspatologi möjliggör omfattande analys, inklusive vävnadsuppdelning, cellsegmentering, markörkvantifiering i alla cellulära fack och närmaste granne och närhetsanalys. Att skaffa en tredjeparts digital analysprogramvara för användning ökar kostnaden för en redan dyr teknik15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Don Norwood från Editing Services, Research Medical Library vid MD Anderson för redigering av denna artikel och Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory vid Institutionen för translationell molekylär patologi vid MD Anderson. Denna publikation resulterade delvis från forskning som underlättades av det vetenskapliga och ekonomiska stödet till Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) som tillhandahålls genom National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) till University of Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
- Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T.
- Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).
- Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
- Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
- Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
- Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).
- Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98 (2021).
- Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
- Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Rad, H. S., et al. The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).
