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Developmental Biology

चूहों में जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स एलील्स बनाने के लिए जाइगोट माइक्रोइंजेक्शन

Published: June 24, 2022 doi: 10.3791/64161
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory Animal Resource Center and Trans-Border Medical Research Center, University of Tsukuba, 2Ph.D. Program in Human Biology, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल में जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहों का कुशलतापूर्वक उत्पादन करने के लिए सीआरआईएसपीआर-कैस 9 और दाता डीएनए के युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन का वर्णन किया गया है।

Abstract

CRISPR-Cas तकनीक ने आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की तेजी से और सहज पीढ़ी को सक्षम किया है। विशेष रूप से, चूहों और बिंदु उत्परिवर्ती चूहों को युग्मनज में सीआरआईएसपीआर कारकों (और एकल-फंसे हुए ऑलिगो डीएनए दाताओं) के इलेक्ट्रोपोरेशन द्वारा आसानी से उत्पादित किया जाता है। इसके विपरीत, जीन कैसेट (>1 केबी) नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहे मुख्य रूप से सीआरआईएसपीआर कारकों और डबल-फंसे डीएनए दाताओं के युग्मकों के माइक्रोइंजेक्शन द्वारा उत्पन्न होते हैं। जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों ने आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के उत्पादन के लचीलेपन में भी वृद्धि की है। अब लक्षित जीनोमिक क्षेत्रों में लक्षित उत्परिवर्तन को कई फायदेमंद इनब्रेड माउस उपभेदों में पेश करना संभव है। हमारी टीम ने जापान सहित कई देशों के अनुरोधों के बाद सीआरआईएसपीआर-कैस 9 के युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन द्वारा 200 से अधिक जीन कैसेट नॉक-इन माउस लाइनों और 110 से अधिक फ्लोक्स्ड माउस लाइनों का उत्पादन किया है। इनमें से कुछ जीनोम संपादन में बीएएलबी /सी, सी 3 एच / एचईजे, और सी 57 बीएल / 6 एन इनब्रेड उपभेदों का उपयोग किया गया था, हालांकि अधिकांश ने सी 57 बीएल / 6 जे का उपयोग किया। इलेक्ट्रोपोरेशन विधि के विपरीत, चूहों के विभिन्न इनब्रेड उपभेदों में युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन द्वारा जीनोम संपादन इतना आसान नहीं है। हालांकि, एकल इनब्रेड आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहे आनुवंशिक मानवीकृत, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर और सशर्त नॉकआउट माउस मॉडल के रूप में महत्वपूर्ण हैं। इसलिए, यह लेख जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहों को उत्पन्न करने के लिए सी 57बीएल / 6 जे चूहों में सीआरआईएसपीआर कारकों और डबल-फंसे डीएनए दाताओं के युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह लेख विशेष रूप से साइटोप्लाज्मिक इंजेक्शन के बजाय परमाणु इंजेक्शन पर केंद्रित है। युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन के अलावा, हम उत्पादन प्रक्रिया और परिधीय तकनीकों जैसे सुपरोव्यूलेशन और भ्रूण हस्तांतरण के प्रेरण के लिए समयरेखा की रूपरेखा तैयार करते हैं।

Introduction

नॉक-इन चूहों, जिसमें लक्षित लोकी पर इच्छित बहिर्जात जीन पेश किए जाते हैं, विवो अध्ययनों में जीन मानवीकृत चूहों, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों और क्रे ड्राइवर चूहों1,2 के रूप में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। जब माउस युग्मकों में जीनोम संपादन द्वारा नॉक-इन उत्परिवर्तन प्रेरित होते हैं, तो एकल-फंसे हुए डीएनए (एकल-फंसे हुए ऑलिगो डीएनए दाता, एसएसओडीएन) या डबल-फंसे हुए डीएनए (डीएसडीएनए) का उपयोग दाता डीएनए 2,3 के रूप में किया जाता है। एसएसओडीएन का उपयोग मुख्य रूप से 200 बीपी 4 से कम के अपेक्षाकृत छोटे जीन टुकड़ों को खटखटाने के लिए किया जाताहै। लंबे एसएसओडीएन (एलएसओडीएन) 5,6 का उपयोग करके 1 केबी डीएनए से अधिक लंबे टुकड़ों को खटखटाना संभव है, हालांकि उनकी तैयारी समय लेने वाली है। जब डीएसडीएनए दाताओं का उपयोग किया जाता है, तो जीन कैसेट (>1 केबी) नॉक-इन चूहों को श्रमसाध्य दाता डीएनए तैयारी के बिना उत्पन्न किया जा सकताहै।

एसएसओडीएन का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि इलेक्ट्रोपोरेशन8 नॉक-इन चूहों को उत्पन्न कर सकता है। हालांकि, डीएसडीएनए दाताओं को युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन द्वारा सीधे नाभिक में पेश किया जाना चाहिए। फ्लोक्स्ड चूहों को बनाने के लिए दो साइटों पर एक साथ नॉक-इन की आवश्यकता होती है, जिसमें प्रत्येक लॉक्सपी अनुक्रम को लक्ष्य जीन के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम में खटखटाया जाता है। माउस युग्मकों में जीनोम संपादन द्वारा फ्लोक्स्ड चूहों को उत्पन्न करने के दो तरीके हैं- दो स्वतंत्र एसएसओडीएन का उपयोग करके, प्रत्येक में एक एकल लॉक्सपी साइट होती है, या फ्लोक्स्ड अनुक्रम के साथ एकल डीएसडीएनए (या एलएसडीएनए) का उपयोग किया जाता है; पूर्व बहुत अक्षम 9,10,11 है। डीएसडीएनए दाताओं का उपयोग करके जीनोम संपादन जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहों का उत्पादन करने का सबसे सरल तरीका है यदि वातावरण युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन के लिए अनुकूल है।

प्रारंभ में, कैस 9 एमआरएनए और एसजीआरएनए या डीएनए वैक्टर एन्कोडिंग एसजीआरएनए और कैस 9 के मिश्रण का उपयोग माउस युग्मकों12,13 में जीनोम संपादन के लिए किया जाता है। चूंकि उच्च गुणवत्ता वाले और स्थिर कैस 9 प्रोटीन अब कम लागत पर उपलब्ध हैं, माउस युग्मकों14 में सीआरआरएनए-ट्रैकआरएनए-कैस 9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) की शुरूआत लोकप्रिय हो गई है। हाल ही में, नॉक-इन चूहों को एक सेल चक्र चरण में माउस युग्मकों के दोनों प्रोन्यूक्लियस में सीआरआरएनए-ट्रैकआरएनए-कैस 9 आरएनपी और दाता डीएनए पेश करके उच्च दक्षता के साथउत्पन्न किया गया है, जहां नॉक-इन होने की सबसे अधिक संभावना है। इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल इस विधि द्वारा विभिन्न प्रकार के नॉक-इन चूहों के उत्पादन के लिए तकनीकों का वर्णन करता है।

प्रयोगशाला चूहों के कई उपयोगी इनब्रेड उपभेद हैं। इनब्रेड पृष्ठभूमि के भीतर आनुवंशिक संशोधन फेनोटाइप पर आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रभाव की उपेक्षा कर सकता है। यह लेख सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले इनब्रेड माउस लाइन, सी 57बीएल / 6 जे17 के युग्मनज में जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड म्यूटेशन को प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की पीढ़ी और उपयोग की जाने वाली परिधीय तकनीकों की समयरेखा पर भी चर्चा की जाती है, जिसमें सुपरोव्यूलेशन और भ्रूण हस्तांतरण का प्रेरण शामिल है।

Protocol

सुकुबा विश्वविद्यालय के पशु प्रयोगों के लिए विनियमों और शिक्षा मंत्रालय के अधिकार क्षेत्र के तहत अकादमिक अनुसंधान संस्थानों में पशु प्रयोगों और संबंधित गतिविधियों के उचित संचालन के लिए मौलिक दिशानिर्देशों के अनुसार, सुकुबा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु प्रयोग समिति से अनुमोदन के साथ सभी पशु प्रयोगों को मानवीय रूप से आयोजित किया गया था। जापान की संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी। 10-25 सप्ताह के दोनों लिंगों के सी 57बीएल / 6 जे चूहों को युग्मनज दाता के रूप में इस्तेमाल किया गया था। आईसीआर चूहों (10 सप्ताह से अधिक उम्र के) का उपयोग प्राप्तकर्ता चूहों के रूप में किया गया था। चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. सेल-मुक्त प्रणाली में सीआरआरएनए दरार गतिविधि की पुष्टि

  1. क्रमशः 25 μL और 250 μL RNase-मुक्त पानी में crRNA (सूखा) के 2 nmol और tracrRNA (शुष्क) के 20 nmol को घोलें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: CRISPR लक्ष्य अनुक्रम जिनमें उच्च दरार गतिविधि और जितना संभव हो उतना कम ऑफ-टारगेट होने की भविष्यवाणी की गई थी, CRISPOR का उपयोग करके चुने जाते हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। जीन कैसेट नॉक-इन के मामले में, सम्मिलन स्थल पर अनुक्रम को लक्षित करें। फ्लोक्स किए जाने वाले एक्सॉन (ओं) को कोनेज़ुमी का उपयोग करके चुना गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. जीनोमिक पीसीआर 9 द्वारा लक्ष्य साइट वाले डीएनए टुकड़े (लगभग 0.5-1 केबी) कोबढ़ाएं। सामान्य पीसीआर उत्पाद निष्कर्षण किट के साथ इस पीसीआर एम्प्लिकॉन को शुद्ध करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. CRISPR मिश्रण का 10 μL तैयार करें (CRRNA का 100 ng/μL, tracrRNA का 150 ng/μL, और Cas9 का 1 ng/μL Cas9 न्यूक्लियस रिएक्शन बफर में, सामग्री की तालिका देखें)। CRISPR-Cas9 कॉम्प्लेक्स का निर्माण करने के लिए, CRISPR मिश्रण को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हीट ब्लॉक में रखें।
  4. चरण 1.2 में वर्णित पीसीआर उत्पाद (10 μL, 20 ng/μL) में CRISPR मिश्रण की कुल मात्रा (10 μL) जोड़ें और 1 घंटे के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सीआरआरएनए और ट्रैकआरएनए को नीचा दिखाने के लिए 1 μL RNase (500 ng / μL) जोड़ें, क्योंकि वैद्युतकणसंचलन के दौरान आरएनए अनुपस्थित होना चाहिए। सोडियम डोडेसिल सल्फेट (2% डब्ल्यू / वी) युक्त लोडिंग डाई का उपयोग करके उपरोक्त नमूनों का वैद्युतकणसंचलन करें।
    नोट: दुर्लभ मामलों में, बिना दरार गतिविधि वाले सीआरआरएनए देखे जाते हैं। ऐसे मामलों में, जीनोम संपादन डिजाइन को फिर से डिजाइन करने की सिफारिश की जाती है।

2. युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन के लिए सीआरआरएनए, ट्रैकआरएनए, कैस 9 प्रोटीन और दाता डीएनए के मिश्रण की तैयारी

  1. CRISPR समाधान तैयार करें (CRRNA का 50 ng/μL, tracrRNA का 200 ng/μL, और RNase-मुक्त पानी में Cas9 का 200 ng/μL)। एक दाता डीएनए समाधान तैयार करें (स्व-निर्मित प्लास्मिड डीएनए वेक्टर का 20 एनजी /
    1. दाता डीएनए समाधान को 0.22 μm छिद्र आकार के साथ बाँझ सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। CRISPR समाधान और फ़िल्टर किए गए दाता डीएनए समाधान की समान मात्रा मिलाएं। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक की अंतिम सांद्रता सीआरआरएनए का 25 एनजी / μL, ट्रैकआरएनए का 100 एनजी / μL, Cas9 का 100 ng / μL, और दाता डीएनए का 10 ng / μL है। इस मिश्रण को बाद में आरएनएपीडी के रूप में संदर्भित किया जाएगा।
      नोट: दो साइटों को काटते समय, जैसे कि फ्लोक्स्ड चूहों के उत्पादन के दौरान, प्रत्येक सीआरआरएनए की एकाग्रता 25 एनजी / दाता डीएनए एक गोलाकार प्लास्मिड डीएनए है और इसे एक सामान्य मिनी प्रेप स्पिन कॉलम किट के साथ शुद्ध किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें)। तैयार समाधान को बर्फ पर रखा जाना चाहिए और जितनी जल्दी हो सके माइक्रो-इंजेक्शन के लिए उपयोग किया जाना चाहिए।

3. प्राकृतिक संभोग द्वारा चूहों के युग्मकों को प्राप्त करना

  1. गर्भवती घोड़ी के सीरम गोनाडोट्रोपिन (पीएमएसजी, सामग्री की तालिका देखें) के 5 आईयू को माइक्रोइंजेक्शन से 3 दिन पहले सी 57बीएल / 6 जे मादा चूहों (10-25 सप्ताह की उम्र) में चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें। लगभग 46-48 घंटे बाद, मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (एचसीजी, सामग्री की तालिका देखें) के 5 आईयू को इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित करें। पीएमएसजी- और एचसीजी-उपचारित मादा चूहों को नर सी 57बीएल / 6 जे चूहों के साथ सह-घर करें और अगली सुबह योनि प्लग की जांच करें।
    नोट: लगभग 15-25 युग्मकों को एक महिला C57BL / 6J माउस से प्राप्त किया जा सकता है। समयरेखा चित्र 1 में दिखाया गया है।
  2. युग्मनज संस्कृति के लिए दो 35 मिमी पेट्री व्यंजन तैयार करें, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। उपयोग होने तक उन्हें इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में रखें। इन्हें रात भर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पुष्टि किए गए योनि प्लग के साथ मादा चूहों को इच्छामृत्यु करें और, छोटी कैंची का उपयोग करके, पेट की त्वचा और मांसपेशियों की परत के माध्यम से निचले पेट की मध्य रेखा से पसलियों के नीचे तक प्रवेश करें।
    नोट: इच्छामृत्यु के लिए स्थानीय पशु नैतिकता समिति की सिफारिशों का पालन करें।
  4. डिंबवाहिनी को इकट्ठा करें और उन्हें पेट्री डिश के ढक्कन पर 0.75 मिलीग्राम / एमएल हाइलूरोनिडेस ( सामग्री की तालिका देखें) युक्त एम 2 माध्यम की 20 μL बूंद में रखें। ठीक टिप फोर्स के साथ एक डिंबवाहिनी उठाएं और फिम्ब्रिया के माध्यम से हायलूरोनिडेज़ के साथ लगभग 50 μL M2 माध्यम को भरें।
    नोट: इस समय, युग्मकों को कई क्यूमुलस कोशिकाओं से घिरा हुआ है।
  5. 30 सेकंड के बाद, ग्लास केशिका का उपयोग करके मध्यम की थोड़ी मात्रा के साथ रूपात्मक रूप से सामान्य युग्मकों को उठाएं और उन्हें ताजा एम 16 मध्यम बूंदों में स्थानांतरित करके धो लें। पूलिंग के लिए धुले हुए युग्मकों को पेट्री डिश (चित्रा 2) में स्थानांतरित करें।
    नोट: समयरेखा चित्रा 1 में दिखाया गया है। रूपात्मक रूप से सामान्य युग्मकों में एक नर और मादा प्रोन्यूक्लियस और दो ध्रुवीय निकाय होते हैं जिन्होंने गोलाकार आकार15 से गंभीर रूप से समझौता नहीं किया है। युग्मनज की आकृति विज्ञान उपभेदों और प्रजातियों के बीच काफी भिन्न होता है।
  6. चरण 3.3 और 3.4 को तब तक दोहराएँ जब तक कि सभी युग्मक पुनर्प्राप्त न हो जाएं। संस्कृति पकवान में एक एम 16 बूंद में लगभग 100 युग्मकों को पूल किया जा सकता है। डिश को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में माइक्रोइंजेक्शन तक स्टोर करें।

4. माइक्रोइंजेक्शन सुई की तैयारी

  1. प्रोग्राम करने योग्य पिपेट पुलर का उपयोग करके कुछ ग्लास पिपेट खींचें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: माइक्रोइंजेक्शन सुइयों में एक पतली नोक और लंबी टेपर होनी चाहिए। यदि पुलर के पास इंट्रासाइटोप्लाज्मिक शुक्राणु इंजेक्शन के लिए सुई बनाने का कार्यक्रम है, तो उसी कार्यक्रम का उपयोग माइक्रोइंजेक्शन के लिए सुइयों को बनाने के लिए किया जा सकता है।
  2. माइक्रोफोर्ज टिप से जुड़ी कांच की गेंद को मारकर माइक्रोइंजेक्शन सुई की नोक को तोड़ें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोइंजेक्शन सुई का टिप आकार व्यास में लगभग 1 μm है। 1000x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के तहत टिप आकार की जांच करें।
  3. माइक्रोफॉर्ज का उपयोग करके सिरे से लगभग 2-3 मिमी पर माइक्रोइंजेक्शन सुई को मोड़ें।
    नोट: मोड़ का कोण माइक्रोमैनिपुलेटर के सेटअप पर निर्भर करता है। बहुत अधिक झुकने से पीजो पल्स की प्रभावशीलता कम हो जाएगी।

5. जाइगोट माइक्रोइंजेक्शन

  1. माइक्रोइंजेक्शन सुई के केंद्र में ऑपरेशन तरल (जड़ता शरीर जो पारा के विकल्प के रूप में छेद बनाने के लिए पीजो प्रभाव के लिए आवश्यक है, सामग्री की तालिका देखें) के 1-1.5 सेमी इंजेक्टर इंजेक्ट करें और इसे पीजो एक्ट्यूएटर के साथ मैनुअल माइक्रोइंजेक्टर धारक से संलग्न करें।
    1. इसके अलावा, होल्डिंग सुई को विपरीत मैनुअल माइक्रोइंजेक्टर धारक से जोड़ें। ऑपरेशन तरल को धीरे-धीरे दबाव के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुई टिप पर ले जाएं। माइक्रोमैनिपुलेटर पर दोनों मैनुअल माइक्रोइंजेक्टर धारकों को ठीक करें।
      नोट: माइक्रोइंजेक्शन सुई की नोक से निकलने वाले ऑपरेशन तरल को 50x आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के तहत देखा जा सकता है। उत्सर्जित तरल की मात्रा को समायोजित करने के बाद, पीजो दालों को लागू करने पर तरल के छींटे देखे जा सकते हैं, यह पुष्टि करते हुए कि पीजो दालें प्रभावी हैं। यदि इसकी पुष्टि नहीं की जा सकती है, तो माइक्रोइंजेक्शन सुई को फिर से तैयार करें।
  2. तीन बूंदों के साथ एक इंजेक्शन कक्ष तैयार करें: (1) एम 2 माध्यम का 10 μL; (2) एम 2 माध्यम में 12% पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन (पीवीपी) का 5 μL; और (3) सीआरआरएनए, ट्रैकआरएनए, कैस 9 प्रोटीन और डोनर डीएनए (आरएनपीडी) समाधान का 5 μL मिश्रण। बूंदों को खनिज तेल के साथ चरण 3.2 के समान तरीके से कवर करें और इंजेक्शन कक्ष को उल्टे माइक्रोस्कोप चरण पर सेट करें।
    1. 50x आवर्धन पर उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत, माइक्रोइंजेक्शन पिपेट को 12% पीवीपी ड्रॉप में कम करें। माइक्रोइंजेक्शन सुई टिप के अंदर को साफ करने और इसे आरएनपीडी बूंद में स्थानांतरित करने के लिए 12% पीवीपी को एस्पिरेट और डिस्पेंस करें।
  3. मैनुअल माइक्रोइंजेक्टर को नकारात्मक दबाव में रखें और आरएनएपीडी समाधान को माइक्रोइंजेक्शन सुई में चूसें। पर्याप्त मात्रा एस्पिरेटेड होने तक कुछ मिनटों तक प्रतीक्षा करें; एक माइक्रोस्कोप के तहत 50x आवर्धित, तरल के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुई के पूरे अंदर भरें।
    1. सेवन बंद करें और मैनुअल माइक्रोइंजेक्टर को सकारात्मक दबाव में सेट करके आरएनएपीडी समाधान को धीरे-धीरे निष्कासित करने की अनुमति दें। माइक्रोइंजेक्शन सुई की नोक को तेल में ले जाएं।
      नोट: साँस लेने के लिए मैन्युअल माइक्रोइंजेक्टर के नॉब को काउंटरक्लॉकवाइज घुमाएं। साँस लेना रोकने के लिए, नॉब को घड़ी की तरह घुमाएं और माइक्रोस्कोप के तहत देखते हुए धीरे-धीरे दबाव बढ़ाएं। आरएनपीडी समाधान धीरे-धीरे सूखा जाएगा। माइक्रोइंजेक्शन सुई में तरल स्तर आंदोलन बहिर्वाह की पुष्टि की अनुमति देता है।
  4. एम 2 बूंद में 50 युग्मक डालें और धीरे से होल्डिंग पिपेट को उसी बूंद में कम करें। माइक्रोइंजेक्शन सुई को युग्मकों युक्त एम 2 ड्रॉप में स्थानांतरित करें। 20x उद्देश्य पर स्विच करें और माइक्रोइंजेक्शन पिपेट की नोक पर ध्यान केंद्रित करें।
    नोट: 10 मिनट में इंजेक्ट किए जा सकने वाले कई युग्मकों को रखें।
  5. एक युग्मनज पकड़ो और माइक्रोमैनिपुलेटर को स्थानांतरित करके प्रोन्यूक्लियस पर ध्यान केंद्रित करें। माइक्रोइंजेक्शन सुई को युग्मनज में डालें और नोक को प्रोन्यूक्लियस के करीब लाएं। एक बार जब नोक प्रोन्यूक्लियस झिल्ली तक पहुंच जाती है, तो छेद करने के लिए पीजो पल्स (तीव्रता: 6-10, गति: 1) लागू करें।
    1. जब माइक्रोइंजेक्शन सुई प्रोन्यूक्लियस को पंचर करती है, तो आरएनएपीडी समाधान इंजेक्ट करें, और प्रोन्यूक्लियस की सूजन का निरीक्षण करें। एक बार जब प्रोन्यूक्लियस पूरी तरह से फुला हो जाता है, तो जल्दी से सुई को बाहर निकालें। महिला और पुरुष दोनों प्रोन्यूक्लियस पर एक ही प्रक्रिया करें।
      नोट: इंजेक्शन द्वारा प्रोन्यूक्लियस की मुद्रास्फीति माइक्रोस्कोप के नीचे स्पष्ट रूप से देखी जा सकती है। इस मुद्रास्फीति की डिग्री को मौखिक रूप से व्यक्त करना मुश्किल है, लेकिन पिछली रिपोर्ट15 का उल्लेख करके इसकी पुष्टि की जा सकती है।
  6. इंजेक्शन से पहले और बाद में युग्मनज की पहचान करने के लिए इंजेक्शन वाले युग्मनज को एम 2 बूंद के भीतर दूसरे स्थान पर ले जाएं।
  7. चरण 5.5-5.6 को दोहराएं जब तक कि एम 2 बूंद में सभी युग्मकों को इंजेक्ट नहीं किया जाता है। इंजेक्शन के बाद, युग्मकों को एक ताजा एम 16 डिश में स्थानांतरित करें।
  8. इंजेक्शन के 10 मिनट बाद जीवित युग्मकों का चयन करें। इंजेक्शन से क्षतिग्रस्त होने वाले लाइस्ड युग्मकों को हटा दें और एम 16 डिश में प्रत्येक बूंद में जीवित युग्मकों को वितरित करें। प्रत्येक बूंद में एक स्यूडोप्रेग्नेंट महिला के लिए 20-24 युग्मक होने चाहिए। यह भ्रूण हस्तांतरण के दौरान इनक्यूबेटर के बाहर के वातावरण के संपर्क में आने वाले समय को कम करता है।
    नोट: इष्टतम इंजेक्शन स्थितियों के तहत, जीवित रहने की दर 90% -95% है। यह सुई टिप के आकार, पीजो पल्स की ताकत और आरएनपीडी समाधान के बहिर्वाह दबाव पर निर्भर करता है।

6. अंडाकार में भ्रूण स्थानांतरण

  1. स्यूडोप्रेग्नेंट चूहों को प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक महिला आईसीआर माउस को प्रोस्ट्रस चरण में एक वासोलिगेटेड नर आईसीआर माउस के साथ मेट करें। अगले दिन प्लग की जाँच करें।
    नोट: लगभग 15 स्यूडोप्रेग्नेंट चूहों को 20 संभोग जोड़े से प्राप्त किया जाता है।
  2. तीन प्रकार के मिश्रित एनेस्थेटिक एजेंटों (0.2 मिलीग्राम / किग्रा मेडेटोमिडीन, 4.0 मिलीग्राम / किलोग्राम मिडाज़ोलम, और 2.5 मिलीग्राम / किलोग्राम बुटोरफेनोल, सामग्री की तालिका देखें) को स्यूडोप्रेग्नेंट मादा चूहों को चमड़े के नीचे प्रशासित करें। श्वसन दर में कमी और पूंछ-चुटकी और हिंदलिम्ब पेडल निकासी सजगता के गायब होने से उचित संज्ञाहरण की पुष्टि करें। स्थानीय पशु नैतिकता समिति की सिफारिशों के अनुसार आंखों को चिकनाई देने के लिए नेत्र मरहम लागू करें।
  3. रेजर-शेविंग के बाद माउस के पृष्ठीय क्षेत्र को प्रवण स्थिति में शेव करने और सर्जिकल क्षेत्र को तीन बार कीटाणुरहित करने के बाद, आयोडीन या क्लोरहेक्सिडाइन-आधारित स्क्रब और अल्कोहल के बीच बारी-बारी से, रीढ़ की हड्डी के साथ पृष्ठीय त्वचा को लगभग 1 सेमी तक छोटे विच्छेदित कैंची से संक्रमित करें।
  4. पृष्ठीय चीरा घाव को उदर रूप से एक तरफ स्थानांतरित करें, मांसपेशियों की परत को इंजेक्ट करें जिसके माध्यम से अंडाशय को देखा जा सकता है, चिमटी के साथ अंडाशय के ऊपर वसा को पकड़ें, और अंडाशय, डिंबवाहिनी और गर्भाशय को वापस लें।
    1. एक सेरेफाइन क्लैंप के साथ वसा को सुरक्षित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। कोट के साथ सीधे संपर्क से बचने के लिए प्रजनन ऊतकों को बाँझ धुंध पर रखें।
  5. निम्नलिखित क्रम में, थोड़ी मात्रा में संस्कृति माध्यम (एम 2 या एम 16), कुछ हवा के बुलबुले एक मार्कर के रूप में, और युग्मनज को स्थानांतरण के लिए एक पिपेट में रखें।
    नोट: प्रति अंडाकार लगभग 10-12 युग्मकों को स्थानांतरित करें।
  6. एम्पुला और ओविडक्ट के फिम्ब्रिया के बीच एक माइक्रो कतरनी ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एक चीरा बनाएं (ग्लास पिपेट को प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए पर्याप्त लंबा), चीरा में युग्मकों को पेश करें, और साथ ही साथ पुष्टि करें कि हवा का बुलबुला पेश किया गया है।
  7. अन्य डिंबवाहिनी में आरोपण को इसी तरह करें (चरण 6.6)।
  8. ऑटोक्लिप्स के साथ बाहरी त्वचा को सीवन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: जब तक चीरा घाव अपरिहार्य रूप से बड़ा न हो, तब तक इंसाइज्ड मांसपेशी परत को सीवन न करें। इंसाइज्ड मांसपेशी परत का आदर्श आकार 2-3 मिमी से कम होना चाहिए। यदि चीरा 5 मिमी से अधिक है, तो मांसपेशियों की परत को निष्फल सीवन सुई और धागे का उपयोग करके सीवन किया जाना चाहिए ( सामग्री की तालिका देखें)।

7. पशु वसूली

  1. चूहों को चमड़े के नीचे एटिपामेज़ोल हाइड्रोक्लोराइड (0.3 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रशासन करें।
    नोट: पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया के लिए स्थानीय पशु नैतिकता समिति की सिफारिशों का पालन करें।
  2. फिर, चूहों को पिंजरों में रखें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर गर्म रखें।
  3. चूहों के जागने के बाद, उन्हें लगभग 2 घंटे के लिए गर्म रखें। चूहों के असामान्य व्यवहार की पुष्टि करने के बाद, पिंजरों को प्रजनन रैक में वापस करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहों के उत्पादन परिणाम तालिका 1 और तालिका 2 में दिखाए गए हैं। लक्ष्य जीन नहीं बताए गए थे क्योंकि प्रत्येक जीनोम-संपादित माउस लाइन वर्तमान में एक स्वतंत्र, अप्रकाशित परियोजना में उपयोग की जा रही है। इसके बजाय, लक्ष्य क्रोमोसोमल क्षेत्रों का वर्णन किया गया था।

जीनोटाइपिंग विश्लेषण पहले रिपोर्ट की गई विधि18 का उपयोग करके किया गया था। इस जीनोटाइपिंग विधि में, जिन चूहों में दाता डीएनए को अनपेक्षित क्रोमोसोमल साइटों में डाला जाता है, उन्हें सकारात्मक व्यक्तियों के रूप में नहीं गिना जाता है, भले ही वांछित जीनोम संपादन प्रेरित हो। इसलिए, संस्थापक चूहों की उत्पादन दक्षता जो वास्तविक उद्देश्यों के लिए वास्तव में उपयोगी हैं, जीनोम संपादन की दक्षता के बजाय दिखाई गई थी।

13 स्वतंत्र जीन कैसेट नॉक-इन चूहों की औसत उत्पादन दक्षता 20.8% थी, जिसमें अधिकतम 39.5% और न्यूनतम 7.9% (तालिका 1) थी। इस दक्षता को पर्याप्त रूप से व्यावहारिक माना जाता था। जीन कैसेट नॉक-इन के दौरान किसी भी घातक भ्रूण जीन को लक्षित नहीं किया गया था। इस गैर-घातक जीन लक्ष्यीकरण स्थिति के तहत औसत जन्म दर 34.0% (अधिकतम 43.3% और न्यूनतम 15.9%) थी। चूंकि यह आनुवंशिक हेरफेर के बिना भ्रूण हस्तांतरण में जन्म दर के बराबर है, इसलिए हमने माना कि पेश किए गए जीनोम संपादन तत्वों की विषाक्तता और युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन की शारीरिक क्षति भ्रूण के विकास को प्रभावित करने की संभावना नहीं थी।

10 स्वतंत्र फ्लोक्स्ड चूहों की औसत उत्पादन दक्षता 7.7% थी, जिसमें अधिकतम 20.7% और न्यूनतम 2.1% (तालिका 2) थी। यद्यपि कई लक्षित जीनों के कार्य अज्ञात थे, औसत जन्म दर 30.2% थी, जिसमें अधिकतम 43.8% और न्यूनतम 17.3% था। यह दर जीन कैसेट नॉक-इन चूहों के बराबर थी, यह सुझाव देते हुए कि माइक्रो-इंजेक्शन ऑपरेशन का फ्लोक्स्ड चूहों के भ्रूण के विकास पर नगण्य प्रभाव पड़ता है।

Figure 1
चित्र 1: युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन की समयरेखा। सफेद और गहरा रंग क्रमशः प्रकाश और अंधेरे चक्र को दर्शाता है। चूहों को 14 घंटे प्रकाश / 10 घंटे अंधेरे चक्र के तहत बनाए रखा गया था। पीएमएसजी: गर्भवती घोड़ी का सीरम गोनाडोट्रोपिन; एचसीजी: मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: संस्कृति व्यंजनों की तैयारी। (A) इंजेक्शन से पहले युग्मकों के लिए संस्कृति पकवान। 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में एम 16 माध्यम (प्रत्येक के लिए 20-25 μL) की दो बूंदें रखें। (बी) इंजेक्शन के बाद युग्मकों के लिए कल्चर डिश। 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में एम 16 की 10 बूंदें (प्रत्येक बूंद के लिए 10-20 μL) रखें। बूंदें खनिज तेल (3 एमएल) से ढकी होती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लक्षित क्रोमोसोमल क्षेत्र की संख्या नॉक-इन सम्मिलन लंबाई (kb) होमोलॉजी हाथ की लंबाई (केबी)
भ्रूण नवजात शिशु जांच की गई (वीनिंग्स) नॉक-इन W/O rTG rTGc
इंजेक्शन स्थानांतरित 5' हाथ 3' हाथ
2qE2 349 331 114 (34.4%) a 114 9 (7.9%) b 5 (4.4%) d 1.0 1.0 1.0
2qE2 231 215 78 (36.3%) a 74 15 (20.3%) b 23 (31.1%) डी 2.2 1.0 1.1
5qG2 288 262 90 (34.4%) a 81 19 (23.5%) b 18 (22.2%) 1.6 2.0 2.0
6qB1 278 259 58 (22.4%) a 46 11 (23.9%) b 11 (23.9%) d 4.2 1.2 1.0
6qE3 [ROSA26] 295 277 97 (35.0%) a 23 2 (8.7%) b 4 (17.4%) डी 6.5 1.1 3.0
6qE3 [ROSA26] 246 219 87 (39.7%) a 83 22 (26.5%) b 18 (21.7%) 5.8 1.1 3.0
7qF5 279 268 116 (43.3%) a 114 45 (39.5%) b 44 (38.6%) डी 1.4 3.1 1.0
11qB4 405 353 56 (15.9%) a 47 8 (17.0%) b 12 (25.5%) डी 1.7 1.0 0.8
11qD 310 294 100 (34.4%) a 98 15 (15.3%) b 76 (77.6%) डी 1.0 1.8 2.4
12qE 368 320 86 (26.9%) a 84 12 (14.3%) b 19 (22.6%) d 3.4 1.1 1.3
12qF1 315 265 76 (28.7%) a 72 17 (23.6%) b 28 (38.9%) d 1.0 1.1 1.1
14qE5 256 215 48 (22.3%) a 48 11 (22.9%) b 21 (43.8%) d 3.1 1.0 0.9
14qE5 287 285 85 (29.8%) a 72 15 (20.8%) b 19 (26.4%) d 2.6 1.0 0.9

तालिका 1: माइक्रो-इंजेक्शन द्वारा नॉक-इन चूहों का उत्पादन। तालिका जन्म दर और उत्पादक चूहों की दक्षता को दर्शाती है जो दाता डीएनए के (डब्ल्यू / ओ) यादृच्छिक एकीकरण (आरटीजी) के बिना इच्छित नॉक-इन एलील ले जाते हैं। सभी परियोजनाओं में इच्छित नॉक-इन एलील के साथ चूहों को प्राप्त करना संभव था। ए: नवजात शिशुओं की संख्या / स्थानांतरित भ्रूण की संख्या; बी: चूहों को ले जाने वाले नॉक-इन एलील्स की संख्या / जांच किए गए चूहों की संख्या; सी: यह निश्चित नहीं है कि क्या एक इच्छित एलील है; डी: आरटीजी एलील की संख्या चूहों / जांच किए गए चूहों की संख्या; आरटीजी: दाता वेक्टर का यादृच्छिक एकीकरण। W / O: बिना।

लक्षित क्रोमोसोमल क्षेत्र की संख्या फ्लोक्स्ड लंबाई (kb) होमोलॉजी हाथ की लंबाई (केबी)
भ्रूण नवजात शिशु जांच की गई (वीनिंग्स) W/O rTG
इंजेक्शन स्थानांतरित 5' हाथ 3' हाथ
3qC 325 313 93 (29.7%) a 87 9 (10.3%) b 1.3 1.2 1.1
4qB1 210 200 36 (18.0%) a 29 6 (20.7%) b 1.6 1.2 0.9
4qC4 272 256 112 (43.8%) a 100 5 (5.0%) b 2.4 1.0 1.4
5qF 143 137 40 (29.2%) a 40 6 (15.0%) b 1.8 1.0 1.1
5qF 255 227 80 (35.2%) a 76 2 (2.6%) b 1.3 1.1 0.9
9qE3.1 289 261 80 (30.7%) a 77 9 (11.7%) b 1.2 1.2 1.2
10qB3 284 269 88 (32.7%) a 78 3 (3.8%) b 1.3 1.1 0.9
10qC1 243 231 40 (17.3%) a 38 4 (10.5%) b 2.1 1.0 1.3
14qE5 390 372 139 (37.4%) a 135 5 (3.7%) b 1.1 0.8 0.9
17qA3.3 383 374 99 (26.5%) a 95 2 (2.1%) b 2.1 0.6 0.8

तालिका 2: माइक्रो-इंजेक्शन द्वारा फ्लोक्स्ड चूहों का उत्पादन। तालिका जन्म दर और चूहों के उत्पादन की दक्षता को दर्शाती है जो दाता डीएनए के (डब्ल्यू / ओ) यादृच्छिक एकीकरण (आरटीजी) के बिना इच्छित फ्लोक्स एलील ले जाते हैं। सभी परियोजनाओं में इच्छित फ्लोक्स एलील के साथ चूहों को प्राप्त करना संभव था। ए: नवजात शिशुओं की संख्या / स्थानांतरित भ्रूण की संख्या; बी: फ्लोक्स एलील की संख्या चूहों / जांच किए गए चूहों की संख्या। आरटीजी: दाता वेक्टर का यादृच्छिक एकीकरण; W / O: बिना।

Discussion

वर्तमान अध्ययन में, प्राकृतिक संभोग से प्राप्त ताजा (जमे हुए-पिघले हुए नहीं) सी 57बीएल / 6 जे माउस युग्मकों का उपयोग जीनोम संपादन माउस उत्पादन के लिए किया गया था। सेल चक्र चरण में इन युग्मकों के दोनों प्रोन्यूक्लियस में सीआरआरएनए-ट्रैकआरएनए-कैस 9 और दाता डीएनए (आरएनपीडी) को इंजेक्ट करके, जहां नॉक-इन होने की सबसे अधिक संभावना है, जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहों को उच्च जन्म दर और पर्याप्त जीनोम संपादन दक्षता के साथ उत्पन्न किया गया था। वर्तमान अध्ययन स्प्रिंट-सीआरआईएसपीआर विधि15 की विस्तारशीलता को मजबूत करता है, जहां यह सी 57बीएल / 6 जे आनुवंशिक पृष्ठभूमि में भी पर्याप्त नॉक-इन दक्षता सुनिश्चित करता है, और फ्लोक्स्ड चूहों के उत्पादन पर लागू किया जा सकता है।

प्रायोगिक उपकरणों की कम लागत और तकनीक सीखने में आसानी के कारण इलेक्ट्रोपोरेशन जीनोम-संपादित चूहों के उत्पादन की एक अत्यधिक सामान्यीकृत विधिहै। इसके अलावा, आई-गोनाड विधि19, जिसमें ओवीडक्ट में मौजूद प्रीइम्प्लांटेशन भ्रूण के साथ जीनोम संपादन किया जाता है, को प्राप्तकर्ता माउस की आवश्यकता नहीं होती है। इन विधियों की तुलना में, हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर दोनों के संदर्भ में प्रयोगात्मक वातावरण तैयार करते समय यहां प्रस्तुत वर्तमान विधि महंगी और समय लेने वाली है। हालांकि, एक बार प्रयोगात्मक सुविधाएं स्थापित होने के बाद, जटिल जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स्ड चूहों का उत्पादन केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीआरआईएसपीआर तत्वों (सीआरआरएनए, ट्रैकआरएनए और कैस 9 प्रोटीन) और दाता डीएनए के रूप में उपयोग किए जाने वाले परिपत्र प्लास्मिड वेक्टर की एक सरल, छोटी मात्रा के साथ किया जा सकता है। इसका मतलब यह है कि कई जटिल जीनोम-संपादित माउस लाइनों को तैयार करने के लिए समय लेने वाले (या अपेक्षाकृत महंगे) एलएसओडीएन 5,6 या एडेनो से जुड़े वायरस वैक्टर20 की आवश्यकता के बिना उत्पादित किया जा सकता है।

मूल स्प्रिंट-सीआरआईएसपीआर विधि15 के विपरीत, ताजा (जमे हुए-पिघले हुए) युग्मकों का उपयोग किया गया था। प्राकृतिक संभोग द्वारा ताजा युग्मन प्राप्त करते समय, तकनीकी त्रुटियों को अनदेखा किया जा सकता है जो इन विट्रो निषेचन या ठंड और पिघलने के दौरान हो सकते हैं। इसके अलावा, भ्रूण हेरफेर प्रक्रिया वर्तमान दृष्टिकोण के बाद लगभग आधे दिन (चित्रा 1) में पूरी की जा सकती है। दूसरी ओर, वर्तमान विधि की कुछ सीमाओं में कई नर चूहों की आवश्यकता, निषेचन के समय का ढीला नियंत्रण और माइक्रोइंजेक्शन के लिए युग्मनज की संख्या की पूरी तरह से भविष्यवाणी करने की सीमित क्षमता शामिल है। मूल स्प्रिंट-सीआरआईएसपीआर विधि की तुलना में, इस विधि में उच्च जन्म दर हो सकती है (तालिका 1)। इसके बावजूद, यह निष्कर्ष नहीं निकाला जा सकता है कि प्रयोग कंडक्टर, लक्ष्य जीन, आनुवंशिक पृष्ठभूमि और भ्रूण की पुष्टि के समय में अंतर के कारण वर्तमान विधि जन्म दर के मामले में बेहतर है।

जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है, अधिकांश जीन कैसेट नॉक-इन परियोजनाओं में बड़ी संख्या में चूहों में यादृच्छिक एकीकरण एलील थे। यादृच्छिक एकीकरण को समाप्त किया जाना चाहिए क्योंकि इससे अंतर्जात जीन और ट्रांसजेन की अस्थानिक अभिव्यक्ति का अनपेक्षित विघटन हो सकता है। भविष्य के लिए चुनौती प्रयोगात्मक स्थितियों को ढूंढना है जो पर्याप्त नॉक-इन दक्षता बनाए रखते हुए यादृच्छिक एकीकरण घटनाओं की संख्या को कम करते हैं।

जीनोम एडिटिंग प्रभावकों का उपयोग करके लगभग सभी माउस युग्मनज जीनोम संपादन जिसके परिणामस्वरूप डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक होता है, ऑन-टारगेट साइटों 9,21 पर अनपेक्षित उत्परिवर्तन को प्रेरित करने की संभावना है। इन अनपेक्षित ऑन-टारगेट म्यूटेशन के परिणामों को यहां वर्णित नहीं किया गया है क्योंकि हम ऐसी स्थिति में नहीं हैं जिसमें चूहों की अगली पीढ़ी को उनके स्पष्ट सबूत पेश करने के लिए प्रबंधित किया जा सके। अनपेक्षित ऑन-टारगेट म्यूटेनेसिस के कारण भ्रम की चिंता को दूर करने का सबसे अच्छा तरीका यह है कि संस्थापकों को इंटरक्रॉसिंग करने के बजाय जंगली प्रकार के चूहों के साथ संभोग करके चूहों की अगली पीढ़ी प्राप्त की जाए। सिद्धांत रूप में, इस क्रॉस से उत्पन्न एन 1 चूहे एलील के एक तरफ जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) हैं, इसलिए यदि इच्छित नॉक-इन (केआई) एलील का पता लगाया जाता है, तो वे डब्ल्यूटी / केआई विषमयुग्मी हैं। इसलिए, ऑन-टारगेट म्यूटेनेसिस प्रयोगशाला माउस में एक महत्वपूर्ण समस्या नहीं है, जिसमें अपेक्षाकृत तेज जीवन चक्र है और एक विपुल जानवर है। हालांकि, जब यह तकनीक अपेक्षाकृत बड़े स्तनधारियों पर लागू होती है तो आगे सुधार आवश्यक होगा।

यह पुष्टि की गई है कि यह तकनीक सी 57बीएल / 6 जे के अलावा अन्य इनब्रेड उपभेदों में जीन कैसेट नॉक-इन चूहों का उत्पादन कर सकती है, लेकिन पर्याप्त संख्या में परियोजनाएं सुरक्षित नहीं हैं, और डेटा अत्यधिक परिवर्तनशील हैं। इस कारण से, यह जानकारी वर्तमान अध्ययन में शामिल नहीं है। यह माना जाता है कि माउस आनुवंशिकी और रोग मॉडल अनुसंधान को आगे बढ़ाने के लिए इस विषय पर आगे के अध्ययन आवश्यक होंगे।

Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है।

Acknowledgments

इस काम को शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से वैज्ञानिक अनुसंधान (बी) (19एच03142: एसएम), वैज्ञानिक अनुसंधान (ए) (20एच00444: एफएस), वैज्ञानिक अनुसंधान (ए) (21एच04838: एसएम के लिए), और अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान "उन्नत पशु मॉडल समर्थन का मंच" (16एच06276: एसटी के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि तैयार करने में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी। हम जीनोम-संपादन डिजाइन के बारे में उनकी उपयोगी चर्चा के लिए रयोइची मोरी के आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole Hydrochloride ZENOAQ -
Autoclip Wound Clip BD 427631
Autoclip Wound Clip Applier BD 427630
Butorphanol Meiji Seika Pharma -
C57BL/6J mice Jackson Laboratory Japan - older than 10 weeks old
Calibrated Pipet, 100ul Drummond Scientific Company 2-000-100 for collecting zygote and embryo transfer
Cas9 Thermo Fisher Scientific A36499
Cas9 Nuclease Reaction Buffer NEB B7203
CellTram 4r  oil Eppendorf 5196000030
CRISPOR http://crispor.tefor.net/ web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system
crRNA IDT -
Gel/PCR Extraction Kit FastGene FG-91302
hCG ASKA Animal Health -
Hyaluronidase Merck Sigma-Aldrich H3884
ICR mice Jackson Laboratory Japan - older than 10 weeks old, weight 28 G or more
Inverted microscope Leica
KOnezumi https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice
M16 medium Merck Sigma-Aldrich M7292
M2 medium Merck Sigma-Aldrich M7167
Medetomidine ZENOAQ -
Micro shears Natsume Seisakusho MB-54-1
Microforge Narishige MF-900 for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle
Micromanipulator units Narishige
Micropipette puller Sutter Instrument P-1000 programmable pipette puller
Midazolam Maruishi Pharmaceutical -
MILLEX-GV 0.22 µm filter Merck Millipore SLGV033R
Mineral oil Nacalai 26114-75 for zygote culture and injection chamber
Petri dish (35mm, untreated) Iwaki 1000-035 for zygote culture
PIEZO micromanipulator PRIME TECH PMM-150
Plasmid Mini Kit FastGene FG-90502 mini prep spin column kit
PMM Operation Liquid PRIME TECH KIT-A operation liquid for microinjection
PMSG ASKA Animal Health -
Polyvinylpyrrolidone Merck Sigma-Aldrich P5288
RNase QIAGEN 19101
RNase Free Water IDT - tracrRNA Accessory Reagents
Serrefine clamp Natsume Seisakusho C-18
Sodium dodecyl sulfate SIGMA 151-21-3
Suture needle with thread Natsume Seisakusho C11-60B2
Thin wall borosilicate glass
without filament		 Sutter Instrument B100-75-10 for microinjection needle and holding pipette
tracrRNA IDT -

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 184 CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस जीन कैसेट नॉक-इन फ्लोक्स युग्मनज माइक्रोइंजेक्शन पीजो
चूहों में जीन कैसेट नॉक-इन और फ्लोक्स एलील्स बनाने के लिए जाइगोट माइक्रोइंजेक्शन
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Tanimoto, Y., Mikami, N., Ishida, M., Iki, N., Kato, K., Sugiyama, F., Takahashi, S., Mizuno, S. Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice. J. Vis. Exp. (184), e64161, doi:10.3791/64161 (2022).

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