Neuroscience

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Published: August 1, 2022 doi: 10.3791/64096

Felix A. Kyere*^1,2, Ian Curtin*^1,2, Oleh Krupa^1,2, Carolyn M. McCormick^1,2, Mustafa Dere³, Sarah Khan^3,7, Minjeong Kim⁷, Tzu-Wen Winnie Wang^4,5,6, Qiuhong He^4,5,6, Guorong Wu³, Yen-Yu Ian Shih^4,5,6, Jason L. Stein^1,2

¹UNC Neuroscience Center, University of North Carolina, Chapel Hill, ²Department of Genetics, University of North Carolina, Chapel Hill, ³Department of Psychiatry, University of North Carolina, Chapel Hill, ⁴Center for Animal Magnetic Resonance Imaging, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁵Biomedical Research Imaging Center, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁶Department of Neurology, The University of North Carolina at Chapel Hill, ⁷Department of Computer Science, The University of North Carolina at Greensboro

* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, iDISCO + kullanarak bozulmamış fare beyinlerinin manyetik rezonans görüntüleme, temizleme ve immünoetiketleme yöntemlerini açıklar, ardından ışık tabakası mikroskobu kullanılarak görüntülemenin ayrıntılı bir açıklaması ve NuMorph kullanılarak aşağı akış analizleri yapılır.

Abstract

Doku temizlemenin ardından ışık tabakası mikroskobu (LSFM), bozulmamış beyin yapısının hücresel çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayarak genetik veya çevresel bozulmaların neden olduğu yapısal değişikliklerin nicel analizine izin verir. Tüm beyin görüntülemesi, hücrelerin daha doğru bir şekilde ölçülmesi ve fiziksel olarak kesitlenmiş dokunun yaygın olarak kullanılan mikroskopisi ile gözden kaçırılabilecek bölgeye özgü farklılıkların incelenmesi ile sonuçlanır. Temizlenmiş beyinleri görüntülemek için ışık tabakası mikroskobu kullanmak, konfokal mikroskopiye kıyasla edinme hızını büyük ölçüde artırır. Bu görüntüler çok büyük miktarlarda beyin yapısal verisi üretmesine rağmen, temizlenmiş doku görüntülerinde özellik ölçümü yapan çoğu hesaplama aracı, tüm çekirdeklerden ziyade seyrek hücre popülasyonlarını saymakla sınırlıdır.

Burada, bir ışık tabakası mikroskobunda temizlendikten ve görüntülendikten sonra, doğum sonrası 4. gün (P4) fare beyninin açıklamalı bölgelerindeki tüm çekirdekleri ve nükleer belirteçleri ölçmek için bir grup analiz aracı olan NuMorph'u (Nükleer Tabanlı Morfometri) gösteriyoruz. Doku temizleme dehidrasyon adımlarının neden olduğu büzülmeden önce beyin hacmini ölçmek için manyetik rezonans görüntülemeyi (MRG), immünoetiketleme de dahil olmak üzere iDISCO + yöntemini kullanarak doku temizlemeyi ve ardından fare beyinlerini hücresel çözünürlükte görüntülemek için ticari olarak temin edilebilen bir platform kullanarak ışık tabakası mikroskobu kullanıyoruz. Daha sonra, yoğunluk farklılıklarını düzeltmek, görüntü döşemelerini dikmek, birden fazla kanalı hizalamak, çekirdekleri saymak ve genel kullanıma açık atlaslara kayıt yoluyla beyin bölgelerine açıklama eklemek için kullanılan NuMorph'u kullanarak bu görüntü analizi işlem hattını gösteriyoruz.

Bu yaklaşımı, gerekli mikroskop ve hesaplama kaynaklarına sahip herhangi bir araştırmacının bu teknikleri gerçekleştirmesine izin veren halka açık protokolleri ve yazılımları kullanarak tasarladık. Bu doku temizleme, görüntüleme ve hesaplama araçları, korteksteki hücre tiplerinin üç boyutlu (3B) organizasyonunun ölçülmesine ve nicelleştirilmesine izin verir ve herhangi bir vahşi tip / nakavt fare çalışması tasarımına yaygın olarak uygulanmalıdır.

Introduction

Tek hücreli çözünürlükte tüm beyin görüntüleme, nörobilimde önemli bir zorluktur. Hücresel çözünürlüklü beyin görüntüleri, beyin devresinin ayrıntılı analizine ve sistem düzeyinde haritalandırılmasına ve bu devrenin nöropsikiyatrik bozukluklar için genetik veya çevresel risk faktörleri, gelişmekte olan embriyolardaki hücresel davranış ve yetişkin beynindeki nöral devreler tarafından nasıl bozulduğuna izin verir ^1,2,3. Yeniden yapılandırılmış 3D beynin yüksek çözünürlüklü görüntülerine izin veren birden fazla histolojik yöntem vardır; Bununla birlikte, bu teknikler pahalı, özel ekipman gerektirir, immünoetiketleme ile uyumlu olmayabilir ve bazı yöntemlerin iki boyutlu (2D) doğası, ^4,5 kesiti sırasında doku hasarına ve kesmeye neden olabilir.

Son gelişmeler, doku kesiti gerektirmeyen tüm beyinleri görüntülemek için alternatif bir yaklaşım sağlamıştır; beyinleri şeffaf hale getirmek için doku temizlemeyi kullanmayı içerirler. Çoğu doku temizleme yönteminde şeffaflık, hem ışık saçılmasının önemli bir kaynağı oldukları için lipitlerin çıkarılması hem de görüntüleme sırasında nesnenin kırılma indisinin (RI) numune daldırma çözeltisinin RI ile eşleştirilmesi ile sağlanır. Işık daha sonra^dağılmadan malzemeler arasındaki sınırdan geçebilir ^6,7,8,9.

İDISCO+ gibi doku temizleme yöntemleri genellikle LSFM ^6,7,10 gibi tek foton uyarma mikroskobu kullanılarak hızlı 3D görüntüleme ile birleştirilir. Florofor ile etiketlenmiş şeffaf dokular içinde, ışık tabakası floresan mikroskopi, ince bir ışık düzlemi ile uyarılarak bölümler^{halinde görüntülenir 11}. LSFM'nin temel avantajı, bir seferde tek bir optik bölümün aydınlatılması, bu bölümdeki moleküllerden gelen tüm floresanların uyarılması ve bu da fotobeyazlatmayı en aza indirmesidir. Dahası, tüm optik dilimin görüntülenmesi, bu heyecanlı dilimin kamera tabanlı algılanmasını sağlayarak nokta tarama^12'ye göre hızı artırır. LSFM, tahribatsız bir şekilde, 3D rekonstrüksiyon için uygun olan iyi kaydedilmiş optik bölümler üretir.

iDISCO + yöntemi ~ 3 hafta içinde ucuz doku temizlemeye izin verirken, protokoldeki dehidrasyon adımları doku büzülmesine ve numune morfolojisinin potansiyel olarak değişmesine neden olabilir, böylece hacimsel ölçümleri etkileyebilir ^6,10. Doku temizleme prosedüründen önce kullanılacak MRI gibi ikincil bir görüntüleme yönteminin eklenmesi, numune boyunca doku temizlemeye bağlı büzülme derecesini ölçebilir. Dehidrasyon aşamaları sırasında, gri ve beyaz cevher arasındaki mekanik özelliklerdeki farklılıklar, düzgün olmayan beyin maddesi deformasyonlarına yol açabilir, bu da vahşi tip ve mutant numuneler arasında farklı doku temizlemeye bağlı hacim deformasyonlarına neden olabilir ve bu numunelerdeki hacimsel farklılıkların yorumlarını karıştırabilir^10,13 . MRG, ilk önce hayvanı bir kontrast madde (örneğin, gadolinyum) ile perfüze ederek, ardından görüntüleme^14'ten önce ekstrakte edilen dokuyu bir daldırma çözeltisinde (örneğin, fomblin) inkübe ederek gerçekleştirilir. MRG, doku temizleme ve aynı numune üzerinde LSFM yapılması ile uyumludur.

LSFM genellikle beyin yapısının nicel olarak değerlendirilmesinden ziyade, ilgilenilen beyin dokusunun kalitatif görselleştirmesi için büyük ölçekli mikroskopi görüntüleri oluşturmak için kullanılır (Şekil 1). Nicel değerlendirme olmadan, genetik veya çevresel hakaretlerden kaynaklanan yapısal farklılıkları göstermek zordur. Doku temizleme ve görüntüleme teknolojileri geliştikçe, depolama ve hesaplama gücünün maliyetlerinin azalmasıyla birlikte, ilgilenilen doku içindeki hücre tipi lokalizasyonlarını ölçmek daha erişilebilir hale geliyor ve daha fazla araştırmacının bu verileri çalışmalarına dahil etmesine izin veriyor.

Fare beynindeki 100 milyondan fazla hücre¹⁵ ve terabaytlarca veri üretebilen tüm beyin görüntüleme oturumlarıyla, hücreler gibi görüntülerdeki özelliklerin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayan gelişmiş görüntü analiz araçlarına olan talep artmaktadır. Nükleer boyama yoğunluğu için eşik uygulayan ve önceden tanımlanmış şekil, boyut veya yoğunluklara sahip nesneleri filtreleyen doku temizlenmiş görüntüler için bir dizi segmentasyon yöntemi mevcuttur^10,16,17,18. Bununla birlikte, sonuçların yanlış yorumlanması, hücre boyutu, görüntü kontrastı ve etiketleme yoğunluğu gibi parametrelerdeki değişikliklerden kaynaklanabilir. Bu makale, fare beynindeki hücre çekirdeklerini ölçmek için kurulan protokolümüzü açıklamaktadır. İlk olarak, P4 fare beyninin doku toplanması için adımları detaylandırıyoruz, ardından halka açık iDISCO+ yöntem^10'dan optimize edilmiş bir doku temizleme ve immünoetiketleme protokolü izliyoruz. İkincisi, görüntü yakalama için kullanılan parametreler de dahil olmak üzere MRI ve ışık tabakası mikroskobu kullanarak görüntü yakalamayı açıklıyoruz. Son olarak, grubumuzun geliştirdiği, doku temizleme, nükleer belirteçlerle immünoetiketleme ve açıklamalı bölgelerin ışık tabakası görüntülemesinden sonra hücre tipine özgü nicelleştirmeye izin veren bir dizi görüntü analiz aracı olan NuMorph^19'u tanımlıyoruz ve gösteriyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm fareler, Chapel Hill'deki Kuzey Carolina Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'ne (IACUC) uygun olarak kullanılmış ve onaylanmıştır.

1. Fare diseksiyonu ve perfüzyonu

NOT: Aşağıdaki diseksiyonlar P4 ve P14 farelerde bir şırınga kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Perfüzyon sıvısının hacmi, hayvanın yaşına bağlı olarak değişecektir.

Perfüzyon
DİKKAT: Paraformaldehit (PFA) tehlikeli bir kimyasaldır. Tüm perfüzyon adımlarını kimyasal bir duman davlumbazında gerçekleştirin.
1. Ameliyattan önce, intraperitoneal enjeksiyon (100 mg / kg) yoluyla pentobarbital uygulayın ve anestezinin etkili olmasına izin verin.
2. Hayvan cerrahi bir anestezi düzlemine ulaştığında, tepkisizliği doğrulamak için ayak parmağını sıkıştırma yanıt yöntemini kullanın.
3. Hayvanın göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için göğüs kafesinin altında yanal bir kesi yapın.
4. Kavisli, cerrahi makas kullanarak, göğüs kafesinden hayvanın bir tarafındaki köprücük kemiğine kadar dikkatlice kesin ve karşı tarafta aynı kesimi yaparak sternumun kaldırılmasına izin vererek kalbi açığa çıkarın.
5. İnen aortlara zarar vermeden, kanın vaskülatürden dışarı akmasına izin vermek için sağ atriyumda küçük bir kesi yapmadan önce kalbe bağlı herhangi bir dokuyu dikkatlice kesin.
6. Şırınga bazlı bir yöntem kullanarak, fareyi sol ventrikülden sırasıyla P14 ve P4 için 10 mL ve 7 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile perfüzyon hızı sistem üzerinden 1,5 mL / dak perfüzyon hızıyla perfüze edin.
7. Kan temizlendikten sonra, hayvanı sabitlemek için 1,5 mL / dak perfüzyon hızı ile sırasıyla P14 ve P4 için 10 mL PBS +% 4 PFA +% 4 PFA ile 4 ° C'de tekrar perfüze edin.
  NOT: Fiksasyon titremeleri gözlenecek ve hayvan tamamlandığında sert olacaktır. Numunelerde MRG kullanılıyorsa, PFA çözeltisinde her zaman noktası + %20 gadolinyum bazlı MRI kontrast maddesi için benzer hacimlerde PBS ve PFA ile perfüze edin.
8. Cerrahi makas kullanarak kafayı çıkarın ve tam fiksasyon için 4 ° C'de 24 saat boyunca PBS +% 4 PFA ile damla sabitleyin.
  NOT: Bu aşamada, beyin kafatası açıkken bozulmadan kalır (bakınız Bölüm 2). Duraklama noktası: beyinler bu aşamada birkaç ay boyunca PBS +% 0.1 sodyum azidde 4 ° C'de depolanabilir.

2. Sağlam kafatası ile MR tabanlı brüt beyin yapısı görüntüleme ve analiz

NOT: Beyin, kafatasından çıkarılmadan yukarıda tarif edildiği gibi gadolinyumda perfüze edilmeli ve inkübe edilmelidir. Tüm MRG, diseksiyon sırasında istenmeyen doku kaybını önlemek için beynin kafatasından çıkarılmasından önce gerçekleşir. Sağlam bir kafatası ile görüntüleme, numune hazırlama ve görüntüleme sırasında numune tutucudaki beyne (yani şırınga) destek sağlar.

Numune hazırlama
NOT: Aşağıdaki adımlar P4 ve P14 fare beyin örnekleri için optimize edilmiştir. Gerekli şırınga boyutu, numunenin fiziksel boyutuna bağlı olacaktır.
1. Numune üzerinde MRG yapıyorsanız, cildi kafatasından çıkarın ve görüntülemeden önce 4 ° C'de 23 gün boyunca PBS +% 3 gadolinyum içinde inkübe edin¹⁴. 23 gün sonra, numuneleri PBS'de hızlı bir şekilde durulayın.
2. MRG için bir numune tutucu oluşturmak için 5 mL şırıngalar kullanın, şırınga²⁰ ile yapılan tutucunun her bir ucunu kapatmak için şırınga pistonları kullanın. Kafatasını tutucuda sıkıca yerinde tutmak için plastik parçalar kullanın (Şekil 2A). Görüntüleme sırasında artefaktları önlemek için şırınga üzerindeki işaretleri etanol ile çıkarın.
3. Kafatasını numune tutucuya güvenli bir şekilde yerleştirin ve MRI ile uyumlu bir daldırma çözeltisi ile doldurun ( Malzeme Tablosuna bakın). Tutucuyu kapatın ve bir şırınga kullanarak tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
  NOT: Duraklama noktası: Kafatası, görüntülemeden önce birkaç ay boyunca daldırma çözeltisinde saklanabilir.
Brüt beyin yapısı görüntüleme (MRG)
1. Numuneleri, 15 mm'lik hacimli bir bobin ve aşağıdaki parametrelere sahip spin-echo tabanlı bir dizi kullanarak 9,4T/30 cm yatay delikli, hayvan MRI sistemi ile görüntüleyin: Uzamsal çözünürlük: 60 μm x 60 μm x60 μm; toplam tarama süresi: 7 saat 12 dakika; yankı süresi (TE): 6,83 ms; tekrarlama süresi (TR): 40 ms; uyarma/yeniden odaklama çevirme açıları: 90/180 derece; resim boyutu:166 x 168 x 209 voksel; Görüş alanı (FOV): 9,9 mm x 10,1 mm x 12,4 mm; bant genişliği: 100.000 kHz.
Hesaplamalı brüt beyin yapısı analizi
1. Segmentasyon yazılımını kullanarak fare beynini manuel olarak izleyerek çevredeki kafatasını ham MRI görüntülerinden çıkarın. Ardından, kafatası soyulmuş beyin MRI görüntüsünü oluşturmak için maske görüntüsü ile ham MRI görüntüsü arasında voksel olarak çarpma işlemini uygulayın.
  NOT: Çıktı, aksi takdirde beyin voksellerinin yoğunluğunun 1 ve 0 olarak ayarlandığı ikili bir maske görüntüsüdür.
2. FSL paketi^21,22'deki 'flirt' kullanarak kafatası soyulmuş MRI görüntüsünü (hareketli görüntü) karşılık gelen ışık tabakası mikroskopi ^{görüntüsüne (}referans görüntü) hizalamak için katı görüntü kaydı (yalnızca çeviri ve rotasyonu tahmin ederek) uygulayın.
3. Adım 2.3.2'deki rijit hizalanmış MRI görüntüsü ile ışık sayfası görüntüsü (adım^2.3.2'deki aynı referans görüntüsü) arasındaki noktadan noktaya yazışmaları bulmak için katı olmayan kayıt uygulayın (ANTS yazılımı 23'te 'SyN' kullanarak).
  NOT: Çıktı, çarpık MRI görüntüsünü ve MRG'den ışık sayfası görüntülerine hacim değişiklikleriyle ilişkili deformasyon alanını içerir.
4. Adım 2.3.3'te oluşturulan deformasyon alanındaki Jacobian determinantını hesaplayın, bu da 3 x 3 x 3 voksel yerel mahallesindeki hacim değişimini ölçer.
5. Deforme edilebilir görüntü kaydını kullanarak kafatası soyulmuş görüntüleri Allen Gelişimsel Fare Beyin Atlası ile hizalayın.
  NOT: Kurulan uzamsal noktadan noktaya yazışmalar, yeni fare görüntüsündeki ilgilenilen beyin bölgelerinin otomatik olarak açıklanmasına izin verir (Şekil 2C-H).

3. Kafatasından beyin diseksiyonu

Kafatasını ortaya çıkarmak için kafatasının üst kısmı boyunca boyundan buruna kadar bir orta hat kesisi yapın.
Kalan boyun kasını ve diğer tüm artık kasları keserek kafatasının tabanını ortaya çıkarın.
Keskin cerrahi makas kullanarak, kafatasının iç yüzeyi boyunca dikkatlice kesin, keskin cerrahi ekipmanla kesim yaparken hafif bir yukarı doğru basıncı koruyarak beyne zarar vermemeye özen gösterin.
Kafatasının iki kesilmiş yarısını beyinden uzaklaştırmak için cımbız kullanın ve beyne bağlı fazla yağları dikkatlice kesin.
Beyni kafatasına bağlayan herhangi bir durayı kesmek için cerrahi bir makas kullanın ve ardından beyni kafadan nazikçe çıkarmak için bir spatula kullanın.
Beyni çıkarın, PBS ile yıkayın ve% 0.1 sodyum azid ile PBS'ye geçin ve uzun süreli depolama için 4 ° C'de tutun.

4. Doku temizleme

NOT: Bu protokol, P4 fareler⁶ için iDISCO+ protokolünden küçük değişikliklerle uyarlanmıştır. Bazı detaylar farklı zaman noktaları/türler/deneyler için değişebilir). DİKKAT: Metanol, diklorometan (DCM) ve dibenzil eter (DBE) tehlikeli kimyasallardır. Bu doku temizleme adımları kimyasal bir duman davlumbazında gerçekleştirilir.

Antikor doğrulaması
NOT: Test edilmemiş antikorların metanol uyumluluğu, iDISCO + protokolünde gerekli olan sert metanol yıkamalarından olumsuz etkilenebileceğinden kontrol edilmelidir. iDISCO+ 'da çalıştığı gösterilen antikorların listesi için²⁴ numaralı web sitesine bakın.
1. PFA ile sabitlenmiş dokunun 10 μm dondurulmuş bölümlerini stereolojik slaytlara hasat edin.
2. Bölümleri oda sıcaklığında 3 saat boyunca% 100 metanol içinde inkübe edin.
3. Metanol yıkandıktan sonra antikorun beklenen floresan paternini gösterip göstermediğini belirlemek için standart immünohistokimya protokollerine geçmeden önce PBS'de rehidrat. Pozitif kontrol için, metanol ile muamele edilmemiş bir slayt kullanın.
Tampon hazırlama
1. Arabellekleri resmi iDISCO protokolüne göre hazırlayın. Bu protokolde kullanılan tamponların ve diğer çözeltilerin bileşimi için Malzeme Tablosuna bakınız.
Ön işlem
1. Numuneyi metanol / PBS serisi ile kurutun: % 20,% 40,% 60,% 80,% 100; Oda sıcaklığında her biri 1 saat.
  NOT: Dehidrasyon sırasında PBS kullanılması, metanol yıkamalarında numunelerin çatlamasını önlemeye yardımcı olur.
2. Numuneyi 1 saat boyunca% 100 metanol içinde yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında% 66 DCM / % 33 metanol içinde çalkalayarak gece boyunca inkübe etmeden önce 1 saat boyunca 4 ° C'de soğutun.
3. Numuneyi oda sıcaklığında% 100 metanol içinde 2x yıkayın ve ardından 4 ° C'de soğutun.
4. Numuneyi 4 ° C'de gece boyunca ağartmak için metanol içinde taze%_{5 H 2}O₂ kullanın.
5. Numuneyi metanol / PBS serisi ile rehidre edin: % 80,% 60,% 40,% 20, PBS; Oda sıcaklığında her biri 1 saat ve oda sıcaklığında PTx.2'de 1 saat boyunca 2x yıkayın.
6. Numuneyi gece boyunca 37 °C'de 1x PBS/%0,2 TritonX-100/%20 DMSO'da inkübe edin.
7. Numuneyi gece boyunca 37 °C'de 1x PBS / % 0.1 Tween-20 / 0.1% TritonX-100 / % 0.1 Deoksikolat / % 0.1 NP40 / 20% DMSO'da inkübe edin.
8. PTx.2'de oda sıcaklığında 1 saat iki kez yıkayın.
İmmünoetiketleme
1. Permeabilizasyon Çözeltisindeki numuneleri 2 gün (~ 48 saat) boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. Numuneleri Bloke Çözeltisinde 37 ° C'de 2 gün (~ 48 saat) bloke edin.
3. Birincil antikoru olan örnekleri 4 gün boyunca (~96 saat) 37 °C'de PTwH / %5 DMSO / %3 Serumda inkübe edin (örneğin, tavşan (Rb) Brn2 / POU3F2 mAb (1:100) ve anti-Ctip2 sıçan (Rt) antikoru (1:400) (Malzeme Tablosu).
4. PTwH'de 3 x 1 saat yıkayın. PTwH'de 2 saat daha yıkayın.
5. Numuneleri ikincil antikor ve TO-PRO-3 gibi nükleer bir boya ile 4 gün boyunca 37 ° C'de PTwH / %3 Serumda (~ 96 saat; örneğin, keçi anti-Rb (1:50) ve (keçi anti-Rt (1:200)) (Malzeme Tablosu) inkübe edin.
6. PTwH'de 3 x 1 saat yıkayın PTwH'de 2 saat daha yıkayın.
Temizleme
1. Metanol / PBS serisinde dehidrat, oda sıcaklığında her biri% 20,% 40,% 60,% 80,% 100-1 saat. Oda sıcaklığında% 66 DCM / % 33 metanol içinde, çalkalanma ile 3 saat boyunca inkübe edin.
  NOT: Numune, %100 metanol içinde dehidrasyondan hemen sonra gece boyunca oda sıcaklığında bırakılabilir.
2. MeOH'yi yıkamak için oda sıcaklığında (çalkalanma ile) iki kez 15 dakika boyunca% 100 DCM'de inkübe edin.
3. Oda sıcaklığında sallanmadan dibenzil eter (DBE) içinde inkübe edin. Numunenin oksidasyonunu önlemek için tüpün neredeyse tamamen DBE ile doldurulduğundan emin olun. Görüntülemeden önce birkaç kez ters çevirerek çözeltiyi karıştırmayı bitirin.

5. Işık tabakası görüntüleme

NOT: iDISCO doku temizlemeli beyinler, korteks içinde tek hücreli çözünürlüğe izin verdiği için P4 zaman noktası için 2X/0.5 NA hedef, tamamlayıcı bir metal oksit yarı iletken kamera ve 0.75 x 0.75 x 4 μm/voksel'de mikroskop çalıştırma ve görüntü alma yazılımı ile donatılmış bir ışık tabakası mikroskobu ile görüntülenmiştir (Şekil 3A,B).

Örnek montaj
1. Numuneyi, doğru numune boyutu tutucusuna, ışık tabakası mikroskobunun nominal çalışma mesafesi nedeniyle numunenin en fazla 5,2 mm derinlikte z boyutuyla yönlendirileceği şekilde dikkatlice monte edin (5,7 mm eksi 0,5 mm güvenlik marjı)²⁵.
2. Tutucuyu numune yuvasına, tutucunun vidası ile beşik desteklerine 45° açıyla yerleştirin (Şekil 1B). Beşiği, ışık yolu numuneye dik olacak şekilde konumlandırın (Şekil 1C).
Görüntüleme parametreleri
1. Mikroskoptaki yakınlaştırma gövdesini 4x büyütmeye veya 0,75 μm/piksel üreten daha yüksek bir değere ayarlayın.
  NOT: P4 ışık yaprağı görüntüleri üzerindeki tek hücreli hesaplamalı analizler, 0,75 x 0,75 x 4 μm / voksel veya daha yüksek çözünürlüğe izin veren, piyasada bulunan herhangi bir ışık tabakası mikroskobu ile yapılabilir. Daha düşük bir çözünürlük, çekirdeklerin daha seyrek dağıldığı daha sonraki zaman noktalarındaki beyinler için yeterlidir.
2. Görüntü yakalama yazılımında, NA = ~ 0,08 (9 μm kalınlık/4 μm z adım) olan tek bir ışık tabakası seçin.
  NOT: Bu ayar, yatay dinamik odaklama ile birleştirildiğinde, makul bir süre içinde bir fare beyninin tek hücreli çözünürlüğünde tüm beyin görüntülemesine olanak tanır. Doğum sonrası 4. gün (P4) beyin için, görüntü alma süresinin beynin büyüklüğüne bağlı olarak üç kanal için 11-15 saat olduğu tahmin edilmektedir.
3. Eksenel çözünürlüğün görüntünün genişliği boyunca korunmasını sağlamak için Yatay Dinamik Odaklama'yı seçin ve lazer dalga boyuna bağlı olarak önerilen adım sayısını uygulayın. Bütün bir P4 fare beyni için, yatay dinamik odaklamayı 11 olarak ayarlayın. Her kanal için İnce Netlemeyi kayıt kanalına göre ayarlayın.
  NOT: Burada, TO-PRO-3 kanalı (647 nm), Allen Gelişimsel Fare Beyin Atlası'na kayıtlıdır, çünkü bu tüm çekirdekleri etiketler.
4. Kanal başına lazer gücünü kanal özelliklerine göre ayarlayın.
  NOT: Daha uzun dalga boyları, daha kısa dalga boylarına kıyasla daha yüksek lazer gücü gerektirir. Örneğin, 780 nm'nin yüksek lazer gücünde (% 70 -% 75) ve düşük pozlamada (50 ms) görüntülenmesi gerekirken, 647 nm kanalın ortalama bir lazer gücü (% 40 -% 45) ve düşük pozlama (50 ms) gerektirmektedir.
5. Levha gücünün bu örnek boyutu için y boyutunda en uygun şekilde dağıtıldığından emin olmak için Işık Tabakası Genişliğini ~%50'ye ayarlayın.
  NOT: Yatay dinamik odaklama ile birlikte, %50 tabaka genişliği, görüntü boyunca ortalama bir güç dağılımı sağlar ve fotobeyazlatma riskini azaltır²⁵.
6. Kutucuklar arasında önerilen %15'lik bir Örtüşme ile numunenin boyutuna göre Kutucuk Sayısı'nı ayarlayın ve belirli bir döşeme konumundaki her yığın için sırayla her kanal için görüntüler yakalayın.

6. NuMorph kullanarak görüntü işleme

NOT: NuMorph işlem hattının 3B görüntü analizi için üç ana bölümü vardır: ön işleme, analiz ve değerlendirme. Bu bölümler, aşağıda tartışılan sırasıyla NMp_template, NMa_template ve NMe_template olarak düzenlenmiştir. Ayrıca, NuMorph'un sorunsuz çalışması için gereken yazılım paketlerini indirmek ve yüklemek için NM_setup.m eklenmiştir. NM_samples.m ayrıca görüntü alma bilgilerini girmek için bir şablon sağlar.

NuMorph kurulumu
1. Linux²⁶ için conda ortam yöneticisini indirin ve yükleyin. NuMorph¹⁹ görüntü işleme araçlarını indirin ve yükleyin.
2. Komut satırında Matlab'ı çalıştırın. Analizler için gereken görüntü analizi yazılım paketlerini indirmek ve yüklemek için NuMorph'tan NM_setup.m dosyasını çalıştırın.
  NOT: Bu adım, conda ortamının doğru şekilde kurulmasını ve Matlab'ın üç işlem hattının her birini çalıştırması için gereken tüm araçların ve eklentilerin doğru şekilde indirilmesini ve kurulmasını sağlar. Burada en dikkat çekici olanı, kayıt çalıştırmak için Elastix ve hücre algılama ve sayma için 3D-Unet'tir.
Dosyayı NM_samples düzenleyerek örnek adlarını, giriş ve çıkış dizinlerini, kanal bilgilerini ve ışık sayfası görüntüleme parametrelerini belirtin.
NOT: Burada, doğru bilgilerin, özellikle de görüntü giriş dizininin doğru şekilde belirtildiğinden emin olmak için iki kez kontrol etmeniz önerilir. Sonraki adımlar çalıştırılana kadar hatalar genellikle burada çağrılmaz.
Görüntü ön işleme
1. Yoğunluk ayarı
  1. NMp_template, yoğunluk ayarı = true olarak ayarlayın.
    NOT: Yoğunluk ayarı gerekiyorsa true olarak ayarlayın. Değilse, yoğunluk ayarını ayarlayın = false. Önceki ayarlama parametrelerinin üzerine yazmak için 'güncelleme' kullanma seçeneği de vardır.
  2. İşlenen görüntüleri kullan = yeni bir görüntü kümesiyle çalışırken yanlış olarak ayarlayın. Aksi takdirde, sonraki işleme adımlarında kullanmak üzere çıkış dizininde önceden kaydedilmiş görüntü veri kümelerini (ör. "hizalanmış", "dikişli") belirtin.
    NOT: Bu seçenek, giriş görüntülerinin önceden işlenmiş olması durumunda sağlanır. Bu durumda, önceden işlenmiş görüntüler giriş görüntüleri olarak kullanılır ve seçenek çıkış dizinindeki alt dizinin adına ayarlanır.
  3. Save images = true olarak ayarlayın.
    NOT: Bu seçeneğin kullanılması, işlenen görüntülerin çıktı dizinine kaydedilmesini sağlar; aksi takdirde, yalnızca parametreler hesaplanır ve kaydedilir.
  4. Kayıt örneklerini = true olarak ayarlayın.
    NOT: Bu seçenek, her ana adım için örnek sonuçların kaydedilmesini sağlar.
  5. BaSiC algoritması^27'yi kullanarak gölgelendirme düzeltmesi uygulamak için ayar karo gölgelendirmesi = temel veya belirli ışık sayfası genişliklerinde ışık tabakası mikroskobundan ölçümler kullanarak karo gölgelendirme düzeltmesi uygulamak için manuel olarak ayarlayın.
    NOT: Bu seçenek, tabaka belinin şeklinden kaynaklanan y boyutu boyunca eşit olmayan aydınlatmayı düzeltir.
2. Görüntü kanalı hizalaması
  1. NMp_template'de, kanal hizalamasını = true olarak ayarlayın. Kanal hizalaması gerekiyorsa bu seçeneği true olarak ayarlayın. Değilse, false olarak ayarlayın. Kanal hizalama yöntemini çeviri (sert) veya elastix (katı olmayan) olarak ayarlayın.
    NOT: Çeviri yöntemi, birden fazla kanalı hizalamada katı 2B kayıt yaklaşımlarını kullanırken, elastix yöntemi, uzun görüntü yakalama¹⁹ sırasında oluşabilecek dönme sürüklenmesini düzeltmek için katı olmayan B-spline^28'i kullanır.
3. Yinelemeli görüntü dikişi
  1. NMp_template, dikiş görüntüleri = true olarak ayarlayın.
    NOT: Dikiş gerekiyorsa bu seçeneği true olarak ayarlayın.
  2. Eleme iyileştirmesini ayarla = true.
    NOT: Bu seçenek, Ölçek Değişmez Özellik Dönüşümü²⁹ kullanılarak xy cinsinden çeviriyi daha da hassaslaştırmak için kullanılır.
  3. Yük hizalama parametrelerini ayarlayın = true.
    NOT: Bu seçenek, dikiş sırasında kanal hizalama çevirilerini kullanır. Bu seçenek çok kanallı görüntüleme için önerilir. Aksi takdirde, false olarak ayarlayın.
  4. Görüntüleme sırasında döşeme çakışmalarını eşleştirmek için örtüşme = 0,15 değerini ayarlayın.
4. Bu ön işleme adımlarından herhangi birini çalıştırmak için, Matlab'da NMp_template ortamının dışında aşağıdakileri çalıştırın:
  1. Örnek adı belirtin. Set config = NM_config(process,sample).
  2. NM_process(config,stage) belirterek ön işleme adımlarından herhangi birini çalıştırın ve herhangi bir işlem için yoğunluk, hizalama veya dikiş kullanarak aşamayı belirtin. Aşamaların her biri için çıktı dosyaları için çıktı dizinini kontrol edin (Şekil 3 ve Şekil 4).
Görüntü analizi
1. NuMorph'tan önce
  1. Bir 3B atlas görüntüsü ve her vokseli belirli bir yapıya atayan ilişkili bir ek açıklama görüntüsüyle başlayın.
    NOT: Burada MagellanMapper^30'dan üretilen P4 Allen Gelişimsel Fare Beyin Atlası kullanılmıştır.
  2. Atlas görüntüsünü ve ek açıklama dosyasını doğru yönde doğru şekilde eşleştiklerinden emin olmak için hizalayın.
2. NuMorph içinde
  NOT: Artık atlas ve ek açıklamaları doğru hizalandığına göre, dosyaların daha sonra kullanılmak üzere kaydedilebilmeleri için NuMorph içinde "munged" edilmesi veya işlenmesi gerekir. Bunu yapmak için, girişleri aşağıda gösterildiği gibi belirtmek üzere munge_atlas işlevini kullanın.
  1. Atlas_file belirtin: (dize). Atlas dosyasının tam yolunu sağlayın.
  2. Annotation_file belirtin: (dize). İlişkili ek açıklamaların tam yolunu sağlayın.
  3. Çözünürlüğü Belirtin: (1x3 sayısal). Atlas y,x,z çözünürlüğünü piksel başına mikron olarak belirtin.
  4. Yönlendirmeyi Belirtin: (1 x 3 karakter). Atlas oryantasyonunu sağlayın ve beşikteki numunenin kurulumuyla eşleştiğinden emin olun (anterior(a)/posterior(p),superior(s)/inferior(i),left(l)/right(r)).
  5. Yarımküreyi Belirtin: Hangi beyin yarımküresinin görüntülendiğini belirtin ("sol", "sağ", "her ikisi", "hiçbiri").
  6. out_resolution:(int) belirtin. Atlas çıktısının izotropik çözünürlüğünü mikron cinsinden belirtin. (varsayılan: 25).
  7. /data/munge_atlas içinde munged ek açıklamalar ve /data/atlas içinde atlas görüntüsünün bir kopyasını oluşturmak için "atlas_file(annotation_file, annotation_data, resolution, orientation, heisphere)" komutunu çalıştırın.
  8. Her iki dosyanın da doğru yönde doğru şekilde munged olduğunu doğrulamak için Matlab yapısını ve atlas dosyasını okuyun.
    NOT: İmmün etiketli protein belirteçlerinin birlikte lokalizasyonuna dayalı olarak hücre tiplerini ölçmek için ek bir hücre sınıflandırma adımı gerçekleştirilebilir.
3. Resampling
  1. NMa_template, atlasa başvurmak veya yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin alt örneklenmiş birimlerini oluşturmak için görüntü kaydı gerçekleştiriyorsanız, görüntüleri yeniden örnekleme = true olarak ayarlayın.
    NOT: NMa_template.m, yeniden örnekleme, kayıt, çekirdek algılama ve hücre sayımı parametrelerini ayarlamak için kullanılacaktır.
  2. Yeniden örnekleme çözünürlüğünü atlasla eşleşecek şekilde ayarlayın.
    NOT: Burada, referans atlası bu çözünürlükte olduğu için 25 μm³/voksel izotropik çözünürlük kullanılır.
  3. Yeniden örnekleme kanalları kullanılarak yeniden örneklenecek kanal numarasını belirtin = [ ].
    NOT: Burada, kanal numarası nükleer kanalla eşleşecek şekilde ayarlanmıştır. Bu seçenek boşsa, yalnızca kayıt kanalı yeniden örneklenir.
4. Kayıt
  1. NMa_template, register images = true değerini ayarlayın. Kayıt gerekiyorsa true olarak ayarlayın. Değilse, kayıt = false değerini ayarlayın.
  2. Atlas dizinindeki dosyayla eşleşmesi için atlas dosyasını belirtin.
  3. Kayıt parametrelerini ayarla = varsayılan.
    NOT: Bu seçenek, uzamsal yazışmaları tahmin etmek için bir afin ve ardından B spline dönüşümü kullanır. Aksi takdirde, /data/elastix_parameter_files/atlas_registration içinde Elastix aracılığıyla yeni bir kayıt parametreleri kümesi tanımlayın.
  4. Kayıtlı resimleri kaydet = true olarak ayarlayın.
    NOT: Kayıt ve yeniden örneklemeden elde edilen çıktı dosyaları Matlab'da veya FIJI³¹ gibi diğer görselleştirme araçlarında indirilebilir ve görsel olarak incelenebilir.
5. Çekirdek Tespiti, Hücre Sayımı ve Sınıflandırması
  NOT: Burada oluşan hatalar, ek açıklamalar dosyasının doğru belirtilmemesinden veya örneğin yaşının doğru ek açıklamayla eşleşmemesinden kaynaklanabilir.
  1. NMa_template'de, hem çekirdeği sayın hem de hücreleri sınıflandırın = true değerini ayarlayın.
  2. Set sayısı yöntemi = 3dunet.
    NOT: Bu seçenek, eğitilmiş 3D-Unet model^19'un kullanılmasına izin verir. Aksi takdirde, Hessian blob algılama yöntemini kullanan Hessian'ı seçin.
  3. Algılanan nesneler için minimum yoğunluk eşiği tanımlamak üzere min_intensity ayarlayın.
    NOT: Uygun bir eşik, nükleer etiketlemenin sinyal-gürültü oranına göre ampirik olarak belirlenir.
  4. classify_method, merkezcil konumlardaki denetimsiz floresan yoğunluklarını temel alan eşik veya denetimli doğrusal Destek Vektör Makinesi (SVM) sınıflandırıcısını modelleyen svm olarak ayarlayın.
    NOT: Bu adım, algılanan tüm hücreleri 3 kanallı görüntüleme ile dört ana sınıfa ayırır. Bu protokolle, Ctip2+/Brn2-, Ctip2-/Brn2⁺, Ctip2-/Brn2^- ve Aykırı Değerler oluşturulur.
6. Analiz adımları
  1. Örnek adı belirtin. Set config =NM_config(analiz,örnek).
  2. NM_analyze(config,stage) belirterek analiz adımlarından herhangi birini çalıştırın ve yeniden örnekleme, kaydetme, sayma veya sınıflandırma özelliklerini kullanarak aşamayı belirtin. Aşamaların her biri için çıktı dosyaları için çıktı dizinini kontrol edin (Şekil 5).
7. Hücre tipi sınıflandırması ve grup analizi
  1. NMe_template, update = true değerini ayarlayın ve hesaplanan önceki tüm istatistiklerin üzerine yazın.
    NOT: NMe_template, analiz edilen aynı beynin beyin bölgeleri arasında hücre tipi grup analizi yapma seçeneği sunar.
  2. compare_structures_by, tüm benzersiz ek açıklamalarla karşılaştırmak üzere dizine veya yapıları tabloya göre karşılaştırmak için tabloya ayarlayın.
  3. Tüm olası yapı dizinlerini belirten ve /annotations içinde bulunması gereken template_file ayarlayın.
  4. structure_table ayarlayın ve değerlendirilecek yapıları belirtin.
  5. Hücre sayımını ve hücre türü sınıflandırmasını NMa_template'de açıklandığı gibi belirtin.
  6. Karşılaştırılacak grupları belirtmek için compare_groups ayarlayın.
  7. Eşleştirilmiş t-testi veya iki örneklemli t-testi gerçekleştirmek için doğru veya yanlış olarak eşleştirilmiş.
8. Analizi çalıştırın.
  Not: Bu adımı gerçekleştirmek için, Matlab'da NMe_template.m ortamının dışında aşağıdakileri çalıştırın.
  1. Örnek adı belirtin. Set config =NM_config(evaluate,sample).
  2. NM_evaluate(config,stage) belirterek analiz adımını çalıştırın ve aşamayı belirtin. Grup analizi için çıktı dosyalarının çıktı dizinini kontrol edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

iDISCO+ protokolü, gözle kolayca fark edilebilen önemli doku büzülmesini beraberinde getirdiğinden (Şekil 2B), doku temizlemenin neden olduğu büzülmeyi ölçmek için doku temizlemeden önce bu boru hattına bir MRI adımı ekledik. İş akışı, beyin dışı dokunun MR görüntüsünden çıkarılmasıyla başlar (Şekil 2C). Daha sonra, MR görüntüsünü ışık tabakası görüntüsüne hizalamak için katı bir dönüşüm (3 çeviri ve 3 dönüş açısı) uygulanır (Şekil 2D). Bunu yaparak, doku temizleme prosedürünün neden olduğu% 60'lık bir toplam hacim kaybı gözlemledik (Şekil 2E), bu da gözle yapılan hacim değişikliği tahminleriyle tutarlıydı (Şekil 2B). Bu sonuç, %5-%10-10,32 küçülmenin bildirildiği önceki bir rapordan oldukça farklıdır. Büzülmedeki fark, iki çalışma arasındaki hayvan yaşı farkından (P4'e karşı yetişkin beyinleri) veya iDISCO + protokolünün temizleme adımındaki metanol yıkamadaki zaman farklılıklarından (16 saate karşı 2 saat) kaynaklanabilir. Beynin farklı bölgelerindeki doku büzülme derecelerini haritalamak için, ışık tabakası görüntüsünün referans olarak kullanıldığı deforme edilebilir bir görüntü kaydı daha da dağıttık. Kayıtlı MR görüntüsü (Şekil 2F)'de gösterilmiştir. Doku temizleme prosedürüne bağlı tahmini hacim değişimi, kortekste diğer beyin bölgelerine kıyasla daha büyük bir küçülme derecesinin gözlendiği renk kodludur (Şekil 2G).

Beyin bölgelerinin hacimlerini ölçmek için, açıklamalı bir atlasa kayıt yoluyla MRG'nin segmentasyonunu gerçekleştirdik. MR ile görüntülenen beyinlerin segmentasyonu, referans atlas kaplamasının ham MRG görüntülerindeki kontrast farklılıklarıyla tanımlanan anatomik sınırlarla yakından eşleşmesi durumunda başarılı kabul edildi (Şekil 2H). Kayıt sırasındaki bindirme, iyi numune hazırlamaya (Şekil 2A), görüntü alımına ve kafatası sıyırmaya bağlıdır. Kafatası sıyırma adımı, iyi kayıt sonuçları için çok önemlidir, çünkü kayıt, referans görüntüsünü atlastan, görüntüde kalan kafatası da dahil olmak üzere tüm MR görüntüsüne çarpıtmaya çalışacaktır. Kafatasının kayda dahil edilmesi, sonuçları çarpıtabilir ve segmentasyonun yanlış kaydedilmiş bir 3D hacim oluşturmasına neden olabilir. Son 3B hacim oluşturma daha sonra ITK-SNAP³³ kullanılarak görselleştirilebilir (Şekil 2H). Bu yöntem, örnek gruplar arasındaki brüt beyin hacmi farklılıklarını değerlendirmek için kullanılır. MRG ile keşfedilen hacim farklılıklarının altında yatan hücresel temel, doku temizleme, ışık tabakası mikroskobu ve NuMorph ile hücre sayımı kullanılarak takip edilebilir.

Doku temizleme ve analizinin amacı, NuMorph kullanarak bireysel çekirdekleri sayarak farklı hücre tiplerinin deneysel koşullar (örneğin, genotip, çevresel maruziyet) arasındaki farklılıklara katkılarını değerlendirmektir. iDISCO+ protokolü ve nöronal tabakaya özgü çekirdek belirteçleri kullanılarak doku temizliği, izokortekste üst ve alt tabaka nöronlarının açıkça tanımlanmış hücre gruplarıyla sonuçlandı (Şekil 3).

NuMorph kullanarak hücre sayımı, yoğunluk ayarı, kanal hizalaması ve dikiş içeren başarılı ön işleme adımlarına bağlıdır (Şekil 4A). Bu adımlardan herhangi birinde meydana gelen hatalar yanlış dikişlere neden olabilir (Şekil 4B, C). Örneğin, yanlış görüntü alımı, ön işleme sırasında odak içi ve odak dışı desenlere sahip görüntülerle sonuçlanabilir (Şekil 4C). Belirli beyin bölgelerindeki çekirdekleri saymak için, dikişli görüntülere herkese açık bir atlas kullanılarak açıklama eklenir. Dikişli görüntülerimizi P4 Allen Gelişimsel Fare Beyin Atlası^34'ün düzeltilmiş bir versiyonuna kaydettik. Burada, dikişli görüntüler atlasın çözünürlüğüne uyacak şekilde yüksek çözünürlükten (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voksel) daha düşük çözünürlüğe (25 μm³/voksel izotropik çözünürlük) indirildi. Atlasın çözünürlüğünün eşleştirilmesi, görüntülerin atlasa doğru şekilde kaydedilmesini sağlar ve elde edilen görüntülerde bölgesel ek açıklamalar sağlar (Şekil 5A).

Spesifik hücre tipine özgü sayım yapmak için, Brn2'yi eksprese eden üst tabaka nöronlarını, Ctip2'yi eksprese eden alt tabaka nöronlarını ve TO-PRO-3 ile tüm çekirdekleri etiketledik (Şekil 3B). Görüntüleme, bireysel çekirdekleri ayırmak için yeterli uzamsal çözünürlükte gerçekleştirilir (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voksel). Çekirdeklerin sentroidleri NuMorph'ta eğitilmiş bir 3D-Unet modeli ile tespit edilir (Şekil 5B,C). İzokortekste To-Pro-3+ olan ~12 × 10⁶ toplam çekirdek tespit ettik, ~ 2.6 × 10 6 Brn2 + ve 1.6 × 10⁶ Ctip2 ⁺ çekirdeği dahil. Ayrıca bazal gangliyonlar^ve hipokampal allokortekste sırasıyla ~ 3.7 × 10 6 ve 2.9 × 10⁶ To-Pro-3 ⁺ toplam çekirdeği tespit ettik. Bazal gangliyon ve hipokampal allokortekste sırasıyla yaklaşık 1.5 × 10 6^ve <1 × 10 6 Ctip2⁺ hücre sayıldı, ancak ihmal edilebilir sayıda Brn2⁺ hücre tespit edildi (Şekil 5D). İzokorteks ve hipokampal allokorteksteki toplam çekirdek sayıları (~ 15 milyon hücre), farenin serebral korteksindeki daha önce bildirilen toplam hücre sayılarına benzerdir¹⁵. Bu sonuçlar, MRI görüntülemenin, iDISCO + doku temizleme metodolojisinin ve NuMorph hesaplamalı analizinin, deney grupları arasında fare beyin yapısındaki farklılıkların altında yatan hacimsel, toplam hücre sayısı ve hücre tipine özgü sayıları ortaya çıkarmak için faydasını göstermektedir.

Şekil 1: Bozulmamış yenidoğan 3D doku temizlenmiş fare beyinlerinin tüm beyin tek hücreli analizine genel bakış . (A) iDISCO + doku temizleme, ışık tabakası görüntüleme ve 3D görüntü analizine genel bakış. (B) Işık tabakası mikroskobu üzerinde doğru numune montajını gösteren görüntüler. (C) Işık tabakası yoluna göre örnek montajı gösteren karikatür. Kısaltma: ab = antikor. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: MRG ile brüt beyin yapısı ölçümleri . (A) MRG için numune hazırlamayı gösteren resim. (B) iDISCO+ doku temizlemeden önce ve sonra temsili P4 beyinlerinin görüntüleri. Ölçek çubuğu = 5,0 cm. (C) Kafatası 60 x 60 x 60 μm³ boyutunda tutturulmuş ham MR görüntüsü. Ölçek çubuğu = 800 μm. (D) Fare beyninin 25 x 25 x 25 μm³ boyutundaki ışık tabakası görüntüsü. Toplam hacim = 68,7 mm³. Dorsal izokorteksin küçük bir bölümünün, ok ucu (beyaz) ile işaretlenmiş diseksiyon sırasında istemeden çıkarıldığını unutmayın. Ölçek çubuğu = 800 μm. (E) kafatası sıyırma ve sert kayıt sonrası fare beyninin MR görüntüsü. Toplam hacim = 171,9 mm³. Ekle (sarı), ışık tabakası görüntüsünden beyin konturunu gösterir. Ölçek çubuğu = 800 μm. (F) Deformasyonu değerlendirmek için ışık tabakası görüntüsüne atıfta bulunan kayıtlı MR görüntüsü. Ölçek çubuğu = 800 μm. (G) Mavi ve kırmızının sırasıyla MR görüntüsünden ışık tabakası görüntüsüne büzülmeyi ve genişlemeyi gösterdiği ışık tabakası görüntüsü ile MR görüntüsü arasındaki hacim değişikliklerini değerlendirmek için Voksel bilge beyin haritalaması. Genel olarak% 60'lık bir hacim kaybı vardı, ancak izokorteks gibi bazı bölgeler diğerlerine göre daha fazla büzülme gösterdi. (H) Sol panel: Allen Gelişimsel Beyin Atlası'ndan kayıtlı segmentasyonlarla MRG görüntüsünün eksenel görünümü. Sağ panel: Segmentasyonun 3D hacimsel olarak oluşturulması. Ölçek çubuğu = 800 μm. Kısaltmalar: OB = koku alma ampulü; Dpall = dorsal palyum/izokorteks; Mb = orta beyin; Cb = beyincik. Oryantasyon: R = Rostral; L = Yanal; D = Dorsal. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Hücresel çözünürlüklü görüntüler ve kanal hizalaması. (A) P4 fare beynindeki Ctip2 (alt tabaka nöron) ve Brn2 (üst tabaka nöron) belirteçleri için TO-PRO-3 (TP3) nükleer boyama ve immünoetiketlemenin optik eksenel bölümü. Ölçek çubuğu = 1 mm. (B) Brn2-immün etiketli üst tabaka ve Ctip2-immün etiketli alt tabaka nöronlarının beklenen lokalizasyonu ile doğru kanal hizalamasını gösteren A'daki (kutu) kortikal alanların genişlemiş girişi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Görüntü dikiş örnekleri . (A) Örnek 2B yinelemeli, doğru dikilmiş bir görüntüden elde edilen sonuçlar. Ölçek çubuğu = 1 mm. Ekle, yakınlaştırılmış doğru dikiş örneğini gösterir. Ölçek çubuğu = 500 μm. (B) Örnek, 2B yinelemeli, yanlış dikilmiş bir görüntüden elde edilir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Eklem, yakınlaştırılmış yanlış dikişlerin bir örneğini gösterir (çıkıntı). Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) Örnek, 2B yinelemeli yanlış dikilmiş bir görüntüden elde edilir. Ölçek çubuğu = 1 mm. Ekle, yakınlaştırılmış yanlış dikişlere bir örnek gösterir (odak dışı). Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: P4 fare beyninde düşük çözünürlüklü görüntü kaydı, yüksek çözünürlüklü çekirdek algılama ve hücre sayımı. (A) Sol panel: 25 μm izotropik çözünürlüğe yeniden örneklenen tüm beyin ışık tabakası 3D görüntülerinden bir z-dilimi örneği. Ölçek çubuğu = 1 mm. Orta panel: Allen Gelişimsel Beyin Atlası'ndan (P4) mikroskopi görüntüsüne kayıtlı ek açıklamalar. Ölçek çubuğu = 1 mm. Sağ panel: Sol ve orta panellerin bindirmesi. Ölçek çubuğu = 1 mm. (B) Eksenel görünümde yoğunluğu ayarlanmış dikişli görüntü örneği. Kutulu bölge (C) içinde gösterilir. Ölçek çubuğu = 1 mm. (C) Çekirdeklerin otomatik olarak algılanması (kırmızı). Ölçek çubuğu = 50 μm. (D) P4 beyninin farklı beyin bölgelerindeki hücre tiplerinin nicelleştirilmesi (Bazal ganglionlar, Hipokampal Allokorteks ve İzokkorteks). Kırmızı = Brn2 ile etiketlenmiş üst tabaka nöronları, Yeşil = Ctip2 ile etiketlenmiş Alt Katman nöronları ve Mavi = To-Pro-3 boyası ile etiketlenmiş tüm çekirdekler. Kısaltmalar: DPall = Dorsal pallium (izokorteks); MPall = Medial palyum (hipokampal allokorteks); CSPall = Merkezi subpalyum (klasik bazal gangliyon). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NuMorph Analiz Aşaması	Tahmini Süre
Yoğunluk Ayarı	1 saat
Kanal Hizalama	2 dk
2D Yinelemeli Dikiş	12 saat
Resampling	3 dk
Kayıt	3 dk
Hücre Sayımı	5 saat
Hücre Sınıflandırması	10 dk

Tablo 1: NuMorph analiz süreleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Doku temizleme yöntemleri, beynin 3D hücresel organizasyonunu ölçmek için yararlı tekniklerdir. Literatürde tanımlanan ve her biri avantajları ve sınırlamaları olan bir dizi doku temizleme yöntemi vardır 6,7,8,9. Doku temizlenmiş görüntülerdeki hücre tiplerini analiz etmek için hesaplama araçlarının seçenekleri nispeten sınırlıdır. Segmentasyonun daha az zor olduğu seyrek hücre popülasyonları için mevcut diğer araçlar uygulanmıştır ^10,35 veya doku genişlemesinden yararlanmıştır¹⁶. Bu makalede, iDISCO+ doku temizleme ile görüntüleme için bir fare beyninin hazırlanması anlatılmakta ve LSFM tarafından yakalanan bir fare korteksinin yapıları içindeki çekirdeklerin işlenmesi ve nicelleştirilmesi için hesaplamalı bir boru hattı olan NuMorph gösterilmektedir. Görüntüleme süresinin uzunluğu, hücre çekirdeklerinin algılama doğruluğu ve hesaplama kaynakları arasında uygun bir denge kurmak için tasarlanmıştır. Bu boru hattı, ^10,36,37 etiketli hücrelerin seyrek popülasyonları yerine tüm çekirdekleri güvenilir bir şekilde bölümlere ayırarak şu anda mevcut olan diğer araçlarla çelişmektedir. Daha önce, hücre algılama doğruluğunun yüksek olduğunu, görüntüleme sürelerinin önemli ölçüde daha kısa olduğunu ve tüm yarımküre edinimi için elde edilen veri boyutlarının diğer yöntemlere kıyasla çok daha az olduğunu göstermiştik¹⁹. NuMorph, kanal hizalaması için araçlar sağlama, sahne alanı hareketlerini bir dikiş aracıyla düzeltme ve görüntü döşemelerindeki sinyal parlaklığını düzeltme gibi çok kanallı ışık sayfası görüntülerinin analizi için bir dizi önemli zorluğu ele alır. Bu makalede sunulan iş akışı, daha geniş bilimsel topluluk için yararlıdır ve araştırma kurumlarındaki tüm gruplar için erişilebilirdir. Sürece genel bir bakış Şekil 1'de görülebilir.

Bu süreç boyunca, fare perfüzyonundan hesaplamalı analize, görüntülerin aşağı akış kalitesini, niceliğini ve sonuçlarını etkileyebilecek birkaç kritik adım vardır. Perfüzyonun, tüm kanın beyinden çıkarılacağı şekilde yapılması esastır, çünkü kan damarları, görüntülerdeki yoğunluğu etkileyecek ve boru hattında ayarlamalar gerektirecek ve sonuçları olumsuz yönde etkileyecek doğal bir otofloresana sahiptir. PFA fiksasyonunun süresi de çok önemlidir, çünkü beyinleri 24 saatten daha uzun bir süre boyunca% 4 PFA'ya batırılmış halde bırakmak, numunenin 'aşırı sabitlenmesine' neden olabilir ve beynin çatlamasına neden olabilir, bu da iDISCO + işlemi sırasında kırılgan hale gelir. Yukarıda açıklanan iDISCO protokolü,²⁴ web sitesinde bulunan resmi protokolden biraz değiştirilmiştir. Önemli bir değişiklik, orijinal protokolde su yerine metanol / PBS serisine PBS'nin eklenmesidir. Bu, embriyonik ve erken doğum sonrası beyinlerde, muhtemelen glial hücrelerin, aksonal projeksiyonların ve hücre dışı matrisin eksik gelişimi nedeniyle ortaya çıkan kortikal çatlamayı önlemek içindir. Bu protokolde kullanılan dokuya bağlı olarak, iDISCO+ protokolünün her adımında, antikor konsantrasyonlarını değiştirmek ve daha büyük doku örneklerinin kuluçka sürelerini artırmak gibi, tercih edilen belirteci yakalamak ve doğru bir şekilde analiz etmek için ideal parametreleri optimize etmek gibi değişiklikler yapılması gerekebilir.

Doku büzülmesinin, iDISCO+ doku temizleme işlemi sırasında meydana geldiği bilinmektedir ve bu da daha sonra^{hacimsel ölçümleri aşağı} akış ^6,10'da değiştirebilir. Doku temizlemeden önce yapılan MRG gibi alternatif yöntemler, herhangi bir hacimsel farklılığın doku temizleme işleminden değil, çalışılan fenotipten kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için deney hayvanlarına karşı kontrollerde doku boyutundaki herhangi bir değişikliğin derecesini belirlemek için kullanılabilir. Mutantların kortikal bölgelerinin hacimlerindeki heterojen değişiklikler, bölgesel hücresel içeriğe bağlı olarak farklılık gösterebilir, çünkü beynin gri ve beyaz maddesi metanol dehidrasyonlarından farklı şekilde etkilenebilir. MRG verileri, doku büzülmesinin beynin alt bölgelerinde düzgün olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir (Şekil 2G) ve temizleme protokolünün neden olduğu herhangi bir değişiklik, aşağı akış hesaplamalı analizde ayarlanabilir. Ayrıca, iDISCO + prosesi, numuneyi kurutmak için sert metanol yıkamaları kullanır, bu da çekirdek yüzeylerindeki bazı antijenlerde hasara veya değişikliklere neden olabilir. Kullanılan antikorların, antikorun iDISCO + protokolü ile uyumlu olduğundan emin olmak için ilk olarak% 100 metanol içinde ~ 3 saat yıkanmış beyin dokusu bölümlerinde test edilmesi önerilir.

Uzun işlem süreleri gerektiren büyük veri kümeleri için, Linux'ta MATLAB'ın, bir sunucuya bağlantı kesildikten sonra bile bir işlemi çalıştırmaya devam edecek olan "nohup" komutunu uygulama gibi stratejilere izin veren penceresiz sürümünü kullanmanızı öneririz. Ayrıca, NuMorph yüksek bilgi işlem gücü gerektirir, bu nedenle analizler için en az 10 GB bellek öneririz. Örnekleri, 2,6 GHz 14 çekirdekli işlemci, 8 x 64 GB DDR4 2400 LRDIMM bellek, 4 x 11 GB GPU ve 2 x 4 TB harici SSD ile donatılmış CentOS 7 çalıştıran bir Linux iş istasyonu kullanarak analiz ediyoruz. Burada kullanılan ham ışık sayfası verileri 620 GB ve işlemler için bellek gereksinimi 10 GB idi. Burada, Tablo 1'de görüldüğü gibi NuMorph analizlerinin her adımını tamamlamak için tahmini süreleri içeren bir tablo ekledik.

Görüntü ön işleme adımları, her z-düzlemi, kanal hizalaması ve dikiş için xy boyutunda yoğunluk ayarlamasını içerir. Görüntü yoğunluğu, döşemeler arasındaki yoğunluk farklılıklarını ve y boyutu boyunca eşit olmayan aydınlatmayı hesaba katacak şekilde ayarlanır. Yoğunluktaki fark, ışık tabakasının fayanslar²⁵ arasında görüntü alırken doğal teknik özelliklerinden kaynaklanır. Ardından, çok kanallı görüntülemede görüntü kanallarının doğru şekilde hizalandığından emin olmak için kanal hizalaması gerçekleştirilir. Çok kanallı görüntülemedeki her kanal ayrı ayrı edinildiğinden ve sahnenin ince hareketleri numune kaymalarına neden olabileceğinden ve uzamsal yanlış hizalamayla sonuçlanabileceğinden bu adım önerilir¹⁹. Son olarak, z-düzlemi başına karolar daha sonra her z-düzleminde tek bir görüntü oluşturmak için bir araya getirilir. Sonunda, numunenin tüm hacmini temsil eden kanal başına dikişli bir görüntü yığını olacaktır. Yinelemeli görüntü dikiş, kanal başına tüm 2B görüntüleri örnek^19'un 3B hacminde düzenlemek için özel bir yönteme dayanır. Yöntem ilk olarak, hem yatay hem de dikey yönde üst üste binen karo bölgelerini eşleştirmek için eksenel yönde çift yönlü bir z-yazışması uygular. Her bir karo için son z-yer değiştirme, minimum yayılan ağaç³⁸ kullanılarak belirlenir. 2B yinelemeli dikiş, yığının ortasındaki bir konumdan başlayarak daha az arka plan sinyaline sahip bir yığında gerçekleştirilir. Sol üst kutucuk, z boyutundaki görüntülerin ince bir şekilde kaymasını önlemek için her dikiş yinelemesi için ilk sıraya yerleştirilir.

Ön işleme işlem hattının her birini, özellikle hataları düzeltmek için en iyi duruma getirirken sırayla çalıştırmanızı öneririz. Başlıca sorunlar genellikle dikiş adımları sırasında ortaya çıkar. Ortaya çıkabilecek bir sorun, ışık tabakasında yanlış görüntü alımıdır. Bu sorun, yatay dinamik odaklama ışık tabakasında yanlış ayarlandığında ve görüntülerde faz içi/faz dışı desenlerin değişmesine neden olduğunda oluşabilir (Şekil 4B, C). Numune sıkıca sabitlenmemişse ve elde etme sırasında önemli numune hareketi meydana gelirse ek hatalar ortaya çıkabilir. Bu durumlarda, bitişik fayanslar arasında çift yönlü yazışma olmaması nedeniyle doğru dikiş mümkün olmayabilir. Diğer olası hatalar dikiş başlangıç sitesinden kaynaklanabilir. NuMorph, dikiş başlangıç bölgesini kabaca yığının ortasında belirler. Ancak, başlangıç dilimi sitesinde önemli bir arka plan olduğunda, görüntü döşemelerindeki ikili karşılaştırmada hatalar oluşabilir. Burada, yüksek sinyal-gürültü oranına sahip bir başlangıç sitesi seçmeniz önerilir.

Burada açıklanan görüntü analizi, dikişli görüntülerin yüksek çözünürlükten (0,75 x 0,75 x 4 μm³/voksel) 25 μm³/voksellik daha düşük izotropik çözünürlüğe yeniden örneklenmesini içerir. Bir sonraki adım^34'te dikişli görüntüleri Allen Gelişimsel Fare Beyin Atlası'na kaydetmek için nükleer kanaldan dikilmiş görüntüleri yeniden örnekliyoruz. Daha sonra, eğitimli bir 3D-Unet model¹⁹ kullanılarak yüksek çözünürlükte (0,75 x 0,75 x 4 μm³ / voksel) atlasa atıfta bulunarak görüntülerin açıklamalı bölgelerindeki her kanal için hücreler sayılır. Bu yöntem, blob nesnelerini algılamak ve saymak için de kullanılabilir. NuMorph'u geliştirirken, aynı doku temizleme prosedüründen, aynı mikroskoptan ve aynı nükleer etiket bulma hassasiyetinden 0.99 ve 0.94^19'un geri çağrılmasından eğitim sırasında hiç görülmemiş tamamen yeni görüntülere göre segmentasyon doğruluğunu test ettik. NuMorph doğruluğu henüz farklı doku temizleme prosedürleri, mikroskoplar veya belirteçler üzerinde test edilmemiştir; Bu nedenle, diğer deneysel tasarımlardaki segmentasyonun doğruluğu bilinmemektedir. NM_setup.m'deki varsayılan atlas, özel ek açıklama olarak Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework'ün (CCFv3) üçüncü yinelemesi ile yetişkin Nissl lekeli Allen Reference Atlas^39'dur .

NuMorph, yetişkin fare korteksi gibi nispeten yoğun olan dokuları etkili bir şekilde analiz etse de, daha zorlu deneysel tasarımlar (embriyonik fare beyinleri veya beyincik gibi oldukça yoğun yapılar gibi) ek hesaplama araçlarının geliştirilmesini gerektirebilir. Mevcut topluluk temelli çabalar, bu daha zor durumları segmentlere ayırmak için kullanılan derin öğrenme modellerinin eğitimi için yeterli ek açıklama verisi üretmeye çalışmaktadır⁴⁰. Işık tabakası görüntüleme teknolojilerindeki ilerlemeler, hücresel-yoğun beyin bölgelerinde artan çözünürlük ve doğruluğa yol açan çift görünümlü ters seçici düzlem aydınlatma mikroskobu (diSPIM) gibi yeni yaklaşımlarla hücre altı yapıların yüksek verimli nicel olarak araştırılmasına olanak tanır^40,41. Bu araştırmada yer alan doku temizleme, görüntüleme ve hesaplama araçlarındaki gelişmeler geliştikçe, nöropsikiyatrik bozuklukların genetik veya çevresel risk faktörlerinin neden olduğu beyin yapısındaki değişikliklerden nasıl kaynaklanabileceğine dair nicel analizler için doku temizleme yöntemlerinin daha geniş kullanımına yol açacağını umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH (R01MH121433, R01MH118349 ve R01MH120125 JLS'ye ve R01NS110791'den GW'ye) ve Umut Vakfı tarafından desteklenmiştir. Mikroskopi Hizmetleri Laboratuvarı'ndan Pablo Ariel'e örnek görüntülemeye yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Anabilim Dalı'ndaki Mikroskopi Hizmetleri Laboratuvarı, kısmen Kuzey Carolina Üniversitesi (UNC) Lineberger Kapsamlı Kanser Merkezi'ne Kanser Merkezi Çekirdek Destek Hibe P30 CA016086 tarafından desteklenmektedir. Nörobilim Mikroskopi Çekirdeği, hibe P30 NS045892 tarafından desteklenmektedir. Bu yayında bildirilen araştırmalar kısmen Kuzey Carolina Biyoteknoloji Merkezi Kurumsal Destek Hibe 2016-IDG-1016 tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bruker 9.4T/30 cm MRI Scanner	Bruker Biospec		Horizontal Bore Animal MRI System
Dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014-1KG
Dichloromethane (DCM)	Sigma-Aldrich	270997-1L
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher-Scientific	ICN19605590
Donkey serum	Sigma-Aldrich	S30-100ML
EVO 860 4TB external SSD
Fomblin Y	Speciality Fluids Company	YL-VAC-25-6	perfluoropolyether lubricant
gadolinium contrast agent (ProHance)	Bracco Diagnostics	A9576
gadolinium contrast agent(ProHance)	Bracco Diagnostics	0270-1111-03
GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU	EVGA	08G-P4-6286-KR
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3393-10KU	Dissolved in H₂O to 10 mg/mL
Hydrogen peroxide solution, 30%	Sigma-Aldrich	H1009-100ML
ImSpector Pro	LaVision BioTec		Microscope image acquisition software
ITK Snap			segmentation software
Methanol	Fisher-Scientific	A412SK-4
MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective	Olympus
Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA)	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Dissolved in 1x PBS to 4%
Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Corning	46-013-CM	Diluted to 1x in H₂O
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G	Dissolved in H₂O to 10%
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750-10G
Tergitol type NP-40	Sigma-Aldrich	NP40S-100ML
TritonX-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Fisher-Scientific	BP337 500
Ultramicroscope II Light Sheet Microscope	LaVision BioTec
Xeon Processor E5-2690 v4	Intel	E5-2690
Zyla sCMOS Camera	Andor		Complementary metal oxide semiconductor camera
Antibody			Working concentration
Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit	Thermofisher Scientific	A11369	(1:50)
Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat	Thermofisher Scientific	A11077	(1:200)
Rat anti-Ctip2	Abcam	ab18465	(1:400)
Rabbit anti-Brn2	Cell Signaling Technology	12137	(1:100)
To-Pro 3 (TP3)	Thermofisher Scientific	T3605	(1:400)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
Hägerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO Journal. 32 (5), 629-644 (2013).
Tomer, R., Khairy, K., Keller, P. J. Shedding light on the system: studying embryonic development with light sheet microscopy. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 558-565 (2011).
Li, A., et al. Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain. Science. 330 (6009), 1404-1408 (2010).
Stoner, R., et al. Patches of disorganization in the neocortex of children with autism. The New England Journal of Medicine. 370 (13), 1209-1219 (2014).
Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews. Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (2), 129-138 (2011).
Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal of Optics. 20 (5), 053002 (2018).
Budday, S., et al. Mechanical properties of gray and white matter brain tissue by indentation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 46, 318-330 (2015).
Johnson, G. A., et al. High-throughput morphologic phenotyping of the mouse brain with magnetic resonance histology. NeuroImage. 37 (1), 82-89 (2007).
Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
Matsumoto, K., et al. Advanced CUBIC tissue clearing for whole-organ cell profiling. Nature Protocols. 14 (12), 3506-3537 (2019).
Fürth, D., et al. An interactive framework for whole-brain maps at cellular resolution. Nature Neuroscience. 21 (1), 139-149 (2018).
Chandrashekhar, V., et al. CloudReg: automatic terabyte-scale cross-modal brain volume registration. Nature Methods. 18 (8), 845-846 (2021).
Krupa, O., et al. NuMorph: Tools for cortical cellular phenotyping in tissue-cleared whole-brain images. Cell Reports. 37 (2), 109802 (2021).
Petiet, A., Delatour, B., Dhenain, M. Models of neurodegenerative disease - Alzheimer's anatomical and amyloid plaque imaging. Methods in Molecular Biology. 771, 293-308 (2011).
Jenkinson, M., Beckmann, C. F., Behrens, T. E. J., Woolrich, M. W., Smith, S. M. FSL. NeuroImage. 62, 782-790 (2012).
Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. NeuroImage. 17 (2), 825-841 (2002).
Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12 (1), 26-41 (2008).
iDISCO method. , Available from: https://idisco.info/ (2022).
Ariel, P. UltraMicroscope II - A User Guide. University of North Carolina at Chapel Hill. , UniversityLibraries. Chapel Hill (NC). (2019).
Anaconda Distribution - Anaconda documentation. , Available from: https://docs.anaconda.com/anaconda/ (2022).
Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Communications. 8, 14836 (2017).
Klein, S., Staring, M., Murphy, K., Viergever, M. A., Pluim, J. P. W. elastix: a toolbox for intensity-based medical image registration. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29, 196-205 (2010).
Lowe, G. Sift-the scale invariant feature transform. International Journal. 2 (91-110), 2 (2004).
Young, D. M., et al. Whole-brain image analysis and anatomical atlas 3D generation using MagellanMapper. Current Protocols in Neuroscience. 94 (1), Editorial Board, Jacqueline N. Crawley ... [et al] 104 (2020).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Velíšek, L. Under the (Light) sheet after the iDISCO. Epilepsy Currents / American Epilepsy Society. 16 (6), 405-407 (2016).
ITK-SNAP home. , Available from: http://www.itksnap/org/pmwiki/pmwiki.php (2022).
Young, D. M., et al. Constructing and optimizing 3D atlases from 2D data with application to the developing mouse brain. eLife. 10, (2021).
Yun, D. H., et al. Ultrafast immunostaining of organ-scale tissues for scalable proteomic phenotyping. bioRxiv. , (2019).
Silvestri, L., et al. Universal autofocus for quantitative volumetric microscopy of whole mouse brains. Nature Methods. 18 (8), 953-958 (2021).
Frasconi, P., et al. Large-scale automated identification of mouse brain cells in confocal light sheet microscopy images. Bioinformatics. 30 (17), 587 (2014).
Kruskal, J. B. On the shortest spanning subtree of a graph and the traveling salesman problem. Proceedings of the American Mathematical Society. American Mathematical Society. 7 (1), 48-50 (1956).
Wang, Q., et al. The allen mouse brain common coordinate framework: A 3D reference atlas. Cell. 181, 936-953 (2020).
Borland, D., et al. Segmentor: a tool for manual refinement of 3D microscopy annotations. BMC Bioinformatics. 22 (1), 260 (2021).
Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).

Neuroscience

Tüm Beyin Tek Hücreli Görüntüleme ve MRG, Doku Temizleme ve Işık Tabakası Mikroskobu Kullanarak Bozulmamış Yenidoğan Fare Beyinlerinin Analizi

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.