Summary
Mevcut protokol, gen kaseti knock-in ve flokslu fareleri verimli bir şekilde üretmek için CRISPR-Cas9 ve donör DNA'sının zigot mikroenjeksiyonunu tanımlamaktadır.
Abstract
CRISPR-Cas teknolojisi, genetiği değiştirilmiş farelerin hızlı ve zahmetsiz bir şekilde üretilmesini sağlamıştır. Spesifik olarak, fareler ve nokta mutant fareler, CRISPR faktörlerinin (ve tek sarmallı oligo DNA donörlerinin) zigot içine elektroporasyonu ile kolayca üretilir. Buna karşılık, gen kaseti (>1 kb) knock-in ve flokslu fareler esas olarak CRISPR faktörlerinin ve çift sarmallı DNA donörlerinin zigotlara mikroenjeksiyonu ile üretilir. Genom düzenleme teknolojileri, genetiği değiştirilmiş farelerin üretiminin esnekliğini de arttırmıştır. Artık hedef genomik bölgelerdeki amaçlanan mutasyonları, bir dizi faydalı inbred fare suşunda tanıtmak mümkündür. Ekibimiz, Japonya da dahil olmak üzere çeşitli ülkelerden gelen talepleri takiben CRISPR-Cas9'un zigot mikroenjeksiyonu ile 200'den fazla gen kaseti knock-in fare hattı ve 110'dan fazla flokslu fare çizgisi üretti. Bu genom düzenlemelerinden bazıları BALB / c, C3H / HeJ ve C57BL / 6N akraba suşlarını kullandı, ancak çoğu C57BL / 6J'yi kullandı. Elektroporasyon yönteminden farklı olarak, farelerin çeşitli inbred suşlarında zigot mikroenjeksiyonu ile genom düzenleme o kadar kolay değildir. Bununla birlikte, tek bir inbred genetik arka plan üzerinde gen kaseti knock-in ve floxed fareler, genetik insancıllaştırılmış, floresan muhabir ve koşullu nakavt fare modelleri kadar kritiktir. Bu nedenle, bu makalede, gen kaseti knock-in ve flokslu fareler üretmek için C57BL / 6J farelerde CRISPR faktörlerinin ve çift sarmallı DNA donörlerinin zigot mikroenjeksiyonu için protokol sunulmaktadır. Bu makale sadece sitoplazmik enjeksiyondan ziyade nükleer enjeksiyona odaklanmaktadır. Zigot mikroenjeksiyonuna ek olarak, üretim süreci ve süperovülasyonun indüksiyonu ve embriyo transferi gibi periferik teknikler için zaman çizelgesini özetliyoruz.
Introduction
Amaçlanan eksojen genlerin hedef lokuslara tanıtıldığı knock-in fareler, gen insanlaştırılmış fareler, floresan muhabir fareler ve Cre sürücü fareleri 1,2 olarak birçok in vivo çalışmada yaygın olarak kullanılmaktadır. Fare zigotlarında genom düzenleme ile knock-in mutasyonları indüklendiğinde, donör DNA2,3 olarak tek sarmallı DNA (tek sarmallı oligo DNA donörleri, ssODN) veya çift sarmallı DNA (dsDNA) kullanılır. ssODN esas olarak 200 bp4'ten daha az nispeten kısa gen parçalarını vurmak için kullanılır. Uzun ssODN'ler (lsODN)5,6 kullanarak 1 kb DNA'dan daha uzun parçaları zincirlemek mümkündür, ancak bunların hazırlanması zaman alıcıdır. dsDNA donörleri kullanıldığında, gen kaseti (>1 kb) knock-in fareleri, zahmetli donör DNA hazırlığı olmadan üretilebilir7.
SsODN'leri kullanmanın temel avantajı, elektroporasyon8'in knock-in fareler üretebilmesidir. Bununla birlikte, dsDNA donörleri zigot mikroenjeksiyonu ile doğrudan çekirdeğe verilmelidir. Her bir loxP dizisinin hedef genin yukarı ve aşağı akışına vurulduğu flokslu fareler oluşturmak için iki bölgede eşzamanlı knock-in gereklidir. Fare zigotlarında genom düzenleme yoluyla flokslu fareler üretmenin iki yolu vardır - her biri tek bir loxP bölgesi taşıyan iki bağımsız ssODN kullanarak veya flokslu bir diziye sahip tek bir dsDNA (veya lsDNA) kullanarak; birincisi çok verimsiz 9,10,11. dsDNA donörlerini kullanarak genom düzenleme, ortam zigot mikroenjeksiyonuna elverişliyse, gen kaseti knock-in ve flokslu fareler üretmek için en basit yaklaşımdır.
Başlangıçta, Cas9 mRNA ve sgRNA karışımları veya sgRNA ve Cas9'u kodlayan DNA vektörleri, fare zigotlarında genom düzenleme için kullanılır12,13. Yüksek kaliteli ve kararlı Cas9 proteinleri artık düşük bir maliyetle mevcut olduğundan, crRNA-tracrRNA-Cas9 ribonükleoproteininin (RNP) fare zigotları14'e sokulması popüler hale gelmiştir. Son zamanlarda, knock-in fareleri, crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP ve donör DNA'sını, knock-in'in meydana gelme olasılığının en yüksek olduğu bir hücre döngüsü fazında fare zigotlarının her iki proçekirdeğine sokarak yüksek verimlilikle üretilmiştir15. Bu nedenle, mevcut protokol, bu yöntemle çeşitli tipte knock-in fareler üretme tekniklerini açıklamaktadır.
Laboratuvar farelerinin birçok yararlı akraba suşu vardır16. Akraba arka plan içindeki genetik modifikasyon, genetik arka planın fenotip üzerindeki etkisini göz ardı edebilir. Bu makalede, en sık kullanılan inbred fare hattı olan C57BL/6J17'nin zigotunda gen kaseti knock-in ve floksed mutasyonlarını indüklemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş farelerin üretimi için zaman çizelgesi ve süperovulasyon indüksiyonu ve embriyo transferi de dahil olmak üzere kullanılan periferik teknikler de tartışılmaktadır.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri, Tsukuba Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yönetmeliği ve Eğitim Bakanlığı'nın yetkisi altındaki Akademik Araştırma Kurumlarında Hayvan Deneylerinin ve İlgili Faaliyetlerin Uygun Şekilde Yürütülmesi için Temel Kılavuz'a göre, Tsukuba Üniversitesi Kurumsal Hayvan Deneyleri Komitesi'nin onayı ile insancıl bir şekilde yürütülmüştür. Japonya'nın Kültür, Spor, Bilim ve Teknolojisi. Her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareler, 10-25 haftalık, zigot donörü olarak kullanıldı. ICR fareleri (10 haftadan eski) alıcı fareler olarak kullanıldı. Fareler ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Hücresiz bir sistemde crRNA bölünme aktivitesinin doğrulanması
- 2 nmol crRNA (kuru) ve 20 nmol tracrRNA (kuru) sırasıyla 25 μL ve 250 μL RNaz içermeyen suda çözün ( bkz.
NOT: Yüksek bölünme aktivitesine sahip olduğu tahmin edilen CRISPR hedef dizileri ve mümkün olduğunca az sayıda hedef dışı CRISPOR kullanılarak seçilir (bkz. Gen kaseti knock-in durumunda, yerleştirme bölgesi boyunca diziyi hedefleyin. Floks edilecek ekzon (lar) KOnezumi kullanılarak seçilmiştir (bkz. - Hedef bölgeyi içeren DNA fragmanını (yaklaşık 0.5-1 kb) genomik PCR9 ile güçlendirin. Bu PCR amplikonunu ortak PCR ürün ekstraksiyon kiti ile saflaştırın (bkz.
- Cas9 Nükleaz Reaksiyon Tamponunda 10 μL CRISPR karışımı hazırlayın (100 ng/μL crRNA, 150 ng/μL tracrRNA ve 1 ng/μL Cas9 , bkz. CRISPR-Cas9 kompleksini oluşturmak için, CRISPR karışımını 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir ısı bloğuna yerleştirin.
- Adım 1.2'de açıklanan PCR ürününe (10 μL, 20 ng / μL) toplam CRISPR karışımı hacmini (10 μL) ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Elektroforez sırasında RNA'ların bulunmaması gerektiğinden, crRNA ve tracrRNA'yı 30 dakika boyunca 37 ° C'de parçalamak için 1 μL RNaz (500 ng / μL) ekleyin. Sodyum dodesil sülfat (%2 w/v) içeren yükleme boyası kullanarak yukarıdaki numunelerin elektroforezini gerçekleştirin.
NOT: Nadir durumlarda, bölünme aktivitesi olmayan crRNA'lar gözlenir. Bu gibi durumlarda, genom düzenleme tasarımının yeniden tasarlanması önerilir.
2. Zigot mikroenjeksiyonu için crRNA, tracrRNA, Cas9 proteini ve donör DNA karışımının hazırlanması
- CRISPR çözeltisi hazırlayın (RNaz içermeyen suda 50 ng / μL crRNA, 200 ng / μL tracrRNA ve 200 ng / μL Cas9). Bir donör DNA çözeltisi hazırlayın (20 ng / μL kendi kendine oluşturulmuş plazmid DNA vektörü).
- Donör DNA solüsyonunu 0,22 μm gözenek boyutuna sahip steril bir şırınga filtresinden geçirin. Eşit miktarda CRISPR çözeltisi ve filtrelenmiş donör DNA çözeltisini karıştırın. Her birinin nihai konsantrasyonunun 25 ng / μL crRNA, 100 ng / μL tracrRNA, 100 ng / μL Cas9 ve 10 ng / μL donör DNA olduğundan emin olun. Bu karışım bundan böyle RNPD olarak anılacaktır.
NOT: Flokslu farelerin üretimi sırasında olduğu gibi iki bölgeyi keserken, her crRNA'nın konsantrasyonu 25 ng / μL olmalıdır. Donör DNA'sı dairesel bir plazmid DNA'sıdır ve ortak bir mini prep spin kolon kiti ile saflaştırılabilir (bakınız Malzeme Tablosu). Hazırlanan çözelti buz üzerine yerleştirilmeli ve mümkün olan en kısa sürede mikro enjeksiyon için kullanılmalıdır.
- Donör DNA solüsyonunu 0,22 μm gözenek boyutuna sahip steril bir şırınga filtresinden geçirin. Eşit miktarda CRISPR çözeltisi ve filtrelenmiş donör DNA çözeltisini karıştırın. Her birinin nihai konsantrasyonunun 25 ng / μL crRNA, 100 ng / μL tracrRNA, 100 ng / μL Cas9 ve 10 ng / μL donör DNA olduğundan emin olun. Bu karışım bundan böyle RNPD olarak anılacaktır.
3. Doğal çiftleşme ile farelerin zigotlarının elde edilmesi
- Mikroenjeksiyondan 3 gün önce 5 IU hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG, bakınız Malzeme Tablosu) deri altından C57BL / 6J dişi farelere (10-25 haftalık) enjekte edin. Yaklaşık 46-48 saat sonra, intraperitoneal olarak 5 IU insan koryonik gonadotropini (hCG , bkz. PMSG ve hCG ile tedavi edilen dişi fareleri erkek C57BL / 6J farelerle birlikte barındırın ve ertesi sabah vajinal tıkaçları kontrol edin.
NOT: Bir dişi C57BL/6J fareden yaklaşık 15-25 zigot elde edilebilir. Zaman çizelgesi Şekil 1'de gösterilmiştir. - Zigot kültürü için Şekil 2'de gösterildiği gibi iki adet 35 mm'lik Petri kabı hazırlayın. Bunları kullanıma kadar inkübatöre (37 ° C,% 5 CO2) yerleştirin. Bunlar bir gecede saklanabilir.
- Dişi fareleri servikal çıkık ile doğrulanmış vajinal tıkaçlarla ötenazi yapın ve küçük makas kullanarak, alt karın orta hattından kaburgaların altına kadar karın derisi ve kas tabakası boyunca kesin.
NOT: Ötanazi için yerel hayvan etik komitesi tavsiyelerine uyun. - Yumurta kanallarını toplayın ve Petri kabının kapağında 0.75 mg / mL hyaluronidaz içeren 20 μL'lik bir M2 ortamına (bkz. İnce uçlu forsepsli bir yumurta kanalı alın ve fimbrialardan hyaluronidaz ile yaklaşık 50 μL M2 ortamını perfüze edin.
NOT: Şu anda, zigotlar gevşek bir şekilde çok sayıda kümülüs hücresi ile çevrilidir. - 30 sn sonra, bir cam kılcal damar kullanarak az miktarda ortam içeren morfolojik olarak normal zigotları toplayın ve taze M16 orta damlacıklarına aktararak yıkayın. Yıkanmış zigotları havuzlama için bir Petri kabına aktarın (Şekil 2).
NOT: Zaman çizelgesi Şekil 1'de gösterilmiştir. Morfolojik olarak normal zigotlar, bir erkek ve dişi pronükleusa ve küresel şekil15'i ciddi şekilde tehlikeye atmayan iki kutupsal gövdeye sahiptir. Zigotun morfolojisi suşlar ve türler arasında önemli ölçüde değişir. - Tüm zigotlar alınana kadar 3.3 ve 3.4 adımlarını yineleyin. Kültür kabındaki bir M16 damlasında yaklaşık 100 zigot toplanabilir. Çanağı mikroenjeksiyona kadar inkübatörde (37 ° C, % 5 CO2) saklayın.
4. Mikroenjeksiyon iğnesinin hazırlanması
- Programlanabilir pipet çektiricisini kullanarak bazı cam pipetleri çekin (bkz.
NOT: Mikroenjeksiyon iğneleri ince uçlu ve uzun konikli olmalıdır. Çektiricinin intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu için iğne yapmak için bir programı varsa, aynı program mikroenjeksiyon için iğne yapmak için de kullanılabilir. - Microforge ucuna takılı cam topa vurarak mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu kırın. Mikroenjeksiyon iğnesinin uç boyutunun çapının yaklaşık 1 μm olduğundan emin olun. Uç boyutunu mikroskop altında 1000x büyütmede kontrol edin.
- Mikroenjeksiyon iğnesini bir mikroforge kullanarak uçtan yaklaşık 2-3 mm bükün.
NOT: Virajın açısı mikromanipülatörün kurulumuna bağlıdır. Çok fazla bükülme, piezo darbesinin etkinliğini azaltacaktır.
5. Zigot mikroenjeksiyonu
- Mikroenjeksiyon iğnesinin ortasına 1-1,5 cm işlem sıvısını (piezo etkisinin cıvaya alternatif olarak delikler açması için gerekli olan atalet gövdesi, Malzeme Tablosuna bakınız) enjekte edin ve piezo aktüatörü ile manuel mikroenjektör tutucusuna takın.
- Ayrıca, tutma iğnesini karşıdaki manuel mikroenjektör tutucusuna takın. İşlem sıvısını kademeli basınç ile mikroenjeksiyon iğne ucuna taşıyın. Her iki manuel mikroenjektör tutucusunu da mikromanipülatöre sabitleyin.
NOT: Mikroenjeksiyon iğnesinin ucundan çıkan işlem sıvısı mikroskop altında 50x büyütmede gözlemlenebilir. Yayılan sıvı miktarını ayarladıktan sonra, piezo darbeleri uygulandığında sıvının sıçraması gözlemlenebilir ve piezo darbelerinin etkili olduğunu doğrular. Bu doğrulanamazsa, mikroenjeksiyon iğnesini yeniden hazırlayın.
- Ayrıca, tutma iğnesini karşıdaki manuel mikroenjektör tutucusuna takın. İşlem sıvısını kademeli basınç ile mikroenjeksiyon iğne ucuna taşıyın. Her iki manuel mikroenjektör tutucusunu da mikromanipülatöre sabitleyin.
- Üç damlacık içeren bir enjeksiyon odası hazırlayın: (1) 10 μL M2 ortamı; (2) M2 ortamında 5 μL% 12 polivinilpirolidon (PVP); ve (3) crRNA, tracrRNA, Cas9 proteini ve Donör DNA (RNPD) çözeltisinin 5 μL karışımı. Damlacıkları adım 3.2 ile aynı şekilde mineral yağ ile örtün ve enjeksiyon odasını ters mikroskop aşamasına yerleştirin.
- 50x büyütmede ters çevrilmiş mikroskop altında, mikroenjeksiyon pipetini %12 PVP düşüşüne indirin. Mikroenjeksiyon iğne ucunun içini temizlemek ve RNPD damlacığına aktarmak için% 12 PVP'yi aspire edin ve dağıtın.
- Manuel mikroenjektörü negatif basınç altına alın ve RNPD çözeltisini mikroenjeksiyon iğnesine emer. Yeterli bir hacim aspire edilene kadar birkaç dakika bekleyin; 50x büyütülmüş bir mikroskop altında, mikroenjeksiyon iğnesinin tüm içini sıvı ile doldurun.
- Girişi durdurun ve manuel mikroenjektörünü pozitif basınca ayarlayarak RNPD çözeltisinin kademeli olarak dışarı atılmasına izin verin. Mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu yağın içine doğru hareket ettirin.
NOT: Soluma için manuel mikroenjektörün düğmesini saat yönünün tersine çevirin. Solumayı durdurmak için, düğmeyi saat yönünde döndürün ve mikroskop altında gözlemlerken basıncı kademeli olarak artırın. RNPD çözeltisi yavaş yavaş boşaltılacaktır. Mikroenjeksiyon iğnesindeki sıvı seviyesi hareketi, çıkışın doğrulanmasını sağlar.
- Girişi durdurun ve manuel mikroenjektörünü pozitif basınca ayarlayarak RNPD çözeltisinin kademeli olarak dışarı atılmasına izin verin. Mikroenjeksiyon iğnesinin ucunu yağın içine doğru hareket ettirin.
- M2 damlacığına 50 zigot koyun ve tutma pipetini yavaşça aynı damlacığa indirin. Mikroenjeksiyon iğnesini zigot içeren M2 damlasına aktarın. 20x hedefine geçin ve mikroenjeksiyon pipetinin ucuna odaklanın.
NOT: 10 dakika içinde enjekte edilebilecek kadar zigot koyun. - Bir zigot tutun ve mikromanipülatörü hareket ettirerek proçekirdeğe odaklanın. Mikroenjeksiyon iğnesini zigotun içine yerleştirin ve ucu proçekirdeğe yaklaştırın. Uç pronükleus zarına ulaştığında, delmek için piezo darbesini (yoğunluk: 6-10, hız: 1) uygulayın.
- Mikroenjeksiyon iğnesi proçekirdeği deldiğinde, RNPD çözeltisini enjekte edin ve pronükleusun şişmesini gözlemleyin. Pronükleus tamamen şişirildikten sonra, iğneyi hızla dışarı çekin. Aynı prosedürü hem dişi hem de erkek pronükleus üzerinde uygulayın.
NOT: Proçekirdeğin enjeksiyonla şişirilmesi mikroskop altında açıkça görülebilir. Bu enflasyonun derecesinin sözel olarak ifade edilmesi zordur, ancak önceki raporlara atıfta bulunularak doğrulanabilir15.
- Mikroenjeksiyon iğnesi proçekirdeği deldiğinde, RNPD çözeltisini enjekte edin ve pronükleusun şişmesini gözlemleyin. Pronükleus tamamen şişirildikten sonra, iğneyi hızla dışarı çekin. Aynı prosedürü hem dişi hem de erkek pronükleus üzerinde uygulayın.
- Enjeksiyondan önce ve sonra zigotları tanımlamak için enjekte edilen zigotu M2 damlacığı içinde başka bir yere taşıyın.
- M2 damlacığındaki tüm zigotlar enjekte edilene kadar 5.5-5.6 adımlarını tekrarlayın. Enjeksiyondan sonra, zigotları taze bir M16 kabına aktarın.
- Enjeksiyondan 10 dakika sonra hayatta kalan zigotları seçin. Enjeksiyondan zarar gören lize zigotları çıkarın ve hayatta kalan zigotları M16 kabındaki her damlacığa dağıtın. Her damlacık, bir sahte hamile kadın için 20-24 zigot içermelidir. Bu, M16 kabının embriyo transferi sırasında inkübatörün dışındaki ortama maruz kalma süresini azaltır.
NOT: Optimal enjeksiyon koşulları altında, hayatta kalma oranı% 90 -% 95'tir. Bu, iğne ucunun boyutuna, piezo darbesinin gücüne ve RNPD çözeltisinin çıkış basıncına bağlıdır.
6. Yumurta kanalına embriyo transferi
- Psödohamile fareler elde etmek için, proöstrus fazındaki her dişi ICR faresini vazolige edilmiş bir erkek ICR faresi ile eşleştirin. Ertesi gün fişleri kontrol edin.
NOT: 20 çiftleşme çiftinden yaklaşık 15 sahte hamile fare elde edilir. - Psödohamile dişi farelere deri altından üç tip karışık anestezik ajan (0.2 mg / kg medetomidin, 4.0 mg / kg midazolam ve 2.5 mg / kg butorphanol, bakınız Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın. Solunum hızında bir azalma ve kuyruk sıkışma ve arka bacak pedalı çekilme reflekslerinin ortadan kalkmasıyla uygun anesteziyi onaylayın. Yerel hayvan etik kurulu tavsiyelerine göre gözleri yağlamak için oftalmik merhem uygulayın.
- Farenin sırt bölgesini yüzüstü pozisyonda tıraş ederek tıraş ettikten ve cerrahi alanı üç kez dezenfekte ettikten sonra, iyot veya klorheksidin bazlı bir ovma ve alkol arasında geçiş yaparak, sırt derisini omurga boyunca yaklaşık 1 cm küçük diseksiyon makası ile kesin.
- Dorsal insizyon yarasını bir yan ventralal olarak kaydırın, yumurtalığın görülebildiği kas tabakasını kesin, yumurtalık üzerindeki yağları cımbızla kavrayın ve yumurtalık, yumurtalık ve uterusu geri çekin.
- Yağı bir serrefine kelepçe ile sabitleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Katla doğrudan teması önlemek için üreme dokularını steril gazlı bez üzerine yerleştirin.
- Aşağıdaki sırayla, az miktarda kültür ortamı (M2 veya M16), işaretleyici olarak bazı hava kabarcıkları ve zigotları transfer için bir pipete yerleştirin.
NOT: Yumurta kanalı başına yaklaşık 10-12 zigot aktarın. - Ampulla ile yumurta kanalının fimbriaları arasında (cam pipetin girmesine izin verecek kadar uzun) bir mikro kesme kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız) bir kesi yapın, zigotları insizyona sokun ve aynı anda hava kabarcığının sokulduğunu onaylayın.
- İmplantasyonu diğer yumurta kanalına benzer şekilde gerçekleştirin (adım 6.6).
- Dış cildi otomatik klipslerle dikin (bkz.
NOT: Kesi yarası kaçınılmaz olarak büyük olmadıkça kesilmiş kas tabakasını dikmeyin. Kesilen kas tabakasının ideal boyutu 2-3 mm'den az olmalıdır. Kesi 5 mm'den büyükse, kas tabakası sterilize edilmiş bir dikiş iğnesi ve ipliği kullanılarak dikilmelidir (bkz.
7. Hayvan kurtarma
- Atipamezol hidroklorürü (0.3 mg / kg) farelere deri altından uygulayın.
NOT: Postoperatif analjezi için yerel hayvan etik komitesinin tavsiyelerine uyun. - Ardından, fareleri kafeslere yerleştirin ve 37 ° C'de sıcak bir plakada sıcak tutun.
- Fareler uyandırıldıktan sonra, onları yaklaşık 2 saat sıcak tutun. Farelerin anormal davranışlarını onaylamadıktan sonra, kafesleri üreme rafına geri getirin.
Representative Results
Bu protokolü kullanan gen kaseti knock-in ve flokslu farelerin üretim sonuçları Tablo 1 ve Tablo 2'de gösterilmiştir. Hedef genler belirtilmedi, çünkü genomu düzenlenmiş her fare çizgisi şu anda bağımsız, yayınlanmamış bir projede kullanılıyor. Bunun yerine, hedef kromozomal bölgeler tanımlanmıştır.
Genotipleme analizleri daha önce bildirilen bir yöntem18 kullanılarak yapıldı. Bu genotipleme yönteminde, donör DNA'sının istenmeyen kromozomal bölgelere yerleştirildiği fareler, istenen genom düzenlemesi indüklense bile, pozitif bireyler olarak sayılmaz. Bu nedenle, gerçek amaçlar için gerçekten yararlı olan kurucu farelerin üretim verimliliği, genom düzenlemenin kendisinin verimliliğinden ziyade gösterilmiştir.
13 bağımsız gen kaset knock-in faresinin medyan üretim verimliliği %20,8, maksimum %39,5 ve minimum %7,9 idi (Tablo 1). Bu verimliliğin yeterince pratik olduğu düşünülüyordu. Herhangi bir ölümcül embriyonik gen, gen kaseti çalma sırasında hedeflenmedi. Bu ölümcül olmayan gen hedefleme koşulu altında medyan doğum oranı% 34.0 idi (maksimum% 43.3 ve minimum% 15.9). Bu, genetik manipülasyon olmadan embriyo transferindeki doğum oranıyla karşılaştırılabilir olduğundan, tanıtılan genom düzenleme elemanlarının toksisitesinin ve zigot mikroenjeksiyonunun fiziksel hasarının embriyonik gelişimi etkileme ihtimalinin düşük olduğunu düşündük.
10 bağımsız flokslu farenin medyan üretim verimliliği, maksimum% 20.7 ve minimum% 2.1 ile% 7.7 idi (Tablo 2). Birkaç hedef genin fonksiyonları bilinmemekle birlikte, medyan doğum oranı maksimum% 43.8 ve minimum% 17.3 ile% 30.2 idi. Bu oran, gen kaseti knock-in farelerinkiyle karşılaştırılabilirdi, bu da mikro-enjeksiyon operasyonunun flokslu farelerin embriyonik gelişimi üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahip olduğunu düşündürmektedir.
Şekil 1: Zigot mikroenjeksiyonunun zaman çizelgesi. Beyaz ve koyu renk sırasıyla açık ve koyu döngüyü gösterir. Fareler 14 saat ışık / 10 saat karanlık döngü altında tutuldu. PMSG: hamile kısrak serum gonadotropin; hCG: insan koryonik gonadotropin Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kültür yemeklerinin hazırlanması . (A) Enjeksiyondan önce zigotlar için kültür tabağı. 35 mm'lik plastik bir Petri kabına iki damla M16 ortamı (her biri için 20-25 μL) yerleştirin. (B) Enjeksiyondan sonra zigotlar için kültür kabı. 35 mm'lik plastik bir Petri kabına 10 damla (her damla için 10-20 μL) M16 yerleştirin. Damlalar mineral yağ (3 mL) ile kaplanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Hedeflenen Kromozomal Bölge | Sayısı | Knock-in ekleme uzunluğu (kb) | Homoloji kol uzunluğu (kb) | ||||||
| Embriyo | Yenidoğan | İncelenen (sütten kesmeler) | rTG olmadan vuruntu | rTGc | |||||
| Enjekte | Transfer | 5' kol | 3' kol | ||||||
| 2qE2 | 349 | 331 | 114 (%34,4)a | 114 | 9 (%7,9)b | 5 (%4,4)d | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 2qE2 | 231 | 215 | 78 (%36,3)a | 74 | 15 (%20,3)b | 23 (%31,1)d | 2.2 | 1.0 | 1.1 |
| 5qG2 | 288 | 262 | 90 (%34,4)a | 81 | 19 (%23,5)b | 18 (%22,2)d | 1.6 | 2.0 | 2.0 |
| 6qB1 | 278 | 259 | 58 (%22,4)a | 46 | 11 (%23,9)b | 11 (%23,9)d | 4.2 | 1.2 | 1.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 295 | 277 | 97 (%35,0)a | 23 | 2 (%8,7)b | 4 (%17,4)d | 6.5 | 1.1 | 3.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 246 | 219 | 87 (%39,7)a | 83 | 22 (%26,5)b | 18 (%21,7)d | 5.8 | 1.1 | 3.0 |
| 7qF5 | 279 | 268 | 116 (%43,3)a | 114 | 45 (%39,5)b | 44 (%38,6)d | 1.4 | 3.1 | 1.0 |
| 11qB4 | 405 | 353 | 56 (%15,9)a | 47 | 8 (%17,0)b | 12 (%25,5)d | 1.7 | 1.0 | 0.8 |
| 11qD | 310 | 294 | 100 (%34,4)a | 98 | 15 (%15,3)b | 76 (%77,6)d | 1.0 | 1.8 | 2.4 |
| 12qE | 368 | 320 | 86 (%26,9)a | 84 | 12 (%14,3)b | 19 (%22,6)d | 3.4 | 1.1 | 1.3 |
| 12qF1 | 315 | 265 | 76 (%28,7)a | 72 | 17 (%23,6)b | 28 (%38,9)d | 1.0 | 1.1 | 1.1 |
| 14qE5 | 256 | 215 | 48 (%22,3)a | 48 | 11 (%22,9)b | 21 (%43,8)d | 3.1 | 1.0 | 0.9 |
| 14qE5 | 287 | 285 | 85 (%29,8)a | 72 | 15 (%20,8)b | 19 (%26,4)d | 2.6 | 1.0 | 0.9 |
Tablo 1: Mikroenjeksiyon ile knock-in fare üretimi. Tablo, doğum oranını ve donör DNA'sının (W / O) rastgele entegrasyonu (rTG) olmadan amaçlanan knock-in alelini taşıyan farelerin üretilmesinin verimliliğini göstermektedir. Tüm projelerde amaçlanan knock-in aleli ile fareler elde etmek mümkündü. a: Yenidoğan Sayısı/Transfer Edilen Embriyo Sayısı; b: Taşınan farelerin knock-in alel sayısı/incelenen farelerin sayısı; c: amaçlanan bir alel olup olmadığı kesin değildir; d: Taşınan farelerin rTG aleli sayısı/incelenen farelerin sayısı; rTG: Donör vektörünün rastgele entegrasyonu. W/O: olmadan.
| Hedeflenen Kromozomal Bölge | Sayısı | flokslu uzunluk (kb) | Homoloji kol uzunluğu (kb) | |||||
| Embriyo | Yenidoğan | İncelenen (sütten kesmeler) | flokslu W/O rTG | |||||
| Enjekte | Transfer | 5' kol | 3' kol | |||||
| 3qC | 325 | 313 | 93 (%29,7)a | 87 | 9 (%10,3)b | 1.3 | 1.2 | 1.1 |
| 4qB1 | 210 | 200 | 36 (%18,0)a | 29 | 6 (%20,7)b | 1.6 | 1.2 | 0.9 |
| 4qC4 | 272 | 256 | 112 (%43,8)a | 100 | 5 (%5,0)b | 2.4 | 1.0 | 1.4 |
| 5qF | 143 | 137 | 40 (%29,2)a | 40 | 6 (%15,0)b | 1.8 | 1.0 | 1.1 |
| 5qF | 255 | 227 | 80 (%35,2)a | 76 | 2 (%2,6)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 9qE3.1 | 289 | 261 | 80 (%30,7)a | 77 | 9 (%11,7)b | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| 10qB3 | 284 | 269 | 88 (%32,7)a | 78 | 3 (%3,8)b | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 10qC1 | 243 | 231 | 40 (%17,3)a | 38 | 4 (%10,5)b | 2.1 | 1.0 | 1.3 |
| 14qE5 | 390 | 372 | 139 (%37,4)a | 135 | 5 (%3,7)b | 1.1 | 0.8 | 0.9 |
| 17qA3.3 | 383 | 374 | 99 (%26,5)a | 95 | 2 (%2,1)b | 2.1 | 0.6 | 0.8 |
Tablo 2: Mikro enjeksiyon ile flokslu fare üretimi. Tablo, doğum oranını ve donör DNA'sının (W / O) rastgele entegrasyonu (rTG) olmadan amaçlanan floks alelini taşıyan farelerin üretilmesinin verimliliğini göstermektedir. Tüm projelerde amaçlanan floks aleli ile fareler elde etmek mümkündü. a: Yenidoğan sayısı/transfer edilen embriyo sayısı; b: Taşınan farelerin floks alel sayısı/incelenen farelerin sayısı. rTG: donör vektörünün rastgele entegrasyonu veya donör vektörü; W/O: olmadan.
Discussion
Bu çalışmada, genom düzenleme fare üretimi için doğal çiftleşmeden elde edilen taze (dondurulmamış-çözülmemiş) C57BL/6J fare zigotları kullanılmıştır. crRNA-tracrRNA-Cas9 ve donör DNA'sı (RNPD), knock-in'in meydana gelme olasılığının en yüksek olduğu bir hücre döngüsü fazında bu zigotların her iki pronüklesine enjekte edilerek, gen kaseti knock-in ve flokslu fareler yüksek doğum oranı ve yeterli genom düzenleme etkinliği ile üretildi. Mevcut çalışma, C57BL / 6J genetik arka planında bile yeterli knock-in verimliliği sağladığı ve flokslu farelerin üretimine uygulanabildiği SPRINT-CRISPR yöntem15'in genişletilebilirliğini güçlendirmektedir.
Elektroporasyon, deneysel cihazların düşük maliyeti ve tekniği öğrenmenin kolaylığı nedeniyle genom düzenlenmiş fareler üretmek için oldukça genelleştirilmiş bir yöntemdir8. Ayrıca, yumurta kanalında bulunan preimplantasyon embriyolarla genom düzenlemesinin yapıldığı i-GONAD yöntemi19, alıcı fare gerektirmez. Bu yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada sunulan mevcut yöntem, hem donanım hem de yazılım açısından deneysel bir ortam hazırlarken ve sürdürürken maliyetli ve zaman alıcıdır. Bununla birlikte, deney tesisleri kurulduktan sonra, karmaşık gen kaseti knock-in ve flokslu fareler, yalnızca ticari olarak temin edilebilen CRISPR elementleri (crRNA, tracrRNA ve Cas9 proteini) ve donör DNA olarak kullanılacak basit, az miktarda dairesel plazmid vektörü ile üretilebilir. Bu, birçok karmaşık genom düzenlenmiş fare çizgisinin, hazırlanması için zaman alıcı (veya nispeten pahalı) lsODN 5,6 veya adeno ilişkili virüs vektörleri20'ye ihtiyaç duymadan üretilebileceği anlamına gelir.
Orijinal SPRINT-CRISPR yöntem15'in aksine, taze (dondurulmuş-çözülmüş) zigotlar kullanıldı. Doğal çiftleşme ile taze zigotlar elde edilirken, in vitro fertilizasyon veya donma ve çözülme sırasında oluşabilecek teknik hatalar göz ardı edilebilir. Ayrıca mevcut yaklaşımı takiben embriyo manipülasyon işlemi yaklaşık yarım günde tamamlanabilmektedir (Şekil 1). Öte yandan, mevcut yöntemin bazı sınırlamaları, birçok erkek farenin gerekliliğini, döllenme zamanlamasının gevşek kontrolünü ve mikroenjeksiyon için zigot sayısını tamamen tahmin etme yeteneğinin sınırlı olmasını içerir. Orijinal SPRINT-CRISPR yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu yöntem daha yüksek bir doğum oranına sahip olabilir (Tablo 1). Buna rağmen, deney iletkenleri, hedef genler, genetik arka planlar ve embriyo doğrulamasının zamanlamasındaki farklılıklar nedeniyle mevcut yöntemin doğum oranı açısından daha iyi olduğu sonucuna varılamamaktadır.
Tablo 1'de gösterildiği gibi, gen kaseti zincirleme projelerinin çoğunda çok sayıda farenin rastgele entegrasyon alelleri vardı. Rastgele entegrasyon ortadan kaldırılmalıdır, çünkü endojen genlerin istenmeyen şekilde bozulmasına ve transgenlerin ektopik ekspresyonuna yol açabilir. Geleceğin zorluğu, yeterli zincirleme verimliliği korurken rastgele entegrasyon olaylarının sayısını azaltan deneysel koşullar bulmaktır.
DNA çift iplikçik kırılmalarına neden olan genom düzenleme efektörleri kullanılarak yapılan hemen hemen tüm fare zigot genom düzenlemelerinin, hedef bölgelerde istenmeyen mutasyonlara neden olması muhtemeldir 9,21. Bu istenmeyen hedef mutasyonlarının sonuçları burada açıklanmamıştır, çünkü yeni nesil farelerin net kanıtlarını sunmak için yönetilebilecekleri bir durumda değiliz. İstenmeyen hedef mutajenezinin neden olduğu karışıklık endişesini ortadan kaldırmanın en iyi yolu, kurucuları kesişen kurucular yerine vahşi tip farelerle çiftleştirerek yeni nesil fareleri elde etmektir. Prensip olarak, bu haçtan kaynaklanan N1 fareleri, alelin bir tarafında vahşi tiptir (WT), bu nedenle amaçlanan knock-in (KI) aleli tespit edilirse, WT / KI heterozigotturlar. Bu nedenle, hedefteki mutajenez, nispeten hızlı bir yaşam döngüsüne sahip olan ve üretken bir hayvan olan laboratuvar faresinde kritik bir sorun değildir. Bununla birlikte, bu teknoloji nispeten büyük memelilere uygulandığında daha fazla iyileştirme gerekli olacaktır.
Bu teknolojinin C57BL / 6J dışındaki inbred suşlarda gen kaseti knock-in fareleri üretebileceği doğrulanmıştır, ancak yeterli sayıda proje güvence altına alınmamıştır ve veriler oldukça değişkendir. Bu nedenle bu bilgiler bu çalışmada yer almamaktadır. Fare genetiği ve hastalık modeli araştırmalarını ilerletmek için bu konuda daha fazla çalışmanın gerekli olacağına inanılmaktadır.
Disclosures
Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan etmişlerdir.
Acknowledgments
Bu çalışma, Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan Bilimsel Araştırma (B) (19H03142: SM'ye), Bilimsel Araştırma (A) (20H00444: FS'ye), Bilimsel Araştırma (A) (21H04838: SM'ye) ve Yenilikçi Alanlar Üzerine Bilimsel Araştırma "İleri Hayvan Modeli Destek Platformu" (16H06276: ST'ye) tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makale hazırlamada hiçbir rolü yoktu. Ryoichi Mori'ye genom düzenleme tasarımı hakkındaki yararlı tartışması için minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | - | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | - | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | - | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | - | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | - | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | - | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | - | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | - | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | - |
References
- Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
- Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
- Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
- Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
- Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
- Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
- Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
- Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
- Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
- Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
- Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).
