Summary
Denne protokol beskriver zygote mikroinjektion af CRISPR-Cas9 og donor-DNA for effektivt at producere genkassetteknock-in og floxede mus.
Abstract
CRISPR-Cas-teknologien har muliggjort hurtig og ubesværet generering af genetisk modificerede mus. Specifikt produceres mus og punktmutante mus let ved elektroporation af CRISPR-faktorer (og enkeltstrengede oligo-DNA-donorer) i zygoten. I modsætning hertil genereres genkassette (>1 kb) knock-in og floxede mus hovedsageligt ved mikroinjektion af CRISPR-faktorer og dobbeltstrengede DNA-donorer i zygoter. Genomredigeringsteknologier har også øget fleksibiliteten i produktionen af genetisk modificerede mus. Det er nu muligt at introducere de tilsigtede mutationer i målgenomområderne i en række gavnlige indavlede musestammer. Vores team har produceret over 200 genkassette knock-in muselinjer og over 110 floxed muselinjer ved zygote mikroinjektion af CRISPR-Cas9 efter anmodninger fra flere lande, herunder Japan. Nogle af disse genomredigeringer brugte BALB / c, C3H / HeJ og C57BL / 6N indavlede stammer, men mest brugte C57BL / 6J. I modsætning til elektroporationsmetoden er genomredigering ved zygotemikroinjektion i forskellige indavlede stammer af mus ikke så let. Genkassette knock-in og floxed mus på enkelt indavlede genetiske baggrunde er imidlertid lige så kritiske som genetisk humaniserede, fluorescerende reporter og betingede knockout-musemodeller. Derfor præsenterer denne artikel protokollen for zygotemikroinjektion af CRISPR-faktorer og dobbeltstrengede DNA-donorer i C57BL/6J-mus til generering af genkassetteknock-in og floxede mus. Denne artikel fokuserer udelukkende på nuklear injektion snarere end cytoplasmatisk injektion. Ud over zygote mikroinjektion skitserer vi tidslinjen for produktionsprocessen og perifere teknikker såsom induktion af superovulation og embryooverførsel.
Introduction
Knock-in-mus, hvor de tilsigtede eksogene gener introduceres på målstedet, anvendes i vid udstrækning i mange in vivo-undersøgelser som genhumaniserede mus, fluorescerende reportermus og Cre-drivermus 1,2. Når knock-in-mutationer induceres ved genomredigering i musezygoter, anvendes enkeltstrenget DNA (enkeltstrengede oligo-DNA-donorer, ssODN) eller dobbeltstrenget DNA (dsDNA) som donor-DNA 2,3. ssODN bruges hovedsageligt til at banke relativt korte genfragmenter på mindre end 200 bp4 ind. Det er muligt at banke fragmenter længere end 1 kb DNA ved hjælp af lange ssODN'er (lsODN)5,6, men deres forberedelse er tidskrævende. Når dsDNA-donorer anvendes, kan genkassette (>1 kb) knock-in-mus genereres uden besværlig donor-DNA-forberedelse7.
Den største fordel ved at bruge ssODN'er er, at elektroporation8 kan generere knock-in mus. Imidlertid skal dsDNA-donorer indføres direkte i kernen ved zygote mikroinjektion. Samtidig knock-in på to steder er nødvendig for at skabe floxed mus, hvor hver loxP-sekvens bankes ind opstrøms og nedstrøms for målgenet. Der er to måder at generere floxede mus ved genomredigering i musezygoter - ved hjælp af to uafhængige ssODN'er, der hver bærer et enkelt loxP-sted eller bruger et enkelt dsDNA (eller lsDNA) med en floxed sekvens; Førstnævnte er meget ineffektiv 9,10,11. Genomredigering ved hjælp af dsDNA-donorer er den enkleste tilgang til at producere genkassetteknock-in og floxede mus, hvis miljøet er befordrende for zygotemikroinjektion.
Indledningsvis anvendes blandinger af Cas9 mRNA og sgRNA eller DNA-vektorer, der koder for sgRNA og Cas9, til genomredigering i musezygoter12,13. Da stabile Cas9-proteiner af høj kvalitet nu er tilgængelige til en lav pris, er introduktionen af crRNA-tracrRNA-Cas9 ribonukleoprotein (RNP) i musezygoter14 blevet populær. For nylig er knock-in-mus blevet genereret med høj effektivitet ved at indføre crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP og donor-DNA i begge pronuclei af musezygoter i en cellecyklusfase, hvor knock-in mest sandsynligt forekommer15. Derfor beskriver denne protokol teknikker til fremstilling af forskellige typer knock-in-mus ved denne metode.
Der er mange nyttige indavlede stammer af laboratoriemus16. Gensplejsning inden for den indavlede baggrund kan se bort fra den genetiske baggrunds indflydelse på fænotypen. Denne artikel beskriver en metode til at inducere genkassette knock-in og floxed mutationer i zygoten af den mest almindeligt anvendte indavlede muselinje, C57BL/6J17. Endvidere diskuteres tidsplanen for generering af genetisk modificerede mus og de anvendte perifere teknikker, herunder induktion af superovulation og embryooverførsel.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført humant med godkendelse fra Institutional Animal Experiment Committee ved University of Tsukuba i henhold til reglerne for dyreforsøg ved University of Tsukuba og de grundlæggende retningslinjer for korrekt gennemførelse af dyreforsøg og relaterede aktiviteter i akademiske forskningsinstitutioner under undervisningsministeriets jurisdiktion, Kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan. C57BL/6J-mus af begge køn, 10-25 uger gamle, blev brugt som zygotedonor. ICR-mus (ældre end 10 uger) blev brugt som modtagermus. Musene blev hentet fra kommercielle kilder (se materialetabel).
1. Bekræftelse af crRNA-spaltningsaktivitet i et cellefrit system
- Opløs 2 nmol crRNA (tør) og 20 nmol tracrRNA (tør) i henholdsvis 25 μL og 250 μL RNasefrit vand (se materialetabel).
BEMÆRK: CRISPR-målsekvenser, der blev forudsagt at have høj spaltningsaktivitet og så få off-targets som muligt, vælges ved hjælp af CRISPOR (se materialetabel). I tilfælde af genkassette knock-in skal sekvensen målrettes på tværs af indsættelsesstedet. Den eller de exoner, der skal floxes, blev valgt ved hjælp af KOnezumi (se materialetabel). - DNA-fragmentet (ca. 0,5-1 kb), der indeholder målstedet, amplificeres ved hjælp af genomisk PCR9. Rens denne PCR-amplikon med det almindelige PCR-produktekstraktionssæt (se materialetabel).
- Forbered 10 μL CRISPR-blanding (100 ng/μL crRNA, 150 ng/μL tracrRNA og 1 ng/μL Cas9 i Cas9-nukleasereaktionsbufferen, se materialetabel). For at konstruere CRISPR-Cas9-komplekset anbringes CRISPR-blandingen i en varmeblok ved 37 °C i 30 minutter.
- Det totale volumen (10 μL) CRISPR-blanding tilsættes PCR-produktet (10 μL, 20 ng/μL) beskrevet i trin 1.2, og inkuberes ved 37 °C i 1 time. Der tilsættes 1 μL RNase (500 ng/μL) for at nedbryde crRNA og tracrRNA ved 37 °C i 30 minutter, da RNA'er skal være fraværende under elektroforese. Udfør elektroforese af ovennævnte prøver ved hjælp af påfyldningsfarvestof indeholdende natriumdodecylsulfat (2% w / v).
BEMÆRK: I sjældne tilfælde observeres crRNA'er uden spaltningsaktivitet. I sådanne tilfælde anbefales det at redesigne genomredigeringsdesignet.
2. Fremstilling af blandingen af crRNA, tracrRNA, Cas9-protein og donor-DNA til zygotmikroinjektion
- Forbered CRISPR-opløsning (50 ng/μL crRNA, 200 ng/μL tracrRNA og 200 ng/μL Cas9 i RNasefrit vand). Der fremstilles en donor-DNA-opløsning (20 ng/μL selvkonstrueret plasmid-DNA-vektor).
- Donor-DNA-opløsningen filtreres gennem et sterilt sprøjtefilter med en porestørrelse på 0,22 μm. Bland lige store mængder CRISPR-opløsning og filtreret donor-DNA-opløsning. Sørg for, at den endelige koncentration af hver er 25 ng/μL crRNA, 100 ng/μL tracrRNA, 100 ng/μL Cas9 og 10 ng/μL donor-DNA. Denne blanding vil i det følgende blive benævnt RNPD.
BEMÆRK: Ved skæring af to steder, f.eks. under produktion af floxede mus, skal koncentrationen af hvert crRNA være 25 ng/μL. Donor-DNA'et er et cirkulært plasmid-DNA og kan renses med et almindeligt mini prep spin-søjlesæt (se materialetabel). Den tilberedte opløsning skal anbringes på is og anvendes til mikroinjektion så hurtigt som muligt.
- Donor-DNA-opløsningen filtreres gennem et sterilt sprøjtefilter med en porestørrelse på 0,22 μm. Bland lige store mængder CRISPR-opløsning og filtreret donor-DNA-opløsning. Sørg for, at den endelige koncentration af hver er 25 ng/μL crRNA, 100 ng/μL tracrRNA, 100 ng/μL Cas9 og 10 ng/μL donor-DNA. Denne blanding vil i det følgende blive benævnt RNPD.
3. Opnåelse af mus zygoter ved naturlig parring
- 5 IE drægtige hoppers serumgonadotropin (PMSG, se materialetabel) injiceres subkutant i C57BL/6J hunmus (10-25 uger gamle) 3 dage før mikroinjektion. Ca. 46-48 timer senere administreres 5 IE humant choriongonadotropin (hCG, se materialetabel) intraperitonealt. Co-house PMSG- og hCG-behandlede hunmus med mandlige C57BL/6J mus og tjek vaginalpropperne den følgende morgen.
BEMÆRK: Ca. 15-25 zygoter kan fås fra en hun C57BL/6J mus. Tidslinjen er vist i figur 1. - Forbered to 35 mm petriskåle til zygotekultur, som vist i figur 2. De anbringes i inkubatoren (37 °C, 5% CO2) indtil brug. Disse kan opbevares natten over.
- Aflive hunmusene med bekræftede vaginale propper ved cervikal dislokation, og skær gennem mavehuden og muskellaget fra midterlinjen i underlivet til under ribbenene ved hjælp af en lille saks.
BEMÆRK: Følg den lokale dyreetiske komités anbefalinger for aktiv dødshjælp. - Ovidukterne samles og anbringes i en dråbe på 20 μL M2 indeholdende 0,75 mg/ml hyaluronidase (se materialetabel) på petriskålens låg. Der udtages en ovidukt med pincet med fin spids og perfuserer ca. 50 μL M2-medium med hyaluronidase gennem fimbriae.
BEMÆRK: På dette tidspunkt er zygoterne løst omgivet af talrige cumulusceller. - Efter 30 s afhentes morfologisk normale zygoter med en lille mængde medium ved hjælp af en glaskapillær og vaskes ved at overføre dem til friske M16 mellemstore dråber. Overfør de vaskede zygoter til en petriskål (figur 2) til pooling.
BEMÆRK: Tidslinjen er vist i figur 1. Morfologisk normale zygoter har en mandlig og kvindelig pronucleus og to polære kroppe, der ikke alvorligt har kompromitteret den sfæriske form15. Zygotens morfologi varierer betydeligt mellem stammer og arter. - Gentag trin 3.3 og 3.4, indtil alle zygoter er hentet. Omkring 100 zygoter kan samles i en M16 dråbe i kulturskålen. Opbevar skålen i inkubatoren (37 °C, 5% CO2) indtil mikroinjektion.
4. Klargøring af mikroinjektionsnålen
- Træk i nogle glaspipetter ved hjælp af den programmerbare pipettetrækker (se materialetabellen).
BEMÆRK: Mikroinjektionsnåle skal have en tynd spids og lang tilspidsning. Hvis aftrækkeren har et program til fremstilling af nåle til intracytoplasmatisk sædinjektion, kan det samme program bruges til at fremstille nåle til mikroinjektion. - Knæk spidsen af mikroinjektionsnålen ved at ramme glaskuglen, der er fastgjort til microforge-spidsen. Sørg for, at spidsstørrelsen på mikroinjektionsnålen er omkring 1 μm i diameter. Kontroller spidsstørrelsen under et mikroskop ved 1000x forstørrelse.
- Mikroinjektionsnålen bøjes ca. 2-3 mm fra spidsen ved hjælp af en mikrosmedje.
BEMÆRK: Bøjningsvinklen afhænger af mikromanipulatorens opsætning. For meget bøjning vil reducere effektiviteten af piezopulsen.
5. Zygote mikroinjektion
- Injicer 1-1,5 cm af driftsvæsken (inertilegeme, der er nødvendig for, at piezoeffekten kan lave huller som et alternativ til kviksølv, se materialetabel) i midten af mikroinjektionsnålen og fastgør den til den manuelle mikroinjektorholder med piezoaktuatoren.
- Fastgør endvidere holdenålen til den modsatte manuelle mikroinjektorholder. Flyt driftsvæsken til mikroinjektionsnålens spids med gradvist tryk. Fastgør begge de manuelle mikroinjektorholdere på mikromanipulatoren.
BEMÆRK: Operationsvæsken, der kommer ud af spidsen af mikroinjektionsnålen, kan observeres under et mikroskop ved 50x forstørrelse. Efter justering af mængden af udsendt væske kan sprøjtning af væske observeres, når piezopulserne påføres, hvilket bekræfter, at piezopulserne er effektive. Hvis dette ikke kan bekræftes, skal mikroinjektionsnålen klargøres igen.
- Fastgør endvidere holdenålen til den modsatte manuelle mikroinjektorholder. Flyt driftsvæsken til mikroinjektionsnålens spids med gradvist tryk. Fastgør begge de manuelle mikroinjektorholdere på mikromanipulatoren.
- Forbered et injektionskammer med tre dråber: (1) 10 μL M2-medium; (2) 5 μL 12% polyvinylpyrrolidon (PVP) i M2-medium; og (3) en 5 μL blanding af crRNA, tracrRNA, Cas9-protein og donor-DNA (RNPD) opløsning. Dæk dråberne med mineralolie på samme måde som trin 3.2, og indstil injektionskammeret på det omvendte mikroskoptrin.
- Under det omvendte mikroskop ved en 50x forstørrelse sænkes mikroinjektionspipetten ned i 12% PVP-faldet. Opsug og dispenser 12% PVP for at rengøre indersiden af mikroinjektionsnålens spids og overføre den til RNPD-dråben.
- Sæt den manuelle mikroinjektor under undertryk, og sug RNPD-opløsningen op i mikroinjektionsnålen. Vent et par minutter, indtil et tilstrækkeligt volumen er aspireret; Under et mikroskop forstørret 50x, fyld hele indersiden af mikroinjektionsnålen med væske.
- Stop indtaget, og lad RNPD-opløsningen udvises gradvist ved at indstille den manuelle mikroinjektor til positivt tryk. Flyt spidsen af mikroinjektionsnålen ind i olien.
BEMÆRK: Drej knappen på den manuelle mikroinjektor mod uret for indånding. For at stoppe indånding skal du dreje knappen med uret og gradvist øge trykket, mens du observerer under et mikroskop. RNPD-opløsningen drænes gradvist. Væskeniveaubevægelse i mikroinjektionsnålen muliggør bekræftelse af udstrømningen.
- Stop indtaget, og lad RNPD-opløsningen udvises gradvist ved at indstille den manuelle mikroinjektor til positivt tryk. Flyt spidsen af mikroinjektionsnålen ind i olien.
- Sæt 50 zygoter i M2-dråben og sænk forsigtigt holdepipetten ned i den samme dråbe. Overfør mikroinjektionsnålen til M2-dråben, der indeholder zygoter. Skift til et 20x mål, og fokuser på spidsen af mikroinjektionspipetten.
BEMÆRK: Sæt så mange zygoter, der kan injiceres på 10 min. - Hold en zygote og fokuser på pronucleus ved at flytte mikromanipulatoren. Indsæt mikroinjektionsnålen i zygoten og bring spidsen tæt på pronucleus. Når spidsen når pronucleusmembranen, skal du anvende piezopulsen (intensitet: 6-10, hastighed: 1) for at gennembore.
- Når mikroinjektionsnålen punkterer pronucleus, injiceres RNPD-opløsningen og observeres hævelsen af pronucleus. Når pronucleus er helt oppustet, skal du hurtigt trække nålen ud. Udfør den samme procedure på både kvindelige og mandlige pronuclei.
BEMÆRK: Oppustningen af pronucleus ved injektion kan tydeligt ses under mikroskopet. Graden af denne inflation er vanskelig at sætte ord på, men kan bekræftes ved at henvise til tidligere rapporter15.
- Når mikroinjektionsnålen punkterer pronucleus, injiceres RNPD-opløsningen og observeres hævelsen af pronucleus. Når pronucleus er helt oppustet, skal du hurtigt trække nålen ud. Udfør den samme procedure på både kvindelige og mandlige pronuclei.
- Flyt den injicerede zygote til et andet sted i M2-dråben for at identificere zygoterne før og efter injektionen.
- Gentag trin 5.5-5.6, indtil alle zygoterne i M2-dråben er injiceret. Efter injektionen overføres zygoterne til en frisk M16-skål.
- Vælg de overlevede zygoter 10 minutter efter injektion. Fjern de lyserede zygoter, der er beskadiget af injektionen, og fordel overlevede zygoter til hver dråbe i M16-skålen. Hver dråbe skal indeholde 20-24 zygoter til en pseudogravid kvinde. Dette reducerer den tid, M16-skålen udsættes for miljøet uden for inkubatoren under embryooplægningen.
BEMÆRK: Under optimale injektionsbetingelser er overlevelsesraten 90% -95%. Dette afhænger af nålespidsens størrelse, piezopulsens styrke og RNPD-opløsningens udstrømningstryk.
6. Embryooverførsel til ovidukten
- For at opnå pseudogravide mus skal du parre hver kvindelig ICR-mus i proestrusfasen med en vasoligeret ICR-hanmus. Kontroller stikkene den følgende dag.
BEMÆRK: Ca. 15 pseudogravide mus opnås fra 20 parringspar. - Administrer tre typer blandede anæstetiske midler (0,2 mg / kg medetomidin, 4,0 mg / kg midazolam og 2,5 mg / kg butorphanol, se materialetabel) subkutant til de pseudogravide hunmus. Bekræft passende anæstesi ved et fald i respirationsfrekvensen og forsvinden af haleklemmen og bagbenets pedaludtagningsreflekser. Påfør oftalmisk salve til at smøre øjnene i henhold til lokale dyreetiske komités anbefalinger.
- Efter barbering af musens dorsale region i den udsatte position og desinfektion af det kirurgiske område tre gange, skiftevis mellem en jod- eller chlorhexidinbaseret skrubbe og alkohol, skær dorsalhuden ca. 1 cm langs rygsøjlen med en lille dissekerende saks.
- Skift det dorsale snitsår til den ene side ventralt, skær muskellaget, gennem hvilket æggestokken kan ses, tag fat i fedtet over æggestokken med pincet, og træk æggestokken, ovidukten og livmoderen tilbage.
- Fastgør fedtet med en serrefinklemme (se Materialetabel). Placer reproduktionsvævet på sterilt gasbind for at undgå direkte kontakt med pelsen.
- I følgende rækkefølge anbringes en lille mængde dyrkningsmedium (M2 eller M16), nogle luftbobler som markør og zygoterne i en pipette til overførsel.
BEMÆRK: Overfør ca. 10-12 zygoter pr. Ovidukt. - Lav et snit ved hjælp af en mikroforskydning (se materialetabel) mellem ampulla og oviduktens fimbriae (lige længe nok til at lade glaspipetten komme ind), indfør zygoterne i snittet, og bekræft samtidig, at luftboblen er blevet introduceret.
- Udfør implantationen i den anden ovidukt på samme måde (trin 6.6).
- Sutur den ydre hud med autoclips (se Tabel over materialer).
BEMÆRK: Sutur ikke det indskårne muskellag, medmindre snitsåret er uundgåeligt stort. Den ideelle størrelse af det indskårne muskellag skal være mindre end 2-3 mm. Hvis snittet er større end 5 mm, skal muskellaget sutureres ved hjælp af en steriliseret suturnål og tråd (se materialetabel).
7. Genopretning af dyr
- Atipamazolhydrochlorid (0,3 mg/kg) administreres subkutant til mus.
BEMÆRK: Følg den lokale dyreetiske komités anbefalinger for postoperativ analgesi. - Anbring derefter musene i bure og hold dem varme på en varm plade ved 37 °C.
- Når musene er vækket, skal du holde dem varme i ca. 2 timer. Efter at have bekræftet, at musene ikke har nogen unormal opførsel, skal du returnere burene til avlsstativet.
Representative Results
Produktionsresultaterne for genkassetteknock-in og floxede mus ved hjælp af denne protokol er vist i tabel 1 og tabel 2. Målgenerne blev ikke oplyst, fordi hver genomredigeret muselinje i øjeblikket bruges i et uafhængigt, upubliceret projekt. I stedet blev målkromosomregionerne beskrevet.
Genotypeanalyserne blev udført ved hjælp af en tidligere rapporteret metode18. I denne genotypemetode tælles mus, hvor donor-DNA'et indsættes i utilsigtede kromosomsteder, ikke som positive individer, selvom den ønskede genomredigering induceres. Derfor blev produktionseffektiviteten af grundlæggermusene, der virkelig er nyttige til faktiske formål, vist, snarere end effektiviteten af selve genomredigeringen.
Medianproduktionseffektiviteten for 13 uafhængige genkassette-knock-in-mus var 20,8 %, med et maksimum på 39,5 % og et minimum på 7,9 % (tabel 1). Denne effektivitet blev anset for at være tilstrækkelig praktisk. Eventuelle dødelige embryonale gener blev ikke målrettet under genkassettens knock-in. Den mediane fødselsrate under denne ikke-dødelige genmålretningstilstand var 34,0% (maksimalt 43,3% og minimum 15,9%). Da dette kan sammenlignes med fødselsraten ved embryooverførsel uden genetisk manipulation, vurderede vi, at toksiciteten af de indførte genomredigeringselementer og den fysiske skade ved zygotemikroinjektion sandsynligvis ikke ville påvirke embryonal udvikling.
Medianproduktionseffektiviteten for de 10 uafhængige floksede mus var 7,7 %, med et maksimum på 20,7 % og et minimum på 2,1 % (tabel 2). Selvom funktionerne af flere målgener var ukendte, var medianfødselsraten 30,2%, med et maksimum på 43,8% og et minimum på 17,3%. Denne hyppighed var sammenlignelig med hyppigheden af genkassettebanker, hvilket tyder på, at mikroinjektionsoperationen har en ubetydelig effekt på embryonal udvikling hos floxede mus.
Figur 1: Tidslinje for zygote mikroinjektion. Hvid og mørk farve viser henholdsvis lys og mørk cyklus. Musene blev opretholdt under en 14 timers lys/10 timers mørk cyklus. PMSG: drægtig hoppes serumgonadotropin; hCG: humant choriongonadotropin Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tilberedning af dyrkningsretter . (A) Kulturskål til zygoterne før injektionen. Læg to dråber M16 medium (20-25 μL for hver) i en 35 mm plast petriskål. B) Dyrkningsskål til zygoterne efter injektionen. Anbring 10 dråber (10-20 μL for hver dråbe) M16 i en 35 mm petriskål af plast. Dråber er dækket af mineralolie (3 ml). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Målrettet kromosomområde | Antal | Indsæt længde (kb) | Homologi armlængde (kb) | ||||||
| Embryoner | Nyfødte | Undersøgt (fravænning) | Knock-in uden rTG | rTGc | |||||
| Injiceres | Overført | 5' arm | 3' arm | ||||||
| 2qE2 | 349 | 331 | 114 (34,4 %)a | 114 | 9 (7,9%)b | 5 (4,4%)d | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 2qE2 | 231 | 215 | 78 (36,3%)a | 74 | 15 (20,3%)b | 23 (31,1%)d | 2.2 | 1.0 | 1.1 |
| 5qG2 | 288 | 262 | 90 (34,4%)a | 81 | 19 (23,5%)b | 18 (22,2%)d | 1.6 | 2.0 | 2.0 |
| 6qB1 | 278 | 259 | 58 (22,4%)a | 46 | 11 (23,9%)b | 11 (23,9%)d | 4.2 | 1.2 | 1.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 295 | 277 | 97 (35,0%)a | 23 | 2 (8,7%)b | 4 (17,4%)d | 6.5 | 1.1 | 3.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 246 | 219 | 87 (39,7%)a | 83 | 22 (26,5%)b | 18 (21,7%)d | 5.8 | 1.1 | 3.0 |
| 7qF5 | 279 | 268 | 116 (43,3%)a | 114 | 45 (39,5%)b | 44 (38,6%)d | 1.4 | 3.1 | 1.0 |
| 11qB4 | 405 | 353 | 56 (15,9%)a | 47 | 8 (17,0%)b | 12 (25,5%)d | 1.7 | 1.0 | 0.8 |
| 11qD | 310 | 294 | 100 (34,4 %)a | 98 | 15 (15,3%)b | 76 (77,6%)d | 1.0 | 1.8 | 2.4 |
| 12qE | 368 | 320 | 86 (26,9%)a | 84 | 12 (14,3%)b | 19 (22,6%)d | 3.4 | 1.1 | 1.3 |
| 12qF1 | 315 | 265 | 76 (28,7%)a | 72 | 17 (23,6%)b | 28 (38,9%)d | 1.0 | 1.1 | 1.1 |
| 14qE5 | 256 | 215 | 48 (22,3 %)a | 48 | 11 (22,9%)b | 21 (43,8%)d | 3.1 | 1.0 | 0.9 |
| 14qE5 | 287 | 285 | 85 (29,8%)a | 72 | 15 (20,8%)b | 19 (26,4%)d | 2.6 | 1.0 | 0.9 |
Tabel 1: Produktion af knock-in-mus ved mikroinjektion. Tabellen viser fødselsraten og effektiviteten af at producere mus, der bærer den tilsigtede knock-in allel uden (W / O) tilfældig integration (rTG) af donor-DNA'et. Det var muligt at få mus med den tilsigtede knock-in allel i alle projekter. a: Antal nyfødte/Antal overførte embryoner b: Antal knock-in alleler båret mus/antal undersøgte mus; c: det er ikke sikkert, om der er en tilsigtet allel; d: Antal rTG-allelebårne mus/antal undersøgte mus rTG: tilfældig integration af donorvektor. W/O: uden.
| Målrettet kromosomområde | Antal | flokset længde (kb) | Homologi armlængde (kb) | |||||
| Embryoner | Nyfødte | Undersøgt (fravænning) | floxed W/O rTG | |||||
| Injiceres | Overført | 5' arm | 3' arm | |||||
| 3qC | 325 | 313 | 93 (29,7%)a | 87 | 9 (10,3%)b | 1.3 | 1.2 | 1.1 |
| 4qB1 | 210 | 200 | 36 (18,0 %)a | 29 | 6 (20,7%)b | 1.6 | 1.2 | 0.9 |
| 4qC4 | 272 | 256 | 112 (43,8 %)a | 100 | 5 (5,0%)b | 2.4 | 1.0 | 1.4 |
| 5qF | 143 | 137 | 40 (29,2%)a | 40 | 6 (15,0%)b | 1.8 | 1.0 | 1.1 |
| 5qF | 255 | 227 | 80 (35,2%)a | 76 | 2 (2,6%)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 9qE3.1 | 289 | 261 | 80 (30,7%)a | 77 | 9 (11,7%)b | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| 10qB3 | 284 | 269 | 88 (32,7%)a | 78 | 3 (3,8%)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 10qC1 | 243 | 231 | 40 (17,3%)a | 38 | 4 (10,5%)b | 2.1 | 1.0 | 1.3 |
| 14qE5 | 390 | 372 | 139 (37,4%)a | 135 | 5 (3,7%)b | 1.1 | 0.8 | 0.9 |
| 17qA3.3 | 383 | 374 | 99 (26,5%)a | 95 | 2 (2,1%)b | 2.1 | 0.6 | 0.8 |
Tabel 2: Produktion af floxede mus ved mikroinjektion. Tabellen viser fødselsraten og effektiviteten af at producere mus, der bærer den tilsigtede flox-allel uden (W/O) tilfældig integration (rTG) af donor-DNA'et. Det var muligt at få mus med den påtænkte flox-allel i alle projekter. a: Antal nyfødte/antal overførte embryoner B: Antal FLOX-allelbårne mus/antal undersøgte mus. rTG: tilfældig integration af eller donorvektor W/O: uden.
Discussion
I denne undersøgelse blev friske (ikke frosne-optøede) C57BL/6J musezygoter, opnået ved naturlig parring, anvendt til genomredigering af museproduktion. Ved at injicere crRNA-tracrRNA-Cas9 og donor-DNA (RNPD) i begge pronuclei af disse zygoter i en cellecyklusfase, hvor knock-in er mest sandsynligt, blev genkassetteknock-in og floxed mus genereret med en høj fødselsrate og tilstrækkelig genomredigeringseffektivitet. Den aktuelle undersøgelse styrker udvidelsesmulighederne for SPRINT-CRISPR-metode15, hvor den sikrer tilstrækkelig knock-in-effektivitet selv i C57BL/6J-genetisk baggrund og kan anvendes til produktion af floxede mus.
Elektroporation er en meget generaliseret metode til fremstilling af genomredigerede mus på grund af de lave omkostninger ved de eksperimentelle enheder og den lette indlæring af teknikken8. Desuden kræver i-GONAD-metode19, hvor genomredigering udføres med præimplantationsembryoner, der findes i ovidukten, ikke en modtagermus. Sammenlignet med disse metoder er den nuværende metode, der præsenteres her, dyr og tidskrævende, når man forbereder og vedligeholder et eksperimentelt miljø med hensyn til både hardware og software. Men når forsøgsfaciliteterne er oprettet, kan komplekse genkassetteknock-in og floxede mus produceres med kun kommercielt tilgængelige CRISPR-elementer (crRNA, tracrRNA og Cas9-protein) og en simpel, lille mængde cirkulær plasmidvektor, der skal bruges som donor-DNA. Det betyder, at mange komplekse genomredigerede muselinjer kan produceres uden behov for tidskrævende (eller relativt dyre) lsODN 5,6 eller adeno-associerede virusvektorer20 at forberede.
I modsætning til den oprindelige SPRINT-CRISPR-metode15 blev der anvendt friske (frosne-optøede) zygoter. Ved opnåelse af friske zygoter ved naturlig parring kan de tekniske fejl ignoreres, der kan opstå under in vitro-befrugtning eller frysning og optøning. Desuden kan embryomanipulationsprocessen afsluttes på ca. en halv dag (figur 1) efter den nuværende fremgangsmåde. På den anden side inkluderer nogle begrænsninger ved den nuværende metode kravet om mange hanmus, den løse kontrol af befrugtningstimen og den begrænsede evne til fuldstændigt at forudsige antallet af zygoter til mikroinjektion. Sammenlignet med den oprindelige SPRINT-CRISPR-metode kan denne metode have en højere fødselsrate (tabel 1). På trods af dette kan det ikke konkluderes, at den nuværende metode er bedre med hensyn til fødselsrate på grund af forskellene i eksperimentledere, målgener, genetisk baggrund og timing af embryobekræftelse.
Som vist i tabel 1 havde et stort antal mus i de fleste genkassetteknock-in-projekter tilfældige integrationsalleler. Tilfældig integration skal elimineres, fordi det kan føre til utilsigtet forstyrrelse af endogene gener og ektopisk ekspression af transgener. Udfordringen for fremtiden er at finde eksperimentelle forhold, der reducerer antallet af tilfældige integrationshændelser, samtidig med at der opretholdes tilstrækkelig knock-in-effektivitet.
Næsten al musezygote-genomredigering ved hjælp af genomredigeringseffektorer, der resulterer i DNA-dobbeltstrengsbrud, vil sandsynligvis fremkalde utilsigtede mutationer på målsteder 9,21. Resultaterne af disse utilsigtede mutationer på målet er ikke beskrevet her, fordi vi ikke er i en situation, hvor den næste generation af mus kan styres for at præsentere klare beviser for dem. Den bedste måde at udelukke bekymringen for forvirring forårsaget af utilsigtet mutagenese på målet er at få den næste generation af mus ved at parre grundlæggere med vildtypemus snarere end krydsende grundlæggere. I princippet er N1-musene som følge af dette kryds vildtype (WT) på den ene side af allelen, så hvis den tilsigtede knock-in (KI) allel detekteres, er de WT/KI heterozygote. Derfor er mutagenesen på målet ikke et kritisk problem i laboratoriemusen, som har en relativt hurtig livscyklus og er et produktivt dyr. Der vil imidlertid være behov for yderligere forbedringer, når denne teknologi anvendes på relativt store pattedyr.
Det er blevet bekræftet, at denne teknologi kan producere genkassettebankmus i andre indavlede stammer end C57BL/6J, men et tilstrækkeligt antal projekter er ikke sikret, og dataene varierer meget. Derfor er disse oplysninger ikke medtaget i nærværende undersøgelse. Det menes, at yderligere undersøgelser om dette emne vil være nødvendige for at fremme musegenetik og sygdomsmodelforskning.
Disclosures
Forfatterne har ikke erklæret nogen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af videnskabelig forskning (B) (19H03142: til SM), videnskabelig forskning (A) (20H00444: til FS), videnskabelig forskning (A) (21H04838: til SM) og videnskabelig forskning på innovative områder "Platform of Advanced Animal Model Support" (16H06276: til ST) fra ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi. Bidragyderne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om udgivelse eller manuskriptforberedelse. Vi er Ryoichi Mori taknemmelige for hans nyttige diskussion om genomredigeringsdesign.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | - | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | - | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | - | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | - | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | - | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | - | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | - | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | - | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | - |
References
- Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
- Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
- Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
- Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
- Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
- Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
- Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
- Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
- Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
- Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
- Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).
