Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

الحقن المجهري للزيجوت لإنشاء أليلات كاسيت الجينات وأليلات فلوكس في الفئران

Published: June 24, 2022 doi: 10.3791/64161
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory Animal Resource Center and Trans-Border Medical Research Center, University of Tsukuba, 2Ph.D. Program in Human Biology, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba
* These authors contributed equally

Summary

يصف البروتوكول الحالي الحقن المجهري للزيجوت ل CRISPR-Cas9 والحمض النووي للمتبرع لإنتاج فئران كاسيت الجينات وفئرانها المتخبطة بكفاءة.

Abstract

مكنت تقنية كريسبر-كاس من توليد الفئران المعدلة وراثيا بسرعة وبدون عناء. على وجه التحديد ، يتم إنتاج الفئران والفئران الطافرة النقطية بسهولة عن طريق التثقيب الكهربائي لعوامل كريسبر (ومتبرعي الحمض النووي قليل التقطعت بهم السبل) في الزيجوت. في المقابل ، يتم إنشاء كاسيت الجينات (>1 كيلوبايت) والفئران المتخبطة بشكل أساسي عن طريق الحقن المجهري لعوامل كريسبر والمتبرعين بالحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل في الزيجوت. كما زادت تقنيات تحرير الجينوم من مرونة إنتاج الفئران المعدلة وراثيا. أصبح من الممكن الآن إدخال الطفرات المقصودة في المناطق الجينومية المستهدفة في عدد من سلالات الفئران الفطرية المفيدة. أنتج فريقنا أكثر من 200 خط فأر كاسيت جيني ، وأكثر من 110 خطوط فأر متخبطة عن طريق الحقن المجهري للزيجوت ل CRISPR-Cas9 بعد طلبات من العديد من البلدان ، بما في ذلك اليابان. استخدمت بعض عمليات تحرير الجينوم هذه سلالات BALB / c و C3H / HeJ و C57BL / 6N الفطرية ، ولكن معظمها يستخدم C57BL / 6J. على عكس طريقة التثقيب الكهربائي ، فإن تحرير الجينوم عن طريق الحقن المجهري للزيجوت في سلالات مختلفة من الفئران ليس بهذه السهولة. ومع ذلك ، فإن الفئران الكاسيت الجيني والفئران المتخبطة على خلفيات وراثية فطرية واحدة لا تقل أهمية عن نماذج الفئران الجينية المتوافقة مع البشر والفلورسنت والضربة القاضية المشروطة. لذلك ، تقدم هذه المقالة بروتوكول الحقن المجهري للزيجوت لعوامل كريسبر والمتبرعين بالحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل في الفئران C57BL / 6J لتوليد الفئران الكاسيت والفئران المتخبطة. تركز هذه المقالة حصريا على الحقن النووي بدلا من الحقن السيتوبلازمي. بالإضافة إلى الحقن المجهري للزيجوت ، نحدد الجدول الزمني لعملية الإنتاج والتقنيات المحيطية مثل تحريض الإباضة الفائقة ونقل الأجنة.

Introduction

تستخدم الفئران الضربة القاضية ، التي يتم فيها إدخال الجينات الخارجية المقصودة في الموقع المستهدف ، على نطاق واسع في العديد من الدراسات في الجسم الحي مثل الفئران المؤنسنة الجينية ، والفئران المراسل الفلورية ، والفئران سائق Cre 1,2. عندما يتم إحداث طفرات غير ناجحة عن طريق تحرير الجينوم في زيجوت الفأر ، يتم استخدام الحمض النووي أحادي الشريط (متبرعو الحمض النووي قليل الجديلة ، ssODN) أو الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت بهم السبل (dsDNA) كحمض نووي متبرع 2,3. يستخدم ssODN بشكل أساسي لضرب شظايا جينية قصيرة نسبيا أقل من 200 bp4. من الممكن ضرب شظايا أطول من 1 كيلو بايت من الحمض النووي باستخدام ssODNs طويلة (lsODN) 5,6 ، ولكن تحضيرها يستغرق وقتا طويلا. عند استخدام متبرعين ب dsDNA ، يمكن إنشاء فئران كاسيت جيني (>1 كيلو بايت) دون تحضير الحمض النووي الشاقللمتبرع 7.

الميزة الرئيسية لاستخدام ssODNs هي أن التثقيب الكهربائي8 يمكن أن يولد فئران غير مطرودة. ومع ذلك ، يجب إدخال متبرعي dsDNA مباشرة في النواة عن طريق الحقن المجهري للزيجوت. مطلوب ضربة قاضية متزامنة في موقعين لإنشاء فئران متخبطة ، حيث يتم ضرب كل تسلسل loxP في المنبع والمصب للجين المستهدف. هناك طريقتان لتوليد الفئران المتخبطة عن طريق تحرير الجينوم في زيجوت الفئران باستخدام اثنين من ssODNs المستقلة ، كل منهما يحمل موقع loxP واحد ، أو باستخدام dsDNA واحد (أو lsDNA) مع تسلسل متخبط. الأول غير فعال للغاية9،10،11. يعد تحرير الجينوم باستخدام الجهات المانحة dsDNA أبسط طريقة لإنتاج الفئران ذات الكاسيت الجيني والفئران المتخبطة إذا كانت البيئة مواتية للحقن المجهري للزيجوت.

في البداية ، يتم استخدام مخاليط Cas9 mRNA و sgRNA أو ناقلات الحمض النووي التي تشفر sgRNA و Cas9 لتحرير الجينوم في زيجوت الفأر12,13. نظرا لأن بروتينات Cas9 عالية الجودة والمستقرة متوفرة الآن بتكلفة منخفضة ، فقد أصبح إدخال البروتين النووي الريبي crRNA-Cas9 (RNP) في زيجوت الماوس14 شائعا. في الآونة الأخيرة ، تم إنشاء الفئران الضربة القاضية بكفاءة عالية من خلال إدخال crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP والحمض النووي للمانح في كل من نواة زيجوت الفأر في مرحلة دورة الخلية حيث من المرجح أن تحدث الضربة القاضية15. لذلك ، يصف البروتوكول الحالي تقنيات لإنتاج أنواع مختلفة من الفئران الضربة القاضية بهذه الطريقة.

هناك العديد من السلالات الفطرية المفيدة من الفئران المختبرية16. يمكن أن يتجاهل التعديل الوراثي داخل الخلفية الفطرية تأثير الخلفية الجينية على النمط الظاهري. توضح هذه المقالة طريقة لإحداث طفرات كاسيت الجين والطفرات المتخبطة في الزيجوت لخط الفأر الفطري الأكثر استخداما ، C57BL / 6J17. علاوة على ذلك ، تمت مناقشة الجدول الزمني لتوليد الفئران المعدلة وراثيا والتقنيات المحيطية المستخدمة ، بما في ذلك تحريض الإباضة الفائقة ونقل الأجنة.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات بطريقة إنسانية بموافقة من لجنة التجارب الحيوانية المؤسسية بجامعة تسوكوبا ، وفقا للوائح التجارب على الحيوانات بجامعة تسوكوبا والمبادئ التوجيهية الأساسية للإجراء السليم للتجارب على الحيوانات والأنشطة ذات الصلة في مؤسسات البحث الأكاديمي الخاضعة لولاية وزارة التعليم ، الثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان. تم استخدام الفئران C57BL / 6J من كلا الجنسين ، التي تتراوح أعمارها بين 10 و 25 أسبوعا ، كمتبرع بالزيجوت. تم استخدام الفئران ICR (أكبر من 10 أسابيع) كفئران متلقية. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد).

1. تأكيد نشاط انقسام crRNA في نظام خال من الخلايا

  1. قم بإذابة 2 نانومول من crRNA (جاف) و 20 نانومول من tracrRNA (جاف) في 25 ميكرولتر و 250 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase ، على التوالي (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يتم اختيار تسلسلات أهداف كريسبر التي كان من المتوقع أن يكون لها نشاط انقسام مرتفع وأقل عدد ممكن من الأهداف خارج الأهداف باستخدام كريسبور (انظر جدول المواد). في حالة ضربة قاضية لشريط الجينات، استهدف التسلسل عبر موقع الإدراج. تم اختيار الإكسون (الإكسون) المراد تخفيضه باستخدام KOnezumi (انظر جدول المواد).
  2. تضخيم جزء الحمض النووي (حوالي 0.5-1 كيلو بايت) الذي يحتوي على الموقع المستهدف بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الجينومي9. قم بتنقية أمبليكون PCR هذا باستخدام مجموعة استخراج منتج PCR الشائعة (انظر جدول المواد).
  3. تحضير 10 ميكرولتر من خليط كريسبر (100 نانوغرام/ميكرولتر من crRNA، و150 نانوغرام/ميكرولتر من tracrRNA، و1 نانوغرام/ميكرولتر من Cas9 في محلول تفاعل النيوكلياز Cas9، انظر جدول المواد). لبناء مركب كريسبر-كاس 9، ضع خليط كريسبر في كتلة حرارية على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. أضف الحجم الكلي (10 ميكرولتر) من خليط كريسبر إلى منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (10 ميكرولتر ، 20 نانوغرام / ميكرولتر) الموصوف في الخطوة 1.2 واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أضف 1 ميكرولتر من RNase (500 نانوغرام / ميكرولتر) لتحلل crRNA و tracrRNA عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، حيث يجب أن تكون الحمض النووي الريبي غائبة أثناء الرحلان الكهربائي. إجراء رحلان كهربائي للعينات المذكورة أعلاه باستخدام صبغة تحميل تحتوي على كبريتات دوديسيل الصوديوم (2٪ وزن / حجم).
    ملاحظة: في حالات نادرة ، يتم ملاحظة crRNAs بدون نشاط انقسام. في مثل هذه الحالات ، يوصى بإعادة تصميم تصميم تحرير الجينوم.

2. تحضير خليط من crRNA و tracrRNA وبروتين Cas9 والحمض النووي المانح للحقن المجهري للزيجوت

  1. تحضير محلول كريسبر (50 نانوغرام / ميكرولتر من crRNA ، 200 نانوغرام / ميكرولتر من tracrRNA ، و 200 نانوغرام / ميكرولتر من Cas9 في الماء الخالي من RNase). تحضير محلول الحمض النووي للمتبرع (20 نانوغرام / ميكرولتر من ناقل الحمض النووي البلازميد ذاتي البناء).
    1. قم بتصفية محلول الحمض النووي للمتبرع من خلال مرشح حقنة معقم بحجم مسام 0.22 ميكرومتر. امزج كميات متساوية من محلول كريسبر ومحلول الحمض النووي للمتبرع المصفى. تأكد من أن التركيز النهائي لكل منها هو 25 نانوغرام / ميكرولتر من crRNA ، و 100 نانوغرام / ميكرولتر من tracrRNA ، و 100 نانوغرام / ميكرولتر من Cas9 ، و 10 نانوغرام / ميكرولتر من الحمض النووي المانح. سيشار إلى هذا الخليط فيما بعد باسم RNPD.
      ملاحظة: عند قطع موقعين ، كما هو الحال أثناء إنتاج الفئران المتخبطة ، يجب أن يكون تركيز كل crRNA 25 نانوغرام / ميكرولتر. الحمض النووي للمتبرع هو حمض نووي بلازميد دائري ويمكن تنقيته باستخدام مجموعة أعمدة الدوران الإعدادية المصغرة الشائعة (انظر جدول المواد). يجب وضع المحلول المحضر على الثلج واستخدامه للحقن الدقيق في أسرع وقت ممكن.

3. الحصول على زيجوت الفئران عن طريق التزاوج الطبيعي

  1. حقن 5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل (PMSG ، انظر جدول المواد) تحت الجلد في إناث الفئران C57BL / 6J (10-25 أسبوعا) قبل 3 أيام من الحقن المجهري. بعد حوالي 46-48 ساعة ، يتم تطبيق 5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (قوات حرس السواحل الهايتية ، انظر جدول المواد) داخل الصفاق. شارك في إيواء إناث الفئران المعالجة ب PMSG و hCG مع ذكور الفئران C57BL / 6J وتحقق من سدادات المهبل في صباح اليوم التالي.
    ملاحظة: يمكن الحصول على ما يقرب من 15-25 زيجوت من أنثى ماوس C57BL / 6J. يظهر المخطط الزمني في الشكل 1.
  2. قم بإعداد طبقين بتري 35 مم لثقافة الزيجوت ، كما هو موضح في الشكل 2. ضعها في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) حتى الاستخدام. يمكن تخزينها بين عشية وضحاها.
  3. القتل الرحيم للفئران الإناث باستخدام سدادات مهبلية مؤكدة عن طريق خلع عنق الرحم ، وباستخدام مقص صغير ، شق من خلال جلد البطن وطبقة العضلات من خط الوسط في أسفل البطن إلى أسفل الأضلاع.
    ملاحظة: اتبع توصيات لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية للقتل الرحيم.
  4. اجمع قنوات البيض وضعها في قطرة 20 ميكرولتر من وسط M2 تحتوي على 0.75 مجم / مل من الهيالورونيداز (انظر جدول المواد) على غطاء طبق بتري. التقط قناة بيض واحدة مع ملقط رفيع الطرف وقم بتغذية حوالي 50 ميكرولتر من وسط M2 مع الهيالورونيداز من خلال fimbriae.
    ملاحظة: في هذا الوقت، تكون الزيجوتات محاطة بشكل فضفاض بالعديد من الخلايا الركامية.
  5. بعد 30 ثانية ، التقط الزيجوت الطبيعي شكليا بكمية صغيرة من الوسط باستخدام شعرية زجاجية واغسلها عن طريق نقلها إلى قطرات متوسطة M16 طازجة. انقل الزيجوت المغسول إلى طبق بتري (الشكل 2) للتجميع.
    ملاحظة: يظهر المخطط الزمني في الشكل 1. تحتوي الزيجوت الطبيعية شكليا على نواة ذكورية وأنثوية وجسمين قطبيين لم يعرضا الشكل الكروي للخطر بشدة15. يختلف مورفولوجيا الزيجوت اختلافا كبيرا بين السلالات والأنواع.
  6. كرر الخطوتين 3.3 و3.4 حتى تسترجع جميع الزيجوتات. يمكن تجميع حوالي 100 زيجوت في قطرة واحدة M16 في طبق الاستزراع. قم بتخزين الطبق في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) حتى الحقن المجهري.

4. إعداد إبرة الحقن المجهري

  1. اسحب بعض الماصات الزجاجية باستخدام مجتذب الماصة القابل للبرمجة (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يجب أن تحتوي إبر الحقن المجهري على طرف رفيع وتفتق طويل. إذا كان لدى الساحب برنامج لصنع الإبر لحقن الحيوانات المنوية داخل الهيولى ، فيمكن استخدام نفس البرنامج لصنع إبر للحقن المجهري.
  2. اكسر طرف إبرة الحقن المجهري عن طريق ضرب الكرة الزجاجية المتصلة بطرف microforge. تأكد من أن حجم طرف إبرة الحقن المجهري يبلغ قطره حوالي 1 ميكرومتر. تحقق من حجم الطرف تحت المجهر عند تكبير 1000x.
  3. ثني إبرة الحقن المجهري عند حوالي 2-3 مم من الحافة باستخدام microforge.
    ملاحظة: تعتمد زاوية الانحناء على إعداد المعالج الدقيق. الكثير من الانحناء سيقلل من فعالية نبض بيزو.

5. الحقن المجهري للزيجوت

  1. قم بحقن 1-1.5 سم من سائل التشغيل (جسم القصور الذاتي اللازم لتأثير بيزو لعمل ثقوب كبديل للزئبق ، انظر جدول المواد) في وسط إبرة الحقن الدقيق وإرفاقها بحامل الحاقن الدقيق اليدوي باستخدام مشغل بيزو.
    1. علاوة على ذلك ، قم بتوصيل إبرة التثبيت بحامل الحاقن اليدوي المعاكس. انقل سائل العملية إلى طرف إبرة الحقن المجهري بضغط تدريجي. إصلاح كل من حاملي حاقن الدقيق اليدوي على micromanipulator.
      ملاحظة: يمكن ملاحظة سائل العملية الخارج من طرف إبرة الحقن المجهري تحت المجهر عند تكبير 50x. بعد ضبط كمية السائل المنبعث ، يمكن ملاحظة رش السائل عند تطبيق نبضات بيزو ، مما يؤكد أن نبضات بيزو فعالة. إذا تعذر تأكيد ذلك ، فأعد تحضير إبرة الحقن المجهري.
  2. تحضير غرفة حقن بثلاث قطرات: (1) 10 ميكرولتر من وسط M2 ؛ (2) 5 ميكرولتر من 12٪ بولي فينيل بيروليدون (PVP) في وسط M2 ؛ و (3) خليط 5 ميكرولتر من crRNA و tracrRNA وبروتين Cas9 ومحلول الحمض النووي المانح (RNPD). قم بتغطية القطرات بالزيت المعدني بنفس طريقة الخطوة 3.2 واضبط حجرة الحقن على مرحلة المجهر المقلوب.
    1. تحت المجهر المقلوب عند تكبير 50x ، قم بخفض ماصة الحقن المجهري إلى انخفاض 12٪ PVP. نضح واستغني عن 12٪ PVP لتنظيف الجزء الداخلي من طرف إبرة الحقن المجهري ونقله إلى قطرة RNPD.
  3. ضع الحاقن الدقيق اليدوي تحت ضغط سلبي وامتص محلول RNPD في إبرة الحقن المجهري. انتظر بضع دقائق حتى يتم استنشاق حجم كاف ؛ تحت المجهر المكبرة 50x ، املأ الجزء الداخلي بالكامل من إبرة الحقن المجهري بالسائل.
    1. أوقف المدخول واترك محلول RNPD يطرد تدريجيا عن طريق ضبط الحاقن الدقيق اليدوي على الضغط الإيجابي. حرك طرف إبرة الحقن المجهري في الزيت.
      ملاحظة: أدر مقبض الحاقن الدقيق اليدوي عكس اتجاه عقارب الساعة للاستنشاق. لإيقاف الاستنشاق ، قم بتدوير المقبض في اتجاه عقارب الساعة وقم بزيادة الضغط تدريجيا أثناء المراقبة تحت المجهر. سيتم استنزاف محلول RNPD تدريجيا. تسمح حركة مستوى السائل في إبرة الحقن المجهري بتأكيد التدفق الخارجي.
  4. ضع 50 زيجوت في قطرة M2 واخفض ماصة التثبيت برفق في نفس القطرة. انقل إبرة الحقن المجهري إلى قطرة M2 التي تحتوي على الزيجوت. قم بالتبديل إلى هدف 20x وركز على طرف ماصة الحقن المجهري.
    ملاحظة: ضع أكبر عدد ممكن من الزيجوتات التي يمكن حقنها في 10 دقائق.
  5. امسك زيجوتا وركز على النواة عن طريق تحريك المناور الدقيق. أدخل إبرة الحقن المجهري في الزيجوت واجعل الطرف قريبا من النواة. بمجرد وصول الطرف إلى غشاء النواة ، ضع نبضة بيزو (الشدة: 6-10 ، السرعة: 1) للثقب.
    1. عندما تثقب إبرة الحقن المجهري النواة ، قم بحقن محلول RNPD ، ولاحظ تورم النواة. بمجرد نفخ النواة بالكامل ، اسحب الإبرة بسرعة. نفذ نفس الإجراء على كل من أنثى وذكور النواة.
      ملاحظة: يمكن رؤية تضخم النواة عن طريق الحقن بوضوح تحت المجهر. ومن الصعب التعبير عن درجة هذا التضخم ولكن يمكن تأكيدها بالرجوع إلى التقارير السابقة15.
  6. انقل الزيجوت المحقون إلى مكان آخر داخل قطرة M2 لتحديد الزيجوت قبل الحقن وبعده.
  7. كرر الخطوات 5.5-5.6 حتى يتم حقن جميع الزيجوت في قطرة M2. بعد الحقن ، انقل الزيجوت إلى طبق M16 طازج.
  8. حدد الزيجوت الباقي على قيد الحياة بعد 10 دقائق من الحقن. قم بإزالة الزيجوت المحلل الذي تضرر من الحقن وتوزيع الزيجوت الباقي على كل قطرة في طبق M16. يجب أن تحتوي كل قطرة على 20-24 زيجوت لأنثى واحدة حامل زائفة. هذا يقلل من الوقت الذي يتعرض فيه طبق M16 للبيئة خارج الحاضنة أثناء نقل الأجنة.
    ملاحظة: في ظل ظروف الحقن المثلى ، يكون معدل البقاء على قيد الحياة 90٪ -95٪. هذا يعتمد على حجم طرف الإبرة ، وقوة نبضة بيزو ، وضغط التدفق الخارجي لمحلول RNPD.

6. نقل الأجنة إلى قناة البيض

  1. للحصول على الفئران الحامل الزائفة ، قم بتزاوج كل أنثى فأر ICR في مرحلة الشبق مع فأر ذكر ICR مبتذل بالأوعية. تحقق من المقابس في اليوم التالي.
    ملاحظة: يتم الحصول على ما يقرب من 15 فأرا حاملا زائفا من 20 زوجا من التزاوج.
  2. يتم تطبيق ثلاثة أنواع من عوامل التخدير المختلطة (0.2 ملغم/كغ من ميديتوميدين، 4.0 ملغ/كغ من الميدازولام، و2.5 ملغ/كغ من بوتورفانول، انظر جدول المواد) تحت الجلد لدى إناث الفئران الكاذبة الحامل. تأكيد التخدير المناسب عن طريق انخفاض معدل التنفس واختفاء منعكسات انسحاب قرصة الذيل والدواسة الخلفية. ضع مرهم العيون لتليين العينين وفقا لتوصيات لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية.
  3. بعد حلاقة المنطقة الظهرية للفأر في وضعية الانبطاح وتطهير المنطقة الجراحية ثلاث مرات ، بالتناوب بين فرك اليود أو الكلورهيكسيدين والكحول ، شق الجلد الظهري حوالي 1 سم على طول العمود الفقري بمقص تشريح صغير.
  4. قم بتحويل جرح الشق الظهري إلى جانب واحد من الناحية البطنية ، وقم بشق طبقة العضلات التي يمكن من خلالها رؤية المبيض ، وأمسك الدهون فوق المبيض بالملاقط ، واسحب المبيض وقناة البيض والرحم.
    1. قم بتأمين الدهون بمشبك مصقول (انظر جدول المواد). ضع الأنسجة التناسلية على شاش معقم لتجنب الاتصال المباشر بالمعطف.
  5. بالترتيب التالي ، ضع كمية صغيرة من وسط الاستزراع (M2 أو M16) ، وبعض فقاعات الهواء كعلامة ، والزيجوت في ماصة للنقل.
    ملاحظة: نقل ما يقرب من 10-12 زيجوت لكل قناة البيض.
  6. قم بعمل شق باستخدام مقص دقيق (انظر جدول المواد) بين الأمبولة و fimbriae من قناة البيض (فقط طويلة بما يكفي للسماح للماصة الزجاجية بالدخول) ، وأدخل الزيجوت في الشق ، وتأكد في نفس الوقت من إدخال فقاعة الهواء.
  7. إجراء الزرع في قناة البيض الأخرى بالمثل (الخطوة 6.6).
  8. قم بخياطة الجلد الخارجي بمشابك تلقائية (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: لا تقم بخياطة طبقة العضلات المحفورة إلا إذا كان جرح الشق كبيرا لا مفر منه. يجب أن يكون الحجم المثالي لطبقة العضلات المحفورة أقل من 2-3 مم. إذا كان الشق أكبر من 5 مم ، فيجب خياطة طبقة العضلات باستخدام إبرة خياطة معقمة وخيط (انظر جدول المواد).

7. استعادة الحيوان

  1. تطبيق أتيباميزول هيدروكلوريد (0.3 ملغ/كغ) تحت الجلد لدى الفئران.
    ملاحظة: اتبع توصيات لجنة أخلاقيات الحيوان المحلية لتسكين ما بعد الجراحة.
  2. ثم ضع الفئران في أقفاص واحتفظ بها دافئة على طبق ساخن عند 37 درجة مئوية.
  3. بعد استيقاظ الفئران ، احتفظ بها دافئة لمدة 2 ساعة تقريبا. بعد التأكد من عدم وجود سلوك غير طبيعي للفئران ، أعد الأقفاص إلى رف التكاثر.

Representative Results

يتم عرض نتائج إنتاج الفئران الكاسيت الجيني والفئران المتخبطة باستخدام هذا البروتوكول في الجدول 1 والجدول 2. لم يتم ذكر الجينات المستهدفة لأن كل خط فأر محرر بالجينوم يستخدم حاليا في مشروع مستقل غير منشور. بدلا من ذلك ، تم وصف مناطق الكروموسومات المستهدفة.

تم إجراء تحليلات التنميط الجيني باستخدام طريقة18 المبلغ عنها سابقا. في طريقة التنميط الجيني هذه ، لا يتم احتساب الفئران التي يتم فيها إدخال الحمض النووي للمتبرع في مواقع كروموسومية غير مقصودة كأفراد إيجابيين ، حتى لو تم تحفيز تحرير الجينوم المطلوب. ومن ثم ، تم عرض كفاءة إنتاج الفئران المؤسسة المفيدة حقا للأغراض الفعلية ، بدلا من كفاءة تحرير الجينوم نفسه.

كان متوسط كفاءة الإنتاج ل 13 فأرا مستقلا من كاسيت الجينات 20.8٪ ، بحد أقصى 39.5٪ وحد أدنى 7.9٪ (الجدول 1). واعتبرت هذه الكفاءة عملية بما فيه الكفاية. لم يتم استهداف أي جينات جنينية قاتلة أثناء ضرب شريط الجينات. كان متوسط معدل المواليد في ظل حالة استهداف الجينات غير القاتلة هذه 34.0٪ (بحد أقصى 43.3٪ و 15.9٪ كحد أدنى). نظرا لأن هذا يمكن مقارنته بمعدل المواليد في نقل الأجنة دون التلاعب الجيني ، فقد اعتبرنا أن سمية عناصر تحرير الجينوم التي تم إدخالها والضرر المادي للحقن المجهري للزيجوت من غير المرجح أن تؤثر على التطور الجنيني.

كان متوسط كفاءة الإنتاج ل 10 فئران متقلبة مستقلة 7.7٪ ، بحد أقصى 20.7٪ وحد أدنى 2.1٪ (الجدول 2). على الرغم من أن وظائف العديد من الجينات المستهدفة كانت غير معروفة ، إلا أن متوسط معدل المواليد كان 30.2٪ ، بحد أقصى 43.8٪ و 17.3٪ كحد أدنى. كان هذا المعدل مشابها لمعدل الفئران الجينية، مما يشير إلى أن عملية الحقن الدقيقة لها تأثير ضئيل على التطور الجنيني للفئران المتخبطة.

Figure 1
الشكل 1: الجدول الزمني للحقن المجهري للزيجوت. يظهر اللون الأبيض والداكن دورة الضوء والظلام ، على التوالي. تم الحفاظ على الفئران تحت دورة مظلمة لمدة 14 ساعة / 10 ساعات. PMSG: موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحامل. قوات حرس السواحل الهايتية: موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: تحضير أطباق الاستزراع. أ: طبق استزراع للزيجوت قبل الحقن. ضع قطرتين من وسط M16 (20-25 ميكرولتر لكل منهما) في طبق بتري بلاستيكي 35 مم. ب: طبق استزراع للزيجوت بعد الحقن. ضع 10 قطرات (10-20 ميكرولتر لكل قطرة) من M16 في طبق بتري بلاستيكي 35 مم. قطرات مغطاة بالزيت المعدني (3 مل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

منطقة الكروموسومات المستهدفة عدد طول إدخال الضربة القاضية (kb) طول ذراع التماثل (kb)
الاجنه المواليد الجدد فحص (الفطام) ضربة قاضية مع rTG rTGج
حقن نقل ذراع 5 ' ذراع 3 '
2qE2 349 331 114 (34.4٪)أ 114 9 (7.9٪)ب 5 (4.4٪)د 1.0 1.0 1.0
2qE2 231 215 78 (36.3٪)أ 74 15 (20.3٪)ب 23 (31.1٪)د 2.2 1.0 1.1
5qG2 288 262 90 (34.4٪)أ 81 19 (23.5٪)ب 18 (22.2٪)د 1.6 2.0 2.0
6qB1 278 259 58 (22.4٪)أ 46 11 (23.9٪)ب 11 (23.9٪)د 4.2 1.2 1.0
6qE3 [ROSA26] 295 277 97 (35.0٪)أ 23 2 (8.7٪)ب 4 (17.4٪)د 6.5 1.1 3.0
6qE3 [ROSA26] 246 219 87 (39.7٪)أ 83 22 (26.5٪)ب 18 (21.7٪)د 5.8 1.1 3.0
7qF5 279 268 116 (43.3٪)أ 114 45 (39.5٪)ب 44 (38.6٪)د 1.4 3.1 1.0
11qB4 405 353 56 (15.9٪)أ 47 8 (17.0٪)ب 12 (25.5٪)د 1.7 1.0 0.8
11 د.ق 310 294 100 (34.4٪)أ 98 15 (15.3٪)ب 76 (77.6٪)د 1.0 1.8 2.4
12qE 368 320 86 (26.9٪)أ 84 12 (14.3٪)ب 19 (22.6٪)د 3.4 1.1 1.3
12qF1 315 265 76 (28.7٪)أ 72 17 (23.6٪)ب 28 (38.9٪)د 1.0 1.1 1.1
14qE5 256 215 48 (22.3٪)أ 48 11 (22.9٪)ب 21 (43.8٪)د 3.1 1.0 0.9
14qE5 287 285 85 (29.8٪)أ 72 15 (20.8٪)ب 19 (26.4٪)د 2.6 1.0 0.9

الجدول 1: إنتاج الفئران عن طريق الحقن الدقيق. يوضح الجدول معدل المواليد وكفاءة إنتاج الفئران التي تحمل الأليل المقصود بدون (W / O) التكامل العشوائي (rTG) للحمض النووي للمتبرع. كان من الممكن الحصول على الفئران مع أليل الضربة القاضية المقصود في جميع المشاريع. أ: عدد المواليد الجدد/عدد الأجنة المنقولة؛ ب: عدد الأليلات التي حملتها الفئران / عدد الفئران التي تم فحصها ؛ ج: ليس من المؤكد ما إذا كان هناك أليل مقصود ؛ د: عدد أليل rTG الذي حملته الفئران / عدد الفئران التي تم فحصها ؛ rTG: التكامل العشوائي للناقل المانح. ث / س: بدون.

منطقة الكروموسومات المستهدفة عدد طول فلوكسيد (كيلوبايت) طول ذراع التماثل (kb)
الاجنه المواليد الجدد فحص (الفطام) فلوكسيد ث / س rTG
حقن نقل ذراع 5 ' ذراع 3 '
3 كيو سي 325 313 93 (29.7٪)أ 87 9 (10.3٪)ب 1.3 1.2 1.1
4qB1 210 200 36 (18.0٪)أ 29 6 (20.7٪)ب 1.6 1.2 0.9
4qC4 272 256 112 (43.8٪)أ 100 5 (5.0٪)ب 2.4 1.0 1.4
5qF 143 137 40 (29.2٪)أ 40 6 (15.0٪)ب 1.8 1.0 1.1
5qF 255 227 80 (35.2٪)أ 76 2 (2.6٪)ب 1.3 1.1 0.9
9qE3.1 289 261 80 (30.7٪)أ 77 9 (11.7٪)ب 1.2 1.2 1.2
10qB3 284 269 88 (32.7٪)أ 78 3 (3.8٪)ب 1.3 1.1 0.9
10qC1 243 231 40 (17.3٪)أ 38 4 (10.5٪)ب 2.1 1.0 1.3
14qE5 390 372 139 (37.4٪)أ 135 5 (3.7٪)ب 1.1 0.8 0.9
17qA3.3 383 374 99 (26.5٪)أ 95 2 (2.1٪)ب 2.1 0.6 0.8

الجدول 2: إنتاج الفئران المتخبطة عن طريق الحقن الدقيق. يوضح الجدول معدل المواليد وكفاءة إنتاج الفئران التي تحمل أليل flox المقصود بدون (W / O) التكامل العشوائي (rTG) للحمض النووي للمتبرع. كان من الممكن الحصول على الفئران مع أليل flox المقصود في جميع المشاريع. (أ): عدد المواليد الجدد/عدد الأجنة المنقولة؛ ب: عدد أليل فلوكس الذي حملته الفئران / عدد الفئران التي تم فحصها. rTG: التكامل العشوائي أو ناقل المانحين ؛ ث / س: بدون.

Discussion

في الدراسة الحالية ، تم استخدام زيجوت الفأر C57BL / 6J الطازجة (غير المجمدة المذابة) ، التي تم الحصول عليها من التزاوج الطبيعي ، لإنتاج فأر تحرير الجينوم. عن طريق حقن crRNA-tracrRNA-Cas9 والحمض النووي للمتبرع (RNPD) في كل من نواة هذه الزيجوت في مرحلة دورة الخلية حيث من المرجح أن تحدث ضربة قاضية ، تم إنشاء كاسيت الجينات والفئران المتخبطة بمعدل مواليد مرتفع وكفاءة كافية في تحرير الجينوم. تعزز الدراسة الحالية قابلية التوسع لطريقة SPRINT-CRISPR15 ، حيث تضمن كفاءة كافية حتى في الخلفية الجينية C57BL / 6J ، ويمكن تطبيقها على إنتاج الفئران المتخبطة.

التثقيب الكهربائي هو طريقة معممة للغاية لإنتاج الفئران المحررة بالجينوم بسبب التكلفة المنخفضة للأجهزة التجريبية وسهولة تعلم التقنية8. علاوة على ذلك ، فإن طريقة i-GONAD19 ، التي يتم فيها تحرير الجينوم مع الأجنة قبل الزرع الموجودة في قناة البيض ، لا تتطلب فأرا متلقيا. بالمقارنة مع هذه الطرق ، فإن الطريقة الحالية المعروضة هنا مكلفة وتستغرق وقتا طويلا عند إعداد وصيانة بيئة تجريبية من حيث كل من الأجهزة والبرامج. ومع ذلك ، بمجرد إنشاء المرافق التجريبية ، يمكن إنتاج الفئران المعقدة من الكاسيت الجيني والفئران المتخبطة باستخدام عناصر CRISPR المتاحة تجاريا فقط (crRNA و tracrRNA وبروتين Cas9) وكمية بسيطة وصغيرة من ناقل البلازميد الدائري لاستخدامها كحمض نووي متبرع. هذا يعني أنه يمكن إنتاج العديد من خطوط الماوس المعقدة المحررة بالجينوم دون الحاجة إلى تحضير lsODN 5,6 أو ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدي20 التي تستغرق وقتا طويلا (أو مكلفة نسبيا).

على عكس طريقة SPRINT-CRISPR الأصلية15 ، تم استخدام زيجوت طازجة (مجمدة مذابة). عند الحصول على الزيجوت الطازج عن طريق التزاوج الطبيعي ، يمكن تجاهل الأخطاء الفنية التي قد تحدث أثناء الإخصاب في المختبر أو التجميد والذوبان. أيضا ، يمكن إكمال عملية معالجة الأجنة في حوالي نصف يوم (الشكل 1) باتباع النهج الحالي. من ناحية أخرى ، تتضمن بعض قيود الطريقة الحالية متطلبات العديد من ذكور الفئران ، والتحكم الفضفاض في توقيت الإخصاب ، والقدرة المحدودة على التنبؤ الكامل بعدد الزيجوت للحقن المجهري. بالمقارنة مع طريقة SPRINT-CRISPR الأصلية ، قد يكون لهذه الطريقة معدل مواليد أعلى (الجدول 1). على الرغم من ذلك ، لا يمكن استنتاج أن الطريقة الحالية أفضل من حيث معدل المواليد بسبب الاختلافات في موصلات التجربة والجينات المستهدفة والخلفيات الجينية وتوقيت تأكيد الجنين.

كما هو موضح في الجدول 1 ، كان لدى عدد كبير من الفئران في معظم مشاريع كاسيت الجينات أليلات تكامل عشوائية. يجب القضاء على التكامل العشوائي لأنه يمكن أن يؤدي إلى تعطيل غير مقصود للجينات الداخلية والتعبير خارج الرحم عن الجينات المحورة. يتمثل التحدي في المستقبل في إيجاد ظروف تجريبية تقلل من عدد أحداث التكامل العشوائي مع الحفاظ على كفاءة كافية في الضربة.

من المرجح أن يؤدي تحرير جينوم زيجوت الفأر تقريبا باستخدام مستجيبات تحرير الجينوم التي تؤدي إلى فواصل مزدوجة الحمض النووي إلى حدوث طفرات غير مقصودة في المواقع المستهدفة 9,21. لم يتم وصف نتائج هذه الطفرات غير المقصودة على الهدف هنا لأننا لسنا في وضع يمكن فيه إدارة الجيل التالي من الفئران من أجل تقديم دليل واضح عليها. أفضل طريقة لاستبعاد القلق من الارتباك الناجم عن الطفرات غير المقصودة على الهدف هي الحصول على الجيل التالي من الفئران عن طريق تزاوج المؤسسين مع الفئران البرية بدلا من تهجين المؤسسين. من حيث المبدأ ، فإن الفئران N1 الناتجة عن هذا التقاطع هي من النوع البري (WT) على جانب واحد من الأليل ، لذلك إذا تم اكتشاف أليل الضربة القاضية (KI) المقصود ، فهي WT / KI متغاير الزيجوت. لذلك ، فإن الطفرات المستهدفة ليست مشكلة حرجة في فأر المختبر ، الذي له دورة حياة سريعة نسبيا وهو غزير الإنتاج. ومع ذلك ، سيكون من الضروري إجراء مزيد من التحسين عند تطبيق هذه التكنولوجيا على الثدييات الكبيرة نسبيا.

وقد تم التأكيد على أن هذه التكنولوجيا يمكن أن تنتج فئران كاسيت الجينات في سلالات فطرية أخرى غير C57BL / 6J ، ولكن لم يتم تأمين عدد كاف من المشاريع ، والبيانات متغيرة للغاية. ولهذا السبب، لم تدرج هذه المعلومات في هذه الدراسة. ويعتقد أنه سيكون من الضروري إجراء مزيد من الدراسات حول هذا الموضوع لتعزيز علم الوراثة للفئران وبحوث نماذج الأمراض.

Disclosures

ولم يعلن أصحاب البلاغ عن أي مصالح متنافسة.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل البحث العلمي (B) (19H03142: إلى SM) ، والبحث العلمي (A) (20H00444: إلى FS) ، والبحث العلمي (A) (21H04838: إلى SM) ، والبحث العلمي في المجالات المبتكرة "منصة دعم النموذج الحيواني المتقدم" (16H06276: إلى ST) من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطات. نحن ممتنون لريويتشي موري لمناقشته المفيدة حول تصميم تحرير الجينوم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole Hydrochloride ZENOAQ -
Autoclip Wound Clip BD 427631
Autoclip Wound Clip Applier BD 427630
Butorphanol Meiji Seika Pharma -
C57BL/6J mice Jackson Laboratory Japan - older than 10 weeks old
Calibrated Pipet, 100ul Drummond Scientific Company 2-000-100 for collecting zygote and embryo transfer
Cas9 Thermo Fisher Scientific A36499
Cas9 Nuclease Reaction Buffer NEB B7203
CellTram 4r  oil Eppendorf 5196000030
CRISPOR http://crispor.tefor.net/ web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system
crRNA IDT -
Gel/PCR Extraction Kit FastGene FG-91302
hCG ASKA Animal Health -
Hyaluronidase Merck Sigma-Aldrich H3884
ICR mice Jackson Laboratory Japan - older than 10 weeks old, weight 28 G or more
Inverted microscope Leica
KOnezumi https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice
M16 medium Merck Sigma-Aldrich M7292
M2 medium Merck Sigma-Aldrich M7167
Medetomidine ZENOAQ -
Micro shears Natsume Seisakusho MB-54-1
Microforge Narishige MF-900 for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle
Micromanipulator units Narishige
Micropipette puller Sutter Instrument P-1000 programmable pipette puller
Midazolam Maruishi Pharmaceutical -
MILLEX-GV 0.22 µm filter Merck Millipore SLGV033R
Mineral oil Nacalai 26114-75 for zygote culture and injection chamber
Petri dish (35mm, untreated) Iwaki 1000-035 for zygote culture
PIEZO micromanipulator PRIME TECH PMM-150
Plasmid Mini Kit FastGene FG-90502 mini prep spin column kit
PMM Operation Liquid PRIME TECH KIT-A operation liquid for microinjection
PMSG ASKA Animal Health -
Polyvinylpyrrolidone Merck Sigma-Aldrich P5288
RNase QIAGEN 19101
RNase Free Water IDT - tracrRNA Accessory Reagents
Serrefine clamp Natsume Seisakusho C-18
Sodium dodecyl sulfate SIGMA 151-21-3
Suture needle with thread Natsume Seisakusho C11-60B2
Thin wall borosilicate glass
without filament		 Sutter Instrument B100-75-10 for microinjection needle and holding pipette
tracrRNA IDT -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
  2. Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
  3. Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
  4. Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
  5. Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
  6. Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
  7. Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  9. Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
  10. Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
  11. Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
  12. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  13. Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
  14. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
  15. Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
  16. Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
  17. Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
  18. Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
  19. Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
  20. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  21. Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 184 ، CRISPR-Cas9 ، تحرير الجينوم ، الماوس المعدل وراثيا ، ضرب كاسيت الجينات ، flox ، الحقن المجهري للزيجوت ، بيزو
الحقن المجهري للزيجوت لإنشاء أليلات كاسيت الجينات وأليلات فلوكس في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tanimoto, Y., Mikami, N., Ishida,… More

Tanimoto, Y., Mikami, N., Ishida, M., Iki, N., Kato, K., Sugiyama, F., Takahashi, S., Mizuno, S. Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice. J. Vis. Exp. (184), e64161, doi:10.3791/64161 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter