Neuroscience

Одноклеточная визуализация всего мозга и анализ интактного мозга новорожденных мышей с использованием МРТ, очистки тканей и микроскопии световых листов

Published: August 1, 2022 doi: 10.3791/64096

Felix A. Kyere*^1,2, Ian Curtin*^1,2, Oleh Krupa^1,2, Carolyn M. McCormick^1,2, Mustafa Dere³, Sarah Khan^3,7, Minjeong Kim⁷, Tzu-Wen Winnie Wang^4,5,6, Qiuhong He^4,5,6, Guorong Wu³, Yen-Yu Ian Shih^4,5,6, Jason L. Stein^1,2

¹UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, ²Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, ³Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, ⁴Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁵Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁶Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁷Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro

* These authors contributed equally

Summary

Этот протокол описывает методы проведения магнитно-резонансной томографии, очистки и иммуномаркировки интактного мозга мыши с использованием iDISCO+, за которым следует подробное описание визуализации с использованием микроскопии светового листа и последующих анализов с использованием NuMorph.

Abstract

Очистка тканей с последующей микроскопией светового листа (LSFM) позволяет визуализировать неповрежденную структуру мозга с клеточным разрешением, что позволяет проводить количественный анализ структурных изменений, вызванных генетическими или экологическими возмущениями. Визуализация всего мозга приводит к более точной количественной оценке клеток и изучению региональных различий, которые могут быть пропущены при обычно используемой микроскопии физически разделенной ткани. Использование световой листовой микроскопии для изображения очищенного мозга значительно увеличивает скорость получения по сравнению с конфокальной микроскопией. Хотя эти изображения производят очень большие объемы структурных данных мозга, большинство вычислительных инструментов, которые выполняют количественную оценку признаков на изображениях очищенной ткани, ограничены подсчетом разреженных клеточных популяций, а не всех ядер.

Здесь мы демонстрируем NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), группу инструментов анализа, для количественной оценки всех ядер и ядерных маркеров в аннотированных областях мозга мыши послеродового дня 4 (P4) после очистки и визуализации на световом микроскопе. Мы описываем магнитно-резонансную томографию (МРТ) для измерения объема мозга до усадки, вызванной этапами обезвоживания тканей, очистки тканей с использованием метода iDISCO+, включая иммуномаркировку, с последующей микроскопией светового листа с использованием коммерчески доступной платформы для изображения мозга мыши с клеточным разрешением. Затем мы демонстрируем этот конвейер анализа изображений с помощью NuMorph, который используется для коррекции различий в интенсивности, сшивания плиток изображений, выравнивания нескольких каналов, подсчета ядер и аннотирования областей мозга путем регистрации в общедоступных атласах.

Мы разработали этот подход с использованием общедоступных протоколов и программного обеспечения, позволяя любому исследователю с необходимым микроскопом и вычислительными ресурсами выполнять эти методы. Эти инструменты очистки тканей, визуализации и вычислений позволяют измерять и количественно определять трехмерную (3D) организацию типов клеток в коре головного мозга и должны быть широко применимы к любому дизайну исследования дикого типа / нокаутированных мышей.

Introduction

Визуализация всего мозга с разрешением одной клетки является важной проблемой в нейробиологии. Изображения мозга с клеточным разрешением позволяют проводить подробный анализ и картирование на системном уровне схем головного мозга и того, как эта схема нарушается генетическими или экологическими факторами риска нервно-психических расстройств, клеточного поведения у развивающихся эмбрионов, а также нейронных цепей во взрослом мозге ^1,2,3. Существует несколько гистологических методов, которые позволяют получать изображения с высоким разрешением реконструированного 3D-мозга; однако эти методы требуют дорогостоящего специализированного оборудования, могут быть несовместимы с иммуномаркировкой, а двумерный (2D) характер некоторых методов может привести к повреждению тканей и сдвигу во время сечения ^4,5.

Последние достижения обеспечили альтернативный подход к визуализации всего мозга, который не требует разрезания тканей; они включают в себя использование очистки тканей, чтобы сделать мозг прозрачным. Прозрачность достигается в большинстве методов очистки тканей как путем удаления липидов, поскольку они являются основным источником рассеяния света, так и путем сопоставления показателя преломления (RI) объекта с RI раствора погружения образца во время визуализации. Затем свет может проходить через границу между материалами, не рассеиваясь 6,7,8,9.

Методы очистки тканей, такие как iDISCO+, часто сочетаются с быстрой 3D-визуализацией с использованием однофотонной микроскопии возбуждения, такой как LSFM ^6,7,10. Внутри прозрачных тканей, меченных флуорофором, светоплотная флуоресцентная микроскопия рисует участки путем возбуждения тонкой плоскостью света¹¹. Основным преимуществом LSFM является то, что одна оптическая секция освещается за один раз, при этом вся флуоресценция от молекул в этой секции возбуждается, что сводит к минимуму фотоотбеливание. Кроме того, визуализация всего оптического среза позволяет обнаруживать этот возбужденный срез на основе камеры, увеличивая скорость по сравнению с точечным сканированием¹². LSFM неразрушающе производит хорошо зарегистрированные оптические секции, которые подходят для 3D-реконструкции.

В то время как метод iDISCO+ позволяет провести недорогую очистку тканей в течение ~ 3 недель, этапы обезвоживания в рамках протокола могут привести к усадке ткани и потенциальному изменению морфологии образца, что влияет на объемные измерения ^6,10. Добавление вторичного метода визуализации, такого как МРТ, который будет использоваться до процедуры очистки тканей, может измерить степень усадки, вызванной очисткой тканей, по всему образцу. На этапах обезвоживания различия в механических свойствах между серым и белым веществом могут привести к неоднородным деформациям мозгового вещества, что приводит к неоднородным объемным деформациям, вызванным очисткой тканей, между образцами дикого типа и мутантами и может сбивать с толку интерпретации объемных различий в этих образцах^10,13 . МРТ выполняют путем сначала перфузии животного контрастным веществом (например, гадолинием), а затем инкубированием интересующей ткани в иммерсионном растворе (например, фомблине) перед визуализацией¹⁴. МРТ совместима с очисткой тканей и выполнением LSFM на одном образце.

LSFM часто используется для создания крупномасштабных микроскопических изображений для качественной визуализации интересующей ткани мозга, а не количественной оценки структуры мозга (рисунок 1). Без количественной оценки трудно продемонстрировать структурные различия, возникающие в результате генетических или экологических нарушений. По мере совершенствования технологий очистки тканей и визуализации, наряду с уменьшением затрат на хранение и вычислительную мощность, количественная оценка локализаций клеточного типа в интересующей ткани становится все более доступной, что позволяет большему количеству исследователей включать эти данные в свои исследования.

С более чем 100 миллионами клеток в мозге мыши¹⁵ и сеансами визуализации всего мозга, которые могут генерировать терабайты данных, существует повышенный спрос на передовые инструменты анализа изображений, которые позволяют точно количественно оценивать особенности в изображениях, такие как клетки. Существует множество методов сегментации для изображений, очищенных тканью, которые применяют пороговое значение для интенсивности ядерного окрашивания и фильтруют объекты с предопределенными формами, размерами или плотностями 10,16,17,18. Однако неточные интерпретации результатов могут возникать из-за различий в таких параметрах, как размер ячейки, контрастность изображения и интенсивность маркировки. В этой статье описывается наш установленный протокол для количественной оценки клеточных ядер в мозге мыши. Во-первых, мы подробно описываем шаги по сбору тканей мозга мыши P4, за которыми следует протокол очистки и иммуномаркировки тканей, оптимизированный из общедоступного метода iDISCO+¹⁰. Во-вторых, мы описываем получение изображений с помощью МРТ и световой микроскопии, включая параметры, используемые для захвата изображений. Наконец, мы описываем и демонстрируем NuMorph¹⁹, набор инструментов анализа изображений, разработанных нашей группой, которые позволяют количественно определять специфический клеточный тип после очистки тканей, иммуномаркировку ядерными маркерами и визуализацию аннотированных областей на световых листах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все мыши использовались в соответствии с и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл.

1. Рассечение и перфузия мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие вскрытия были выполнены на мышах P4 и P14 с использованием шприца. Объем перфузионной жидкости будет варьироваться в зависимости от возраста животного.

Перфузия
ВНИМАНИЕ: Параформальдегид (PFA) является опасным химическим веществом. Выполните все этапы перфузии в химическом вытяжном шкафу.
1. Перед операцией введите пентобарбитал с помощью внутрибрюшинной инъекции (100 мг / кг) и дайте анестетику вступить в силу.
2. После того, как животное достигло хирургической плоскости анестезии, используйте метод ответа на защемление пальцев ног, чтобы подтвердить невосприимчивость.
3. Сделайте боковой разрез под грудной клеткой, чтобы обнажить грудную полость животного.
4. Используя изогнутые, хирургические ножницы, аккуратно прорежьте грудную клетку до ключицы с одной стороны животного и сделайте идентичный разрез на противоположной стороне, позволив грудине оторваться, обнажив сердце.
5. Не повреждая нисходящую аорту, тщательно обрежьте любую ткань, связанную с сердцем, прежде чем сделать небольшой разрез в правом предсердии, чтобы позволить крови вытечь из сосудистой системы.
6. Используя метод на основе шприца, перфузируйте мышь через левый желудочек 10 мл и 7 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для P14 и P4, соответственно, со скоростью перфузии 1,5 мл / мин через систему.
7. Как только кровь очищена, снова перфьюируют 10 мл PBS + 4% PFA и 7 мл PBS + 4% PFA для P14 и P4, соответственно, при 4 °C со скоростью перфузии 1,5 мл / мин для фиксации животного.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Будет наблюдаться фиксация тремора, и животное будет жестким по завершении. При использовании МРТ на образцах перфузируйте с аналогичными объемами PBS и PFA для каждой временной точки + 20% контрастное вещество МРТ на основе гадолиния в растворе PFA.
8. Удаляют головку хирургическими ножницами и капельно-фиксируют PBS + 4% PFA в течение 24 ч при 4 °C для полной фиксации.
  ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе мозг остается нетронутым с черепом (см. Раздел 2). Точка паузы: мозг может храниться в течение нескольких месяцев на этом этапе в PBS + 0,1% азида натрия при 4 °C.

2. Визуализация грубой структуры мозга на основе МРТ с неповрежденным черепом и анализом

ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг должен быть перфузирован и инкубирован в гадолинии, как описано выше, без удаления из черепа. Все МРТ происходит до удаления мозга из черепа, чтобы избежать непреднамеренной потери тканей во время рассечения. Визуализация с неповрежденным черепом также обеспечивает поддержку мозга в держателе образца (т. Е. Шприце) во время подготовки образца и визуализации.

Пробоподготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги оптимизированы для образцов мозга мыши P4 и P14. Размер необходимого шприца будет зависеть от физического размера образца.
1. При выполнении МРТ на образце удаляют кожу из черепа и инкубируют в PBS + 3% гадолиния в течение 23 дней при 4 °C перед визуализацией¹⁴. Через 23 дня быстро промыть образцы в PBS.
2. Используйте шприцы 5 мл для создания держателя образца для МРТ, используя поршни шприца для закрытия каждого конца держателя, изготовленного с помощью шприца²⁰. Используйте пластиковые кусочки, чтобы плотно удерживать череп на месте в держателе (рисунок 2А). Удалите маркировку на шприце этанолом, чтобы предотвратить артефакты при визуализации.
3. Надежно поместите череп в держатель образца и заполните иммерсионным раствором, совместимым с МРТ (см. Таблицу материалов). Закройте держатель и удалите все пузырьки воздуха с помощью шприца.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Точка паузы: череп может храниться в растворе погружения в течение нескольких месяцев перед визуализацией.
Грубая визуализация структуры мозга (МРТ)
1. Изобразите образцы с помощью системы МРТ животных с горизонтальным отверстием 9,4 Тл/30 см с использованием объемной катушки 15 мм и последовательности на основе спин-эха со следующими параметрами: Пространственное разрешение: 60 мкм x 60 мкм x 60 мкм; общее время сканирования: 7 ч 12 мин; время эхо (TE): 6,83 мс; время повторения (TR): 40 мс; углы возбуждения/перефокусировки: 90/180 градусов; размер изображения: 166 х 168 х 209 вокселей; Поле зрения (FOV): 9,9 мм x 10,1 мм x 12,4 мм; полоса пропускания: 100 000 кГц.
Вычислительный анализ структуры мозга
1. Удалите окружающий череп из необработанных изображений МРТ, вручную отслеживая мозг мыши с помощью программного обеспечения сегментации. Затем примените операцию умножения вокселя между изображением маски и необработанным МРТ-изображением для создания изображения МРТ головного мозга с удалением черепа.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные данные представляют собой двоичное изображение маски, где интенсивность для вокселей мозга установлена на 1 и 0 в противном случае.
2. Примените жесткую регистрацию изображения (оценивая только трансляцию и вращение), используя «флирт» в пакете FSL^21,22, чтобы выровнять МРТ-изображение черепа (движущееся изображение) с соответствующим изображением микроскопии светового листа (эталонное изображение).
3. Применение нежесткой регистрации (с использованием "SyN" в программном обеспечении ANTS²³) для поиска точечных соответствий между жестко выровненным МРТ-изображением на этапе 2.3.2 и изображением светового листа (то же эталонное изображение на этапе 2.3.2).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные данные включают искаженное изображение МРТ и поле деформации, связанное с изменениями объема от МРТ до изображений светового листа.
4. Вычислите определитель Якоба на поле деформации, сгенерированном на шаге 2.3.3, который количественно определяет изменение объема в локальном окружении 3 x 3 x 3 вокселя.
5. Выровняйте изображения с черепом в атласе мозга мыши Allen Developmental с помощью деформируемой регистрации изображений.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Установленное пространственное соответствие точка-точка позволяет автоматически аннотировать области мозга, представляющие интерес, в новом изображении мыши (рисунок 2C-H).

3. Рассечение мозга из черепа

Сделайте разрез средней линии вдоль верхней части черепа от шеи до носа, чтобы обнажить череп.
Обнажите основание черепа, обрезав оставшуюся мышцу шеи и все другие остаточные мышцы.
Используя острые хирургические ножницы, аккуратно разрезайте вдоль внутренней поверхности черепа, заботясь о том, чтобы не повредить мозг, поддерживая мягкое давление вверх при резке острым хирургическим оборудованием.
Используйте пинцет, чтобы отклеить две разрезанные половины черепа от мозга и аккуратно отрезать лишний жир, прикрепленный к мозгу.
Используйте хирургические ножницы, чтобы обрезать любую твердую мозговую оболочку, которая соединяет мозг с черепом, а затем используйте шпатель, чтобы аккуратно удалить мозг из головы.
Удалите мозг, промойте PBS, а затем замените на PBS 0,1% азида натрия и держите при температуре 4 °C для длительного хранения.

4. Очистка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол адаптирован из протокола iDISCO+ для мышей P4⁶ с незначительными изменениями. Некоторые детали могут меняться для разных временных точек/видов/экспериментов). ВНИМАНИЕ: Метанол, дихлорметан (DCM) и дибензиловый эфир (DBE) являются опасными химическими веществами. Эти этапы очистки тканей выполняются в химическом вытяжном шкафу.

Проверка антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо проверить совместимость метанола с непроверенными антителами, поскольку на них могут негативно повлиять жесткие промывки метанола, требуемые протоколом iDISCO+. Список антител, которые, как было показано, работают в iDISCO+, см. на веб-сайте²⁴.
1. Соберите 10 мкм замороженных участков интересующей ткани, зафиксированной PFA, на стереологических слайдах.
2. Инкубировать срезы в 100% метаноле в течение 3 ч при комнатной температуре.
3. Регидратировать в PBS, прежде чем приступать к стандартным протоколам иммуногистохимии, чтобы определить, показывает ли антитело ожидаемую картину флуоресценции после промывки метанола. Для положительного контроля используйте слайд, не обработанный метанолом.
Подготовка буфера
1. Подготовьте буферы в соответствии с официальным протоколом iDISCO. См. Таблицу материалов для определения состава буферов и других растворов, используемых в этом протоколе.
Предварительная обработка
1. Обезвоживать образец метанолом/ПБС серией: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; 1 ч каждый при комнатной температуре.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Использование PBS во время обезвоживания помогает предотвратить растрескивание образцов в метаноловых промывках.
2. Промыть образец в 100% метаноле в течение 1 ч, а затем охладить при 4 °C в течение 1 ч перед инкубацией на ночь с встряхиванием в 66% DCM/33% метанола при комнатной температуре.
3. Промыть образец в 2 раза в 100% метаноле при комнатной температуре, а затем охладить его при 4 °C.
4. Используйте свежий 5% H_2O₂ в метаноле для отбеливания образца в течение ночи при 4 °C.
5. Регидратация образца метанолом/ПБС серий: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; 1 ч при комнатной температуре и промывка 2x в течение 1 ч в PTx.2 при комнатной температуре.
6. Инкубируйте образец в 1x PBS/0,2% TritonX-100/20% DMSO при 37 °C в течение ночи.
7. Инкубируйте образец в 1x PBS/0,1% Tween-20/0,1% TritonX-100/0,1% дезоксихолата/0,1% NP40/20% DMSO при 37 °C в течение ночи.
8. Стирать в PTx.2 при комнатной температуре в течение 1 ч дважды.
Иммуномаркировка
1. Инкубируйте образцы в растворе для пермеабилизации при 37 °C в течение 2 дней (~48 ч).
2. Заблокируйте образцы в блокирующем растворе при 37 °C в течение 2 дней (~48 ч).
3. Инкубировать образцы с первичным антителом в PTwH / 5% DMSO / 3% сыворотке при 37 °C в течение 4 дней (~ 96 ч) (например, антитела кролика (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1: 100) и антитела против Ctip2 крыс (Rt) (1: 400) (Таблица материалов).
4. Промыть 3 х 1 ч в PTwH. Промыть еще 2 ч в PTwH. Оставить в моющем растворе на ночь при комнатной температуре.
5. Инкубировать образцы со вторичным антителом и ядерным красителем, таким как TO-PRO-3, в PTwH / 3% сыворотке при 37 °C в течение 4 дней (~96 ч; например, козий анти-Rb(1:50) и (козий анти-Rt(1:200)) (Таблица материалов).
6. Промыть 3 х 1 ч в PTwH Промыть еще 2 ч в PTwH. Оставить в моющем растворе на ночь при комнатной температуре.
Очистка
1. Обезвоживание в серии метанол/ПБС - 20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 ч при комнатной температуре. Инкубировать в течение 3 ч, при встряхивании, в 66% DCM/33% метаноле при комнатной температуре.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Образец можно оставить на ночь при комнатной температуре сразу после обезвоживания в 100% метаноле.
2. Инкубировать в 100% DCM в течение 15 мин дважды при комнатной температуре (с встряхиванием) для промывки MeOH.
3. Инкубировать в дибензиловом эфире (ДБЭ) без встряхивания при комнатной температуре. Убедитесь, что трубка почти полностью заполнена DBE, чтобы предотвратить окисление образца. Закончите смешивание раствора, перевернув пару раз перед визуализацией.

5. Визуализация светового листа

ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенный тканью мозг iDISCO был сфотографирован с помощью светового микроскопа, оснащенного объективом 2X/0.5 NA, дополнительной полупроводниковой камерой из оксида металла и программным обеспечением для работы микроскопа и получения изображений при 0,75 x 0,75 x 4 мкм/воксел для временной точки P4, поскольку это позволяло использовать одноклеточное разрешение в коре головного мозга (рисунок 3A, B).

Монтаж образцов
1. Аккуратно установите образец в держатель образца правильного размера таким образом, чтобы образец был ориентирован с z-размерностью не более 5,2 мм в глубину из-за номинального рабочего расстояния светового листового микроскопа (5,7 мм минус запас прочности 0,5 мм)²⁵.
2. Поместите держатель в подставку для образцов винтом держателя под углом 45° к опорам люльки (рисунок 1B). Расположите колыбель так, чтобы световой путь был перпендикулярен образцу (рисунок 1С).
Параметры визуализации
1. Установите для корпуса зума на микроскопе 4-кратное увеличение или выше, дающее 0,75 мкм/пиксель.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Одноэлементный вычислительный анализ изображений P4 может быть выполнен с помощью любого коммерчески доступного светового микроскопа, который допускает разрешение 0,75 x 0,75 x 4 мкм/воксель или выше. Более низкое разрешение достаточно для мозга в более поздние моменты времени, в которых ядра более разрежены.
2. В программном обеспечении для получения изображений выберите один световой лист с NA = ~0,08 (толщина 9 мкм/шаг z 4 мкм).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Эта настройка в сочетании с горизонтальной динамической фокусировкой позволяет визуализировать весь мозг с одноклеточным разрешением мозга мыши в течение разумного времени. Для мозга на 4-й послеродовой день (P4) время получения изображения оценивается в 11-15 ч для трех каналов в зависимости от размера мозга.
3. Чтобы обеспечить поддержание осевого разрешения по ширине изображения, выберите «Горизонтальная динамическая фокусировка» и примените рекомендуемое количество шагов в зависимости от длины волны лазера. Для всего мозга мыши P4 установите горизонтальную динамическую фокусировку на 11. Настройте fine Focus для каждого канала по отношению к каналу регистрации.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь канал TO-PRO-3 (647 нм) зарегистрирован в Allen Developmental Mouse Brain Atlas, поскольку он маркирует все ядра.
4. Отрегулируйте мощность лазера на канал в соответствии со свойствами канала.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Более длинные волны требуют более высокой мощности лазера по сравнению с более короткими длинами волн. Например, 780 нм необходимо визуализировать при высокой мощности лазера (70% - 75%) и низкой экспозиции (50 мс), в то время как канал 647 нм требует средней мощности лазера (40% - 45%) и низкой экспозиции (50 мс).
5. Отрегулируйте ширину светлого листа до ~50% , чтобы обеспечить оптимальное распределение мощности листа в размере y для данного размера образца.
  ПРИМЕЧАНИЕ: В сочетании с горизонтальной динамической фокусировкой ширина листа 50% обеспечивает среднее распределение мощности по всему изображению с уменьшенным риском фотоотбеливания²⁵.
6. Установите количество плиток по отношению к размеру выборки с рекомендуемым перекрытием 15% между плитками и захватите изображения для каждого канала последовательно для каждого стека в заданном положении плитки.

6. Обработка изображений с помощью NuMorph

ПРИМЕЧАНИЕ: Конвейер NuMorph состоит из трех основных частей для анализа 3D-изображений: предварительная обработка, анализ и оценка. Эти части были организованы в NMp_template, NMa_template и NMe_template, соответственно, которые обсуждаются ниже. Кроме того, добавлен NM_setup.m для загрузки и установки пакетов программного обеспечения, необходимых для бесперебойной работы NuMorph. NM_samples.m также предоставляет шаблон для ввода информации о приобретении изображения.

Настройка NuMorph
1. Загрузите и установите диспетчер среды conda для Linux²⁶. Загрузите и установите инструменты обработки изображений NuMorph¹⁹ .
2. В командной строке запустите Matlab. Запустите NM_setup.m из NuMorph, чтобы загрузить и установить программные пакеты для анализа образов, необходимые для анализа.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг обеспечивает правильную настройку среды conda, а также правильную загрузку и установку всех инструментов и дополнений, необходимых Matlab для запуска каждого из трех конвейеров. Наиболее примечательными здесь являются Elastix для запуска регистрации и 3D-Unet для обнаружения и подсчета клеток.
Укажите имена образцов, входные и выходные каталоги, информацию о каналах и параметры изображения светового листа, отредактировав файл NM_samples.m.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь рекомендуется дважды проверить, чтобы убедиться, что правильная информация, особенно каталог ввода изображения, указана правильно. Ошибки обычно не вызываются здесь до выполнения последующих шагов.
Предварительная обработка изображений
1. Регулировка интенсивности
  1. В NMp_template задайте регулировку интенсивности = true.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите значение true, если требуется регулировка интенсивности. Если нет, установите регулировку интенсивности = false. Существует также возможность использовать 'update' для перезаписи предыдущих параметров настройки.
  2. Установить использовать обработанные изображения = false при работе с новым набором изображений. В противном случае укажите любые ранее сохраненные наборы данных изображений в выходном каталоге (например, «выровненные», «сшитые») для использования на последующих этапах обработки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта опция предоставляется в случае, когда входные изображения уже были предварительно обработаны. В этом случае в качестве входных изображений будут использоваться препроцессированные изображения, а опция будет установлена на имя подкаталога в выходном каталоге.
  3. Установите значение сохранить изображения = true.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование этой опции гарантирует, что обработанные изображения будут сохранены в выходном каталоге; в противном случае будут вычисляться и сохраняться только параметры.
  4. Задайте значение для сохранения образцов = true.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта опция гарантирует, что результаты выборки сохраняются для каждого основного шага.
  5. Установите параметр adjust tile shading = basic для применения коррекции затенения с помощью алгоритма BaSiC²⁷ или вручную для применения коррекции затенения плитки с помощью измерений из микроскопа светового листа при определенной ширине светового листа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот параметр корректирует неравномерное освещение вдоль размера y, вызванное формой талии листа.
2. Выравнивание канала изображения
  1. В NMp_template задайте выравнивание канала = true. Установите для этого параметра значение true, если требуется выравнивание каналов. Если нет, установите значение false. Задайте для метода выравнивания каналов либо трансляцию (жесткий), либо эластикс (нежесткий).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Метод трансляции использует жесткие подходы 2D-регистрации при выравнивании нескольких каналов, в то время как метод эластикса использует нежесткие B-сплайны²⁸ для коррекции вращательного дрейфа, который может произойти во время длительного захвата изображения¹⁹.
3. Итеративная сшивка изображений
  1. В NMp_template установите stitch images = true.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установите для этого параметра значение true, если требуется сшивание.
  2. Уточнение просеивателя множества = true.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот параметр используется для дальнейшего уточнения преобразования в xy с помощью Scale Invariant Feature Transform²⁹.
  3. Задайте параметры выравнивания нагрузки = true.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта опция использует трансляции выравнивания каналов во время сшивания. Этот вариант рекомендуется использовать при многоканальной визуализации. В противном случае задайте значение false.
  4. Установите значение перекрытия = 0,15 для сопоставления перекрытий плиток во время обработки изображений.
4. Чтобы выполнить любой из этих шагов предварительной обработки, выполните следующие действия в Matlab вне среды NMp_template:
  1. Укажите имя образца. Set config = NM_config(процесс;образец).
  2. Выполните любой из шагов предварительной обработки, указав NM_process(config,stage) и укажите этап, используя интенсивность, выравнивание или сшивание для любого из процессов. Проверьте выходной каталог на наличие выходных файлов для каждого из этапов (рисунок 3 и рисунок 4).
Анализ изображений
1. До NuMorph
  1. Начните с 3D-изображения атласа и связанного с ним изображения аннотации, которое присваивает каждый воксель определенной структуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется атлас мозга мыши P4 Allen Developmental, созданный на основе MagellanMapper³⁰ .
  2. Выровняйте изображение атласа и файл аннотации, чтобы убедиться, что они правильно совпадают в правильной ориентации.
2. В городе НуМорф
  ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь, когда атлас и его аннотации выровнены правильно, файлы должны быть «обработаны» или обработаны в NuMorph, чтобы их можно было сохранить для последующего использования. Для этого используйте функцию munge_atlas для указания входных данных, как показано ниже.
  1. Укажите Atlas_file: (строка). Укажите полный путь к файлу атласа.
  2. Укажите Annotation_file: (строка). Укажите полный путь к связанным аннотациям.
  3. Укажите разрешение: (1x3 числовым). Укажите разрешение атласа y,x,z как микрон на пиксель.
  4. Укажите ориентацию: (1 x 3 символа). Обеспечьте ориентацию атласа и убедитесь, что он соответствует расположению образца в люльке (передний(a)/задний(p),верхний(s)/нижний(i),левый(l)/правый(r)).
  5. Укажите полушарие: укажите, какое полушарие мозга было изображено («левое», «правое», «оба», «нет»).
  6. Укажите out_resolution:(int). Укажите изотропное разрешение вывода атласа в микронах. (по умолчанию: 25).
  7. Выполните команду «munge_atlas(atlas_file, annotation_file, разрешение, ориентация, полушарие)», чтобы создать рукописные аннотации в /data/annotation_data и копию изображения атласа в /data/atlas.
  8. Прочитайте структуру Matlab и файл атласа, чтобы убедиться, что оба файла правильно обработаны в правильной ориентации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный этап классификации клеток может быть выполнен для количественной оценки типов клеток на основе совместной локализации иммуномаркированных белковых маркеров.
3. Пересчета
  1. В NMa_template задайте значение ресамплинга изображений = true, если выполняется регистрация изображений для ссылки на атлас или для создания понижаемых объемов наборов данных с высоким разрешением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: NMa_template.m будет использоваться для установки параметров для ресамплинга, регистрации, обнаружения ядер и подсчета клеток.
  2. Установите разрешение ресамплинга в соответствии с атласом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется изотропное разрешение 25 мкм³/воксель, поскольку справочный атлас находится на этом разрешении.
  3. Укажите номер канала для ресамплинга с помощью каналов ресамплинга = [ ].
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь номер канала устанавливается в соответствии с ядерным каналом. Если этот параметр пуст, будет ресамплирован только канал регистрации.
4. Регистрация
  1. В NMa_template задайте значение регистровых изображений = true. Установите значение true, если требуется регистрация. Если нет, задайте значение registration = false.
  2. Укажите файл атласа, соответствующий файлу в каталоге атласа.
  3. Задайте параметры регистрации = по умолчанию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот вариант использует аффину, за которой следует сплайн-преобразование B, для оценки пространственного соответствия. В противном случае определите новый набор регистрационных параметров через Elastix в /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
  4. Установите значение сохранить зарегистрированные изображения = true.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные файлы регистрации и ресамплинга могут быть загружены и визуально проверены в Matlab или других инструментах визуализации, таких как FIJI³¹.
5. Обнаружение ядер, подсчет и классификация клеток
  ПРИМЕЧАНИЕ: Ошибки, возникающие здесь, могут быть вызваны неправильным указанием файла аннотаций или несоответствием возраста образца правильной аннотации.
  1. В NMa_template задайте количество ядер и классифицируйте клетки = true.
  2. Метод set count = 3dunet.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта опция позволяет использовать обученную модель 3D-Unet¹⁹. В противном случае выберите гессенский, который использует гессенский метод обнаружения больших двоичных объектов.
  3. Установите min_intensity , чтобы определить минимальное пороговое значение интенсивности для обнаруженных объектов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соответствующий порог определяется эмпирически на основе отношения сигнал/шум ядерной маркировки.
  4. Установите classify_method любое пороговое значение, которое основано на неконтролируемой интенсивности флуоресценции в центроидных положениях или svm, который моделирует контролируемый линейный классификатор машины опорных векторов (SVM).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг классифицирует все обнаруженные клетки на четыре основных класса с 3-канальной визуализацией. С помощью этого протокола генерируются Ctip2⁺/Brn2^-, Ctip2^-/Brn2⁺, Ctip2^-/Brn2^- и Выбросы.
6. Этапы анализа
  1. Укажите имя образца. Set config =NM_config(analyze,sample).
  2. Выполните любой из этапов анализа, указав NM_analyze(config,stage) и укажите этап с помощью ресамплинга, регистрации, подсчета или классификации. Проверьте выходной каталог на наличие выходных файлов для каждого из этапов (рисунок 5).
7. Классификация по типам клеток и групповой анализ
  1. В NMe_template задайте значение update = true и перезапишите всю предыдущую рассчитанную статистику.
    ПРИМЕЧАНИЕ: NMe_template.m предоставляет возможность выполнять групповой анализ клеточного типа в областях мозга одного и того же анализируемого мозга.
  2. Установите compare_structures_by индекс для сравнения по всем уникальным аннотациям или таблицу для сравнения структур в соответствии с таблицей.
  3. Задайте template_file, который задает все возможные индексы структуры и должен существовать в /annotations.
  4. Задайте structure_table и укажите структуры для оценки.
  5. Укажите подсчет ячеек и классификацию типов ячеек, как описано в NMa_template.м.
  6. Установите compare_groups , чтобы указать группы для сравнения.
  7. Установите значение true или false для выполнения парного t-теста или t-теста с двумя образцами.
8. Запустите анализ.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы выполнить этот шаг, выполните следующее в Matlab вне среды NMe_template.m.
  1. Укажите имя образца. Set config =NM_config(evaluate;sample).
  2. Выполните этап анализа, указав NM_evaluate(config,stage) и укажите этап. Проверьте выходной каталог на наличие выходных файлов для группового анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Поскольку протокол iDISCO+ вводит значительную усадку тканей, которая легко заметна на глаз (рисунок 2B), мы добавили этап МРТ в этот конвейер перед очисткой ткани, чтобы количественно оценить усадку, вызванную очисткой ткани. Рабочий процесс начинается с удаления немозговой ткани из МРТ-изображения (рисунок 2C). Затем применяется жесткое преобразование (3 трансляции и 3 угла поворота) для выравнивания МР-изображения по изображению светового листа (рисунок 2D). Таким образом, мы наблюдали 60% общую потерю объема, вызванную процедурой очистки тканей (рисунок 2E), что соответствовало оценкам изменения объема на глаз (рисунок 2B). Этот результат сильно отличается от предыдущего отчета, где сообщалось о сокращении на 5-10%^10,32. Разница в усадке может быть вызвана разницей в возрасте животных между двумя исследованиями (P4 против мозга взрослого человека) или из-за разницы во времени промывки метанола на этапе очистки протокола iDISCO+ (16 ч против 2 ч). Чтобы отобразить степени усадки тканей в разных областях мозга, мы дополнительно развернули деформируемую регистрацию изображения, где изображение светового листа используется в качестве эталона. Зарегистрированное МР-изображение показано на рисунке 2F). Предполагаемое изменение объема из-за процедуры очистки тканей имеет цветовую кодировку, где в коре наблюдается большая степень сжатия по сравнению с другими областями мозга (рисунок 2G).

Для измерения объемов областей мозга мы выполнили сегментацию МРТ путем регистрации в аннотированном атласе. Сегментация мозга с МРТ-изображением считалась успешной, если наложение эталонного атласа близко соответствовало анатомическим границам, идентифицированным различиями в контрасте в необработанных изображениях МРТ (рисунок 2H). Наложение во время регистрации зависит от хорошей пробоподготовки (рисунок 2A), получения изображения и удаления черепа. Этап удаления черепа имеет решающее значение для хороших результатов регистрации, поскольку регистрация будет пытаться деформировать эталонное изображение из атласа ко всему изображению MR, включая любой череп, который остается на изображении. Включение черепа в регистрацию может исказить результаты и привести к неправильно зарегистрированному 3D объемному рендерингу сегментации. Окончательный объемный 3D-рендеринг можно визуализировать с помощью ITK-SNAP³³ (рисунок 2H). Этот метод используется для оценки общих различий в объеме мозга между выборочными группами. Клеточная основа, лежащая в основе объемных различий, обнаруженных с помощью МРТ, может быть использована с помощью подсчета клеток с очисткой тканей, микроскопии световых листов и NuMorph.

Целью очистки и анализа тканей является оценка вклада различных типов клеток в различия в экспериментальных условиях (например, генотип, воздействие окружающей среды) путем подсчета отдельных ядер с использованием NuMorph. Очистка тканей с использованием протокола iDISCO+ и маркеров ядер нейронного слоя привела к четко определенным клеточным группам нейронов верхнего и нижнего слоя в изокортексе (рисунок 3).

Подсчет ячеек с помощью NuMorph зависит от успешных этапов предварительной обработки, включающих настройку интенсивности, выравнивание каналов и сшивание (рисунок 4A). Ошибки, возникающие на любом из этих шагов, могут привести к неправильному сшиванию (рисунок 4B, C). Например, неправильное получение изображения может привести к появлению изображений с шаблонами фокуса и фокусировки во время предварительной обработки (рисунок 4C). Чтобы подсчитать ядра из определенных областей мозга, сшитые изображения аннотируются с использованием общедоступного атласа. Мы зарегистрировали наши сшитые изображения в исправленной версии P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas³⁴. Здесь сшитые изображения были понижены с высокого разрешения (0,75 x 0,75 x 4 мкм³/воксель) до более низкого разрешения (изотропное разрешение 25 мкм³/воксель), чтобы соответствовать разрешению атласа. Соответствие разрешения атласа обеспечивает правильную регистрацию изображений в атласе и обеспечивает региональные аннотации в полученных изображениях (рисунок 5А).

Для выполнения специфического подсчета клеточного типа мы пометили нейроны верхнего слоя, экспрессирующие Brn2, нейроны нижнего слоя, экспрессирующие Ctip2, и все ядра TO-PRO-3 (рисунок 3B). Визуализация выполняется при достаточном пространственном разрешении для разделения отдельных ядер (0,75 x 0,75 x 4 мкм³/воксель). Центроиды ядер обнаруживаются с помощью обученной модели 3D-Unet в NuMorph (рисунок 5B, C). Мы обнаружили ~ 12 × 10⁶ общих ядер, которые были To-Pro-3 ⁺ в изокортексе, в том числе ~ 2,6 × 10⁶ Brn2 ⁺ и 1,6 × 10⁶ Ctip2 ⁺ ядер. Мы также обнаружили ~ 3,7 × 10⁶ и 2,9 × 10⁶ to-Pro-3⁺ общих ядер в базальных ганглиях и аллокорте гиппокампе соответственно. Приблизительно 1,5 × 10⁶ и <1 × 10⁶ клеток Ctip2⁺ были подсчитаны в базальных ганглиях и аллокорте гиппокампа соответственно, хотя было обнаружено незначительное количество клеток Brn2⁺ (рисунок 5D). Общее количество ядер в изокортексе и аллокортезе гиппокампа вместе взятых (~ 15 миллионов клеток) аналогично ранее сообщенному общему количеству клеток в коре головного мозга мыши¹⁵. Эти результаты демонстрируют полезность МРТ-визуализации, методологии очистки тканей iDISCO+ и вычислительного анализа NuMorph для выявления объемных, общих количеств клеток и специфических подсчетов клеточного типа, лежащих в основе различий в структуре мозга мыши в экспериментальных группах.

Рисунок 1: Обзор анализа одноклеточных клеток всего мозга неповрежденной неонатальной 3D-ткани очищенного мозга мыши. (A) Обзор очистки тканей iDISCO+, визуализации световых листов и анализа 3D-изображений. (B) Изображения, показывающие правильное крепление образца на световом микроскопе. (C) Карикатура, показывающая монтаж образца относительно траектории светового листа. Аббревиатура: ab = антитело. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Измерения структуры мозга с помощью МРТ. (А) Изображение, показывающее подготовку образца к МРТ. (B) Изображения репрезентативного мозга P4 до и после очистки тканей iDISCO+. Шкала = 5,0 см. (C) Необработанное МР-изображение с прикрепленным черепом размером 60 x 60 x 60 мкм³. Шкала = 800 мкм. (D) Световое изображение мозга мыши при 25 x 25 x 25 мкм³. Общий объем = 68,7 мм³. Обратите внимание, что небольшой участок дорсальной изокортекса был непреднамеренно удален во время рассечения, отмеченный наконечником стрелки (белым). Шкала = 800 мкм. (E) МР-изображение мозга мыши после удаления черепа и жесткой регистрации. Общий объем = 171,9 мм³. Вставка (желтый) показывает контур мозга из изображения светлого листа. Шкала = 800 мкм. (F) Зарегистрированное МР-изображение по отношению к изображению светового листа для оценки деформации. Шкала = 800 мкм. (G) Воксельное картирование мозга для оценки изменений объема между изображением светового листа и МРТ-изображением, где синий и красный указывают на усадку и расширение от МР-изображения к изображению светового листа соответственно. В целом наблюдалась потеря объема на 60%, но некоторые регионы, такие как изокортекс, показали большую усадку по сравнению с другими. (H) Левая панель: осевой вид изображения МРТ с зарегистрированными сегментациями из атласа мозга развития Аллена. Правая панель: 3D объемный рендеринг сегментации. Шкала = 800 мкм. Сокращения: OB = обонятельная лампа; Dpall = дорсальный паллий/изокортекс; Mb = средний мозг; Cb = мозжечок. Ориентация: R = Рострал; L = латеральный; D = дорсальный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Изображения клеточного разрешения и выравнивание каналов. (A) Оптический осевой участок ядерного окрашивания TO-PRO-3 (TP3) и иммуномаркировка для маркеров Ctip2 (нейрон нижнего слоя) и Brn2 (нейрон верхнего слоя) в мозге мыши P4. Шкала = 1 мм. (B) Увеличенная вставка корковых областей в A (коробке), показывающая правильное выравнивание каналов с ожидаемой локализацией Brn2-иммуномаркированного верхнего слоя и Ctip2-иммуномаркированных нейронов нижнего слоя. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Примеры сшивания изображений. (A) Результаты выборки из 2D-итеративного, правильно сшитого изображения. Шкала = 1 мм. Вставка показывает пример правильного сшивания, увеличенного в увеличенном масштабе. Шкала = 500 мкм. (B) Выборка получена из 2D-итеративного, неправильно сшитого изображения. Шкала = 1 мм. Вставка показывает пример неправильного сшивания, увеличенного (свеса). Шкала = 100 мкм. (C) Выборка получена из 2D-итеративного неправильно сшитого изображения. Шкала = 1 мм. Вставка показывает пример неправильного сшивания, увеличенного (без фокуса). Шкала = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Регистрация изображений с низким разрешением, обнаружение ядер высокого разрешения и подсчет клеток в мозге мыши P4. (A) Левая панель: пример z-среза из 3D-изображений всего мозгового светового листа, ресамплированных до изотропного разрешения 25 мкм. Шкала = 1 мм. Средняя панель: Аннотации из Атласа мозга Аллена (P4), зарегистрированные на изображении микроскопии. Шкала = 1 мм. Правая панель: наложение левой и средней панелей. Шкала = 1 мм. (B) Пример сшитого изображения с поправкой интенсивности в осевом представлении. Область в коробке отображается в (C). Шкала = 1 мм. (C) Автоматическое обнаружение ядер (красный). Шкала бара = 50 мкм. (D) Количественная оценка типов клеток в различных областях мозга P4 мозга (базальные ганглии, гиппокампальная аллокортекса и изокортекс). Красный = нейроны верхнего слоя, помеченные Brn2, зеленый = нейроны нижнего слоя, помеченные Ctip2, и синий = все ядра, помеченные красителем To-Pro-3. Сокращения: DPall = дорсальный паллиум (изокортекс); MPall = Медиальный паллиум (гиппокампальный аллокортекс); CSPall = Центральный субпаллий (классические базальные ганглии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Этап анализа NuMorph	Расчетное время
Регулировка интенсивности	1 ч
Выравнивание каналов	2 мин
2D итеративная строчка	12 ч
Пересчета	3 мин
Регистрация	3 мин
Подсчет ячеек	5 ч
Классификация клеток	10 мин

Таблица 1: Время анализа NuMorph.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы очистки тканей являются полезными методами измерения 3D-клеточной организации мозга. Существует множество методов очистки тканей, описанных в литературе, каждый со своими преимуществами и ограничениями 6,7,8,9. Возможности вычислительных инструментов для анализа типов клеток на изображениях, очищенных тканью, относительно ограничены. Другие доступные инструменты были реализованы для разрежения клеточных популяций, в которых сегментация менее сложна^10,35 или которые воспользовались расширением^{тканей 16}. В этой статье описывается подготовка мозга мыши к визуализации с помощью очистки тканей iDISCO+ и демонстрируется NuMorph, вычислительный конвейер для обработки и количественной оценки ядер в структурах коры головного мозга мыши, захваченных LSFM. Он предназначен для достижения соответствующего баланса между продолжительностью времени визуализации, точностью обнаружения клеточных ядер и вычислительными ресурсами. Этот конвейер контрастирует с другими доступными в настоящее время инструментами, надежно сегментируя все ядра, а не разреженные популяции меченых клеток 10,36,37. Ранее мы показали, что точность обнаружения клеток высока, со значительно более коротким временем визуализации и значительно уменьшенными размерами полученных данных для сбора всего полушария по сравнению с другими методами¹⁹. NuMorph решает ряд важных задач для анализа многоканальных изображений световых листов, таких как предоставление инструментов для выравнивания каналов, коррекция движений сцены с помощью инструмента сшивания и коррекция яркости сигнала в плитках изображения. Рабочий процесс, представленный в этой статье, полезен для более широкого научного сообщества и доступен для всех групп в научно-исследовательских учреждениях. Обзор процесса можно увидеть на рисунке 1.

На протяжении всего этого процесса существует несколько критических этапов от перфузии мыши до вычислительного анализа, который может повлиять на последующее качество изображений, количественную оценку и результаты. Важно, чтобы перфузия была выполнена таким образом, чтобы вся кровь была удалена из мозга, так как кровеносные сосуды имеют естественную автофлуоресценцию, которая будет влиять на интенсивность на изображениях и потребует корректировок в конвейере, отрицательно влияя на результаты. Продолжительность фиксации PFA также имеет решающее значение, так как погружение мозга в 4% PFA на срок более 24 ч может привести к «перефиксации» образца и привести к растрескиванию мозга, который становится хрупким во время процесса iDISCO+. Протокол iDISCO, описанный выше, был немного изменен по сравнению с официальным протоколом, найденным на веб-сайте²⁴. Одним из важных изменений является добавление PBS в серию метанола/PBS вместо воды в первоначальном протоколе. Это делается для предотвращения корковых трещин в эмбриональном и раннем постнатальном мозге, что, вероятно, происходит из-за неполного развития глиальных клеток, аксональных проекций и внеклеточного матрикса. В зависимости от ткани, используемой в этом протоколе, на каждом этапе протокола iDISCO+, возможно, потребуется внести изменения, такие как изменение концентраций антител и увеличение времени инкубации более крупных образцов тканей, чтобы оптимизировать идеальные параметры для захвата маркера выбора и его точного анализа.

Известно, что усадка тканей происходит во время процесса очистки тканей iDISCO+, который затем может изменить объемные измерения после ^6,10. Альтернативные методы, такие как МРТ, проводимая до очистки тканей, могут быть использованы для определения степени любого изменения размера ткани в контрольной группе по сравнению с экспериментальными животными, чтобы определить, обусловлены ли какие-либо объемные различия изученным фенотипом, а не процессом очистки тканей. Гетерогенные изменения в объемах корковых областей мутантов могут отличаться в зависимости от регионального клеточного содержания, так как серое и белое вещество мозга может дифференцированно влиять на обезвоживание метанола. Данные МРТ могут быть использованы для определения того, является ли усадка тканей неравномерной во всех субрегионах мозга (рисунок 2G), и любые изменения, внесенные протоколом очистки, могут быть скорректированы в последующем вычислительном анализе. Кроме того, процесс iDISCO+ использует жесткие метаноловые промывки для обезвоживания образца, что может привести к повреждению или изменению определенных антигенов на поверхностях ядер. Рекомендуется, чтобы любые используемые антитела сначала тестировались на участках ткани мозга, которые были промыты в течение ~ 3 ч в 100% метаноле, чтобы убедиться, что антитело совместимо с протоколом iDISCO+.

Для больших наборов данных, требующих длительного времени обработки, мы рекомендуем использовать безоконную версию MATLAB в Linux, которая позволяет реализовать такие стратегии, как реализация команды «nohup», которая будет продолжать выполнять процесс даже после потери соединения с сервером. Кроме того, NuMorph требует высокой вычислительной мощности, поэтому мы рекомендуем не менее 10 ГБ памяти для анализа. Мы анализируем образцы с помощью рабочей станции Linux под управлением CentOS 7, которая оснащена 14-ядерным процессором 2,6 ГГц, 8 x 64 ГБ памяти DDR4 2400 LRDIMM, 4 x 11 ГБ gpuus и 2 x 4TB внешних SSD. Исходные данные светового листа, используемые здесь, составляли 620 ГБ, а потребность в памяти для процессов составляла 10 ГБ. Здесь мы включили таблицу с расчетным временем для завершения каждого этапа анализа NuMorph, как показано в таблице 1.

Этапы предварительной обработки изображения включают настройку интенсивности в измерении xy для каждой z-плоскости, выравнивание каналов и сшивание. Интенсивность изображения регулируется с учетом различий в интенсивности между плитками и неравномерного освещения вдоль Y-измерения. Разница в интенсивности возникает из-за присущих световому листу технических свойств, так как он изображен между плитками²⁵. Затем выполняется выравнивание каналов для обеспечения правильного выравнивания каналов изображения в многоканальном изображении. Этот шаг рекомендуется, поскольку каждый канал в многоканальной визуализации приобретается индивидуально, а тонкие движения стадии могут вызвать дрейфы образца и привести к пространственному смещению¹⁹. Наконец, плитки на z-плоскости затем сшиваются вместе, чтобы сформировать одно изображение в каждой z-плоскости. В итоге получится стопка сшитых изображений на канал, представляющих весь объем образца. Итеративное сшивание изображений основано на пользовательском методе организации всех 2D-изображений на канал в 3D-томе образца¹⁹. Метод сначала реализует попарное z-соответствие в осевом направлении для сопоставления областей плитки, которые перекрываются как в горизонтальном, так и в вертикальном направлении. Окончательное z-смещение каждой плитки определяется с использованием минимального связующего дерева³⁸. 2D итеративная сшивка выполняется в стеке, начиная с места в центре стека с меньшим фоновым сигналом. Верхняя левая плитка размещается первой для каждой итерации сшивания, чтобы предотвратить тонкое смещение изображений в измерении z.

Рекомендуется запускать каждый конвейер предварительной обработки последовательно, особенно при оптимизации для исправления ошибок. Основные проблемы часто возникают на этапах сшивания. Одной из проблем, которая может возникнуть, является неправильное получение изображения на световом листе. Эта проблема может возникнуть, когда горизонтальная динамическая фокусировка неправильно установлена на световом листе и может привести к чередованию внутрифазных /внефазовых паттернов на изображениях (рисунок 4B, C). Дополнительные ошибки могут возникнуть, если образец не был плотно закреплен, и во время сбора произошло значительное движение образца. В этих случаях точное сшивание может быть невозможным из-за отсутствия попарного соответствия между соседними плитками. Другие потенциальные ошибки могут быть связаны с местом старта стежка. NuMorph определяет начальную площадку стежка примерно в середине стека. Однако при наличии значительного фона на начальном сайте фрагмента могут возникать ошибки при попарном сравнении на плитках изображений. Здесь рекомендуется выбирать стартовую площадку, которая имеет высокое отношение сигнал/шум.

Анализ изображений, описанный здесь, включает в себя ресамплинг сшитых изображений с высоким разрешением (0,75 x 0,75 x 4 мкм³/воксель) до более низкого изотропного разрешения 25 мкм³/воксель. Мы ресамплируем сшитые изображения из ядерного канала, чтобы зарегистрировать сшитые изображения в атлас мозга мыши Аллена на следующем шаге³⁴. Затем ячейки подсчитываются для каждого канала в аннотированных областях изображений со ссылкой на атлас с высоким разрешением (0,75 x 0,75 x 4 мкм³/воксель) с использованием обученной модели 3D-Unet¹⁹. Этот метод также можно использовать для обнаружения и подсчета объектов больших двоичных объектов. При разработке NuMorph мы проверили точность сегментации относительно совершенно новых изображений, никогда не встречавшихся во время обучения, которые были из той же процедуры очистки тканей, того же микроскопа и той же точности обнаружения ядерной метки 0,99 и отзыва 0,94¹⁹. Точность NuMorph еще не проверялась на различных процедурах очистки тканей, микроскопах или маркерах; следовательно, точность сегментации в других экспериментальных проектах неизвестна. Атласом по умолчанию в NM_setup.м. является взрослый Ссылочный атлас Аллена³⁹ с третьей итерацией общей координатной структуры мозга мыши Аллена (CCFv3) в качестве пользовательской аннотации.

Хотя NuMorph эффективно анализирует ткани, которые являются сравнительно плотными, такими как кора взрослых мышей, более сложные экспериментальные проекты (такие как эмбриональный мозг мыши или очень плотные структуры, такие как мозжечок) могут потребовать разработки дополнительных вычислительных инструментов. В настоящее время усилия на уровне общин направлены на получение адекватных данных аннотаций для обучения моделей глубокого обучения, используемых для сегментации этих более сложных случаев⁴⁰. Достижения в технологиях визуализации световых листов позволяют проводить высокопроизводительное количественное исследование субклеточных структур с новыми подходами, такими как инвертированная селективная плоская микроскопия с двойным видом (diSPIM), что приводит к увеличению разрешения и точности в клеточно-плотных областях мозга^40,41. По мере развития достижений в области очистки тканей, визуализации и вычислительных инструментов, участвующих в этом исследовании, мы надеемся, что они приведут к более широкому использованию методов очистки тканей для количественного анализа того, как нервно-психические расстройства могут быть вызваны изменениями в структуре мозга, вызванными генетическими или экологическими факторами риска.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана NIH (R01MH121433, R01MH118349 и R01MH120125 для JLS и R01NS110791 для GW) и Фондом надежды. Мы благодарим Пабло Ариэля из Лаборатории микроскопических услуг за помощь в визуализации образцов. Лаборатория услуг микроскопии в отделении патологии и лабораторной медицины частично поддерживается грантом первичной поддержки Онкологического центра P30 CA016086 Университету Северной Каролины (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Ядро нейробиологической микроскопии поддерживается грантом P30 NS045892. Исследование, о котором сообщается в этой публикации, было частично поддержано грантом институциональной поддержки Биотехнологического центра Северной Каролины 2016-IDG-1016.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H₂O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H₂O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H₂O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
iDISCO method. , Available from: https://idisco.info/ (2022).
Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).
Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022).
Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104 (2020).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
ITK-SNAP home. , Available from: http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php (2022).
Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

Neuroscience

Одноклеточная визуализация всего мозга и анализ интактного мозга новорожденных мышей с использованием МРТ, очистки тканей и микроскопии световых листов

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.