Summary
El presente protocolo describe la microinyección de cigoto de CRISPR-Cas9 y ADN de donantes para producir eficientemente ratones knock-in y floxed de casetes de genes.
Abstract
La tecnología CRISPR-Cas ha permitido la generación rápida y sin esfuerzo de ratones modificados genéticamente. Específicamente, los ratones y ratones mutantes puntuales se producen fácilmente mediante electroporación de factores CRISPR (y donantes de oligoADN monocatenario) en el cigoto. Por el contrario, los ratones knock-in y floxed de casete de genes (>1 kb) se generan principalmente mediante microinyección de factores CRISPR y donantes de ADN bicatenario en cigotos. Las tecnologías de edición del genoma también han aumentado la flexibilidad de la producción de ratones modificados genéticamente. Ahora es posible introducir las mutaciones previstas en las regiones genómicas objetivo en una serie de cepas de ratones endogámicos beneficiosos. Nuestro equipo ha producido más de 200 líneas de ratones knock-in de casetes genéticos y más de 110 líneas de ratón floxed mediante microinyección de cigoto de CRISPR-Cas9 siguiendo las solicitudes de varios países, incluido Japón. Algunas de estas ediciones genómicas utilizaron cepas endogámicas BALB/c, C3H/HeJ y C57BL/6N, sin embargo, la mayoría utilizó C57BL/6J. A diferencia del método de electroporación, la edición del genoma por microinyección de cigoto en varias cepas endogámicas de ratones no es tan fácil. Sin embargo, los ratones knock-in y floxed de casetes de genes en fondos genéticos endogámicos individuales son tan críticos como los modelos de ratones genéticamente humanizados, reporteros fluorescentes y knockout condicionales. Por lo tanto, este artículo presenta el protocolo para la microinyección de cigoto de factores CRISPR y donantes de ADN bicatenario en ratones C57BL / 6J para generar ratones knock-in y floxed de casetes de genes. Este artículo se centra exclusivamente en la inyección nuclear en lugar de la inyección citoplasmática. Además de la microinyección de cigoto, describimos la línea de tiempo para el proceso de producción y las técnicas periféricas, como la inducción de la superovulación y la transferencia de embriones.
Introduction
Los ratones knock-in, en los que los genes exógenos previstos se introducen en los loci objetivo, son ampliamente utilizados en muchos estudios in vivo como ratones humanizados con genes, ratones reporteros fluorescentes y ratones conductores Cre 1,2. Cuando las mutaciones knock-in son inducidas por la edición del genoma en cigotos de ratón, el ADN monocatenario (donantes de oligo ADN monocatenario, ssODN) o el ADN bicatenario (dsDNA) se utiliza como ADN donante 2,3. ssODN se utiliza principalmente para golpear fragmentos de genes relativamente cortos de menos de 200 pb4. Es posible golpear fragmentos de más de 1 kb de ADN utilizando ssODNs largos (lsODN)5,6, sin embargo, su preparación requiere mucho tiempo. Cuando se utilizan donantes de dsDNA, se pueden generar ratones knock-in de casete de genes (>1 kb) sin una laboriosa preparación de ADN del donante7.
La principal ventaja de usar ssODNs es que la electroporación8 puede generar ratones knock-in. Sin embargo, los donantes de dsDNA deben introducirse directamente en el núcleo mediante microinyección de cigoto. Se requiere un knock-in simultáneo en dos sitios para crear ratones floxed, en los que cada secuencia loxP se golpea aguas arriba y aguas abajo del gen objetivo. Hay dos formas de generar ratones floxed mediante la edición del genoma en cigotos de ratón: utilizando dos ssODN independientes, cada uno con un solo sitio loxP, o usando un solo dsDNA (o lsDNA) con una secuencia floxed; El primero es muy ineficiente 9,10,11. La edición del genoma utilizando donantes de dsDNA es el enfoque más simple para producir ratones de cassette de genes knock-in y floxed si el entorno es propicio para la microinyección de cigoto.
Inicialmente, las mezclas de ARNm Cas9 y sgRNA o vectores de ADN que codifican sgRNA y Cas9 se utilizan para la edición del genoma en cigotos de ratón12,13. Dado que las proteínas Cas9 estables y de alta calidad ahora están disponibles a bajo costo, la introducción de crRNA-tracrRNA-Cas9 ribonucleoproteína (RNP) en cigotos de ratón14 se ha vuelto popular. Recientemente, se han generado ratones knock-in con alta eficiencia mediante la introducción del crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP y ADN del donante en ambos pronúcleos de cigotos de ratón en una fase del ciclo celular donde es más probable que ocurraknock-in 15. Por lo tanto, el presente protocolo describe técnicas para producir varios tipos de ratones knock-in por este método.
Hay muchas cepas endogámicas útiles de ratones de laboratorio16. La modificación genética dentro del fondo endogámico puede ignorar la influencia de los antecedentes genéticos en el fenotipo. Este artículo describe un método para inducir mutaciones en el virus del cassette knock-in y floxed en el cigoto de la línea de ratones endogámicos más utilizada, la C57BL/6J17. Además, también se discute la línea de tiempo para la generación de ratones modificados genéticamente y las técnicas periféricas utilizadas, incluida la inducción de la superovulación y la transferencia de embriones.
Protocol
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo humanamente con la aprobación del Comité Institucional de Experimentación Animal de la Universidad de Tsukuba, de acuerdo con el Reglamento para Experimentos con Animales de la Universidad de Tsukuba y las Directrices fundamentales para la realización adecuada de experimentos con animales y actividades relacionadas en instituciones de investigación académica bajo la jurisdicción del Ministerio de Educación. Cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón. Se utilizaron ratones C57BL/6J de ambos sexos, de 10 a 25 semanas de edad, como donante de cigoto. Se utilizaron ratones ICR (mayores de 10 semanas) como ratones receptores. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales).
1. Confirmación de la actividad de escisión del ARNcr en un sistema libre de células
- Disuelva 2 nmol de crRNA (seco) y 20 nmol de tracrRNA (seco) en 25 μL y 250 μL de agua libre de RNasa, respectivamente (ver Tabla de materiales).
NOTA: Las secuencias objetivo CRISPR que se predijo que tendrían una alta actividad de escisión y el menor número posible de objetivos fuera de lugar se seleccionan utilizando CRISPOR (consulte la Tabla de materiales). En el caso de la llamada de casete de genes, dirija la secuencia a través del sitio de inserción. Los exones a floxar se seleccionaron utilizando el KOnezumi (ver Tabla de materiales). - Amplificar el fragmento de ADN (aproximadamente 0,5-1 kb) que contiene el sitio diana mediante PCR genómica9. Purifice este amplicón de PCR con el kit de extracción de productos de PCR común (consulte la Tabla de materiales).
- Preparar 10 μL de mezcla CRISPR (100 ng/μL de crRNA, 150 ng/μL de tracrRNA y 1 ng/μL de Cas9 en el Tampón de reacción de nucleasa Cas9, ver Tabla de materiales). Para construir el complejo CRISPR-Cas9, coloque la mezcla CRISPR en un bloque de calor a 37 °C durante 30 min.
- Añadir el volumen total (10 μL) de la mezcla CRISPR al producto de PCR (10 μL, 20 ng/μL) descrito en la etapa 1.2 e incubar a 37 °C durante 1 h. Añadir 1 μL de RNasa (500 ng/μL) para degradar el ARNcr y el ARNc a 37 °C durante 30 min, ya que los ARN deben estar ausentes durante la electroforesis. Realizar electroforesis de las muestras anteriores utilizando colorante de carga que contenga dodecil sulfato de sodio (2% p/v).
NOTA: En casos raros, se observan ARNcr sin actividad de escisión. En tales casos, se recomienda rediseñar el diseño de edición del genoma.
2. Preparación de la mezcla de crRNA, tracrRNA, proteína Cas9 y ADN del donante para microinyección de cigoto
- Preparar la solución CRISPR (50 ng/μL de crRNA, 200 ng/μL de tracrRNA y 200 ng/μL de Cas9 en agua libre de RNasa). Preparar una solución de ADN del donante (20 ng/μL de vector de ADN plásmido autoconstruido).
- Filtrar la solución de ADN del donante a través de un filtro de jeringa estéril con un tamaño de poro de 0,22 μm. Mezcle volúmenes iguales de solución CRISPR y solución de ADN de donante filtrada. Asegúrese de que la concentración final de cada uno sea de 25 ng/μL de crRNA, 100 ng/μL de tracrRNA, 100 ng/μL de Cas9 y 10 ng/μL de ADN del donante. Esta mezcla se denominará en lo sucesivo RNPD.
NOTA: Al cortar dos sitios, como durante la producción de ratones floxados, la concentración de cada crRNA debe ser de 25 ng / μL. El ADN del donante es un ADN plásmido circular y se puede purificar con un kit común de mini columna de centrifugado de preparación (consulte la Tabla de materiales). La solución preparada debe colocarse en hielo y utilizarse para microinyección lo antes posible.
- Filtrar la solución de ADN del donante a través de un filtro de jeringa estéril con un tamaño de poro de 0,22 μm. Mezcle volúmenes iguales de solución CRISPR y solución de ADN de donante filtrada. Asegúrese de que la concentración final de cada uno sea de 25 ng/μL de crRNA, 100 ng/μL de tracrRNA, 100 ng/μL de Cas9 y 10 ng/μL de ADN del donante. Esta mezcla se denominará en lo sucesivo RNPD.
3. Obtención de cigotos de ratones por apareamiento natural
- Inyecte 5 UI de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG, ver Tabla de materiales) por vía subcutánea en ratones hembra C57BL / 6J (10-25 semanas de edad) 3 días antes de la microinyección. Aproximadamente 46-48 h más tarde, administrar 5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG, ver Tabla de materiales) por vía intraperitoneal. Co-aloje los ratones hembra tratados con PMSG y hCG con ratones machos C57BL / 6J y verifique los tapones vaginales a la mañana siguiente.
NOTA: Se pueden obtener aproximadamente 15-25 cigotos de un ratón hembra C57BL/6J. La línea de tiempo se muestra en la figura 1. - Prepare dos placas de Petri de 35 mm para el cultivo de cigoto, como se muestra en la Figura 2. Colóquelos en la incubadora (37 °C, 5%CO2) hasta su uso. Estos se pueden almacenar durante la noche.
- Eutanasia a los ratones hembra con tapones vaginales confirmados por dislocación cervical y, usando tijeras pequeñas, incidir a través de la piel abdominal y la capa muscular desde la línea media de la parte inferior del abdomen hasta debajo de las costillas.
NOTA: Siga las recomendaciones del comité local de ética animal para la eutanasia. - Recoja los oviductos y colóquelos en una gota de 20 μL de medio M2 que contenga 0,75 mg/ml de hialuronidasa (ver Tabla de materiales) en la tapa de la placa de Petri. Recoger un oviducto con pinzas de punta fina y perfundir unos 50 μL de medio M2 con hialuronidasa a través de las fimbrias.
NOTA: En este momento, los cigotos están vagamente rodeados por numerosas células cúmulos. - Después de 30 s, recoger cigotos morfológicamente normales con una pequeña cantidad de medio usando un capilar de vidrio y lavarlos transfiriéndolos a gotas medianas M16 frescas. Transfiera los cigotos lavados a una placa de Petri (Figura 2) para su agrupación.
NOTA: La línea de tiempo se muestra en la figura 1. Los cigotos morfológicamente normales tienen un pronúcleo masculino y femenino y dos cuerpos polares que no han comprometido severamente la forma esférica15. La morfología del cigoto varía considerablemente entre cepas y especies. - Repita los pasos 3.3 y 3.4 hasta que se recuperen todos los cigotos. Alrededor de 100 cigotos se pueden agrupar en una gota M16 en el plato de cultivo. Conservar el plato en la incubadora (37 °C, 5%CO2) hasta la microinyección.
4. Preparación de la aguja de microinyección
- Tire de algunas pipetas de vidrio con el extractor de pipetas programable (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Las agujas de microinyección deben tener una punta delgada y una conicidad larga. Si el extractor tiene un programa para hacer agujas para la inyección intracitoplasmática de espermatozoides, el mismo programa se puede usar para hacer agujas para microinyección. - Rompa la punta de la aguja de microinyección golpeando la bola de vidrio unida a la punta de microforja. Asegúrese de que el tamaño de la punta de la aguja de microinyección sea de aproximadamente 1 μm de diámetro. Verifique el tamaño de la punta bajo un microscopio con un aumento de 1000x.
- Doble la aguja de microinyección a unos 2-3 mm de la punta con una microforja.
NOTA: El ángulo de la curvatura depende de la configuración del micromanipulador. Demasiada flexión reducirá la efectividad del pulso piezoeléctrico.
5. Microinyección de cigoto
- Inyecte 1-1,5 cm del líquido de operación (cuerpo de inercia que se necesita para que el efecto piezoeléctrico haga agujeros como alternativa al mercurio, consulte la Tabla de materiales) en el centro de la aguja de microinyección y conéctelo al soporte del microinyector manual con el actuador piezoeléctrico.
- Además, fije la aguja de sujeción al soporte del microinyector manual opuesto. Mueva el líquido de operación a la punta de la aguja de microinyección con presión gradual. Fije los dos soportes del microinyector manual en el micromanipulador.
NOTA: El líquido de operación que sale de la punta de la aguja de microinyección se puede observar bajo un microscopio con un aumento de 50x. Después de ajustar la cantidad de líquido emitido, se puede observar la salpicadura de líquido cuando se aplican los pulsos piezoeléctricos, confirmando que los pulsos piezoeléctricos son efectivos. Si esto no se puede confirmar, vuelva a preparar la aguja de microinyección.
- Además, fije la aguja de sujeción al soporte del microinyector manual opuesto. Mueva el líquido de operación a la punta de la aguja de microinyección con presión gradual. Fije los dos soportes del microinyector manual en el micromanipulador.
- Prepare una cámara de inyección con tres gotas: (1) 10 μL de medio M2; (2) 5 μL de polivinilpirrolidona (PVP) al 12% en medio M2; y (3) una mezcla de 5 μL de ARNcr, ARNtra, proteína Cas9 y la solución de ADN del donante (RNPD). Cubra las gotitas con aceite mineral de la misma manera que el paso 3.2 y coloque la cámara de inyección en la etapa del microscopio invertido.
- Bajo el microscopio invertido con un aumento de 50x, baje la pipeta de microinyección hasta la caída de PVP al 12%. Aspire y dispense PVP al 12% para limpiar el interior de la punta de la aguja de microinyección y transferirla a la gota de RNPD.
- Coloque el microinyector manual bajo presión negativa y aspire la solución de RNPD en la aguja de microinyección. Espere unos minutos hasta que se aspire un volumen suficiente; Bajo un microscopio ampliado 50x, llene todo el interior de la aguja de microinyección con líquido.
- Detenga la ingesta y permita que la solución de RNPD sea expulsada gradualmente ajustando el microinyector manual a presión positiva. Mueva la punta de la aguja de microinyección en el aceite.
NOTA: Gire la perilla del microinyector manual en sentido contrario a las agujas del reloj para inhalarlo. Para detener la inhalación, gire la perilla en el sentido de las agujas del reloj y aumente gradualmente la presión mientras observa bajo un microscopio. La solución de RNPD se drenará gradualmente. El movimiento del nivel de líquido en la aguja de microinyección permite confirmar el flujo de salida.
- Detenga la ingesta y permita que la solución de RNPD sea expulsada gradualmente ajustando el microinyector manual a presión positiva. Mueva la punta de la aguja de microinyección en el aceite.
- Coloque 50 cigotos en la gota M2 y baje suavemente la pipeta de retención en la misma gota. Transfiera la aguja de microinyección a la gota M2 que contiene cigotos. Cambie a un objetivo de 20x y concéntrese en la punta de la pipeta de microinyección.
NOTA: Ponga tantos cigotos que se puedan inyectar en 10 min. - Sostenga un cigoto y concéntrese en el pronúcleo moviendo el micromanipulador. Inserte la aguja de microinyección en el cigoto y acerque la punta al pronúcleo. Una vez que la punta llegue a la membrana del pronúcleo, aplique el pulso piezoeléctrico (intensidad: 6-10, velocidad: 1) para perforar.
- Cuando la aguja de microinyección perfore el pronúcleo, inyecte la solución de RNPD y observe la hinchazón del pronúcleo. Una vez que el pronúcleo esté completamente inflado, saque rápidamente la aguja. Realice el mismo procedimiento tanto en el pronúcleo femenino como en el masculino.
NOTA: La inflación del pronúcleo por inyección se puede ver claramente bajo el microscopio. El grado de esta inflación es difícil de verbalizar, pero puede confirmarse remitiéndose a informes anteriores15.
- Cuando la aguja de microinyección perfore el pronúcleo, inyecte la solución de RNPD y observe la hinchazón del pronúcleo. Una vez que el pronúcleo esté completamente inflado, saque rápidamente la aguja. Realice el mismo procedimiento tanto en el pronúcleo femenino como en el masculino.
- Mueva el cigoto inyectado a otra ubicación dentro de la gota M2 para identificar los cigotos antes y después de la inyección.
- Repita los pasos 5.5-5.6 hasta que se hayan inyectado todos los cigotos de la gota M2. Después de la inyección, transfiera los cigotos a un plato fresco M16.
- Seleccione los cigotos sobrevivientes 10 min después de la inyección. Retire los cigotos lisados que están dañados por la inyección y distribuya los cigotos sobrevivientes a cada gota en el plato M16. Cada gota debe contener 20-24 cigotos para una mujer pseudoembarazada. Esto reduce el tiempo que la placa M16 está expuesta al ambiente fuera de la incubadora durante la transferencia de embriones.
NOTA: En condiciones óptimas de inyección, la tasa de supervivencia es del 90% -95%. Esto depende del tamaño de la punta de la aguja, la fuerza del pulso piezoeléctrico y la presión de salida de la solución RNPD.
6. Transferencia de embriones al oviducto
- Para obtener ratones pseudopreñados, aparee a cada ratón ICR hembra en la fase de proestro con un ratón ICR macho vasoligado. Revise los enchufes al día siguiente.
NOTA: Se obtienen aproximadamente 15 ratones pseudopreñados de 20 parejas de apareamiento. - Administrar tres tipos de agentes anestésicos mixtos (0,2 mg/kg de medetomidina, 4,0 mg/kg de midazolam y 2,5 mg/kg de butorfanol, ver Tabla de materiales) por vía subcutánea a los ratones hembra pseudopreñados. Confirmar la anestesia adecuada mediante una disminución de la frecuencia respiratoria y la desaparición de los reflejos de extracción del pedal de pellizco de la cola y de las extremidades posteriores. Aplique ungüento oftálmico para lubricar los ojos según las recomendaciones del comité local de ética animal.
- Después de afeitarse la región dorsal del ratón en posición prona y desinfectar el área quirúrgica tres veces, alternando entre un exfoliante a base de yodo o clorhexidina y alcohol, incise la piel dorsal aproximadamente 1 cm a lo largo de la columna vertebral con pequeñas tijeras de disección.
- Cambie la herida de la incisión dorsal hacia un lado ventralmente, incise la capa muscular a través de la cual se puede ver el ovario, agarre la grasa por encima del ovario con pinzas y retire el ovario, el oviducto y el útero.
- Asegure la grasa con una abrazadera de serrefinamiento (consulte la Tabla de materiales). Coloque los tejidos reproductivos en una gasa estéril para evitar el contacto directo con la capa.
- En el siguiente orden, coloque una pequeña cantidad de medio de cultivo (M2 o M16), algunas burbujas de aire como marcador y los cigotos en una pipeta para la transferencia.
NOTA: Transfiera aproximadamente 10-12 cigotos por oviducto. - Haga una incisión con un microcizallamiento (consulte la Tabla de materiales) entre la ampolla y las fimbrias del oviducto (el tiempo suficiente para permitir que entre la pipeta de vidrio), introduzca los cigotos en la incisión y, simultáneamente, confirme que se ha introducido la burbuja de aire.
- Realizar la implantación en el otro oviducto de forma similar (paso 6.6).
- Suturar la piel externa con autoclips (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: No suture la capa muscular incisa a menos que la herida de la incisión sea inevitablemente grande. El tamaño ideal de la capa muscular incisa debe ser inferior a 2-3 mm. Si la incisión es mayor de 5 mm, la capa muscular debe suturarse con una aguja de sutura esterilizada e hilo (consulte la Tabla de materiales).
7. Recuperación de animales
- Administrar clorhidrato de atipamezol (0,3 mg/kg) por vía subcutánea a ratones.
NOTA: Siga las recomendaciones del comité local de ética animal para la analgesia postoperatoria. - Luego, coloque los ratones en jaulas y manténgalos calientes en una placa caliente a 37 ° C.
- Después de despertar a los ratones, manténgalos calientes durante aproximadamente 2 h. Después de confirmar que no hay un comportamiento anormal de los ratones, devuelva las jaulas al estante de reproducción.
Representative Results
Los resultados de producción de ratones con llave de genes knock-in y floxed utilizando este protocolo se muestran en la Tabla 1 y la Tabla 2. Los genes objetivo no se indicaron porque cada línea de ratón editada por el genoma se está utilizando actualmente en un proyecto independiente e inédito. En cambio, se describieron las regiones cromosómicas objetivo.
Los análisis de genotipado fueron realizados utilizando un método previamente reportado18. En este método de genotipado, los ratones en los que el ADN del donante se inserta en sitios cromosómicos no deseados no se cuentan como individuos positivos, incluso si se induce la edición del genoma deseada. Por lo tanto, se demostró la eficiencia de producción de los ratones fundadores que son realmente útiles para fines reales, en lugar de la eficiencia de la edición del genoma en sí.
La mediana de la eficiencia de producción de 13 ratones knock-in de casete de genes independientes fue del 20,8%, con un máximo del 39,5% y un mínimo del 7,9% (Tabla 1). Esta eficiencia se consideró suficientemente práctica. Los genes embrionarios letales no fueron atacados durante el golpe del casete de genes. La mediana de la tasa de natalidad bajo esta condición no letal dirigida a genes fue del 34,0% (máximo 43,3% y mínimo 15,9%). Dado que esto es comparable a la tasa de natalidad en la transferencia de embriones sin manipulación genética, consideramos que era poco probable que la toxicidad de los elementos de edición del genoma introducidos y el daño físico de la microinyección de cigoto afectaran el desarrollo embrionario.
La mediana de eficiencia de producción de los 10 ratones floxed independientes fue del 7,7%, con un máximo de 20,7% y un mínimo de 2,1% (Tabla 2). Aunque se desconocían las funciones de varios genes diana, la mediana de la tasa de natalidad fue del 30,2%, con un máximo del 43,8% y un mínimo del 17,3%. Esta tasa fue comparable a la de los ratones knock-in de casete de genes, lo que sugiere que la operación de microinyección tiene un efecto insignificante en el desarrollo embrionario de ratones floxados.
Figura 1: Cronología de la microinyección de cigoto. El color blanco y oscuro muestra el ciclo de luz y oscuridad, respectivamente. Los ratones se mantuvieron bajo un ciclo de luz de 14 h / 10 h de oscuridad. PMSG: gonadotropina sérica de yegua embarazada; hCG: gonadotropina coriónica humana Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación de platos de cultivo. (A) Plato de cultivo para los cigotos antes de la inyección. Coloque dos gotas de medio M16 (20-25 μL para cada una) en una placa de Petri de plástico de 35 mm. (B) Plato de cultivo para los cigotos después de la inyección. Coloque 10 gotas (10-20 μL por cada gota) de M16 en una placa de Petri de plástico de 35 mm. Las gotas se cubren con aceite mineral (3 mL). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Región cromosómica objetivo | Número de | Longitud de inserción de knock-in (kb) | Longitud del brazo de homología (kb) | ||||||
| Embriones | Recién nacidos | Examinado (destete) | Knock-in sin rTG | rTGc | |||||
| Inyectado | Transferido | Brazo de 5' | Brazo de 3' | ||||||
| 2qE2 | 349 | 331 | 114 (34,4%)a | 114 | 9 (7,9%)b | 5 (4,4%)d | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 2qE2 | 231 | 215 | 78 (36,3%)a | 74 | 15 (20,3%)b | 23 (31,1%)d | 2.2 | 1.0 | 1.1 |
| 5qG2 | 288 | 262 | 90 (34,4%)a | 81 | 19 (23,5%)b | 18 (22,2%)d | 1.6 | 2.0 | 2.0 |
| 6qB1 | 278 | 259 | 58 (22,4%)a | 46 | 11 (23,9%)b | 11 (23,9%)d | 4.2 | 1.2 | 1.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 295 | 277 | 97 (35,0%)a | 23 | 2 (8,7%)b | 4 (17,4%)d | 6.5 | 1.1 | 3.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 246 | 219 | 87 (39,7%)a | 83 | 22 (26,5%)b | 18 (21,7%)d | 5.8 | 1.1 | 3.0 |
| 7qF5 | 279 | 268 | 116 (43,3%)a | 114 | 45 (39,5%)b | 44 (38,6%)d | 1.4 | 3.1 | 1.0 |
| 11qB4 | 405 | 353 | 56 (15,9%)a | 47 | 8 (17,0%)b | 12 (25,5%)d | 1.7 | 1.0 | 0.8 |
| 11qD | 310 | 294 | 100 (34,4%)a | 98 | 15 (15,3%)b | 76 (77,6%)d | 1.0 | 1.8 | 2.4 |
| 12qE | 368 | 320 | 86 (26,9%)a | 84 | 12 (14,3%)b | 19 (22,6%)d | 3.4 | 1.1 | 1.3 |
| 12qF1 | 315 | 265 | 76 (28,7%)a | 72 | 17 (23,6%)b | 28 (38,9%)d | 1.0 | 1.1 | 1.1 |
| 14qE5 | 256 | 215 | 48 (22,3%)a | 48 | 11 (22,9%)b | 21 (43,8%)d | 3.1 | 1.0 | 0.9 |
| 14qE5 | 287 | 285 | 85 (29,8%)a | 72 | 15 (20,8%)b | 19 (26,4%)d | 2.6 | 1.0 | 0.9 |
Tabla 1: Producción de ratones knock-in por microinyección. La tabla muestra la tasa de natalidad y la eficiencia de producir ratones que portan el alelo knock-in previsto sin (W/O) integración aleatoria (rTG) del ADN del donante. Fue posible obtener ratones con el alelo knock-in previsto en todos los proyectos. a: Número de recién nacidos/Número de embriones transferidos; b: Número de alelos knock-in portadores de ratones/número de ratones examinados; C: no es seguro si hay un alelo previsto; d: Número de alelos rTG portadores/número de ratones examinados; rTG: integración aleatoria del vector donante. W/O: sin.
| Región cromosómica objetivo | Número de | Longitud floxed (KB) | Longitud del brazo de homología (kb) | |||||
| Embriones | Recién nacidos | Examinado (destete) | floxed W/O rTG | |||||
| Inyectado | Transferido | Brazo de 5' | Brazo de 3' | |||||
| 3qC | 325 | 313 | 93 (29,7%)a | 87 | 9 (10,3%)b | 1.3 | 1.2 | 1.1 |
| 4qB1 | 210 | 200 | 36 (18,0%)a | 29 | 6 (20,7%)b | 1.6 | 1.2 | 0.9 |
| 4qC4 | 272 | 256 | 112 (43,8%)a | 100 | 5 (5,0%)b | 2.4 | 1.0 | 1.4 |
| 5qF | 143 | 137 | 40 (29,2%)a | 40 | 6 (15,0%)b | 1.8 | 1.0 | 1.1 |
| 5qF | 255 | 227 | 80 (35,2%)a | 76 | 2 (2,6%)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 9qE3.1 | 289 | 261 | 80 (30,7%)a | 77 | 9 (11,7%)b | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| 10qB3 | 284 | 269 | 88 (32,7%)a | 78 | 3 (3,8%)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 10qC1 | 243 | 231 | 40 (17,3%)a | 38 | 4 (10,5%)b | 2.1 | 1.0 | 1.3 |
| 14qE5 | 390 | 372 | 139 (37,4%)a | 135 | 5 (3,7%)b | 1.1 | 0.8 | 0.9 |
| 17qA3.3 Español | 383 | 374 | 99 (26,5%)a | 95 | 2 (2,1%)b | 2.1 | 0.6 | 0.8 |
Tabla 2: Producción de ratones floxed por microinyección. La tabla muestra la tasa de natalidad y la eficiencia de producir ratones que portan el alelo flox deseado sin (W/O) integración aleatoria (rTG) del ADN del donante. Fue posible obtener ratones con el alelo flox deseado en todos los proyectos. a: Número de recién nacidos/número de embriones transferidos; B: número de ratones portadores de alelo flox/número de ratones examinados. rTG: integración aleatoria de o vector donante; W/O: sin.
Discussion
En el presente estudio, se utilizaron cigotos de ratón C57BL / 6J frescos (no congelados-descongelados), obtenidos del apareamiento natural, para la producción de ratones de edición del genoma. Al inyectar crRNA-tracrRNA-Cas9 y ADN del donante (RNPD) en ambos pronúcleos de estos cigotos en una fase del ciclo celular donde es más probable que ocurra knock-in, se generaron ratones knock-in y floxed con una alta tasa de natalidad y suficiente eficiencia de edición del genoma. El estudio actual refuerza la extensibilidad del método SPRINT-CRISPR15, donde garantiza una eficiencia de knock-in suficiente incluso en el fondo genético C57BL / 6J, y se puede aplicar a la producción de ratones floxed.
La electroporación es un método altamente generalizado de producción de ratones editados por genoma debido al bajo costo de los dispositivos experimentales y la facilidad de aprendizaje de la técnica8. Además, el método i-GONAD19, en el que la edición del genoma se realiza con embriones preimplantacionales existentes en el oviducto, no requiere un ratón receptor. En comparación con estos métodos, el método actual presentado aquí es costoso y requiere mucho tiempo cuando se prepara y mantiene un entorno experimental en términos de hardware y software. Sin embargo, una vez que se establecen las instalaciones experimentales, se pueden producir ratones complejos de cassette y floxed con solo elementos CRISPR disponibles comercialmente (crRNA, tracrRNA y proteína Cas9) y una cantidad simple y pequeña de vector plásmido circular para ser utilizado como ADN del donante. Esto significa que se pueden producir muchas líneas complejas de ratón editadas por el genoma sin la necesidad de lsODN 5,6 o vectores de virus adenoasociados20 que consumen mucho tiempo (o relativamente caros) para prepararse.
A diferencia del método SPRINT-CRISPR original15, se utilizaron cigotos frescos (congelados-descongelados). Al obtener cigotos frescos por apareamiento natural, se pueden ignorar los errores técnicos que pueden ocurrir durante la fertilización in vitro o la congelación y descongelación. Además, el proceso de manipulación del embrión se puede completar en aproximadamente medio día (Figura 1) siguiendo el enfoque actual. Por otro lado, algunas limitaciones del método actual incluyen el requisito de muchos ratones machos, el control laxo del momento de la fertilización y la capacidad limitada para predecir completamente el número de cigotos para la microinyección. En comparación con el método SPRINT-CRISPR original, este método puede tener una tasa de natalidad más alta (Tabla 1). A pesar de esto, no se puede concluir que el método actual sea mejor en términos de tasa de natalidad debido a las diferencias en los conductores del experimento, los genes objetivo, los antecedentes genéticos y el momento de la confirmación del embrión.
Como se muestra en la Tabla 1, un gran número de ratones en la mayoría de los proyectos de knock-in de casetes de genes tenían alelos de integración aleatorios. La integración aleatoria debe eliminarse porque puede conducir a la interrupción involuntaria de genes endógenos y la expresión ectópica de transgenes. El desafío para el futuro es encontrar condiciones experimentales que reduzcan el número de eventos de integración aleatorios mientras se mantiene una eficiencia de knock-in suficiente.
Casi toda la edición del genoma del cigoto del ratón utilizando efectores de edición del genoma que resultan en roturas de doble cadena de ADN es probable que induzca mutaciones no intencionales en los sitios objetivo 9,21. Los resultados de estas mutaciones no deseadas en el objetivo no se describen aquí porque no estamos en una situación en la que la próxima generación de ratones pueda ser manejada para presentar evidencia clara de ellas. La mejor manera de descartar la preocupación de confusión causada por la mutagénesis no intencional en el objetivo es obtener la próxima generación de ratones apareando a los fundadores con ratones de tipo salvaje en lugar de cruzar a los fundadores. En principio, los ratones N1 resultantes de este cruce son de tipo salvaje (WT) en un lado del alelo, por lo que si se detecta el alelo knock-in (KI) previsto, son heterocigotos WT/KI. Por lo tanto, la mutagénesis en el objetivo no es un problema crítico en el ratón de laboratorio, que tiene un ciclo de vida relativamente rápido y es un animal prolífico. Sin embargo, será necesario mejorar aún más cuando esta tecnología se aplique a mamíferos relativamente grandes.
Se ha confirmado que esta tecnología puede producir ratones knock-in de casete de genes en cepas endogámicas distintas de C57BL / 6J, pero no se asegura un número suficiente de proyectos y los datos son muy variables. Por esta razón, esta información no se incluye en el presente estudio. Se cree que serán necesarios más estudios sobre este tema para avanzar en la genética del ratón y la investigación de modelos de enfermedades.
Disclosures
Los autores no han declarado ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por Investigación Científica (B) (19H03142: a SM), Investigación Científica (A) (20H00444: a FS), Investigación Científica (A) (21H04838: a SM) e Investigación Científica en Áreas Innovadoras "Plataforma de Apoyo a Modelos Animales Avanzados" (16H06276: a ST) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Agradecemos a Ryoichi Mori por su útil discusión sobre el diseño de edición del genoma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | - | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | - | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | - | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | - | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | - | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | - | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | - | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | - | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | - |
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