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Neuroscience

MRI, 조직 투명화 및 라이트 시트 현미경을 사용한 온전한 신생아 마우스 뇌의 전뇌 단일 세포 이미징 및 분석

Published: August 1, 2022 doi: 10.3791/64096
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 3, 3,7, 7, 4,5,6, 4,5,6, 3, 4,5,6, 1,2
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

Summary

이 프로토콜은 iDISCO+를 사용하여 온전한 마우스 뇌의 자기 공명 영상, 제거 및 면역 표지를 수행하는 방법을 설명한 다음, 라이트 시트 현미경을 사용한 이미징 및 NuMorph를 사용한 다운스트림 분석에 대한 자세한 설명을 설명합니다.

Abstract

조직 투명화 후 라이트 시트 현미경(LSFM)을 통해 온전한 뇌 구조의 세포 분해능 이미징이 가능하여 유전적 또는 환경적 섭동으로 인한 구조적 변화를 정량적으로 분석할 수 있습니다. 전뇌 영상은 세포의 보다 정확한 정량화와 물리적으로 절단된 조직의 일반적으로 사용되는 현미경으로는 놓칠 수 있는 영역별 차이에 대한 연구를 가능하게 합니다. 라이트 시트 현미경을 사용하여 맑은 뇌를 이미지화하면 컨포칼 현미경에 비해 획득 속도가 크게 향상됩니다. 이러한 이미지는 매우 많은 양의 뇌 구조 데이터를 생성하지만 제거 된 조직의 이미지에서 특징 정량화를 수행하는 대부분의 계산 도구는 모든 핵이 아닌 희소 세포 집단을 계산하는 것으로 제한됩니다.

여기에서는 분석 도구 그룹인 NuMorph(핵 기반 형태 측정법)를 시연하여 라이트 시트 현미경으로 투명화 및 이미징한 후 출생 후 4일차(P4) 마우스 뇌의 주석이 달린 영역 내의 모든 핵과 핵 마커를 정량화합니다. 조직 제거 탈수 단계로 인한 수축 전에 뇌 부피를 측정하는 자기 공명 영상 (MRI), 면역 표지를 포함한 iDISCO + 방법을 사용한 조직 청소, 상용 플랫폼을 사용하여 세포 해상도로 마우스 뇌를 이미지화하는 라이트 시트 현미경에 대해 설명합니다. 그런 다음 강도 차이를 수정하고, 이미지 타일을 연결하고, 여러 채널을 정렬하고, 핵을 계산하고, 공개적으로 사용 가능한 지도책에 등록을 통해 뇌 영역에 주석을 추가하는 데 사용되는 NuMorph를 사용하여 이 이미지 분석 파이프라인을 시연합니다.

우리는 공개적으로 사용 가능한 프로토콜과 소프트웨어를 사용하여 이 접근 방식을 설계하여 필요한 현미경과 계산 리소스를 가진 모든 연구원이 이러한 기술을 수행할 수 있도록 했습니다. 이러한 조직 청소, 이미징 및 계산 도구를 사용하면 피질에서 세포 유형의 3차원(3D) 조직을 측정하고 정량화할 수 있으며 모든 야생형/녹아웃 마우스 연구 설계에 널리 적용할 수 있어야 합니다.

Introduction

단일 세포 분해능의 전체 뇌 영상은 신경 과학에서 중요한 과제입니다. 세포 해상도 뇌 이미지는 뇌 회로에 대한 상세한 분석 및 시스템 수준 매핑과 신경 정신 장애에 대한 유전 적 또는 환경 적 위험 요소, 발달중인 배아의 세포 행동 및 성인 뇌의 신경 회로 1,2,3에 의해 회로가 어떻게 파괴되는지를 허용합니다. 재구성 된 3D 뇌의 고해상도 이미지를 허용하는 여러 조직 학적 방법이 있습니다. 그러나 이러한 기술은 값 비싸고 전문화 된 장비가 필요하며 면역 표지와 호환되지 않을 수 있으며 일부 방법의 2 차원 (2D) 특성으로 인해 절편 4,5 동안 조직 손상 및 전단이 발생할 수 있습니다.

최근의 발전은 조직 절편이 필요하지 않은 전체 뇌를 영상화하는 대안적인 접근 방식을 제공했습니다. 그들은 뇌를 투명하게 만들기 위해 조직 청소를 사용하는 것을 포함합니다. 대부분의 조직 투명화 방법에서 지질은 광산란의 주요 원인이기 때문에 지질을 제거하고 이미징 중에 물체의 굴절률(RI)을 샘플 액침 용액의 RI와 일치시킴으로써 달성됩니다. 빛은 산란되지 않고 물질 사이의 경계를 통과 할 수 있습니다 6,7,8,9.

iDISCO+와 같은 조직 투명화 방법은 종종 LSFM 6,7,10과 같은 단일 광자 여기 현미경을 사용하는 신속한 3D 이미징과 결합됩니다. 형광단으로 표지된 투명한 조직 내에서, 얇은 광면(11)을 사용한 여기(여기)에 의한 광시트 형광 현미경 이미지 절편. LSFM의 주요 장점은 한 번에 하나의 광학 섹션이 조명되고 해당 섹션 내의 분자에서 나오는 모든 형광이 여기되어 광퇴색을 최소화한다는 것입니다. 더욱이, 전체 광학 슬라이스를 이미징하는 것은 그 여기 슬라이스의 카메라 기반 검출을 가능하게 하여, 포인트 스캐닝(12)에 비해 속도를 증가시킨다. LSFM은 3D 재구성에 적합한 잘 등록된 광학 섹션을 비파괴적으로 생산합니다.

iDISCO+ 방법은 ~3주 이내에 저렴한 조직 청소를 가능하게 하지만, 프로토콜 내의 탈수 단계는 조직 수축 및 샘플 형태의 잠재적 변화로 이어질 수 있으므로 체적 측정에 영향을 미칠 수 있습니다6,10. 조직 투명화 절차 전에 사용되는 MRI와 같은 2차 이미징 방법을 추가하면 샘플 전체에 걸쳐 조직 투명화 유도 수축 정도를 측정할 수 있습니다. 탈수 단계에서 회백질과 백질 사이의 기계적 특성의 차이는 불균일한 뇌 물질 변형을 유발할 수 있으며, 이로 인해 야생형 샘플과 돌연변이 샘플 간에 서로 다른 조직 투명으로 인한 부피 변형이 발생할 수 있으며 이러한 샘플의 체적 차이에 대한 해석이 혼란스러울 수 있습니다.10,13 . MRI는 먼저 동물을 조영제(예를 들어, 가돌리늄)로 관류시킨 다음, 추출된 관심 조직을 이미징 전에 침지 용액(예를 들어, 폼블린)에서 인큐베이션함으로써 수행된다(14). MRI는 조직 투명화 및 동일한 샘플에서 LSFM 수행과 호환됩니다.

LSFM은 뇌 구조의 정량적 평가보다는 관심 있는 뇌 조직의 정성적 시각화를 위한 대규모 현미경 이미지를 생성하는 데 자주 사용됩니다(그림 1). 정량적 평가 없이는 유전 적 또는 환경 적 모욕으로 인한 구조적 차이를 입증하기가 어렵습니다. 조직 청소 및 이미징 기술이 향상되고 스토리지 및 컴퓨팅 성능 비용이 감소함에 따라 관심 조직 내에서 세포 유형 위치를 정량화하는 것이 더 쉬워지고 더 많은 연구자들이 이러한 데이터를 연구에 포함할 수 있게 되었습니다.

마우스 뇌(15) 내의 1억 개 이상의 세포와 테라바이트의 데이터를 생성할 수 있는 전뇌 이미징 세션으로 인해, 세포와 같은 이미지 내의 특징을 정확하게 정량화할 수 있는 고급 이미지 분석 도구에 대한 수요가 증가하고 있다. 핵 염색 강도에 대한 임계값을 적용하고 미리 정의된 모양, 크기 또는 밀도가10,16,17,18인 물체를 필터링하는 조직 투명 이미지에 대한 다양한 분할 방법이 있습니다. 그러나 결과의 부정확한 해석은 세포 크기, 이미지 대비 및 라벨링 강도와 같은 매개변수의 변화로 인해 발생할 수 있습니다. 이 논문은 마우스 뇌의 세포핵을 정량화하기 위해 확립 된 프로토콜을 설명합니다. 먼저, P4 마우스 뇌의 조직 수집을 위한 단계를 자세히 설명한 다음, 공개적으로 이용 가능한 iDISCO+ 방법(10)으로부터 최적화된 조직 투명화 및 면역표지 프로토콜이 뒤따른다. 둘째, 이미지 캡처에 사용되는 매개 변수를 포함하여 MRI 및 라이트 시트 현미경을 사용한 이미지 획득에 대해 설명합니다. 마지막으로, 조직 제거 후 세포 유형 특이적 정량화, 핵 마커를 사용한 면역 표지 및 주석이 달린 영역의 라이트 시트 이미징을 가능하게 하는 우리 그룹이 개발한 이미지 분석 도구 세트인 NuMorph19를 설명하고 시연합니다.

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Protocol

모든 마우스는 채플 힐에있는 노스 캐롤라이나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인되고 승인되었습니다.

1. 마우스 해부 및 관류

참고: 다음 해부는 주사기를 사용하여 P4 및 P14 마우스에서 수행되었습니다. 관류액의 양은 동물의 나이에 따라 다릅니다.

  1. 관류
    주의 : 파라 포름 알데히드 (PFA)는 위험한 화학 물질입니다. 화학 흄 후드에서 모든 관류 단계를 수행하십시오.
    1. 수술 전에 복강 주사 (100mg / kg) 를 통해 펜토 바르비탈을 투여하고 마취제가 효과를 발휘하도록하십시오.
    2. 동물이 마취 수술면에 도달하면 발가락 꼬집음 반응 방법을 사용하여 반응이 없는지 확인하십시오.
    3. 흉곽 아래에 측면 절개를하여 동물의 흉강을 노출시킵니다.
    4. 구부러진 수술 용 가위를 사용하여 흉곽을 동물의 한쪽 쇄골까지 조심스럽게 자르고 반대쪽을 똑같이 잘라 흉골을 들어 올려 심장을 노출시킵니다.
    5. 하행 대동맥을 손상시키지 않고 우심방에 작은 절개를하기 전에 심장에 연결된 조직을 조심스럽게 다듬어 혈액이 혈관 구조에서 흘러 나오도록하십시오.
    6. 주사기 기반 방법을 사용하여 좌심실을 통해 마우스를 P14 및 P4에 대해 각각 10mL 및 7mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 관류하고 시스템을 통해 1.5mL/분의 관류 속도로 관류합니다.
    7. 혈액이 깨끗해지면 P14 및 P4에 대해 각각 10mL의 PBS + 4% PFA 및 7mL의 PBS + 4% PFA로 4°C에서 1.5mL/분의 관류 속도로 다시 관류하여 동물을 고정합니다.
      알림: 고정 떨림이 관찰되고 완료되면 동물이 뻣뻣 해집니다. 샘플에 MRI를 사용하는 경우 각 시점에 대해 유사한 부피의 PBS 및 PFA + PFA 용액에서 20% 가돌리늄 기반 MRI 조영제로 관류합니다.
    8. 수술용 가위를 사용하여 머리를 제거하고 완전한 고정을 위해 4°C에서 24시간 동안 PBS + 4% PFA로 드롭픽스합니다.
      참고: 이 단계에서 뇌는 두개골이 켜진 상태로 손상되지 않은 상태로 유지됩니다(섹션 2 참조). 일시 중지 지점: 뇌는 이 단계에서 4°C에서 PBS + 0.1% 아지드화나트륨에 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.

2. 온전한 두개골 및 분석을 통한 MR 기반 총 뇌 구조 영상

알림: 뇌는 두개골에서 제거되지 않고 위에서 설명한 대로 가돌리늄에서 관류 및 배양되어야 합니다. 모든 MRI는 해부 중 의도하지 않은 조직 손실을 피하기 위해 두개골에서 뇌를 제거하기 전에 발생합니다. 손상되지 않은 두개골을 사용한 이미징은 또한 샘플 준비 및 이미징 중에 샘플 홀더(즉, 주사기)의 뇌를 지원합니다.

  1. 샘플 준비
    참고: 다음 단계는 P4 및 P14 마우스 뇌 샘플에 최적화되어 있습니다. 필요한 주사기 크기는 샘플의 물리적 크기에 따라 다릅니다.
    1. 샘플에 대해 MRI를 수행하는 경우, 두개골로부터 피부를 제거하고 영상화 전에 4°C에서 23일 동안 PBS + 3% 가돌리늄에서 배양한다(14). 23일 후, 샘플을 PBS에서 신속하게 헹구십시오.
    2. 5mL 주사기를 사용하여 MRI용 샘플 홀더를 만들고, 주사기 피스톤을 사용하여 주사기(20)로 만든 홀더의 각 끝을 닫습니다. 플라스틱 조각을 사용하여 두개골을 홀더에 단단히 고정합니다(그림 2A). 이미징시 인공물을 방지하기 위해 에탄올로 주사기의 표시를 제거하십시오.
    3. 두개골을 샘플 홀더에 단단히 놓고 MRI와 호환되는 침지 용액으로 채 웁니다 ( 재료 표 참조). 홀더를 닫고 주사기를 사용하여 모든 기포를 제거하십시오.
      알림: 일시 중지 지점: 두개골은 이미징하기 전에 몇 달 동안 침지 용액에 보관할 수 있습니다.
  2. 전체 뇌 구조 영상 (MRI)
    1. 다음 매개 변수가있는 15mm 볼륨 코일과 스핀 에코 기반 시퀀스를 사용하여 9.4T / 30cm 수평 보어 동물 MRI 시스템으로 샘플을 이미지화합니다. 공간 분해능 : 60 μm x 60 μm x 60 μm; 총 스캔 시간: 7시간 12분; 에코 시간(TE): 6.83ms; 반복 시간 (TR) : 40ms; 여기/초점 조정 플립 각도: 90/180도; 이미지 크기:166 x 168 x 209 복셀; 시야 (시야) : 9.9 밀리미터 x 10.1 밀리미터 x 12.4 밀리미터; 대역폭: 100,000 킬로헤르츠.
  3. 전산 총 뇌 구조 분석
    1. 분할 소프트웨어를 사용하여 마우스 뇌를 수동으로 추적하여 원시 MRI 이미지에서 주변 두개골을 제거합니다. 다음으로, 마스크 이미지와 원시 MRI 이미지 사이에 복셀별 곱셈 연산을 적용하여 두개골이 벗겨진 뇌 MRI 이미지를 생성합니다.
      참고: 출력은 브레인 복셀의 강도가 1로 설정되고 그렇지 않으면 0으로 설정된 이진 마스크 이미지입니다.
    2. FSL 패키지(21, 22)에서 'flirt'를 사용하여 엄격한 이미지 정합(평행선-회전 추정)을 적용하여 두개골-박리된 MRI 이미지(동영상)를 대응하는 광시트 현미경 이미지(참조 이미지)에 정렬한다.
    3. 비강체 정합을 적용하여(ANTS 소프트웨어(23)에서 'SyN' 사용) 단계 2.3.2의 강성-정렬된 MRI 이미지와 라이트-시트 이미지(단계 2.3.2의 동일한 참조 이미지) 사이의 점대점 대응을 찾는다.
      참고: 출력에는 뒤틀린 MRI 이미지와 MRI에서 라이트 시트 이미지로의 볼륨 변화와 관련된 변형 필드가 포함됩니다.
    4. 2.3.3단계에서 생성된 변형 필드에 대한 야코비 행렬식을 계산하여 3 x 3 x 3 복셀 로컬 이웃의 볼륨 변화를 정량화합니다.
    5. 변형 가능한 이미지 등록을 사용하여 두개골이 벗겨진 이미지를 Allen 발달 마우스 뇌 아틀라스에 정렬합니다.
      참고: 설정된 공간 지점 간 대응을 통해 새 마우스 이미지에서 관심 있는 뇌 영역의 자동 주석을 달 수 있습니다(그림 2C-H).

3. 두개골에서 뇌 해부

  1. 두개골을 노출시키기 위해 목에서 코까지 두개골 상단을 따라 정중선 절개를하십시오.
  2. 나머지 목 근육과 다른 모든 잔여 근육을 잘라내어 두개골 기저부를 노출시킵니다.
  3. 날카로운 수술 용 가위를 사용하여 날카로운 수술 장비로 절단하는 동안 부드러운 위쪽 압력을 유지하여 뇌가 손상되지 않도록주의하면서 두개골의 안쪽 표면을 따라 조심스럽게 자릅니다.
  4. 핀셋을 사용하여 두개골의 두 잘라낸 반쪽을 뇌에서 떼어내고 뇌에 부착된 과도한 지방을 조심스럽게 제거합니다.
  5. 수술 용 가위를 사용하여 뇌와 두개골을 연결하는 경막을 다듬은 다음 주걱을 사용하여 머리에서 뇌를 부드럽게 제거하십시오.
  6. 뇌를 제거하고 PBS로 씻은 다음 0.1% 아지드화나트륨으로 PBS로 교체하고 장기 보관을 위해 4°C에서 보관합니다.

4. 조직 청소

참고: 이 프로토콜은 P4 마우스6용 iDISCO+ 프로토콜에서 약간 변경된 것입니다. 일부 세부 사항은 다른 시점 / 종 / 실험에 따라 변경 될 수 있습니다. 주의 : 메탄올, 디클로로 메탄 (DCM) 및 디 벤질 에테르 (DBE)는 위험한 화학 물질입니다. 이러한 조직 청소 단계는 화학 흄 후드에서 수행됩니다.

  1. 항체 검증
    참고: 테스트되지 않은 항체의 메탄올 호환성은 iDISCO+ 프로토콜에 필요한 거친 메탄올 세척에 의해 부정적인 영향을 받을 수 있으므로 확인해야 합니다. iDISCO+에서 작용하는 것으로 밝혀진 항체 목록은 웹사이트24를 참조하십시오.
    1. 관심 있는 PFA 고정 조직의 10μm 동결 섹션을 입체 슬라이드에 수확합니다.
    2. 실온에서 3 시간 동안 100 % 메탄올에서 섹션을 배양합니다.
    3. 표준 면역조직화학 프로토콜을 진행하기 전에 PBS에서 재수화하여 항체가 메탄올 세척 후 예상되는 형광 패턴을 나타내는지 여부를 결정합니다. 양성 대조군의 경우 메탄올로 처리되지 않은 슬라이드를 사용하십시오.
  2. 완충액 준비
    1. 공식 iDISCO 프로토콜에 따라 버퍼를 준비합니다. 이 프로토콜에 사용되는 완충액 및 기타 용액의 구성에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
  3. 전처리
    1. 메탄올 / PBS 시리즈로 샘플을 탈수하십시오 : 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 %; 실온에서 각각 1시간.
      알림: 탈수 중에 PBS를 사용하면 메탄올 세척에서 샘플의 균열을 방지하는 데 도움이 됩니다.
    2. 샘플을 100% 메탄올로 1시간 동안 세척한 다음, 실온에서 66% DCM/33% 메탄올에서 진탕하면서 밤새 배양하기 전에 4°C에서 1시간 동안 냉각합니다.
    3. 샘플을 실온에서 100% 메탄올로 2x 세척한 다음 4°C에서 냉각합니다.
    4. 메탄올 중 신선한 5%H2O2를 사용하여 샘플을 4°C에서 밤새 표백한다.
    5. 메탄올 / PBS 시리즈로 샘플을 재수화하십시오 : 80 %, 60 %, 40 %, 20 %, PBS; 실온에서 각각 1시간, 실온에서 PTx.2에서 2시간 동안 2회 세척합니다.
    6. 샘플을 37°C에서 1x PBS/0.2% TritonX-100/20% DMSO에서 밤새 배양합니다.
    7. 샘플을 37°C에서 1x PBS/0.1% 트윈-20/0.1% 트리톤X-100/0.1% 데옥시콜레이트/0.1% NP40/20% DMSO에서 밤새 인큐베이션합니다.
    8. PTx.2에서 실온에서 1 시간 동안 두 번 세척하십시오.
  4. 면역 표지
    1. 샘플을 투과화 용액에서 37°C에서 2일(~48시간) 동안 배양합니다.
    2. 37 ° C에서 2 일 (~ 48 시간) 동안 블로킹 용액에서 샘플을 차단합니다.
    3. 샘플을 37°C에서 4일(~96시간) 동안 PTwH/5%DMSO/3% 혈청 중 1차 항체와 함께 인큐베이션합니다(예: 토끼(Rb) Brn2/POU3F2 mAb(1:100) 및 항-Ctip2 래트(Rt) 항체(1:400)(재료 표).
    4. PTwH에서 3 x 1 시간 세척. PTwH에서 2 시간 더 세척하십시오. 세척 용액에 실온에서 밤새 두십시오.
    5. 샘플을 2차 항체 및 핵 염료, 예컨대 TO-PRO-3과 함께 37°C에서 PTwH/3% 혈청에서 4일 동안 인큐베이션한다(~96시간; 예를 들어, 염소 항-Rb(1:50) 및 (염소 항-Rt(1:200)) (재료 표).
    6. PTwH에서 3 x 1시간 세척 PTwH에서 2시간 더 세척합니다. 세척액에 실온에서 밤새 두십시오.
  5. 지우기
    1. 실온에서 메탄올/PBS 시리즈-20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 h에서 각각 탈수합니다. 실온에서 66% DCM/33% 메탄올에서 진탕하면서 3시간 동안 배양합니다.
      알림: 샘플은 100% 메탄올에서 탈수 직후 실온에서 밤새 방치할 수 있습니다.
    2. MeOH를 세척하기 위해 실온에서 2회 15분 동안 100% DCM에서 인큐베이션(진탕과 함께)합니다.
    3. 실온에서 흔들지 않고 디벤질 에테르(DBE)에서 배양합니다. 샘플의 산화를 방지하기 위해 튜브가 DBE로 거의 완전히 채워져 있는지 확인하십시오. 이미징하기 전에 몇 번 뒤집어 용액 혼합을 마칩니다.

5. 라이트 시트 이미징

참고: iDISCO 조직 청소 뇌는 2X/0.5 NA 대물렌즈, 보완 금속 산화물 반도체 카메라, P4 시점의 경우 0.75 x 0.75 x 4μm/복셀의 현미경 작동 및 이미지 획득 소프트웨어가 장착된 라이트 시트 현미경으로 이미지화되었습니다(그림 3A,B).

  1. 시료 장착
    1. 라이트 시트 현미경의 정격 작동 거리(5.7mm - 0.5mm 안전 여유)로 인해 샘플이 깊이가 5.2mm 이하인 z 치수로 향하도록 샘플을 올바른 샘플 크기 홀더에 조심스럽게 장착하십시오.25.
    2. 홀더의 나사를 크래들 지지대에 대해 45° 각도로 사용하여 홀더를 샘플 크래들에 놓습니다(그림 1B). 광 경로가 샘플에 수직이 되도록 크래들을 배치합니다(그림 1C).
  2. 이미징 매개 변수
    1. 현미경의 줌 바디를 4x 배율 이상으로 설정하여 0.75μm/픽셀을 생성합니다.
      참고: P4 라이트 시트 이미지에 대한 단일 셀 계산 분석은 0.75 x 0.75 x 4 μm/복셀 이상의 해상도를 허용하는 상용 라이트 시트 현미경으로 수행할 수 있습니다. 더 낮은 해상도는 핵이 더 드물게 분포된 나중 시점의 뇌에 충분합니다.
    2. 이미지 수집 소프트웨어에서 NA = ~0.08(두께 9μm/z 단계 4μm)인 단일 라이트 시트를 선택합니다.
      참고: 수평 동적 초점과 결합된 이 설정은 합리적인 시간 내에 마우스 뇌의 단일 세포 해상도로 전체 뇌 이미징을 허용합니다. 출생 후 4일차(P4) 뇌의 경우 이미지 획득 시간은 뇌의 크기에 따라 3개 채널에 대해 11-15시간으로 추정됩니다.
    3. 축 해상도가 이미지 너비를 따라 유지되도록 하려면 수평 동적 초점을 선택하고 레이저 파장에 따라 권장되는 단계 수를 적용합니다. 전체 P4 마우스 브레인의 경우 수평 동적 초점을 11로 설정합니다. 등록 채널을 기준으로 각 채널에 대해 미세 초점을 조정합니다.
      참고 : 여기서 TO-PRO-3 채널 (647 nm) 은 모든 핵에 라벨을 붙이기 때문에 Allen Developmental Mouse Brain Atlas에 등록됩니다.
    4. 채널 속성과 관련하여 채널당 레이저 출력을 조정합니다.
      알림: 더 긴 파장은 더 짧은 파장에 비해 더 높은 레이저 출력이 필요합니다. 예를 들어, 780nm는 높은 레이저 출력(70% - 75%) 및 낮은 노출(50ms)에서 이미징해야 하는 반면 647nm 채널은 평균 레이저 출력(40% - 45%) 및 낮은 노출(50ms)이 필요합니다.
    5. 라이트 시트 너비를 ~50%로 조정하여 시트 전력이 이 샘플 크기에 대해 y 치수에 최적으로 분배되도록 합니다.
      참고: 수평 동적 초점과 함께 50% 시트 너비는 광퇴색 위험을 줄이면서 이미지 전체에 걸쳐 평균 전력 분포를 제공합니다(25).
    6. 샘플 크기에 따라 타일 수를 타일 간 권장 겹침 15%로 설정하고 지정된 타일 위치의 각 스택에 대해 각 채널에 대한 이미지를 순차적으로 캡처합니다.

6. 누모프를 이용한 이미지 처리

참고: NuMorph 파이프라인에는 3D 이미지 분석을 위한 세 가지 주요 부분인 전처리, 분석 및 평가가 있습니다. 이 부분은 각각 NMp_template.m, NMa_template.m 및 NMe_template.m으로 구성되어 있으며 아래에서 설명합니다. 또한 NuMorph가 원활하게 실행되는 데 필요한 소프트웨어 패키지를 다운로드하고 설치할 수 있도록 NM_setup.m이 추가되었습니다. NM_samples.m은 또한 이미지 획득 정보를 입력하는 템플릿을 제공합니다.

  1. 누모프 설정
    1. Linux26용 conda 환경 관리자를 다운로드하여 설치합니다. NuMorph19 이미지 처리 도구를 다운로드하여 설치합니다.
    2. 명령줄에서 Matlab을 실행합니다 . NuMorph에서 NM_setup.m을 실행하여 분석에 필요한 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 다운로드하고 설치합니다.
      참고: 이 단계를 수행하면 conda 환경이 올바르게 설정되고 Matlab이 세 파이프라인 각각을 실행하는 데 필요한 모든 도구와 애드온이 올바르게 다운로드 및 설치되었는지 확인할 수 있습니다. 여기서 가장 주목할만한 것은 등록을 실행하기 위한 Elastix와 세포 감지 및 계수를 위한 3D-Unet입니다.
  2. 샘플 이름, 입력 및 출력 디렉토리, 채널 정보 및 라이트 시트 이미징 파라미터를 NM_samples.m 파일을 편집하여 지정합니다.
    참고: 여기에서는 올바른 정보, 특히 이미지 입력 디렉토리가 올바르게 지정되었는지 다시 확인하는 것이 좋습니다. 오류는 일반적으로 후속 단계를 실행할 때까지 여기에서 호출되지 않습니다.
  3. 이미지 전처리
    1. 강도 조정
      1. NMp_template에서 강도 조정 = true로 설정합니다.
        참고: 강도 조정이 필요한 경우 true로 설정합니다. 그렇지 않은 경우 강도 조정 = false로 설정합니다. '업데이트'를 사용하여 이전 조정 매개 변수를 덮어 쓰는 옵션도 있습니다.
      2. 새 이미지 집합으로 작업할 때 처리된 이미지 사용 = false 를 설정합니다. 그렇지 않으면 출력 디렉터리에 이전에 저장된 이미지 데이터 세트(예: "정렬됨", "스티칭")를 표시하여 후속 처리 단계에 사용합니다.
        참고: 이 옵션은 입력 이미지가 이미 전처리된 경우에 제공됩니다. 이 경우 전처리된 이미지가 입력 이미지로 사용되고 옵션은 출력 디렉터리의 하위 디렉터리 이름으로 설정됩니다.
      3. 이미지 저장 = true로 설정합니다.
        참고: 이 옵션을 사용하면 처리된 이미지가 출력 디렉터리에 저장됩니다. 그렇지 않으면 매개 변수 만 계산되고 저장됩니다.
      4. 저장 샘플 = true로 설정합니다.
        참고: 이 옵션을 사용하면 각 주요 단계에 대한 샘플 결과가 저장됩니다.
      5. 타일 음영 조정 = 기본을 설정하여 BaSiC 알고리즘27을 사용하여 음영 보정을 적용하거나 수동으로 설정하여 특정 라이트 시트 너비에서 라이트 시트 현미경의 측정값을 사용하여 타일 음영 보정을 적용합니다.
        참고: 이 옵션은 시트 허리의 모양으로 인해 발생하는 y 치수를 따라 고르지 않은 조명을 수정합니다.
    2. 이미지 채널 정렬
      1. NMp_template에서 채널 정렬 = true로 설정합니다. 채널 정렬이 필요한 경우 이 옵션을 true로 설정합니다. 그렇지 않은 경우 false로 설정합니다. 채널 정렬 방법을 평행 이동(강성) 또는 탄성체(비강체)로 설정합니다.
        참고: 변환 방법은 다중 채널을 정렬할 때 엄격한 2D 등록 접근 방식을 사용하는 반면, 탄성 방법은 긴 이미지 획득(19) 동안 발생할 수 있는 회전 드리프트를 보정하기 위해 비강성 B-스플라인(28)을 사용합니다.
    3. 반복적인 이미지 스티칭
      1. NMp_template에서 스티치 이미지 = true를 설정합니다.
        참고: 스티칭이 필요한 경우 이 옵션을 true로 설정합니다.
      2. 선별 구체화 = true로 설정합니다.
        참고: 이 옵션은 고정 피쳐 축척 변환29를 사용하여 xy에서 변환을 더 구체화하는 데 사용됩니다.
      3. 하중 맞춤 매개 변수 = true를 설정합니다.
        참고: 이 옵션은 스티칭 중에 채널 정렬 변환을 사용합니다. 이 옵션은 다중 채널 이미징에 권장됩니다. 그렇지 않으면 false로 설정합니다.
      4. 겹침 = 0.15를 설정하여 이미징 중 타일 겹침과 일치시킵니다.
    4. 이러한 전처리 단계를 실행하려면 환경 외부의 Matlab에서 다음을 실행하십시오NMp_template
      1. 샘플 이름을 지정합니다. 설정 = NM_config(프로세스, 샘플)을 설정합니다.
      2. NM_process(config,stage)를 지정하여 전처리 단계를 실행하고 모든 프로세스에 대해 강도, 정렬 또는 스티칭을 사용하여 단계를 지정합니다. 출력 디렉터리에서 각 단계의 출력 파일을 확인합니다(그림 3 및 그림 4).
  4. 이미지 분석
    1. 뉴모프 이전
      1. 3D 아틀라스 이미지와 각 복셀을 특정 구조에 할당하는 관련 주석 이미지로 시작합니다.
        참고 : MagellanMapper30 에서 생성 된 P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas가 여기에 사용됩니다.
      2. 아틀라스 이미지와 주석 파일을 모두 정렬하여 올바른 방향으로 올바르게 일치하는지 확인합니다.
    2. 누모프 내
      참고: 이제 아틀라스와 해당 주석이 올바르게 정렬되었으므로 나중에 사용할 수 있도록 저장할 수 있도록 파일을 NuMorph 내에서 "혼합"하거나 처리해야 합니다. 이렇게 하려면 munge_atlas 함수를 사용하여 아래와 같이 입력을 지정하십시오.
      1. Atlas_file:(문자열)을 지정합니다. 아틀라스 파일의 전체 경로를 제공합니다.
      2. Annotation_file:(문자열)을 지정합니다. 연결된 주석의 전체 경로를 제공합니다.
      3. 해상도 지정: (1x3 숫자). 아틀라스 y, x, z 해상도를 픽셀당 미크론으로 지정합니다.
      4. 방향 지정: (1 x 3자). 아틀라스 방향을 제공하고 크래들(전방(a)/후방(p),상급(s)/열등(i),왼쪽(l)/오른쪽(r))의 샘플 설정과 일치하는지 확인합니다.
      5. 반구 지정: 이미징된 뇌 반 구를 지정합니다("왼쪽", "오른쪽", "둘 다", "없음").
      6. out_resolution:(int)를 지정합니다. 아틀라스 출력의 등방성 분해능을 미크론 단위로 지정합니다. (기본값: 25).
      7. "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, 해상도, 방향, 반구)"명령을 실행하여 /data/annotation_data에 여러 주석을 생성하고 /data/atlas에 아틀라스 이미지의 복사본을 생성합니다.
      8. Matlab 구조체와 아틀라스 파일을 읽고 두 파일이 올바른 방향으로 올바르게 처리되었는지 확인합니다.
        참고: 면역표지된 단백질 마커의 공동 국소화에 기초하여 세포 유형을 정량화하기 위해 추가적인 세포 분류 단계를 수행할 수 있다.
    3. 리샘플링
      1. NMa_template에서 이미지 등록을 수행하여 아틀라스를 참조하거나 고해상도 데이터 세트의 다운샘플링된 볼륨을 생성하는 경우 이미지 리샘플링 = true로 설정합니다.
        참고: NMa_template.m은 리샘플링, 정합, 핵 검출 및 세포 계수를 위한 매개변수를 설정하는 데 사용됩니다.
      2. 아틀라스와 일치하도록 리샘플링 해상도를 설정합니다.
        참고: 여기서 25μm3/복셀 등방성 분해능은 참조 아틀라스가 이 분해능에 있기 때문에 사용됩니다.
      3. 리샘플링 채널 = [ ]을 사용하여 리샘플링할 채널 번호를 지정합니다.
        참고: 여기서 채널 번호는 핵 채널과 일치하도록 설정됩니다. 이 옵션이 비어 있으면 등록 채널만 리샘플링됩니다.
    4. 등록
      1. NMa_template에서는 레지스터 이미지 = true를 설정합니다. 등록이 필요한 경우 true로 설정합니다. 그렇지 않은 경우 등록 = false로 설정합니다.
      2. atlas 디렉터리의 파일과 일치하도록 atlas 파일을 지정합니다.
      3. 등록 매개 변수 설정 = 기본값.
        참고: 이 옵션은 아핀 다음에 B 스플라인 변환을 사용하여 공간 대응을 추정합니다. 그렇지 않으면 /data/elastix_parameter_files/atlas_registration에서 Elastix를 통해 새 등록 매개 변수 세트를 정의합니다.
      4. 등록된 이미지 저장 = true로 설정합니다.
        참고: 등록 및 리샘플링의 출력 파일은 Matlab 또는 FIJI31과 같은 기타 시각화 도구에서 다운로드하여 육안으로 검사할 수 있습니다.
    5. 핵 검출, 세포 계수 및 분류
      참고: 여기서 발생하는 오류는 주석 파일을 올바르게 지정하지 않았거나 샘플의 사용 기간을 올바른 주석과 일치하지 않기 때문일 수 있습니다.
      1. NMa_template에서는 핵 수와 세포 분류 = true를 모두 설정합니다.
      2. 카운트 방법 설정 = 3dunet.
        참고: 이 옵션을 사용하면 훈련된 3D-Unet 모델19를 사용할 수 있습니다. 그렇지 않으면 헤시안 얼룩 검색 방법을 활용하는 헤센을 선택합니다.
      3. 감지된 개체에 대한 최소 강도 임계값을 정의하려면 min_intensity 설정합니다.
        참고: 적절한 임계값은 핵 라벨링의 신호 대 잡음비를 기반으로 경험적으로 결정됩니다.
      4. classify_method 중심 위치의 비지도 형광 강도를 기반으로 하는 임계값 또는 감독된 선형 SVM(서포트 벡터 머신) 분류기를 모델링하는 svm으로 설정합니다.
        참고: 이 단계에서는 감지된 모든 셀을 3채널 이미징을 사용하여 4개의 주요 클래스로 분류합니다. 이 프로토콜을 사용하면 Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2- 및 이상값이 생성됩니다.
    6. 분석 단계
      1. 샘플 이름을 지정합니다. 구성 = NM_config (분석, 샘플)을 설정합니다.
      2. NM_analyze(config,stage)를 지정하여 분석 단계를 실행하고 리샘플링, 레지스터, 카운트 또는 분류를 사용하여 단계를 지정합니다. 출력 디렉터리에서 각 단계의 출력 파일을 확인합니다(그림 5).
    7. 세포 유형 분류 및 그룹 분석
      1. NMe_template에서 update = true를 설정하고 계산된 모든 이전 통계를 덮어씁니다.
        참고: NMe_template.m은 분석 중인 동일한 뇌의 뇌 영역에서 세포 유형 그룹 분석을 수행할 수 있는 옵션을 제공합니다.
      2. compare_structures_by 모든 고유 주석으로 비교할 인덱스 또는 테이블에 따라 구조를 비교할 테이블로 설정합니다.
      3. 가능한 모든 구조체 인덱스를 지정하고 /annotations에 있어야 하는 template_file 설정합니다.
      4. structure_table 설정하고 평가할 구조를 지정합니다.
      5. NMa_template.m에 설명된 대로 세포 계수 및 세포 유형 분류를 지정합니다.
      6. 비교할 그룹을 지정하려면 compare_groups 설정합니다.
      7. 쌍을 이루는 t-검정 또는 2표본 t-검정을 수행하려면 쌍을 이루는 true 또는 false로 설정합니다.
    8. 분석을 실행합니다.
      참고: 이 단계를 수행하려면 NMe_template.m 환경 외부의 Matlab에서 다음을 실행하십시오.
      1. 샘플 이름을 지정합니다. 설정 = NM_config (평가, 샘플)을 설정합니다.
      2. NM_evaluate(config,stage)를 지정하여 분석 단계를 실행하고 단계를 지정합니다. 출력 디렉터리에서 그룹 분석을 위한 출력 파일을 확인합니다.

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Representative Results

iDISCO+ 프로토콜은 눈으로 쉽게 알아볼 수 있는 상당한 조직 수축을 도입하므로(그림 2B), 조직 투명화로 인한 수축을 정량화하기 위해 조직 제거 전에 이 파이프라인에 MRI 단계를 추가했습니다. 워크플로우는 MR 이미지에서 뇌가 아닌 조직을 제거하는 것으로 시작됩니다(그림 2C). 다음으로, 강체 변환(3개의 평행 이동 및 3개의 회전 각도)을 적용하여 MR 이미지를 라이트 시트 이미지에 정렬합니다(그림 2D). 그렇게 함으로써, 우리는 조직 투명화 절차(그림 2E)에 의해 유도된 60%의 총 부피 손실을 관찰했으며, 이는 눈의 부피 변화 추정치와 일치했습니다(그림 2B). 이 결과는 5%-10%10,32의 수축이 보고된 이전 보고서와 상당히 다릅니다. 수축의 차이는 두 연구 (P4 대 성인 뇌) 간의 동물 연령 차이 또는 iDISCO+ 프로토콜의 제거 단계에서 메탄올 세척의 시간 차이 (16 시간 대 2 시간)로 인해 발생할 수 있습니다. 뇌의 여러 영역에 걸친 조직 수축 정도를 매핑하기 위해 우리는 라이트 시트 이미지가 참조로 사용되는 변형 가능한 이미지 등록을 추가로 배포했습니다. 등록된 MR 이미지는 (도 2F)에 나타내었다. 조직 청소 절차로 인한 예상 부피 변화는 색상으로 구분되며, 다른 뇌 영역에 비해 피질에서 더 큰 수축 정도가 관찰됩니다 (그림 2G).

뇌 영역의 부피를 측정하기 위해 주석이 달린 지도책에 등록을 통해 MRI의 분할을 수행했습니다. MR 영상 뇌의 분할은 참조 아틀라스 오버레이가 원시 MRI 이미지의 대비 차이로 식별된 해부학적 경계와 밀접하게 일치하는 경우 성공적인 것으로 간주되었습니다(그림 2H). 등록 중 오버레이는 우수한 샘플 준비(그림 2A), 이미지 획득 및 두개골 스트리핑에 따라 달라집니다. 두개골 스트리핑 단계는 등록이 이미지에 남아 있는 두개골을 포함하여 아틀라스에서 전체 MR 이미지로 참조 이미지를 왜곡하려고 시도하기 때문에 좋은 등록 결과에 매우 중요합니다. 등록에 두개골을 포함하면 결과가 왜곡되고 분할의 잘못 등록된 3D 볼륨 렌더링이 생성될 수 있습니다. 최종 3D 볼륨 렌더링은 ITK-SNAP (33 )를 사용하여 시각화 될 수 있습니다 (그림 2H). 이 방법은 샘플 그룹 간의 총 뇌 부피 차이를 평가하는 데 사용됩니다. MRI로 발견된 부피 차이의 기저에 있는 세포 기반은 조직 투명화, 라이트시트 현미경 및 NuMorph를 통한 세포 계수를 사용하여 추적할 수 있습니다.

조직 제거 및 분석의 목표는 NuMorph를 사용하여 개별 핵을 계수하여 실험 조건(예: 유전자형, 환경 노출)에 따른 차이에 대한 다양한 세포 유형의 기여도를 평가하는 것입니다. iDISCO+ 프로토콜과 뉴런 층 특이적 핵 마커를 사용한 조직 청소는 등피질에서 상층 및 하층 뉴런의 명확하게 정의된 세포 그룹을 생성했습니다(그림 3).

NuMorph를 사용한 세포 계수는 강도 조정, 채널 정렬 및 스티칭과 관련된 성공적인 전처리 단계에 따라 달라집니다(그림 4A). 이러한 단계에서 오류가 발생하면 부적절한 스티칭이 발생할 수 있습니다(그림 4B,C). 예를 들어, 부적절한 이미지 획득으로 인해 전처리 중에 초점이 맞거나 초점이 맞지 않는 패턴이 있는 이미지가 발생할 수 있습니다(그림 4C). 특정 뇌 영역의 핵을 계산하기 위해 스티칭된 이미지에는 공개적으로 사용 가능한 지도책을 사용하여 주석이 달립니다. 우리는 스티칭 된 이미지를 P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas34의 수정 된 버전에 등록했습니다. 여기에서 스티칭된 이미지는 아틀라스의 해상도와 일치하도록 고해상도(0.75 x 0.75 x 4μm³/복셀)에서 더 낮은 해상도(25μm³/복셀 등방성 해상도)로 다운샘플링되었습니다. 아틀라스의 해상도를 일치시키면 이미지가 아틀라스에 올바르게 등록되고 획득된 이미지에 지역 주석이 제공됩니다(그림 5A).

특정 세포 유형 특이적 계수를 수행하기 위해 Brn2를 발현하는 상층 뉴런, Ctip2를 발현하는 하층 뉴런 및 모든 핵을 TO-PRO-3으로 분류했습니다(그림 3B). 이미징은 개별 핵을 분리하기에 충분한 공간 분해능(0.75 x 0.75 x 4 μm3/복셀)으로 수행됩니다. 핵의 중심은 NuMorph에서 훈련된 3D-Unet 모델로 감지됩니다(그림 5B,C). 우리는 ~2.6 × 10 6 Brn2+ 및 10 6 Ctip2+ 핵을 포함하여 등피질에서 To-Pro-3+인 ~12 ×× 10 6개의 총 핵을 검출했습니다. 우리는 또한 기저핵과 해마 동종 피질에서 각각 ~3.7 × 106 및 2.9 × 106 To-Pro-3+ 총 핵을 검출했습니다. 기저핵과 해마 동종 피질에서 각각 기저핵과 해마 동종 피질에서 약 1.5 × 106 및 ×<16 Ctip2+ 세포가 각각 계수되었지만 무시할 수 있는 수의 Brn2+ 세포가 검출되었습니다(그림 5D). 등피질과 해마 동종피질의 총 핵 수(~1,500만 세포)는 마우스15의 대뇌 피질에서 이전에 보고된 총 세포 수와 유사합니다. 이러한 결과는 MRI 영상, iDISCO+ 조직 제거 방법론 및 NuMorph 계산 분석의 유용성을 입증하여 실험 그룹 간 마우스 뇌 구조의 근본적인 차이를 나타내는 체적, 총 세포 수 및 세포 유형별 수를 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: 온전한 신생아 3D 조직 제거 마우스 뇌의 전체 뇌 단일 세포 분석 개요. (A) iDISCO+ 조직 투명화, 라이트 시트 이미징 및 3D 이미지 분석 개요. (B) 라이트 시트 현미경에 올바른 샘플 장착을 보여주는 이미지. (C) 라이트 시트 경로를 기준으로 샘플 장착을 보여주는 만화. 약어 : ab = 항체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: MRI를 사용한 총 뇌 구조 측정 . (A) MRI를 위한 샘플 준비를 보여주는 이미지. (B) iDISCO+ 조직 청소 전후의 대표적인 P4 뇌 이미지. 스케일 바 = 5.0cm. (C) 60 x 60 x 60 μm³에 부착된 두개골이 있는 원시 MR 이미지. 스케일 바 = 800 μm. (D) 25 x 25 x 25 μm³에서 마우스 뇌의 라이트 시트 이미지. 총 부피 = 68.7 mm3. 등쪽 등피질의 작은 부분은 화살촉 (흰색)으로 표시된 해부 중에 의도하지 않게 제거되었습니다. 스케일 바 = 800 μm. (E) 두개골 스트리핑 및 경질 등록 후 마우스 뇌의 MR 이미지. 총 부피 = 171.9 mm3. 삽입(노란색)은 라이트 시트 이미지의 뇌 윤곽을 보여줍니다. 스케일 바 = 800 μm. (F) 변형을 평가하기 위해 라이트 시트 이미지를 참조하여 등록된 MR 이미지. 스케일 바 = 800 μm. (G) 라이트 시트 이미지와 MR 이미지 간의 볼륨 변화를 평가하기위한 복셀 별 브레인 매핑 여기서 파란색과 빨간색은 각각 MR 이미지에서 라이트 시트 이미지로의 수축 및 확장을 나타냅니다. 전체적으로 60 %의 부피 손실이 있었지만 등피질과 같은 일부 영역은 다른 영역에 비해 더 큰 수축을 보였습니다. (H) 왼쪽 패널: 오버레이된 Allen 발달 뇌 아틀라스에서 등록된 분할이 있는 MRI 이미지의 축 방향 보기. 오른쪽 패널: 분할의 3D 볼륨 렌더링. 스케일 바 = 800 μm. 약어 : OB = 후각 전구; Dpall = 등쪽 팔륨/등피질; Mb = 중뇌; Cb = 소뇌. 방향 : R = 주둥이; L = 측면; D = 등쪽. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 셀룰러 해상도 이미지 및 채널 정렬. (A) P4 마우스 뇌의 Ctip2(하층 뉴런) 및 Brn2(상층 뉴런) 마커에 대한 TO-PRO-3(TP3) 핵 염색 및 면역표지의 광학 축 단면. 스케일 바 = 1mm. (B) Brn2- 면역 표지 된 상층 및 Ctip2- 면역 표지 된 하층 뉴런의 예상되는 국소화와 올바른 채널 정렬을 보여주는 A (상자)의 피질 영역의 확대 된 삽입. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 이미지 스티칭의 예. (A) 올바르게 스티칭된 2D 반복 이미지의 샘플 결과. 스케일 바 = 1mm. 삽입은 확대된 올바른 스티칭의 예를 보여줍니다. 스케일 바 = 500 μm. (B) 잘못 스티칭된 2D 반복 이미지의 샘플 결과. 스케일 바 = 1mm. 삽입은 잘못된 스티칭 확대(오버행)의 예를 보여줍니다. 스케일 바 = 100 μm. (C) 잘못 스티칭된 2D 반복 이미지의 샘플 결과. 스케일 바 = 1mm. 삽입은 잘못된 스티칭이 확대된(초점이 맞지 않음) 예를 보여줍니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 저해상도 이미지 정합, 고해상도 핵 검출 및 P4 마우스 뇌의 세포 계수. (A) 왼쪽 패널: 25μm 등방성 해상도로 리샘플링된 전체 뇌 조명 시트 3D 이미지의 z-슬라이스의 예입니다. 스케일 바 = 1mm. 중간 패널: 현미경 이미지에 등록된 Allen 발달 뇌 지도책(P4)의 주석. 스케일 바 = 1mm. 오른쪽 패널: 왼쪽 및 중간 패널의 오버레이입니다. 스케일 바 = 1mm. (B) 축 방향 뷰에서 강도가 조정된 스티칭 이미지의 예. 박스형 영역은 (C)에 나와 있습니다. 스케일 바 = 1mm. (C) 핵 자동 검출 (빨간색). 스케일 바 = 50 μm. (D) P4 뇌의 다른 뇌 영역 (기저핵, 해마 동종 피질 및 이소 피질)의 세포 유형 정량화. 빨간색 = Brn2로 표지된 상층 뉴런, 녹색 = Ctip2로 표지된 하층 뉴런, 파란색 = To-Pro-3 염료로 표지된 모든 핵. 약어 : DPall = 등쪽 팔륨 (등피질); MPall = 내측 팔륨 (해마 동종 피질); CSPall = 중앙 아팔륨(고전적인 기저핵). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

뉴모프 분석 단계 예상 시간
강도 조정 1시간
채널 정렬 2 분
2D 반복 스티칭 12시간
리샘플링 3 민
등록 3 민
세포 계수 5시간
세포 분류 10 분

표 1: 뉴모프 분석 시간.

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Discussion

조직 제거 방법은 뇌의 3D 세포 조직을 측정하는 데 유용한 기술입니다. 문헌에 기술된 다수의 조직 투명화 방법이 있으며, 각각의 장점과 한계가 있다 6,7,8,9. 조직 투명 이미지에서 세포 유형을 분석하기 위한 계산 도구에 대한 옵션은 상대적으로 제한적입니다. 다른 이용가능한 도구들은 분할이 덜 어려운 희소 세포 집단에 구현되었다10,35 또는 조직 확장(16)을 이용하였다. 이 논문은 iDISCO+ 조직 투명을 사용한 이미징을 위한 마우스 뇌의 준비를 설명하고 LSFM에 의해 포획된 마우스 피질의 구조 내에서 핵을 처리하고 정량화하기 위한 계산 파이프라인인 NuMorph를 보여줍니다. 이미징 시간의 길이, 세포핵의 검출 정확도 및 계산 자원 간의 적절한 균형을 유지하도록 설계되었습니다. 이 파이프라인은 표지된 세포10,36,37의 희소 집단이 아닌 모든 핵을 안정적으로 분할함으로써 현재 사용 가능한 다른 도구와 대조됩니다. 우리는 이전에 세포 검출 정확도가 높으며 이미징 시간이 현저히 짧고 다른 방법에 비해 전체 반구 획득을 위해 획득 된 데이터 크기가 훨씬 감소한다는 것을 보여주었습니다19. NuMorph는 채널 정렬을 위한 도구 제공, 스티칭 도구로 스테이지 움직임 수정, 이미지 타일의 신호 밝기 보정과 같은 다중 채널 라이트 시트 이미지 분석과 관련된 여러 가지 중요한 문제를 해결합니다. 이 백서에 제시된 워크플로는 광범위한 과학 커뮤니티에 유용하며 연구 기관의 모든 그룹이 액세스할 수 있습니다. 프로세스의 개요는 그림 1에서 볼 수 있습니다.

이 프로세스 전반에 걸쳐 마우스 관류에서 계산 분석에 이르기까지 이미지의 다운스트림 품질, 정량화 및 결과에 영향을 줄 수 있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 혈관은 이미지의 강도에 영향을 미치고 파이프 라인의 조정이 필요하여 결과에 악영향을 미치는 자연적인자가 형광을 갖기 때문에 모든 혈액이 뇌에서 제거되도록 관류를 수행하는 것이 필수적입니다. 뇌를 4% PFA에 24시간 이상 담그면 샘플이 '과도하게 고정'되어 iDISCO+ 과정에서 부서지기 쉬운 뇌의 균열이 발생할 수 있으므로 PFA 고정 기간도 중요합니다. 상술한 iDISCO 프로토콜은 웹사이트(24)에 있는 공식 프로토콜로부터 약간 수정되었다. 한 가지 중요한 수정은 원래 프로토콜에서 물 대신 메탄올/PBS 시리즈에 PBS를 추가하는 것입니다. 이것은 배아 및 출생 후 초기 뇌의 피질 균열을 방지하기위한 것이며, 이는 신경교 세포, 축삭 돌기 및 세포 외 기질의 불완전한 발달로 인해 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 조직에 따라 항체 농도 변경 및 더 큰 조직 샘플의 배양 시간 증가와 같은 iDISCO+ 프로토콜의 모든 단계에서 수정을 수행하여 선택한 마커를 캡처하고 정확하게 분석하기 위한 이상적인 매개변수를 최적화해야 할 수 있습니다.

조직 수축은 iDISCO+ 조직 청소 과정에서 발생하는 것으로 알려져 있으며, 이는 다운스트림 6,10의 체적 측정을 변경할 수 있습니다. 조직 제거 전에 수행 된 MRI와 같은 대체 방법을 사용하여 대조군 대 실험 동물에서 조직 크기의 변화 정도를 결정하여 체적 차이가 조직 제거 과정이 아닌 연구 된 표현형에 기인하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 돌연변이 체의 피질 영역 부피의 이질적인 변화는 뇌의 회백질과 백질이 메탄올 탈수에 의해 차별적으로 영향을받을 수 있기 때문에 지역 세포 함량에 따라 다를 수 있습니다. MRI 데이터는 뇌의 하위 영역 전체에서 조직 수축이 균일하지 않은지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있으며(그림 2G), 클리어링 프로토콜에 의해 발생한 모든 변화는 다운스트림 계산 분석에서 조정할 수 있습니다. 또한 iDISCO+ 공정은 시료를 탈수하기 위해 거친 메탄올 세척을 사용하므로 핵 표면의 특정 항원이 손상되거나 변경될 수 있습니다. 사용 중인 모든 항체는 먼저 100% 메탄올로 ~3시간 동안 세척한 뇌 조직 절편에서 테스트하여 항체가 iDISCO+ 프로토콜과 호환되는지 확인하는 것이 좋습니다.

처리 시간이 오래 걸리는 대규모 데이터 세트의 경우 서버에 대한 연결이 끊어진 후에도 프로세스를 계속 실행하는 "nohup" 명령 구현과 같은 전략을 허용하는 Linux의 창 없는 MATLAB 버전을 사용하는 것이 좋습니다. 또한 NuMorph는 높은 컴퓨팅 성능이 필요하므로 분석을 위해 최소 10GB의 메모리를 사용하는 것이 좋습니다. 2.6GHz 14코어 프로세서, 8 x 64GB DDR4 2400 LRDIMM 메모리, 4 x 11GB GPU 및 2 x 4TB 외부 SSD가 장착된 CentOS 7을 실행하는 Linux 워크스테이션을 사용하여 샘플을 분석합니다. 여기에 사용된 원시 라이트시트 데이터는 620GB였고 프로세스에 필요한 메모리는 10GB였습니다. 여기에는 표 1에서 볼 수 있듯이 NuMorph 분석의 각 단계를 완료하는 데 걸리는 예상 시간이 포함된 표가 포함되어 있습니다.

이미지 전처리 단계에는 각 z-평면에 대한 xy 치수의 강도 조정, 채널 정렬 및 스티칭이 포함됩니다. 이미지 강도는 타일 간의 강도 차이와 y 차원의 고르지 않은 조명 차이를 고려하여 조정됩니다. 강도의 차이는 타일(25) 사이의 이미지화로서의 라이트시트의 고유한 기술적 특성 때문에 발생한다. 다음으로, 다중 채널 이미징에서 이미지 채널이 올바르게 정렬되도록 채널 정렬이 수행됩니다. 이 단계는 다중 채널 이미징의 각 채널이 개별적으로 획득되고 스테이지의 미묘한 움직임이 샘플 드리프트를 유발하고 공간 오정렬을 초래할 수 있기 때문에 권장됩니다(19). 마지막으로 z-평면당 타일을 함께 스티칭하여 각 z-평면에서 단일 이미지를 형성합니다. 결국, 샘플의 전체 볼륨을 나타내는 채널당 스티칭된 이미지 스택이 있을 것입니다. 반복적인 이미지 스티칭은 샘플(19)의 3D 볼륨에서 채널당 모든 2D 이미지를 구성하는 맞춤형 방법에 기초한다. 이 메서드는 먼저 축 방향으로 쌍별 z-대응을 구현하여 수평 및 수직 방향으로 겹치는 타일 영역을 일치시킵니다. 각각의 타일의 최종 z-변위는 최소 스패닝 트리(38)를 이용하여 결정된다. 2D 반복 스티칭은 배경 신호가 적은 스택 중앙의 위치에서 시작하는 스택에서 수행됩니다. 왼쪽 위 타일은 z 차원에서 이미지의 미묘한 이동을 방지하기 위해 각 결합 반복에 대해 먼저 배치됩니다.

각 전처리 파이프라인을 순차적으로 실행하는 것이 좋으며, 특히 오류를 수정하도록 최적화하는 경우 더욱 그렇습니다. 주요 문제는 종종 스티칭 단계에서 발생합니다. 발생할 수 있는 한 가지 문제는 라이트 시트에서 잘못된 이미지 획득입니다. 이 문제는 수평 동적 초점이 라이트 시트에 잘못 설정되어 이미지에서 동위상/역위상 패턴이 번갈아 나타날 때 발생할 수 있습니다(그림 4B,C). 샘플이 단단히 고정되지 않은 경우 추가 오류가 발생할 수 있으며 수집 중에 상당한 샘플 이동이 발생했습니다. 이러한 경우 인접한 타일 간의 쌍별 대응이 부족하여 정확한 스티칭이 불가능할 수 있습니다. 다른 잠재적 오류는 스티치 시작 사이트에서 발생할 수 있습니다. NuMorph는 스택의 중간에 있는 스티치 시작 사이트를 결정합니다. 그러나 시작 슬라이스 사이트에 중요한 배경이 있는 경우 이미지 타일의 쌍별 비교에서 오류가 발생할 수 있습니다. 여기서는 신호 대 잡음비가 높은 시작 사이트를 선택하는 것이 좋습니다.

여기에 설명된 이미지 분석에는 고해상도(0.75 x 0.75 x 4μm³/복셀)에서 25μm³/복셀의 낮은 등방성 해상도로 스티칭된 이미지의 이미지 리샘플링이 포함됩니다. 핵 채널에서 스티칭된 이미지를 리샘플링하여 스티칭된 이미지를 다음 단계34에서 Allen 발달 마우스 뇌 아틀라스에 등록합니다. 이어서, 세포는 훈련된 3D-Unet 모델(19)을 사용하여 고해상도(0.75 x 0.75 x 4 μm³/복셀)에서 아틀라스를 참조하여 이미지의 주석이 달린 영역 내의 각 채널에 대해 계수된다. 이 메서드는 Blob 개체를 검색하고 계산하는 데도 사용할 수 있습니다. NuMorph를 개발할 때 우리는 동일한 조직 제거 절차, 동일한 현미경 및 동일한 핵 라벨 발견 정밀도 0.99 및 0.9419의 재현율에서 훈련 중에 볼 수 없었던 완전히 새로운 이미지를 기준으로 분할 정확도를 테스트했습니다. NuMorph 정확도는 아직 다른 조직 투명화 절차, 현미경 또는 마커에서 테스트되지 않았습니다. 따라서 다른 실험 설계에서 분할의 정확성은 알려져 있지 않습니다. NM_setup.m의 기본 아틀라스는 사용자 지정 주석으로 Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework (CCFv3)의 세 번째 반복을 사용하는 성인 Nissl 염색 Allen Reference Atlas39 입니다.

NuMorph는 성인 마우스 피질과 같이 비교적 밀도가 높은 조직을 효과적으로 분석하지만 더 까다로운 실험 설계(예: 배아 마우스 뇌 또는 소뇌와 같은 고밀도 구조)에는 추가 계산 도구 개발이 필요할 수 있습니다. 현재의 커뮤니티 기반 노력은 이러한 더 어려운 사례를 분할하는 데 사용되는 딥 러닝 모델의 훈련을 위한 적절한 주석 데이터를 생성하려고 시도하고 있습니다(40). 라이트 시트 이미징 기술의 발전은 세포 내 구조의 높은 처리량 정량 조사를 가능하게 하며, 이중 보기 도립 선택적 평면 조명 현미경(diSPIM)과 같은 새로운 접근 방식을 통해 세포 밀도가 높은 뇌 영역(40,41)에서 해상도와 정확도를 높입니다. 이 연구와 관련된 조직 청소, 이미징 및 계산 도구의 발전이 발전함에 따라 신경 정신 장애가 유전 적 또는 환경 적 위험 요인에 의해 유도 된 뇌 구조의 변화에서 비롯 될 수있는 방법에 대한 정량적 분석을위한 조직 투명화 방법의 광범위한 사용으로 이어지기를 바랍니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

이 작업은 NIH (R01MH121433, R01MH118349 및 R01MH120125에서 JLS로, R01NS110791에서 GW로)와 희망의 재단에 의해 지원되었습니다. 샘플 이미징을 지원해 주신 현미경 서비스 연구소의 Pablo Ariel에게 감사드립니다. 병리학 및 실험실 의학과의 현미경 서비스 실험실은 노스 캐롤라이나 대학교 (UNC) Lineberger 종합 암 센터에 대한 암 센터 핵심 지원 보조금 P30 CA016086에 의해 부분적으로 지원됩니다. 신경 과학 현미경 코어는 보조금 P30 NS045892에 의해 지원됩니다. 이 간행물에보고 된 연구는 노스 캐롤라이나 생명 공학 센터 기관 지원 보조금 2016-IDG-1016에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner Bruker Biospec Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014-1KG
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher-Scientific ICN19605590
Donkey serum Sigma-Aldrich S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y Speciality Fluids Company YL-VAC-25-6 perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance) Bracco Diagnostics A9576
gadolinium contrast agent(ProHance) Bracco Diagnostics 0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU EVGA 08G-P4-6286-KR
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-10KU Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30% Sigma-Aldrich H1009-100ML
ImSpector Pro LaVision BioTec Microscope image acquisition software
ITK Snap segmentation software
Methanol Fisher-Scientific A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) Sigma-Aldrich 30525-89-4 Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Corning 46-013-CM Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002-100G Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
Tergitol type NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-100ML
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Fisher-Scientific BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4 Intel E5-2690
Zyla sCMOS Camera Andor Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit Thermofisher Scientific A11369 (1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat Thermofisher Scientific A11077 (1:200)
Rat anti-Ctip2 Abcam ab18465 (1:400)
Rabbit anti-Brn2 Cell Signaling Technology 12137 (1:100)
To-Pro 3 (TP3) Thermofisher Scientific T3605 (1:400)

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References

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. iDISCO method. , Available from: https://idisco.info/ (2022).
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).
  26. Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022).
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. ITK-SNAP home. , Available from: http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php (2022).
  34. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  35. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  36. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  37. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
  38. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  39. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  40. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
  41. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

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신경 과학 186 호
MRI, 조직 투명화 및 라이트 시트 현미경을 사용한 온전한 신생아 마우스 뇌의 전뇌 단일 세포 이미징 및 분석
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Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., … More

Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., McCormick, C. M., Dere, M., Khan, S., Kim, M., Wang, T. W. W., He, Q., Wu, G., Shih, Y. Y. I., Stein, J. L. Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (186), e64096, doi:10.3791/64096 (2022).

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