Summary
İmmünohistokimyasal yöntemler, yetişkin arıların midgut ve hipofaringeal bezlerindeki apoptoz ve nekroz seviyesini tespit etmek ve değerlendirmek için bal arısı araştırmalarında yararlıdır.
Abstract
Kovanın içindeki (hemşire işçiler ve diğer kovan arıları) ve kovanın dışındaki bal arıları (Apis mellifera L.) (toplayıcılar), iklim ve hava değişikliklerine, çeşitli pestisitlere, patojenlere ve yetersiz beslenmeye maruz kalmaktadır, esas olarak ağızdan girmekte ve öncelikle yetişkin arıların sindirim yollarını etkilemektedir. Bu tür dış ve iç stresörlerin bal arıları üzerindeki etkilerini anlamak ve önlemek için, yararlı bir araştırma yöntemi immünohistokimyasal yöntemdir. Histolojik analiz için yetişkin arıların midgut (ventrikül) ve hipofaringeal bezlerini (HPG'ler) hazırlamak için temel bir protokol tanımlanmıştır. Hücre hasarının seviyesini değerlendirmek ve nekrozu doğal bir doku rejenerasyonu süreci olarak programlanmış hücre ölümünden (apoptoz) ayırt etmek için ayrıntılı bir metodoloji açıklanmaktadır. Oksalik asit ve pestisitler (insektisit ve akarisit) ile erişkin bal arısı tedavisinin sonuçları ve ventriküls ve HPG'lerde hücre ölümünün belirlenmesi sunulmaktadır. Metodolojinin artıları ve eksileri de tartışılmaktadır.
Introduction
Bal arıları (Apis mellifera L.), diğer vahşi tozlayıcıların yanı sıra, tarımsal bitkilerin en önemli tozlayıcılarıdır. Binlerce yıl boyunca, değişen çevre arıların morfolojilerini, fizyolojilerini, davranışlarını ve toleranslarını çeşitli patojenlere ve parazitlere uyarlamalarını etkilemiştir. Bu nedenle, bal arıları dünya çapında çok çeşitli türler ve alt türler geliştirmiştir1. Bu sonuçlar, bal arısının sindirim sistemi yapısında genetik çeşitlilik olduğu yönündeki önceki bulgularla tutarlıdır, ancak aynı zamanda midgut değişikliklerinin çevresel faktörlerden kaynaklandığını düşündürmektedir 2,3.
Bal arısının sindirim sistemi üç ana bölüme sahiptir: foregut, midgut (ventriculus) ve hindgut4. Ventrikül, polen ve nektar/balın sindirimi için gerekli bir organdır; hindgutta, ozmotik kontrol suyun ve iyonların emilimi yoluyla gerçekleşir2. Bal arısı işçilerinin hipofaringeal bezleri (HPG'ler) kafada bulunur ve yavruyu, kraliçeyi ve koloninin üyelerini beslemek için arı sütü bileşenlerini sentezler ve salgılar. Büyüklükleri yaş ve görevlerle birlikte değişir ve doğru beslenmeye (kaliteli polen) bağlıdır. 6 ila 18 günlük hemşire işçiler yavru yetiştiriciliği gerçekleştirir ve HPG'lerin boyutu 5,6 artar. Toplayıcı arılarda, HPG'ler dejenere olur ve sadece karmaşık şekerleri balda basit olanlara (α-glukozidazlar, lösin arylamidaz, invertaz) dönüştürmek için önemli olan enzimleri salgılar7.
Bal arıları çeşitli biyotik ve abiyotik stresörlere maruz kalır8 ve sindirim sistemi birkaç olumsuz uyarıcıdan etkilenebilir. Organizmayı patojenlerden koruyan ilk bariyer, patojenlere karşı korunmak için bağırsak mukozasından oluşan midguttaki peritrofik zardır4. HPG'lerin gelişimi ve işlevi diyete, yaşa ve koloni durumuna bağlıdır9 ve insektisitler, akarisitler10 ve patojenler 11,12,13'ten etkilenir. Varroa kontrol tedavisine bağlı kovanda bulunan akarisit kalıntıları ve çevreden gelen pestisitler toplayıcı arıları ve hemşire arıları etkilemektedir14,15. Bal arısı kolonileri için en büyük tehdit, hem koloni kayıplarına katkıda bulunan virüslerin bir vektörü olarak16 hem de konakçının yağ vücudunun (bal arılarında önemli bir hayati organ) tüketicisi olarak akar Varroa yıkıcısıdır, bu da sonuçta bireyin vücudunu ve koloni işlevlerini etkiler17.
Bununla birlikte, yoğun tarım arazisi habitatları, bal arıları için kısa vadeli bir gıda kaynağı sağlayabilir. Bu nedenle, tarım-çevre planları, bal çiçeklerinin tarımsal arazilerde kullanılabilirliğini arttırmalıdır18. Farklı alt türlerin morfolojisini değerlendirmek için 6,19,20,21 veya bu faktörlerin hücre veya doku seviyelerinde, özellikle midgut ve HPG'lerde subletal etkilerini, histolojik ve immünohistokimyasal yöntemler bal arılarında histoloji araştırmalarında kullanılmak üzere pratik ve yeterince doğrudur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bal arısı araştırmaları için temel histoloji
- Balarısı dokusunun diseksiyonu
NOT: İşçi arıların diseksiyonu için, LED ışık kaynağı olan bir diseksiyon mikroskobu kullanın. En kullanışlı büyütme ~ 20x'tir.- Manipülasyon ve diseksiyon
- Forsepsli bir işçi arıyı dikkatlice alın ve 22 dakika boyunca buza (veya -20 ° C'de dondurucuya) koyun ve 22 dakika boyunca hareketsizhale getirin. Arısı, Petri kabının üzerine, göğüs kafesinin en üst arka kısmından çapraz olarak, soldan sağa ve sağdan sola iki kez sabitleyin.
- Vücudu örtmek için böcek salini dökün. Petri kabını mikroskop altına yerleştirin, odaklanın ve ayarlayın.
- Aletleri hazırlayın ( bkz. Malzeme Tablosu).
- Midgut diseksiyonu
- Arı vücudunun sağ tarafının ortasındaki tergit A5'in (Şekil 1) altına makasın bir noktasını sokarak karın ile başlayın. Tergite A2'ye kesin.
- İç organlara zarar vermemek için makasın iç bıçağını vücudun yan tarafına paralel tutun. Makası sola çevirin ve bir kesim yapın; sağa dönün ve başka bir kesim yapın. Karnın sol kısmını yavaşça açın ve sabitleyin. Diğer tarafta tekrarlayın.
- Bir elinizle forseps kullanarak, bal arısı midesini yavaşça yukarı doğru çekin ve diğer yandan makasla yemek borusunun en sonunda kesin. Mideyi ve midgutu karından uzaklaştırın ve rektumda kesin. Böcek salin çözeltisi içeren bir pipet kullanın ve dışkıyı veya dokunun parçalarını çıkarın.
- HPG'lerin diseksiyonu
- Bir işçi arıyı adım 1.1.1'de açıklandığı gibi buz üzerinde hareketsiz hale getirin. Kafayı kesin ve antenler yukarı bakacak şekilde daha küçük plakaya yerleştirin. Kafayı iki pimle sabitleyin: biri sol bileşik gözden, ikincisi sağ bileşik gözden.
- Pimlerin iç tarafındaki ilk bileşik göz boyunca bir kesim yapın, labruma devam edin ve ardından ikinci bileşik göz boyunca diğer tarafta başka bir kesim yapın (Şekil 2).
- Antenleri kesin. Maskeyi çıkarın ve hala takılı olan yerde kesin. Forsepsleri alın ve bezleri beyin ve bileşik gözlerin bir kısmı ile birlikte dikkatlice çıkarın.
- Manipülasyon ve diseksiyon
- Fiksasyon, dehidrasyon ve parafin gömme
NOT: Koruyucu eldiven giyin.- Dokuyu penisilin şişelerine yerleştirin,% 10 formalin ile 3/4 doldurun. 4 °C'de buzdolabında saklayın.
- 24 saat sonra, dokuyu bir dizi alkolde kurutun:% 70,% 80,% 90,% 100, her biri 1 saat için,% 100 2-propanol, 12 saat boyunca% 100 2-propanol ve son olarak 1 saat boyunca% 100 2-propanol.
- Dokuyu histokasetlere yerleştirin; işaretleyin ve 24 saat boyunca 60 ° C'de bir inkübatörde 2-propanol ve parafin (1: 1) ile cam odalara yerleştirin.
- Histokasetleri 24 saat daha parafin (I.) içeren başka bir odaya taşıyın. Prosedürü her ikisi de 24 saat boyunca taze parafin ile iki kez daha tekrarlayın (II. ve III.).
- Son olarak, montaj istasyonunu hazırlayın ve dokuyu balmumu içine gömmeye başlayın.
- Her histokaseti açın ve kapağı çıkarın. Kalıbı balmumu ile doldurun ve kalıbın ortasına ılık forseps içeren dokuyu dikkatlice yerleştirin.
- Histokaseti kalıba yerleştirin ve hafifçe balmumu ile örtün. Kalıbı derhal montaj istasyonunun soğuk yüzeyine birkaç saniye yerleştirin, ardından balmumu sertleşene ve kalıptan ve histokasetten ayrılana kadar birkaç dakika soğuk plakaya yerleştirin.
- Bitmiş numuneleri toz ve ısıdan uzak bir kutuda saklayın.
- Bir mikrotom üzerinde 4 μm ince kesitler kesin: ilk önce birbirine bağlı iki bölüm ve sonra ayrı ayrı bir bölüm. Bölümleri forseps ile aktarın ve damıtılmış su (42 ° C) üzerinde yüzmelerine izin verin, ardından iki bölümü objektif camın sol tarafına ve üçüncüsünü sağ tarafa yerleştirerek temiz slaytlarda toplayın, belirgin bir şekilde ayrı kalın. İşaretli slaytları gece boyunca ısıtma cihazında bırakın ve son olarak histoloji örnekleri için ayrılmış bir kutuda saklayın.
- Mum giderme ve rehidrasyon
NOT: Koruyucu eldiven giyin.- Dokuz Coplin kavanozu hazırlayın ve bölümleri her biri 5 dakika boyunca bir dizi temizleme maddesine (I., II., III.) koyun.
- 2-propanol,% 96 etanol (I., II.), alkol% 90 ve% 80 ve her biri 3 dakika damıtılmış suya koyun.
- Hematoksilin ve eozin ile boyama
NOT: Koruyucu eldiven giyin.- Altı Coplin kavanoz hazırlayın.
- Hematoksilin ve eozin (H & E) boyama için, mumdan arındırılmış, rehidre edilmiş bölümleri 5 dakika boyunca hematoksilin içine koyun, ardından 2 dakika boyunca akan musluk suyunun altına dikkatlice yerleştirin. Daha sonra bunları 1 dakika boyunca damıtılmış suya ve 4 dakika boyunca eozine koyun (eozin için Coplin kavanozu gerekli değildir).
- Slaytları 1 dakika boyunca% 96 etanol, daha sonra 2 dakika boyunca 2-propanol ve son olarak 2 dakika boyunca temizleme maddesine yerleştirin.
- Montaj ortamı ve bir kapak camı ekleyin ve kurumasını bekleyin. Bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
Resim 1: Bal arısı gövdesinin dorsal görünümü. A1-A7 tergitleri. Bal arısı diseksiyonu ile ilgili ayrıntılı talimatlar Carreck ve ark.24'te bulunabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HPG'lerin dorsal görünümü, beyne bağlı bileşik gözlerin parçaları (görünmez). 5 ila 6 günlük genç bir işçi arı, dolgun ve kremsi beyaz HPG'lere sahiptir. Acini beyinde bulunur ve baş bölgesini beynin arkasına ulaşan dallarla doldurur. Yiyecek arayan arılarda, bu bezler büyük ölçüde küçülür ve sadece ince iplik benzeri kalıntılar bırakır. Bu nedenle, dokuyu kaybetmemek için daha sonraki prosedürlerde daha kolay hale getirmek için bezleri beyinle birlikte çıkarmak daha iyidir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Doku kesitlerinde hücre ölümünün tespiti
- Apoptoz tespit kiti (Tahlil A)
NOT: Üreticinin protokolünü izleyin ( bkz. Malzeme Tablosu).- Coplin kavanozlarını hazırlayın.
- Mumdan arındırma ve rehidrasyondan sonra (bkz. adım 1.3), slaytları% 0.85 NaCl çözeltisine ve ardından fosfat tamponlu salin (PBS) içine daldırın (5 dakika).
- Slaytları% 4 paraformaldehit 2 x 15 dakika içine koyun.
- Slaytları kaba düz bir şekilde yerleştirin ve 100 μL bir Proteinaz K (20 μg / mL) çözeltisi ekleyin, ardından 10-30 dakika bekletin.
- Slaytları PBS'ye yerleştirin (5 dk).
- Slaytları PBS'de% 4 paraformaldehit içine yerleştirin (5 dk).
- Slaytları PBS'ye daldırın (2 x 5 dakika).
- Slaytları kaba düz bir şekilde yerleştirin, 100 μL denge tamponu ekleyin ve 5-10 dakika bekletin.
- 100 μL TdT reaksiyon karışımı ekleyin. Kağıt havluları kabın içine, slaytların etrafına koyun, havluları suyla nemlendirin ve ardından plastik ambalajla örtün. Slaytları 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
- Slaytları tekrar boyama rafına yerleştirin ve 15 dakika boyunca 2x salin-sodyum sitrat (SSC) içine daldırın.
- Slaytları 3 x 5 dakika PBS'ye, daha sonra% 0.3 hidrojen peroksitte 3-5 dakika ve sonra tekrar PBS'ye 3 x 5 dakika batırın.
- Yine, slaytları kaba düz bir şekilde yerleştirin, 100 μL Streptavidin HRP (yaban turpu peroksidaz) ekleyin ve 30 dakika bekletin (plastik ambalajla örtün).
- Slaytları PBS'ye 3 x 5 dakika daldırın.
- Slaytları kaba düz bir şekilde yerleştirin ve 100 μL 3,3'-diaminobenzidin (DAB) çözeltisi ekleyin. Açık kahverengi bir arka plan arayın.
- Slaytları rafa geri koyun ve birkaç kez suda yıkayın (çift damıtılmış).
- Kızakları cam kapakların altına monte edin, montaj ortamında kaymaları ve kurumaya bırakın.
- Bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
- Apoptoz tespit kiti (Tahlil B)
NOT: Üreticinin protokolünü izleyin ( bkz. Malzeme Tablosu).- Coplin kavanozları hazırlayın.
- Proteinaz K (PBS'de seyreltilmiş 20 μg / mL) hazırlayın.
- Bölümleri mumdan arındırdıktan ve yeniden sulandırdıktan sonra (adım 1.3), slaytları 5 dakika boyunca PBS'ye yerleştirin.
- Slaytları kaba düz bir şekilde yerleştirin ve Proteinaz K (20 μg / mL, 5 cm² numune başına 60 μL) ekleyin.
- Slaytları 2 x 2 dakika damıtılmış suda yıkayın.
- Oda sıcaklığında endojen peroksidaz (% 3 hidrojen peroksidaz) içinde söndürün.
- Slaytları PBS veya su ile 2 x 5 dakika durulayın.
- Kızakları kaba düz bir şekilde yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 s boyunca denge tamponu (75 μL / 5cm2) uygulayın.
- Mendilin etrafını dikkatlice silin.
- TdT enzimini (terminal deoksinükleotidil transferaz) her bölüme ekleyin ve nemlendirilmiş bir odada 37 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin. Kağıt havluları tepsinin içine, slaytların etrafına koyun, havluları suyla nemlendirin ve plastik ambalajla örtün.
- Kuluçkadan sonra, numuneleri rafa koyun ve durdurma / yıkama tamponunda bırakın (10 dakika).
- Anti-digoxigenin konjugatını oda sıcaklığına ısıtın.
- Slaytları PBS ile yıkayın (3 x 1 dakika).
- Dokunun etrafını dikkatlice silin.
- Bölümlere iki damla Anti-Digoxigenin-Peroksidaz konjugatı (65 μL / 5 cm²) ekleyin ve nemlendirilmiş bir kapta 30 dakika boyunca inkübe edin.
- PBS 4 x 2 dakika içinde yıkadıktan sonra, çalışma mukavemetli peroksidaz substratını hazırlayın ve fazla sıvıya hafifçe dokunun ve bölümün etrafına aspirasyon yapın.
- Bölümleri peroksidaz substratı (75 μL/5 cm²) ile örtün ve 5 dakika boyunca lekeleyin. Mikroskop altına bir slayt yerleştirin ve en uygun boyama süresini belirleyin.
- Slaytları bir boyama rafında damıtılmış suda (3 x 1 dakika) yıkayın.
- Slaytları 5 dakika boyunca damıtılmış suda inkübe edin.
- 2 dakika boyunca hematoksilin kullanarak karşı boyama.
- Kaydırağı 3 dakika boyunca akan musluk suyunun altına yerleştirin.
- Slaytı damıtılmış suda yıkayın.
- Kızakları cam kapakların altına monte edin, montaj ortamında kaymaları ve kurumaya bırakın.
- Bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
- Apoptoz tespit kiti (Tahlil C)
NOT: Üreticinin protokolünü izleyin ( bkz. Malzeme Tablosu).- Coplin kavanozlarını hazırlayın.
- Doku bölümlerini balmumundan arındırın ve yeniden sulandırın (bkz. adım 1.3).
- Dokuyu Proteinaz K ile inkübe edin (37 ° C'de 15-30 dakika).
- Slaytları tekrar rafa yerleştirin ve PBS'de 2 kat durulayın.
- 50 μL 'TUNEL reaksiyon karışımı' ile örtün. Islak kağıt havluları kabın içine yerleştirin, plastik ambalajla örtün ve 37 ° C'de 60 dakika bekletin.
- PBS ile 3 kat durulayın.
- Slaytları kaba yerleştirin ve doku örneğinin etrafındaki alanı kurutun.
- Numuneye 50 μL Converter-AP ekleyin ve nemlendirilmiş bir kapta 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- PBS'de 3 kat durulayın.
- 50-100 μL substrat çözeltisi ekleyin ve karanlıkta 10 dakika bekletin.
NOT: Boyama işlemini ışık mikroskobu altında gözlemleyin. - Slaytları PBS ile 3 kat durulayın.
- Kesitleri 2 dakika boyunca hematoksiline aktararak karşı leke yapın ve ardından 5 dakika boyunca akan musluk suyunda dikkatlice durulayın.
- Kızakları cam kapakların altına monte edinSulu bir montaj ortamında kaymaları ve kuruması için düz bırakın.
- Bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Etkilenen (pozitif) hücreleri, midgut veya HPG'lerin her bir örneğinde ışık mikroskobu altında 70 ila 100 hücre sayarak değerlendirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Midgutta hücre ölümü tespiti
Ljubljana'daki Slovenya Tarım Enstitüsü'ndeki deneysel arı kovanından yeni ortaya çıkan işçi arılar (Apis mellifera carnica), bireysel olarak% 3 oksalik asit (OA) 23 ile muamele edildi. OA, arıcılıkta Varroa yıkıcı kontrolü için sıklıkla kullanılır. Tedaviden sonra, işçi arılar (her gruptan üç) buz üzerinde hareketsiz hale getirildi. Midgut diseke edildi ve% 10 formalin ile sabitlendi. Doku daha sonra bir dizi alkol çözeltisinde dehidre edildi ve sonunda parafin mumuna gömüldü. Bir mikrotomla 7 μm ince kesitler halinde kesildikten sonra, doku örnekleri analiz için hazırlandı. Bir ışık mikroskobu kullanılarak, etkilenen hücrelerin yüzdesi (üç midgut örneğinin her birinden 70-100 hücre) hesaplandı. Tahlil B ile elde edilen sonuçlar, OA ile tedavinin midguttaki hücreleri önemli ölçüde etkilediğini göstermiştir (Şekil 3). Tahlil A, tedavi edilen ve kontrol edilen arılar arasında hiçbir fark göstermedi; hücre ölüm oranı %10'un altındaydı. Kontrol arılarında, sadece şeker şurubu ile beslenen, midgutun morfolojisi etkilenmemiş ve iyi korunmuştur.
Şekil 3: Midgut. (A) Hematoksilin ve eozin boyaması; (B) midgutun immün boyama (Tahlil C). Yoğun kırmızı boyama, midgut hücrelerinin çekirdeklerinde lokalizedir. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
HPG'lerde hücre ölümü tespiti
Bir sonraki denemede, deney üç hastalıksız koloni (Apis mellifera L.) seçilerek gerçekleştirildi. Kapalı yavrulu taraklar bir inkübatöre (34.5 ° C) yerleştirildi ve yeni ortaya çıkan işçi arılar, yaşlarını tanımlamak için göğüs kafesinde bir nokta ile işaretlendi. Bu prosedür, farklı yaştaki arıları elde etmek için üç kez tekrarlandı. Arılar işaretlendi ve kolonilerine geri döndü. Arılar, denemenin başlangıcından itibaren 30 gün sonra örneklendi. Son olarak, bir tarafında tel örgü bulunan 7,5 cm x 4 cm x 4 cm'lik bir istifleme kafesine konuldu ve 28 ° C'de bir inkübatörde tutuldu.
İşçiler insektisit (imidakloprid) veya akarisit (coumaphos), her ikisi de sublethal dozlarda çözeltiler veya kontrol grubu10 olarak şeker şurubu ile tedavi edildi. Farklı grupların arıları hareketsiz hale getirildi ve HPG'ler diseke edildi. Bir örneklem, mümkün olduğunca çok hücre elde etmek için aynı gruptan üç ila beş işçiden oluşuyordu. Etkilenen hücreler immünohistoloji yöntemleri kullanılarak değerlendirildi. HPG'lerin apoptotik çekirdeklerinde kırmızı (Tahlil C) ve kahverengi (Tahlil B) reaksiyon ürünleri saptandı. Glandüler hücrelerin çoğunda imidacloprid veya coumaphos tedavisinden sonra pozitif kırmızı çekirdekler belirlendi (Şekil 4) ve sadece sporadik hücre çekirdekleri aynı tedavi edilen gruplardan kahverengi reaksiyon ürünü gösterdi. Kontrol grubunda hasarlı HPG hücreleri yoktu.
Şekil 4: Hipofaringeal bezler. (A) Hematoksilin ve eozin boyaması; (B) immün boyama (Tahlil C). Kırmızı boyama, hücrelerin çekirdeğinde lokalizedir. (C) İmmün boyama (Tahlil B). Kahverengi reaksiyon ürünü pozitif hücre çekirdeklerini gösterir. Ölçek çubukları = 50 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Canlı organizmalarda, hücre ölümü apoptoz veya nekroz25 olarak tanımlanır ve otofaji26 eşlik edebilir. Apoptotik ve nekrotik hücreler arasındaki fark, apoptozun programlanmış hücre ölümünün bir şekli olması ve normal hücrelerde ortaya çıkması, nekrozun ise ölümcül koşullar (örneğin, kaza, hastalık) nedeniyle ortaya çıkmasıdır27,28. Apoptoz, TUNEL tekniğine dayanan tahlil kitleri kullanılarak tespit edilebilir (apoptoz sırasında üretilen çift sarmallı DNA kırılmalarında 3'-hidroksil termini etiketleyerek DNA parçalanmasının tespiti). Farklı kitler, hücre delesyonunu tespit etmede çeşitli hassasiyet seviyeleri sağlar.
Tahlillerden biri (Tahlil C) oldukça hassastır ve hem apoptozu hem de nekrozu tespit eder29; diğer tahlil (B) apoptotik hücre ölümünü saptamada daha yüksek duyarlılık gösterir30. Tahlil C'nin prensibi, apoptozun erken evrelerinde DNA kırılmalarını tespit etmektir. Apoptotik hücreleri sabitledikten ve geçirgenleştirdikten sonra, doku bir TUNEL reaksiyon karışımı ile inkübe edilir. Bu arada, TdT'nin rolü, DNA'daki serbest 3′-OH gruplarında floresein-dUTP ilavesini katalize etmektir. Doku yıkandıktan sonra, anti-floresein antikoru, DNA'nın hasarlı kısımlarındaki etiketi işaretler. Antikorun prensibi, muhabir olarak çalışan alkali fosfataz enzimine bağlanmaktır. Son olarak, AP bu spesifik reaksiyonun bir sonucu olarak görülebilir31.
Hematoksilin ve organların eozin boyanması, ışık mikroskobu kullanılarak morfolojik analiz için basit ve kullanışlı bir yöntemdir. Hücrelerin morfolojik değişikliklerini gözlemlemek için önce bu adımı dahil etmeniz önerilir. Bal arısı dokusunun ince kesitlerinde apoptozun erken evrelerinin tespiti için, immünohistokimyasal analiz için en az iki kit mevcuttur ( bkz. Her ikisi de apoptotik hücre çekirdeklerini koyu kahverengiye çevirir ve ışık mikroskobu kullanılarak görselleştirilir. Tahlil A (TUNEL tekniği) kullanarak, Streptavidin HRP (yaban turpu peroksidaz) biyotinile nükleotitlere konjuge olur ve apoptotik çekirdekler DAB'ın (diaminobenzidin, kararlı bir kromojen) reaksiyonundan sonra kahverengiye döner. Tahlil B, erken apoptozun bir işareti olan DNA bölünmesi ve yoğunlaştırılmış kromatinin tespiti yoluyla hücre hasarını ayırt eder.
Sağlıklı bir organizmada, hücre yenilenme seviyesi genellikle küçük yüzdeler32,33 olarak değerlendirilebilir. OA tedavisinden sonra midguttaki hücre ölümü artmıştır, bu da OA kullanımının laboratuar deneylerinde işçi arıların midgutları üzerinde zararlı bir etkiye sahip olduğunu göstermektedir. İmidacloprid ve coumaphos ile tedavi edilen arı grubu, gıda bezlerinde10 hücre hasarını veya nekrozu gösteren artmış bir hücre ölümü (kırmızı çekirdek) ortaya çıkardı; programlanmış hücre ölümü düşük seviyede (kahverengi çekirdekler)10 bulundu. Bununla birlikte, nekrotik ve apoptotik hücre ölümü, özellikle imidacloprid tedavisinden sonra yüksek seviyelerde bulunmuştur. Tedavi edilmeyen arı grubunda, HPG'lerde programlanmış hücre ölümü seviyesi, normal doku döngüsü32'ye uygun olarak% 10'dan fazla değildi.
Hem hasara hem de programlanmış hücre ölümüne bağlı hücre ölümü, her iki tahlil (B ve C) ile tespit edildi ve farklı duyarlılıkla sonuçlandı; birincisi hem nekrotik hem de programlanmış hücre ölümünü tespit eder11. Sağlıklı çalışanlarda (kontrol grubu) doğrulandığı gibi, her iki tahlil de sadece10 sporadik pozitif hücre tespit etti. Bal arısı dokusunun immünohistokimyasal analizinde kullanılan apoptoz ve nekroz tespit tahlillerinin, farklı maddelerin bal arıları üzerindeki ölümcül etkilerini araştırmak için güçlü bir yöntem olduğu ortaya çıktı.
Protokoldeki kritik adımlar:
Bir mikrotomla kesildikten sonra, doku kesitleri gece boyunca ılık bir plaka (düzleştirme masası, Malzeme Tablosuna bakınız) üzerindeki objektif camın üzerine yerleştirilmelidir. Protokollerde gelecekteki adımlar için numunelerin iyi kurutulması esastır. Doku cama iyi bağlanmadığında, hücre ölümü tespiti prosedüründe yüzeyden ayrılabilir. İstenilen dokunun varlığını doğrulamak için ışık mikroskobunun kullanılması tavsiye edilir. Daha sonra, birçok hücreyle (özellikle glandüler doku) doğru bölümü kontrol etmek için ilk slaytı H & E ile boyamak ve midgut bölümünün uygun olmaması durumunda yenilerini hazırlamak yararlıdır. HPG'leri bulmak oldukça zor olabilir, bu nedenle çok fazla bölüm kesmemeye özen gösterilmelidir; aksi takdirde, bezler kaybolacaktır.
DNA parçalanmasını tespit etmek için pozitif kontrol eklemek yararlıdır, ancak isteğe bağlıdır. Deneysel slaytlarda yüksek arka plan lekelenmesini önlemek için slaytları ayrı ayrı işlemek önemlidir. Tahlil B'de, pozitif kontroller bazı kitlere dahil edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu); diğerleri ayrı olarak satın alınmalıdır.
Yöntemin uzunluğu ve hassasiyetinde bir sınırlama vardır. Dokunun sulu bir montaj ortamında korunması sadece kısa sürelidir (3 ayın altında). Daha uzun süre koruma isteniyorsa (olası renk değişiklikleri nedeniyle önerilmez), başka ortamlar da vardır, ancak sonuçlar güvenilir değildir.
Bu iki yöntemi (apoptoz ve nekroz tespiti) aynı anda kullanmak, pestisitlerin bal arısı dokusu üzerindeki farklı etkilerini, özellikle de ölümcül olmayan etkiler için karşılaştırmak için çok yararlıdır. Alternatif yöntem, yiyecek arama aktivitesinin gözlemlenmesi ve pestisitlerden etkilenen işçi arıların bilişsel algısı üzerindeki etkisi olacaktır. Böyle bir yöntem, yetişkin arıların aktiviteleri üzerindeki ölümcül etkilerin tespit edilmesinde daha hızlı olacaktır, ancak genç (hemşire) arılarda olduğu gibi, erken aşamada davranışı değiştirebilecek iç hasarın kapsamı ile ilgili herhangi bir soruyu cevaplamayacaktır.
Bal arısı dokusunun basit morfolojisinin histolojik analizi, hücre hasarı, apoptoz veya malformasyonlarda farklı araştırma perspektiflerine yaklaşmak için sağlam bir temeldir. Parazitler ve zararlılar nedeniyle çevrede veya koloni tedavisinde pestisit kullanımının nedenleri zararlı olabilir ve bal arısı ömrünü ve koloni hayatta kalmasını önemli ölçüde etkileyebilir. Midgut ve HPG'ler bal arılarında temel organlardır ve arıların yaşa bağlı aktivitelerini etkileyen her türlü olumsuz dış faktöre hızlı bir şekilde cevap verme yeteneğine ve amacına sahiptir. HPG'lerin büyüklüğü ve sekresyon yetenekleri azalır ve midguttaki epitel hücreleri artan hücre ölümü ile yanıt verir. In situ çalışmalar gibi immünohistokimya yöntemleri, arı dokusunda apoptoz tespiti için yararlı araçlardır. Ayrıca, bal arıları ve diğer faydalı böcekler üzerindeki olası olumsuz etkilerin çalışmalarında uygulanma potansiyelini de göstermektedirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarın çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Slovenya Araştırma Ajansı'nın P4-133 no'lu hibe desteğine minnetle teşekkür ediyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R.
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , Dadant and Sons. 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. , Cornell University Press. (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , Taylor & Francis Group. 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M.
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, Ö Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , Chapman & Hall. London. (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D'Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
