Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Helhjärna encellig avbildning och analys av intakta neonatala mushjärnor med hjälp av MR, vävnadsrensning och ljusarkmikroskopi

Published: August 1, 2022 doi: 10.3791/64096
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 3, 3,7, 7, 4,5,6, 4,5,6, 3, 4,5,6, 1,2
1UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, 2Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, 3Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, 4Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, 5Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 7Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver metoder för att genomföra magnetisk resonansavbildning, rensning och immunmärkning av intakta mushjärnor med hjälp av iDISCO+, följt av en detaljerad beskrivning av avbildning med hjälp av ljusarkmikroskopi och nedströmsanalyser med NuMorph.

Abstract

Vävnadsrensning följt av ljusarkmikroskopi (LSFM) möjliggör cellulär upplösningsavbildning av intakt hjärnstruktur, vilket möjliggör kvantitativ analys av strukturella förändringar orsakade av genetiska eller miljömässiga störningar. Helhjärnavbildning resulterar i mer exakt kvantifiering av celler och studier av regionspecifika skillnader som kan missas med vanligt förekommande mikroskopi av fysiskt snittad vävnad. Att använda ljusarkmikroskopi för att avbilda rensade hjärnor ökar förvärvshastigheten kraftigt jämfört med konfokalmikroskopi. Även om dessa bilder producerar mycket stora mängder hjärnstrukturdata, är de flesta beräkningsverktyg som utför funktionskvantifiering i bilder av rensad vävnad begränsade till att räkna glesa cellpopulationer, snarare än alla kärnor.

Här demonstrerar vi NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), en grupp analysverktyg, för att kvantifiera alla kärnor och kärnmarkörer inom kommenterade regioner i en postnatal dag 4 (P4) mushjärna efter rensning och avbildning på ett ljusarkmikroskop. Vi beskriver magnetisk resonanstomografi (MRI) för att mäta hjärnvolymen före krympning orsakad av vävnadsrensande uttorkningssteg, vävnadsrensning med iDISCO+-metoden, inklusive immunmärkning, följt av ljusarkmikroskopi med hjälp av en kommersiellt tillgänglig plattform för att avbilda mushjärnor med cellulär upplösning. Vi demonstrerar sedan den här bildanalyspipelinen med NuMorph, som används för att korrigera intensitetsskillnader, sy bildpaneler, justera flera kanaler, räkna kärnor och kommentera hjärnregioner genom registrering till offentligt tillgängliga atlaser.

Vi utformade detta tillvägagångssätt med hjälp av offentligt tillgängliga protokoll och programvara, så att alla forskare med nödvändiga mikroskop och beräkningsresurser kan utföra dessa tekniker. Dessa vävnadsrensnings-, avbildnings- och beräkningsverktyg möjliggör mätning och kvantifiering av den tredimensionella (3D) organisationen av celltyper i cortex och bör vara allmänt tillämplig på alla vilda typer / knockout-musstudiedesigner.

Introduction

Helhjärnavbildning med encellsupplösning är en viktig utmaning inom neurovetenskapen. Hjärnbilder med cellulär upplösning möjliggör detaljerad analys och kartläggning på systemnivå av hjärnkretsar och hur dessa kretsar störs av genetiska eller miljömässiga riskfaktorer för neuropsykiatriska störningar, cellulärt beteende vid utveckling av embryon samt neurala kretsar i den vuxna hjärnan 1,2,3. Det finns flera histologiska metoder som möjliggör högupplösta bilder av den rekonstruerade 3D-hjärnan; Dessa tekniker kräver dock dyr, specialiserad utrustning, kanske inte är kompatibel med immunmärkning, och den tvådimensionella (2D) karaktären hos vissa metoder kan leda till vävnadsskada och skjuvning under sektionering 4,5.

De senaste framstegen har gett ett alternativt tillvägagångssätt för avbildning av hela hjärnor som inte kräver vävnadssektionering; De handlar om att använda vävnadsrensning för att göra hjärnor transparenta. Transparens uppnås i de flesta vävnadsrensningsmetoder genom att både ta bort lipider, eftersom de är en viktig källa till ljusspridning, och matcha objektets brytningsindex (RI) med RI för provets nedsänkningslösning under avbildning. Ljus kan sedan passera genom gränsen mellan material utan att spridas 6,7,8,9.

Vävnadsrensningsmetoder, såsom iDISCO+, kombineras ofta med snabb 3D-avbildning med hjälp av excitationsmikroskopi med en foton, såsom LSFM 6,7,10. I transparenta vävnader märkta med en fluorofor, ljusark fluorescensmikroskopi bilder sektioner genom excitation med ett tunt plan av ljus11. Den största fördelen med LSFM är att en enda optisk sektion belyses åt gången, med all fluorescens från molekylerna inom den sektionen upphetsad, vilket minimerar fotoblekning. Dessutom möjliggör avbildning av en hel optisk skiva kamerabaserad detektering av den upphetsade skivan, vilket ökar hastigheten i förhållande till punktskanning12. LSFM producerar icke-förstörande välregistrerade optiska sektioner som är lämpliga för 3D-rekonstruktion.

Medan iDISCO + -metoden möjliggör billig vävnadsrensning inom ~ 3 veckor, kan uttorkningssteg i protokollet leda till vävnadskrympning och potentiell förändring av provmorfologin, vilket påverkar volymetriska mätningar 6,10. Genom att lägga till en sekundär avbildningsmetod, såsom MRI, som ska användas före vävnadsrensningsproceduren kan man mäta graden av vävnadsrensningsinducerad krympning över provet. Under uttorkningsstegen kan skillnader i mekaniska egenskaper mellan grå och vit substans leda till deformationer av icke-enhetlig hjärnsubstans, vilket resulterar i olika vävnadsrensningsinducerade volymdeformationer mellan vildtyps- och mutantprover och kan förvirra tolkningar av volymetriska skillnader i dessa prover10,13 . MRT utförs genom att först perfuusera djuret med ett kontrastmedel (t.ex. gadolinium), följt av inkubering av den extraherade vävnaden av intresse i en nedsänkningslösning (t.ex. fomblin) före avbildning14. MR är kompatibel med vävnadsrensning och utförande av LSFM på samma prov.

LSFM används ofta för att skapa storskaliga mikroskopibilder för kvalitativ visualisering av hjärnvävnaden av intresse snarare än kvantitativ utvärdering av hjärnstrukturen (figur 1). Utan kvantitativ utvärdering är det svårt att påvisa strukturella skillnader till följd av genetiska eller miljömässiga förolämpningar. I takt med att vävnadsrensnings- och avbildningstekniken förbättras, tillsammans med minskade kostnader för lagring och datorkraft, blir kvantifiering av celltypslokaliseringar inom vävnaden av intresse mer tillgängliga, vilket gör det möjligt för fler forskare att inkludera dessa data i sina studier.

Med över 100 miljoner celler i mushjärnan15 och helhjärnavbildningssessioner som kan generera terabyte data, finns det ökad efterfrågan på avancerade bildanalysverktyg som möjliggör exakt kvantifiering av funktioner i bilderna, till exempel celler. Det finns en mängd segmenteringsmetoder för vävnadsrensade bilder som tillämpar tröskelvärde för kärnfärgningsintensitet och filtrerar objekt med fördefinierade former, storlekar eller densiteter10,16,17,18. Felaktiga tolkningar av resultat kan dock uppstå på grund av variationer i parametrar som cellstorlek, bildkontrast och märkningsintensitet. Detta dokument beskriver vårt etablerade protokoll för att kvantifiera cellkärnor i mushjärnan. Först beskriver vi steg för vävnadsinsamling av P4-mushjärnan, följt av ett vävnadsrensnings- och immunmärkningsprotokoll optimerat från den offentligt tillgängliga iDISCO + -metoden10. För det andra beskriver vi bildförvärv med hjälp av MR och ljusarkmikroskopi, inklusive de parametrar som används för att ta bilder. Slutligen beskriver och demonstrerar vi NuMorph19, en uppsättning bildanalysverktyg som vår grupp har utvecklat som möjliggör celltypspecifik kvantifiering efter vävnadsrensning, immunmärkning med kärnmarkörer och ljusarkavbildning av kommenterade regioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla möss användes i enlighet med och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of North Carolina at Chapel Hill.

1. Musdissektion och perfusion

OBS: Följande dissektioner utfördes på P4- och P14-möss med hjälp av en spruta. Volymen av perfusionsvätska varierar beroende på djurets ålder.

  1. Perfusion
    VARNING: Paraformaldehyd (PFA) är en farlig kemikalie. Utför alla perfusionssteg i en kemisk rökhuv.
    1. Före operationen, administrera pentobarbital via intraperitoneal injektion (100 mg/kg) och låt bedövningsmedlet träda i kraft.
    2. När djuret har nått ett kirurgiskt anestesiplan, använd tå-klämningsmetoden för att bekräfta att det inte svarar.
    3. Gör ett lateralt snitt under bröstkorgen för att exponera djurets brösthålighet.
    4. Använd en krökt, kirurgisk sax, skär försiktigt genom bröstkorgen upp till nyckelbenet på ena sidan av djuret och gör ett identiskt snitt på motsatt sida, så att bröstbenet kan lyftas bort och exponera hjärtat.
    5. Utan att skada den nedåtgående aortan, trimma försiktigt all vävnad som är ansluten till hjärtat innan du gör ett litet snitt på höger förmak så att blod kan strömma ut ur kärlen.
    6. Använd en sprutbaserad metod och perfusera musen genom vänster kammare med 10 ml och 7 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för P14 respektive P4, med en perfusionshastighet på 1,5 ml/min genom systemet.
    7. När blodet har rensats, perfus igen med 10 ml PBS + 4% PFA och 7 ml PBS + 4% PFA för P14 respektive P4 vid 4 ° C med en perfusionshastighet på 1,5 ml / min för att fixera djuret.
      OBS: Fixeringsskakningar kommer att observeras, och djuret kommer att vara styvt när det är klart. Om du använder MR på prover, perfus med liknande volymer PBS och PFA för varje tidpunkt + 20% gadoliniumbaserat MR-kontrastmedel i PFA-lösningen.
    8. Ta bort huvudet med kirurgisk sax och drop-fix med PBS + 4% PFA i 24 timmar vid 4 ° C för fullständig fixering.
      OBS: I detta skede förblir hjärnan intakt med skallen på (se avsnitt 2). Pauspunkt: hjärnor kan lagras i flera månader i detta skede i PBS + 0,1% natriumazid vid 4 ° C.

2. MR-baserad grov hjärnstrukturavbildning med intakt skalle och analys

OBS: Hjärnan måste perfuseras och inkuberas i gadolinium enligt beskrivningen ovan utan att tas bort från skallen. All MR sker före avlägsnande av hjärnan från skallen för att undvika oavsiktlig vävnadsförlust under dissektion. Avbildning med en intakt skalle ger också stöd till hjärnan i provhållaren (dvs. spruta) under provberedning och avbildning.

  1. Beredning av prov
    OBS: Följande steg är optimerade för P4- och P14-mushjärnprover. Den sprutstorlek som behövs beror på provets fysiska storlek.
    1. Om du utför MR-undersökning på provet, ta bort huden från skallen och inkubera i PBS + 3% gadolinium i 23 dagar vid 4 °C före avbildning14. Skölj proverna snabbt i PBS efter 23 dagar.
    2. Använd 5 ml sprutor för att skapa en provhållare för MR, med hjälp av sprutkolvar för att stänga varje ände av hållaren gjord med sprutan20. Använd plastbitar för att hålla skallen tätt på plats i hållaren (figur 2A). Ta bort markeringarna på sprutan med etanol för att förhindra artefakter vid avbildning.
    3. Placera skallen ordentligt i provhållaren och fyll med en nedsänkningslösning som är kompatibel med MR (se materialförteckningen). Stäng hållaren och ta bort alla luftbubblor med en spruta.
      OBS: Pauspunkt: Skallen kan förvaras i nedsänkningslösningen i flera månader före avbildning.
  2. Grov hjärnstrukturavbildning (MRI)
    1. Avbilda proverna med ett 9,4 T/30 cm horisontellt borrat MR-system för djur med en volymspole på 15 mm och en spinnekobaserad sekvens med följande parametrar: Rumslig upplösning: 60 μm x 60 μm x 60 μm; total skanningstid: 7 timmar 12 min; tid till eko (TE): 6,83 ms; repetitionstid (TR): 40 ms; excitation / omfokusering av vändvinklar: 90/180 grader; bildstorlek: 166 x 168 x 209 voxlar; Synfält (FOV): 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm; bandbredd: 100 000 kHz.
  3. Beräkningsmässig grov hjärnstrukturanalys
    1. Ta bort den omgivande skallen från råa MR-bilder genom att manuellt spåra mushjärnan med hjälp av segmenteringsprogramvara. Applicera sedan den voxelvisa multiplikationsoperationen mellan maskbilden och rå MR-bild för att generera den skalle-strippade hjärn-MR-bilden.
      OBS: Utgången är en binär maskbild där intensiteten för hjärnans voxlar är inställd på 1 och 0 annars.
    2. Använd strikt bildregistrering (uppskattning endast översättning och rotation) med "flirt" i FSL-paketet21,22 för att justera den skallavskalade MR-bilden (rörlig bild) till motsvarande ljusarkmikroskopibild (referensbild).
    3. Tillämpa icke-strikt registrering (med "SyN" i ANTS-programvara23) för att hitta punkt-till-punkt-överensstämmelser mellan den styvjusterade MR-bilden i steg 2.3.2 på ljusarkbilden (samma referensbild i steg 2.3.2).
      OBS: Utgången inkluderar den skeva MR-bilden och deformationsfältet som är associerat med volymändringarna från MRI till ljusarkbilderna.
    4. Beräkna den jacobianska determinanten på deformationsfältet som genereras i steg 2.3.3, som kvantifierar volymförändringen i ett lokalt grannskap på 3 x 3 x 3 voxel.
    5. Justera skalle-strippade bilder till Allen Developmental Mouse Brain Atlas med deformerbar bildregistrering.
      OBS: Den etablerade rumsliga punkt-till-punkt-korrespondensen möjliggör automatisk anteckning av hjärnregioner av intresse i den nya musbilden (figur 2C-H).

3. Hjärndissektion från skallen

  1. Gör ett snitt i mittlinjen längs toppen av skallen från nacken till näsan för att exponera skallen.
  2. Exponera basen av skallen genom att trimma bort den återstående nackmuskeln och alla andra kvarvarande muskler.
  3. Använd en skarp kirurgisk sax, skär försiktigt längs den inre ytan av skallen, var noga med att inte skada hjärnan genom att upprätthålla ett försiktigt uppåtgående tryck medan du skär med den skarpa kirurgiska utrustningen.
  4. Använd pincett för att skala bort de två skurna halvorna av skallen från hjärnan och försiktigt klippa bort överflödigt fett som är fäst vid hjärnan.
  5. Använd en kirurgisk sax för att trimma alla dura som förbinder hjärnan med skallen och använd sedan en spatel för att försiktigt ta bort hjärnan från huvudet.
  6. Ta bort hjärnan, tvätta med PBS och byt sedan till PBS med 0,1% natriumazid och håll vid 4 ° C för långvarig lagring.

4. Rensning av vävnader

OBS: Detta protokoll är anpassat från iDISCO+ -protokollet för P4-möss6, med mindre ändringar. Vissa detaljer kan ändras för olika tidpunkter/arter/experiment). VARNING: Metanol, diklormetan (DCM) och dibensyleter (DBE) är farliga kemikalier. Dessa vävnadsrensningssteg utförs i en kemisk rökhuv.

  1. Validering av antikroppar
    OBS: Metanolkompatibilitet för otestade antikroppar måste kontrolleras eftersom de kan påverkas negativt av de hårda metanoltvättar som krävs i iDISCO+-protokollet. För en lista över antikroppar som har visat sig fungera i iDISCO+, se webbplatsen24.
    1. Skörda 10 μm frysta delar av den PFA-fixerade vävnaden av intresse på stereologiska objektglas.
    2. Inkubera sektionerna i 100% metanol i 3 timmar vid rumstemperatur.
    3. Rehydrera i PBS innan du fortsätter med standardprotokoll för immunhistokemi för att avgöra om antikroppen visar det förväntade mönstret av fluorescens efter metanoltvätt. För positiv kontroll, använd en bild som inte behandlas med metanol.
  2. Förberedelse av buffert
    1. Förbered buffertar enligt det officiella iDISCO-protokollet. Se materialförteckningen för sammansättning av buffertar och andra lösningar som används i detta protokoll.
  3. Förbehandling
    1. Dehydrera provet med metanol / PBS-serien: 20%, 40%, 60%, 80%, 100%; 1 h vardera vid rumstemperatur.
      OBS: Användning av PBS under uttorkning hjälper till att förhindra sprickbildning av proverna i metanoltvättar.
    2. Tvätta provet i 100 % metanol i 1 timme och kyl sedan vid 4 °C i 1 timme innan det inkuberas över natten med skakning i 66 % DCM/33 % metanol vid rumstemperatur.
    3. Tvätta provet 2x i 100% metanol vid rumstemperatur och kyl det sedan vid 4 °C.
    4. Använd färsk 5%H2O2i metanol för att bleka provet över natten vid 4 °C.
    5. Rehydrera provet med metanol / PBS-serien: 80%, 60%, 40%, 20%, PBS; 1 h vardera vid rumstemperatur och tvätta 2x i 1 h i PTx.2 vid rumstemperatur.
    6. Inkubera provet i 1x PBS/0,2% TritonX-100/20% DMSO vid 37 °C över natten.
    7. Inkubera provet i 1x PBS/0,1% Tween-20/0,1% TritonX-100/0,1% Deoxykolat/0,1% NP40/20% DMSO vid 37 °C över natten.
    8. Tvätta i PTx.2 vid rumstemperatur i 1 h två gånger.
  4. Immunmärkning
    1. Inkubera proverna i permeabiliseringslösning vid 37 °C i 2 dagar (~48 timmar).
    2. Blockera proverna i blockerande lösning vid 37 °C i 2 dagar (~48 timmar).
    3. Inkubera proverna med primär antikropp i PTwH / 5% DMSO / 3% Serum vid 37 ° C i 4 dagar (~ 96 timmar) (t.ex. kanin (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1:100) och anti-Ctip2 råtta (Rt) antikropp (1:400) (Materialförteckning).
    4. Tvätta 3 x 1 h i PTwH. Tvätta i ytterligare 2 timmar i PTwH. Låt stå i tvättlösningen över natten vid rumstemperatur.
    5. Inkubera proverna med sekundär antikropp och ett kärnfärgämne, såsom TO-PRO-3, i PTwH / 3% serum vid 37 ° C i 4 dagar (~ 96 timmar; t.ex. get anti-Rb (1:50) och (get anti-Rt (1: 200)) (Materialförteckning).
    6. Tvätta 3 x 1 h i PTwH Tvätta i ytterligare 2 timmar i PTwH. Låt stå i tvättlösningen över natten vid rumstemperatur.
  5. Glänta
    1. Dehydrat i metanol/PBS-serie-20%, 40%, 60%, 80%, 100%-1 h vardera vid rumstemperatur. Inkubera i 3 h, med skakning, i 66% DCM / 33% metanol vid rumstemperatur.
      OBS: Provet kan lämnas över natten vid rumstemperatur omedelbart efter uttorkning i 100% metanol.
    2. Inkubera i 100% DCM i 15 min två gånger vid rumstemperatur (med skakning) för att tvätta MeOH.
    3. Inkubera i dibensyleter (DBE) utan att skaka vid rumstemperatur. Se till att röret fylls nästan helt med DBE för att förhindra oxidation av provet. Avsluta blandningen av lösningen genom att invertera ett par gånger innan du bildar.

5. Ljusarksavbildning

OBS: iDISCO vävnadsrensade hjärnor avbildades med ett ljusarkmikroskop, utrustat med ett 2X / 0.5 NA-mål, en komplementär metalloxidhalvledarkamera och mikroskopoperations- och bildförvärvsprogramvara vid 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel för P4-tidpunkten eftersom detta möjliggjorde encellsupplösning i cortex (figur 3A, B).

  1. Exempel på montering
    1. Montera provet försiktigt i rätt provstorlekshållare så att provet är orienterat med z-dimensionen högst 5,2 mm djup på grund av ljusplåtmikroskopets nominella arbetsavstånd (5,7 mm minus 0,5 mm säkerhetsmarginal)25.
    2. Placera hållaren i provvaggan med hållarens skruv i 45° vinkel mot vaggans stöd (figur 1B). Placera vaggan så att ljusbanan är vinkelrät mot provet (figur 1C).
  2. Parametrar för avbildning
    1. Ställ in zoomkroppen på mikroskopet på 4x förstoring eller högre vilket ger 0,75 μm / pixel.
      OBS: Encelliga beräkningsanalyser på P4-ljusarkbilder kan göras med alla kommersiellt tillgängliga ljusarkmikroskop som tillåter upplösning på 0,75 x 0,75 x 4 μm / voxel eller högre. En lägre upplösning är tillräcklig för hjärnor vid senare tidpunkter där kärnor är mer glest fördelade.
    2. I bildinsamlingsprogrammet väljer du ett enda ljusark med ett NA = ~ 0,08 (9 μm tjocklek / 4 μm z steg).
      OBS: Denna inställning i kombination med horisontell dynamisk fokusering möjliggör avbildning av hela hjärnan vid en encellsupplösning av en mushjärna inom rimlig tid. För en postnatal dag 4 (P4) hjärna uppskattas bildförvärvstiden vara 11-15 timmar för tre kanaler beroende på hjärnans storlek.
    3. För att säkerställa att axiell upplösning bibehålls längs bildens bredd, välj Horisontell dynamisk fokusering och tillämpa det rekommenderade antalet steg beroende på laservåglängden. För en hel P4-mushjärna, ställ in den horisontella dynamiska fokuseringen till 11. Justera finfokus för varje kanal med avseende på registreringskanalen.
      OBS: Här är TO-PRO-3-kanalen (647 nm) registrerad på Allen Developmental Mouse Brain Atlas eftersom detta märker alla kärnor.
    4. Justera lasereffekten per kanal med avseende på kanalegenskaperna.
      OBS: Längre våglängder kräver högre lasereffekt jämfört med kortare våglängder. Till exempel måste 780 nm avbildas med hög lasereffekt (70% - 75%) och låg exponering (50 ms), medan 647 nm-kanalen kräver en genomsnittlig lasereffekt (40% - 45%) och låg exponering (50 ms).
    5. Justera ljusarkets bredd till ~50 % för att säkerställa att arkets effekt fördelas optimalt i y-dimensionen för den här provstorleken.
      OBS: I kombination med den horisontella dynamiska fokuseringen ger en bredd på 50% ark en genomsnittlig fördelning av effekt över bilden med minskad risk för fotoblekning25.
    6. Ange antal paneler i förhållande till provets storlek med en rekommenderad överlappning på 15 % mellan paneler och ta bilder för varje kanal sekventiellt för varje stapel vid en viss panelposition.

6. Bildbehandling med NuMorph

NuMorph-pipelinen har tre huvuddelar för 3D-bildanalys: förbehandling, analys och utvärdering. Dessa delar har organiserats i NMp_template.m, NMa_template.m respektive NMe_template.m, som diskuteras nedan. Dessutom läggs NM_setup.m till för att ladda ner och installera programvarupaket som behövs för att NuMorph ska fungera smidigt. NM_samples.m tillhandahåller också en mall för att mata in bildförvärvsinformation.

  1. NuMorph-inställning
    1. Ladda ned och installera conda-miljöhanteraren för Linux26. Ladda ner och installera NuMorph19 bildbehandlingsverktyg.
    2. På kommandoraden kör du Matlab. Kör NM_setup.m från NuMorph för att ladda ner och installera programvarupaket för bildanalyser som behövs för analyser.
      OBS: Det här steget säkerställer att conda-miljön är korrekt konfigurerad samt säkerställer att alla verktyg och tillägg som behövs för att Matlab ska kunna köra var och en av de tre pipelines laddas ned och installeras korrekt. Mest anmärkningsvärt här är Elastix för att köra registrering och 3D-Unet för celldetektering och räkning.
  2. Ange exempelnamn, indata- och utdatakataloger, kanalinformation och bildparametrar för ljusark genom att redigera filen NM_samples.m.
    OBS: Här rekommenderas att dubbelkolla för att se till att rätt information, särskilt bildinmatningskatalogen, är korrekt angiven. Fel kallas vanligtvis inte här förrän efterföljande steg körs.
  3. Förbehandling av bilder
    1. Justering av intensitet
      1. I NMp_template, ställ in intensitetsjustering = sant.
        OBS: Ställ in på true om intensitetsjustering krävs. Om inte, ställ in intensitetsjustering = falskt. Det finns också ett alternativ att använda "uppdatera" för att skriva över tidigare justeringsparametrar.
      2. Ange använd bearbetade bilder = falskt när du arbetar med en ny uppsättning bilder. Annars anger du eventuella tidigare sparade bilddatauppsättningar i utdatakatalogen (t.ex. "justerad", "sydd") som ska användas för efterföljande bearbetningssteg.
        OBS: Det här alternativet tillhandahålls om indatabilder redan har förbearbetats. I det här fallet kommer förbehandlade bilder att användas som indatabilder och alternativet kommer att ställas in på namnet på underkatalogen i utdatakatalogen.
      3. Ställ in spara bilder = sant.
        OBS: Genom att använda det här alternativet säkerställer du att bearbetade bilder sparas i utdatakatalogen; Annars beräknas och sparas endast parametrar.
      4. Ange spara exempel = sant.
        OBS: Detta alternativ säkerställer att provresultat sparas för varje större steg.
      5. Ställ in justera kakelskuggning = grundläggande för att tillämpa skuggningskorrigering med BaSiC-algoritmen27 eller manuell för att tillämpa korrigering av kakelskuggning med hjälp av mätningar från ljusarkmikroskopet vid specifika ljusarkbredder.
        OBS: Detta alternativ korrigerar för den ojämna belysningen längs y-dimensionen som orsakas av formen på arkets midja.
    2. Justering av bildkanal
      1. I NMp_template anger du kanaljustering = sant. Ställ in det här alternativet på true om kanaljustering krävs. Om inte, ställ in på false. Ange kanaljusteringsmetod till antingen översättning (stel) eller elastix (icke-styv).
        OBS: Översättningsmetoden använder styva 2D-registreringsmetoder för att justera flera kanaler medan elastix-metoden använder icke-styva B-splines28 för att korrigera för rotationsdrift, vilket kan uppstå under lång bildförvärv19.
    3. Iterativ bildsömnad
      1. I NMp_template ställer du in stygnbilder = sant.
        OBS: Ställ in det här alternativet på true om sömnad krävs.
      2. Ställ in siktförfining = sant.
        Det här alternativet används för att ytterligare förfina översättningen i xy med hjälp av Scale Invariant Feature Transform29.
      3. Ställ in belastningsjusteringsparams = true.
        OBS: Det här alternativet använder kanaljusteringsöversättningarna under sömnad. Det här alternativet rekommenderas med flerkanalsavbildning. Annars ställer du in på false.
      4. Ange överlappning = 0,15 för att matcha panelöverlappningar under avbildning.
    4. Om du vill köra något av dessa förbearbetningssteg kör du följande i Matlab utanför NMp_template miljö:
      1. Ange exempelnamn. Ställ in config = NM_config(process, exempel).
      2. Kör något av förbearbetningsstegen genom att ange NM_process(config,stage) och ange stadiet med intensitet, justering eller sammanfogning för någon av processerna. Kontrollera utdatakatalogen för utdatafiler för vart och ett av stegen (bild 3 och bild 4).
  4. Bildanalys
    1. Före NuMorph
      1. Börja med en 3D-atlasbild och en tillhörande anteckningsbild som tilldelar varje voxel till en viss struktur.
        OBS: P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas genererad från MagellanMapper30 används här.
      2. Justera både atlasbilden och anteckningsfilen för att säkerställa att de matchar korrekt i rätt riktning.
    2. Inom NuMorph
      OBS: Nu när atlasen och dess anteckningar är korrekt justerade måste filerna "munged" eller bearbetas i NuMorph så att de kan sparas för senare användning. Det gör du genom att använda funktionen munge_atlas för att ange indata enligt nedan.
      1. Ange Atlas_file: (sträng). Ange den fullständiga sökvägen till atlasfilen.
      2. Ange Annotation_file: (sträng). Ange den fullständiga sökvägen till de associerade anteckningarna.
      3. Ange upplösning: (1x3 numerisk). Ange atlasen y,x,z upplösning som mikron per pixel.
      4. Ange orientering: (1 x 3 tecken). Ge atlasorienteringen och se till att den matchar inställningen för provet i vaggan (främre (a) / bakre (p), överlägsen (s) / underlägsen (i), vänster (l) / höger (r)).
      5. Ange halvklot: Ange vilken hjärnhalva som avbildades ("vänster", "höger", "båda", "ingen").
      6. Ange out_resolution:(int). Ange den isotropa upplösningen för atlasutdata i mikron. (standard: 25).
      7. Kör kommandot "munge_atlas(atlas_file, annotation_file, resolution, orientation, hemisphere)" för att generera munged anteckningar i /data/annotation_data och en kopia av atlasbilden i /data/atlas.
      8. Läs Matlab-strukturen och atlasfilen för att verifiera att båda filerna är korrekt munged i rätt riktning.
        OBS: Ett ytterligare cellklassificeringssteg kan utföras för att kvantifiera celltyper baserat på samlokalisering av immunmärkta proteinmarkörer.
    3. Omsampling
      1. I NMa_template anger du omsampla bilder = true om du utför bildregistrering för att referera till atlasen eller för att generera nedsamplade volymer av högupplösta datauppsättningar.
        OBS: NMa_template.m kommer att användas för att ställa in parametrarna för omsampling, registrering, kärndetektering och cellräkning.
      2. Ange upplösningen för omsampling så att den matchar atlasen.
        OBS: Här används 25 μm3/voxel isotrop upplösning eftersom referensatlasen har denna upplösning.
      3. Ange det kanalnummer som ska samplas om med hjälp av omsamplingskanaler = [ ].
        OBS: Här är kanalnumret inställt på att matcha kärnkanalen. Om det här alternativet är tomt kommer endast registreringskanalen att samplas om.
    4. Registrering
      1. I NMa_template anger du registerbilder = sant. Ange till true om registrering krävs. Om inte, ställ in registrering = false.
      2. Ange atlasfilen som ska matcha filen i atlaskatalogen.
      3. Ange registreringsparametrar = standard.
        OBS: Det här alternativet använder en affine följt av B-splinetransformation för att uppskatta rumslig korrespondens. Annars definierar du en ny uppsättning registreringsparametrar via Elastix i /data/elastix_parameter_files/atlas_registration.
      4. Ange spara registrerade bilder = sant.
        Utdatafiler från registrering och omsampling kan laddas ner och inspekteras visuellt i Matlab eller andra visualiseringsverktyg som FIJI31.
    5. Kärndetektering, cellräkning och klassificering
      OBS: Fel som uppstår här kan bero på att du inte anger anteckningsfilen korrekt eller inte matchar provets ålder med rätt anteckning.
      1. I NMa_template ställer du in både räkna kärnor och klassificera celler = sant.
      2. Ställ in räkningsmetod = 3dunet.
        Det här alternativet tillåter användning av den tränade 3D-Unet-modellen19. Annars väljer du Hessian som använder den hessiska blobidentifieringsmetoden.
      3. Ange min_intensity för att definiera en minimiintensitetströskel för identifierade objekt.
        OBS: Ett lämpligt tröskelvärde bestäms empiriskt baserat på signal-brusförhållandet för kärnmärkning.
      4. Ange classify_method till endera tröskeln, som baseras på en oövervakad fluorescensintensitet vid centroidpositioner eller svm, som modellerar en övervakad linjär stödvektormaskin (SVM) klassificerare.
        OBS: Detta steg klassificerar alla upptäckta celler i fyra huvudklasser med 3-kanals avbildning. Med detta protokoll genereras Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2+, Ctip2-/Brn2-, och Outliers.
    6. Steg för analys
      1. Ange exempelnamn. Ställ in config = NM_config(analys, prov).
      2. Kör något av analysstegen genom att ange NM_analyze(config,stage) och ange steget med hjälp av resample, register, count eller classify. Kontrollera utdatakatalogen för utdatafiler för vart och ett av stegen (bild 5).
    7. Celltypsklassificering och gruppanalys
      1. I NMe_template anger du update = true och skriver över all tidigare statistik som beräknats.
        OBS: NMe_template.m ger möjlighet att utföra gruppanalys av celltyp över hjärnregioner i samma hjärna som analyseras.
      2. Ange compare_structures_by till antingen index för att jämföra med alla unika anteckningar eller tabell för att jämföra strukturer enligt tabellen.
      3. Ange template_file, som anger alla möjliga strukturindex och måste finnas i /annoteringar.
      4. Ange structure_table och ange strukturer som ska utvärderas.
      5. Ange cellräkning och celltypsklassificering enligt beskrivningen i NMa_template.m.
      6. Ange compare_groups för att ange grupper som ska jämföras.
      7. Ställ in parat på antingen sant eller falskt för att antingen utföra parat t-test eller två-prov t-test.
    8. Kör analys.
      OBS: För att utföra det här steget, kör följande i Matlab utanför NMe_template.m-miljö.
      1. Ange exempelnamn. Ange config =NM_config(evaluate,sample).
      2. Kör analyssteget genom att ange NM_evaluate(config,stage) och ange steget. Kontrollera utdatakatalogen för utdatafiler för gruppanalysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Eftersom iDISCO+-protokollet introducerar betydande vävnadskrympning, vilket lätt märks av ögat (figur 2B), lade vi till ett MR-steg i denna pipeline före vävnadsrensning för att kvantifiera krympningen som induceras av vävnadsrensning. Arbetsflödet börjar med att ta bort icke-hjärnvävnaden från MR-bilden (figur 2C). Därefter appliceras en styv transformation (3 översättnings- och 3 rotationsvinklar) för att justera MR-bilden till ljusarkbilden (figur 2D). Genom att göra det observerade vi en total volymförlust på 60% inducerad av vävnadsrensningsproceduren (figur 2E), vilket överensstämde med uppskattningar av volymförändringar per öga (figur 2B). Detta resultat skiljer sig ganska mycket från en tidigare rapport där en krympning på 5%-10%10,32 rapporterades. Skillnaden i krympning kan orsakas av skillnaden i djurålder mellan de två studierna (P4 jämfört med vuxna hjärnor) eller på tidsskillnader i metanoltvätten i rensningssteget i iDISCO+-protokollet (16 h mot 2 h). För att kartlägga grader av vävnadskrympning över olika regioner i hjärnan använde vi ytterligare en deformerbar bildregistrering där ljusarkbilden används som referens. Den registrerade MR-bilden visas i (figur 2F). Den uppskattade volymförändringen på grund av vävnadsrensningsproceduren är färgkodad, där en större grad av krympning observeras i cortex jämfört med andra hjärnregioner (figur 2G).

För att mäta volymer av hjärnregioner utförde vi segmentering av MRI genom registrering till en kommenterad atlas. Segmenteringen av MR-avbildade hjärnor ansågs framgångsrik om referensatlasöverlägget nära matchade de anatomiska gränserna som identifierades av skillnader i kontrast i de råa MR-bilderna (figur 2H). Överlägget under registreringen är beroende av god provberedning (figur 2A), bildförvärv och skalleborttagning. Skallborttagningssteget är avgörande för bra registreringsresultat eftersom registreringen kommer att försöka förvränga referensbilden från atlasen till hela MR-bilden, inklusive eventuell skalle som finns kvar i bilden. Skallinkludering i registrering kan snedvrida resultaten och ge en felaktigt registrerad 3D-volymåtergivning av segmenteringen. Den slutliga 3D-volymåtergivningen kan sedan visualiseras med ITK-SNAP33 (figur 2H). Denna metod används för att bedöma grova skillnader i hjärnvolym mellan provgrupper. Den cellulära basen som ligger till grund för volymskillnader som upptäckts med MR kan eftersträvas med hjälp av cellräkning med vävnadsrensning, ljusarkmikroskopi och NuMorph.

Målet med vävnadsrensning och analys är att bedöma olika celltypers bidrag till skillnader mellan experimentella förhållanden (t.ex. genotyp, miljöexponering) genom att räkna enskilda kärnor med hjälp av NuMorph. Vävnadsrensning med hjälp av iDISCO+-protokollet och neuronala skiktspecifika kärnmarkörer resulterade i tydligt definierade cellgrupper av övre och nedre skiktneuroner i isocortexen (figur 3).

Cellräkning med NuMorph är beroende av framgångsrika förbehandlingssteg som involverar intensitetsjustering, kanaljustering och sömnad (figur 4A). Fel som uppstår i något av dessa steg kan leda till felaktig sömnad (figur 4B,C). Till exempel kan felaktig bildinsamling resultera i bilder med in-focus och out-of-focus mönster under förbehandling (figur 4C). För att räkna kärnor från specifika hjärnregioner kommenteras de sydda bilderna med hjälp av en offentligt tillgänglig atlas. Vi registrerade våra sydda bilder till en korrigerad version av P4 Allen Developmental Mouse Brain Atlas34. Här nedsamplades de sydda bilderna från en hög upplösning (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) till en lägre upplösning (25 μm³/voxel isotrop upplösning) för att matcha atlasens upplösning. Matchning av atlasens upplösning säkerställer korrekt registrering av bilderna till atlasen och ger regionala anteckningar i de förvärvade bilderna (figur 5A).

För att utföra specifik celltypsspecifik räkning märkte vi övre lagerneuroner som uttrycker Brn2, neuroner i nedre lagret som uttrycker Ctip2 och alla kärnor med TO-PRO-3 (figur 3B). Avbildning utförs med tillräcklig rumslig upplösning för att separera enskilda kärnor (0,75 x 0,75 x 4 μm3/voxel). Kärnornas centroider detekteras med en tränad 3D-Unet-modell i NuMorph (figur 5B,C). Vi upptäckte ~ 12 × 10 6 totala kärnor som var To-Pro-3+ i isocortexen, inklusive ~ 2,6 × 10 6 Brn2+ och 1,6 × 106 Ctip2+ kärnor. Vi detekterade också ~ 3,7 × 10 6 och 2,9 × 106 To-Pro-3+ totala kärnor i de basala ganglierna respektive hippocampus allocortex. Cirka 1,5 × 10 6 och <1 × 106 Ctip2+ celler räknades i de basala ganglierna respektive hippocampusallocortexen, även om ett försumbart antal Brn2+ -celler detekterades (figur 5D). Det totala antalet kärnor i isocortex och hippocampus allocortex kombinerat (~ 15 miljoner celler) liknar tidigare rapporterade totala cellantal i hjärnbarken hosmusen 15. Dessa resultat visar nyttan av MRI-avbildning, iDISCO + vävnadsrensningsmetodik och NuMorph-beräkningsanalys för att avslöja volymetriskt, totalt cellantal och celltypspecifika räkningar som ligger till grund för skillnader i mushjärnstruktur över experimentella grupper.

Figure 1
Figur 1: Översikt över encellsanalys av hela hjärnan av intakta neonatala 3D-vävnadsrensade mushjärnor. (A) Översikt över iDISCO+ vävnadsröjning, ljusarksavbildning och 3D-bildanalys. (B) Bilder som visar korrekt provmontering på ljusarkmikroskopet. (C) Tecknad film som visar provmontering i förhållande till ljusplåtsbanan. Förkortning: ab = antikropp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Grova hjärnstrukturmätningar med MR. (A) Bild som visar provberedning för MR. (B) Bilder av representativa P4-hjärnor före och efter iDISCO+ vävnadsrensning. Skalstreck = 5,0 cm. (C) Rå MR-bild med skalle fäst vid 60 x 60 x 60 μm³. Skalstreck = 800 μm. (D) Ljusbild av mushjärnan vid 25 x 25 x 25 μm³. Total volym = 68,7 mm3. Observera att en liten del av dorsal isocortex oavsiktligt avlägsnades under dissektion markerad med pilspets (vit). Skalstreck = 800 μm. (E) MR-bild av mushjärna efter skalleborttagning och styv registrering. Total volym = 171,9 mm3. Infoga (gul) visar hjärnkonturen från ljusarkbilden. Skalstreck = 800 μm. (F) Registrerad MR-bild med hänvisning till ljusarksbild för att bedöma deformation. Skalstreck = 800 μm. (G) Voxel-vis hjärnkartläggning för att bedöma volymförändringar mellan ljusarkbild och MR-bild där blått och rött indikerar krympning och expansion från MR-bild till ljusarkbilden. Sammantaget var det en volymförlust på 60%, men vissa regioner som isocortex visade större krympning i förhållande till andra. (H) Vänster panel: Axiell vy av MR-bild med registrerade segmenteringar från Allen Developmental Brain Atlas överlagrad. Höger panel: 3D-volymåtergivning av segmentering. Skalstreck = 800 μm. Förkortningar: OB = luktlampa; Dpall = dorsal pallium / isocortex; Mb = mellanhjärnan; Cb = lillhjärnan. Orientering: R = Rostral; L = Lateral; D = Dorsal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3: Bilder med cellulär upplösning och kanaljustering. (A) Optisk axiell sektion av TO-PRO-3 (TP3) kärnfärgning och immunmärkning för Ctip2 (nedre lagret neuron) och Brn2 (övre lagret neuron) markörer i P4 mushjärna. Skalstång = 1 mm. (B) Förstorad insats av kortikala områden i A (ruta) som visar korrekt kanalinriktning med förväntad lokalisering av Brn2-immunomärkta övre lager och Ctip2-immunomärkta nedre lagerneuroner. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Bild 4: Exempel på bildsömnad . (A) Provresultat från en 2D-iterativ, korrekt sydd bild. Skalstång = 1 mm. Infoga visar ett exempel på korrekt inzoomad sömnad. Skalstreck = 500 μm. (B) Provresultat från en 2D-iterativ, felaktigt sydd bild. Skalstång = 1 mm. Infoga visar ett exempel på felaktiga sömmar inzoomade (överhäng). Skalstreck = 100 μm. (C) Provresultat från en 2D-iterativ felaktigt sydd bild. Skalstång = 1 mm. Infoga visar ett exempel på felaktiga sömmar inzoomade (ur fokus). Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Bild 5: Bildregistrering med låg upplösning, högupplöst kärndetektering och cellräkning i P4-mushjärnan. (A) Vänster panel: Ett exempel på en z-skiva från hela hjärnans ljusark 3D-bilder omsamplade till 25 μm isotrop upplösning. Skalstång = 1 mm. Mittpanel: Anteckningar från Allen Developmental Brain Atlas (P4) registrerade i mikroskopibilden. Skalstång = 1 mm. Höger panel: Överlägg av vänster och mellersta paneler. Skalstreck = 1 mm. (B) Exempel på en intensitetsjusterad sydd bild i axiell vy. Det boxade området visas i (C). Skalstreck = 1 mm. (C) Automatisk detektering av kärnor (röd). Skalstreck = 50 μm. (D) Kvantifiering av celltyper i olika hjärnregioner i P4-hjärnan (Basala ganglier, Hippocampal Allocortex och Isocortex). Röd = Övre lagerneuroner märkta med Brn2, Grön = Nedre lagerneuroner märkta med Ctip2 och Blå = alla kärnor märkta med To-Pro-3-färgämne. Förkortningar: DPall = Dorsal pallium (isocortex); MPall = Medialt pallium (hippocampus allocortex); CSPall = Central subpallium(klassiska basala ganglier). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

NuMorph-analyssteg Beräknad tid
Justering av intensitet 1 timme
Kanaljustering 2 minuter
2D Iterativ sömnad 12 timmar
Omsampling 3 minuter
Registrering 3 minuter
Cellräkning 5 timmar
Cell klassificering 10 minuter

Tabell 1: NuMorph-analystider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vävnadsrensningsmetoder är användbara tekniker för att mäta 3D-cellulär organisation av hjärnan. Det finns en mängd vävnadsrensningsmetoder som beskrivs i litteraturen, var och en med sina fördelar och begränsningar 6,7,8,9. Alternativen för beräkningsverktyg för att analysera celltyperna i de vävnadsrensade bilderna är relativt begränsade. Andra tillgängliga verktyg har implementerats för att glesa cellpopulationer där segmentering är mindre svår 10,35 eller har utnyttjat vävnadsutvidgningen16. Detta dokument beskriver beredningen av en mushjärna för avbildning med iDISCO + vävnadsrensning och demonstrerar NuMorph, en beräkningsrörledning för bearbetning och kvantifiering av kärnor inom strukturer i en muscortex som fångats av LSFM. Den är utformad för att hitta en lämplig balans mellan längden på bildtiden, detekteringsnoggrannheten hos cellkärnor och beräkningsresurser. Denna pipeline står i kontrast till andra för närvarande tillgängliga verktyg genom att på ett tillförlitligt sätt segmentera alla kärnor, snarare än glesa populationer av märkta celler 10,36,37. Vi har tidigare visat att celldetekteringsnoggrannheten är hög, med betydligt kortare avbildningstider och mycket reducerade förvärvade datastorlekar för förvärv av hela halvklotet jämfört med andra metoder19. NuMorph adresserar ett antal viktiga utmaningar för analys av flerkanaliga ljusarkbilder, till exempel att tillhandahålla verktyg för kanaljustering, korrigera för scenrörelser med ett sömnadsverktyg och korrigera signalljusstyrkan i bildpanelerna. Arbetsflödet som presenteras i detta dokument är användbart för det bredare vetenskapliga samfundet och tillgängligt för alla grupper i forskningsinstitutioner. En översikt över processen finns i figur 1.

Det finns flera kritiska steg under hela denna process från musperfusion till beräkningsanalys som kan påverka nedströmskvaliteten på bilder, kvantifiering och resultat. Det är viktigt att perfusionen utförs så att allt blod avlägsnas från hjärnan, eftersom blodkärlen har en naturlig autofluorescens som påverkar intensiteten i bilderna och kommer att kräva justeringar i rörledningen, vilket påverkar resultaten negativt. Varaktigheten av PFA-fixeringen är också avgörande, eftersom att lämna hjärnorna nedsänkta i 4% PFA längre än 24 timmar kan leda till "överfixering" av provet och leda till sprickbildning i hjärnan, som blir spröd under iDISCO + -processen. iDISCO-protokollet som beskrivs ovan har modifierats något från det officiella protokollet som finns på webbplatsen24. En viktig modifiering är tillsatsen av PBS till metanol / PBS-serien, istället för vatten i det ursprungliga protokollet. Detta för att förhindra kortikal sprickbildning i embryonala och tidiga postnatala hjärnor, vilket sannolikt uppstår på grund av ofullständig utveckling av gliaceller, axonala projektioner och extracellulär matris. Beroende på vävnaden som används i detta protokoll kan modifieringar behöva göras vid varje steg i iDISCO + -protokollet, såsom att ändra antikroppskoncentrationer och öka inkubationstiderna för större vävnadsprover, för att optimera de ideala parametrarna för att fånga den valda markören och analysera den exakt.

Det är känt att vävnadskrympning sker under iDISCO+-vävnadsrensningsprocessen, vilket sedan kan ändra volymetriska mätningar nedströms 6,10. Alternativa metoder, t.ex. MR-undersökningar som utförts före vävnadsrensning, kan användas för att bestämma omfattningen av eventuella förändringar i vävnadsstorlek i kontroller jämfört med försöksdjur för att avgöra om några volymetriska skillnader beror på studerad fenotyp och inte på vävnadsrensningsprocessen. Heterogena förändringar i volymerna av mutanternas kortikala regioner kan variera beroende på det regionala cellulära innehållet, eftersom hjärnans grå och vita substans kan påverkas differentiellt av metanoluttorkningarna. MR-data kan användas för att avgöra om vävnadskrympning är ojämn i hjärnans delregioner (figur 2G), och eventuella förändringar som uppstår av clearingprotokollet kan justeras för i nedströms beräkningsanalys. Dessutom använder iDISCO + -processen hårda metanoltvättar för att dehydrera provet, vilket kan leda till skador eller förändringar i vissa antigener på kärnytorna. Det rekommenderas att alla antikroppar som används först testas på hjärnvävnadssektioner som har tvättats i ~ 3 timmar i 100% metanol för att säkerställa att antikroppen är kompatibel med iDISCO + -protokollet.

För stora datauppsättningar som kräver långa bearbetningstider rekommenderar vi att du använder versionen av MATLAB i Linux utan fönster som tillåter strategier som att implementera kommandot "nohup", som fortsätter att köra en process även efter att anslutningen till en server har gått förlorad. Vidare kräver NuMorph hög datorkraft, så vi rekommenderar minst 10 GB minne för analyser. Vi analyserar proverna med hjälp av en Linux-arbetsstation som kör CentOS 7, som är utrustad med en 2, 6 GHz 14-kärnig processor, 8 x 64 GB DDR4 2400 LRDIMM-minne, 4 x 11 GB GPU: er och 2 x 4 TB externa SSD-enheter. De råa ljusarkdata som användes här var 620 GB och minneskravet för processerna var 10 GB. Här har vi inkluderat en tabell med de beräknade tiderna för att slutföra varje steg i NuMorph-analyserna som visas i tabell 1.

Bildförbehandlingsstegen innebär intensitetsjustering i xy-dimensionen för varje z-plan, kanaljustering och sömnad. Bildintensiteten justeras för att ta hänsyn till skillnader i intensitet mellan plattor och ojämn belysning längs y-dimensionen. Skillnaden i intensitet uppstår på grund av inneboende tekniska egenskaper hos ljusarket när det avbildar mellan plattor25. Därefter utförs kanaljustering för att säkerställa att bildkanalerna justeras korrekt i en flerkanalig avbildning. Detta steg rekommenderas eftersom varje kanal i flerkanalig avbildning förvärvas individuellt och subtila rörelser i scenen kan orsaka provdrifter och resultera i rumslig feljustering19. Slutligen sys brickorna per z-plan ihop för att bilda en enda bild i varje z-plan. I slutändan kommer det att finnas en bunt sydda bilder per kanal som representerar hela volymen av provet. Den iterativa bildsammanfogningen baseras på en anpassad metod för att organisera alla 2D-bilder per kanal i en 3D-volym i exemplet19. Metoden implementerar först en parvis z-korrespondens i axiell riktning för att matcha kakelregioner som överlappar varandra i både horisontell och vertikal riktning. Den slutliga z-förskjutningen för varje bricka bestäms med hjälp av det minsta spännträdet38. 2D-iterativ sömnad utförs i en stapel som börjar på en plats i mitten av stapeln med mindre bakgrundssignal. Den övre vänstra panelen placeras först för varje sömnads-iteration för att förhindra subtil förskjutning av bilder i z-dimensionen.

Vi rekommenderar att du kör var och en av förbearbetningspipelinen sekventiellt, särskilt när du optimerar för att korrigera för fel. De stora problemen uppstår ofta under sömnadsstegen. Ett problem som kan uppstå är felaktig bildförvärv på ljusarket. Detta problem kan uppstå när den horisontella dynamiska fokuseringen är felaktigt inställd på ljusarket och kan resultera i alternerande infas-/out-of-phase-mönster i bilderna (figur 4B,C). Ytterligare fel kan uppstå om provet inte var tätt säkrat och betydande provrörelse inträffade under förvärvet. I dessa fall kan det hända att exakta sömmar inte är möjliga på grund av brist på parvis korrespondens mellan intilliggande plattor. Andra potentiella fel kan härröra från stygnstartplatsen. NuMorph bestämmer stygnstartplatsen ungefär i mitten av stapeln. Men när det finns betydande bakgrund på startsegmentplatsen kan fel uppstå i parvis jämförelse i bildpaneler. Det rekommenderas här att välja en startplats som har ett högt signal-brusförhållande.

Bildanalysen som beskrivs här inkluderar bildomsampling av sydda bilder från hög upplösning (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) till en lägre isotrop upplösning på 25 μm³/voxel. Vi samplar om de sydda bilderna från kärnkanalen för att registrera de sydda bilderna till Allen Developmental Mouse Brain Atlas i nästa steg34. Celler räknas sedan för varje kanal i kommenterade regioner i bilderna med hänvisning till atlasen med hög upplösning (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voxel) med hjälp av en tränad 3D-Unet modell19. Den här metoden kan också användas för att identifiera och räkna blobobjekt. När vi utvecklade NuMorph testade vi segmenteringsnoggrannhet i förhållande till helt nya bilder som aldrig setts under träning som var från samma vävnadsrensningsprocedur, samma mikroskop och samma kärnetikett som hittade precision på 0,99 och återkallelse av 0,9419. NuMorph-noggrannhet har ännu inte testats på olika vävnadsrensningsprocedurer, mikroskop eller markörer; därför är noggrannheten i segmenteringen i andra experimentella mönster okänd. Standardatlasen i NM_setup.m är den vuxna Nissl-färgade Allen ReferenceAtlas 39 med den tredje iterationen av Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework (CCFv3) som anpassad anteckning.

Även om NuMorph effektivt analyserar vävnader, som är relativt täta, såsom den vuxna musbarken, kan mer utmanande experimentella mönster (såsom embryonala mushjärnor eller mycket täta strukturer som lillhjärnan) kräva utveckling av ytterligare beräkningsverktyg. Nuvarande community-baserade insatser försöker producera adekvata anteckningsdata för träning av djupinlärningsmodeller som används för att segmentera dessa svårare fall40. Framsteg inom ljusarksavbildningsteknik möjliggör kvantitativ undersökning av subcellulära strukturer med hög genomströmning, med nya tillvägagångssätt som dual-view inverterad selektiv planbelysningsmikroskopi (diSPIM) som leder till ökad upplösning och noggrannhet i celltäta hjärnregioner40,41. När framsteg inom vävnadsrensning, avbildning och beräkningsverktyg som är involverade i denna forskning utvecklas, hoppas vi att de kommer att leda till bredare användning av vävnadsrensningsmetoder för kvantitativa analyser av hur neuropsykiatriska störningar kan härröra från förändringar i hjärnstrukturen inducerade av genetiska eller miljömässiga riskfaktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH (R01MH121433, R01MH118349 och R01MH120125 till JLS och R01NS110791 till GW) och Foundation of Hope. Vi tackar Pablo Ariel från Microscopy Services Laboratory för att ha hjälpt till med provavbildning. Microscopy Services Laboratory vid Institutionen för patologi och laboratoriemedicin stöds delvis av Cancer Center Core Support Grant P30 CA016086 till University of North Carolina (UNC) Lineberger Comprehensive Cancer Center. Neuroscience Microscopy Core stöds av bidrag P30 NS045892. Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes delvis av North Carolina Biotech Center Institutional Support Grant 2016-IDG-1016.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner Bruker Biospec Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether Sigma-Aldrich 108014-1KG
Dichloromethane (DCM) Sigma-Aldrich 270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher-Scientific ICN19605590
Donkey serum Sigma-Aldrich S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y Speciality Fluids Company YL-VAC-25-6 perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance) Bracco Diagnostics A9576
gadolinium contrast agent(ProHance) Bracco Diagnostics 0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU EVGA 08G-P4-6286-KR
Glycine Sigma-Aldrich G7126-500G
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-10KU Dissolved in H2O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30% Sigma-Aldrich H1009-100ML
ImSpector Pro LaVision BioTec Microscope image acquisition software
ITK Snap segmentation software
Methanol Fisher-Scientific A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) Sigma-Aldrich 30525-89-4 Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) Corning 46-013-CM Diluted to 1x in H2O
Sodium Azide Sigma-Aldrich S2002-100G Dissolved in H2O to 10%
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750-10G
Tergitol type NP-40 Sigma-Aldrich NP40S-100ML
TritonX-100 Sigma-Aldrich T8787-50ML
Tween-20 Fisher-Scientific BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4 Intel E5-2690
Zyla sCMOS Camera Andor Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit Thermofisher Scientific A11369 (1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat Thermofisher Scientific A11077 (1:200)
Rat anti-Ctip2 Abcam ab18465 (1:400)
Rabbit anti-Brn2 Cell Signaling Technology 12137 (1:100)
To-Pro 3 (TP3) Thermofisher Scientific T3605 (1:400)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  2. Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
  3. Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
  4. Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
  5. Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
  6. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  8. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  11. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
  12. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
  13. Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
  14. Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
  15. Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
  16. Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
  17. Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
  18. Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
  19. Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
  20. Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
  21. Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
  23. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
  24. iDISCO method. , Available from: https://idisco.info/ (2022).
  25. Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).
  26. Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022).
  27. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
  28. Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
  29. Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
  30. Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104 (2020).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
  33. ITK-SNAP home. , Available from: http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php (2022).
  34. Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
  35. Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
  36. Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
  37. Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
  38. Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
  39. Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
  40. Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
  41. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

Tags

Neurovetenskap utgåva 186
Helhjärna encellig avbildning och analys av intakta neonatala mushjärnor med hjälp av MR, vävnadsrensning och ljusarkmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., … More

Kyere, F. A., Curtin, I., Krupa, O., McCormick, C. M., Dere, M., Khan, S., Kim, M., Wang, T. W. W., He, Q., Wu, G., Shih, Y. Y. I., Stein, J. L. Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy. J. Vis. Exp. (186), e64096, doi:10.3791/64096 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter