Summary
本プロトコルは、遺伝子カセットノックインおよびフロックスマウスを効率的に作製するためのCRISPR-Cas9およびドナーDNAの接合子マイクロインジェクションを記載する。
Abstract
CRISPR-Cas技術は、遺伝子改変マウスの迅速かつ容易な生成を可能にしました。具体的には、マウスおよび点変異マウスは、CRISPR因子(および一本鎖オリゴDNAドナー)を接合子にエレクトロポレーションすることによって容易に作製される。対照的に、遺伝子カセット(>1 kb)ノックインマウスおよびフロックスマウスは、主にCRISPR因子および二本鎖DNAドナーの接合子へのマイクロインジェクションによって生成されます。ゲノム編集技術は、遺伝子改変マウス作製の柔軟性も高めています。多くの有益な近交系マウス系統において標的ゲノム領域に意図した変異を導入することが可能になった。私たちのチームは、日本を含むいくつかの国からの要求を受けて、CRISPR-Cas9の接合子マイクロインジェクションによって200を超える遺伝子カセットノックインマウス株と110を超えるフロックスマウス株を製造してきました。これらのゲノム編集の一部は、BALB / c、C3H / HeJ、およびC57BL / 6N近交系株を使用しましたが、ほとんどはC57BL / 6Jを使用しました。エレクトロポレーション法とは異なり、様々な近交系マウスにおける接合子マイクロインジェクションによるゲノム編集はそれほど容易ではありません。ただし、単一の近交系の遺伝的背景での遺伝子カセットノックインマウスとフロックスマウスは、遺伝子ヒト化マウス、蛍光レポーター、および条件付きノックアウトマウスモデルと同じくらい重要です。したがって、この記事では、遺伝子カセットノックインおよびフロックスマウスを生成するためのC57BL / 6JマウスにおけるCRISPR因子および二本鎖DNAドナーの接合子マイクロインジェクションのプロトコルを提示します。この記事は、細胞質注入ではなく核注射にのみ焦点を当てています。接合子マイクロインジェクションに加えて、生産プロセスのタイムラインと、過排卵誘導や胚移植などの周辺技術を概説します。
Introduction
目的の外因性遺伝子を標的遺伝子座に導入したノックインマウスは、遺伝子ヒト化マウス、蛍光レポーターマウス、およびCreドライバーマウスとして多くのin vivo研究で広く使用されています1,2。マウス接合子のゲノム編集によってノックイン変異が誘導される場合、ドナーDNAとして一本鎖DNA(一本鎖オリゴDNAドナー、ssODN)または二本鎖DNA(dsDNA)が使用されます2,3。ssODNは主に、200 bp4未満の比較的短い遺伝子断片をノックインするために使用されます。長いssODN(lsODN)5,6を使用して1 kb DNAより長いフラグメントをノックインすることは可能ですが、その調製には時間がかかります。dsDNAドナーを使用すると、手間のかかるドナーDNA調製なしで遺伝子カセット(>1 kb)ノックインマウスを生成できます7。
ssODNを使用する主な利点は、エレクトロポレーション8がノックインマウスを生成できることです。ただし、dsDNAドナーは、接合子マイクロインジェクションによって核に直接導入する必要があります。各loxP配列を標的遺伝子の上流と下流にノックインするフロックスマウスを作成するには、2つの部位で同時にノックインする必要があります。マウス接合子のゲノム編集によってフロックスマウスを生成するには、それぞれが単一のloxPサイトを持つ2つの独立したssODNを使用するか、フロックス配列を持つ単一のdsDNA(またはlsDNA)を使用するかの2つの方法があります。前者は非常に非効率的です9,10,11。dsDNAドナーを用いたゲノム編集は、環境が接合子マイクロインジェクションを助長する場合、遺伝子カセットノックインマウスおよびフロックスマウスを作製するための最も簡単なアプローチです。
最初に、Cas9 mRNAとsgRNAの混合物、またはsgRNAとCas9をコードするDNAベクターが、マウス接合体のゲノム編集に使用されます12,13。高品質で安定したCas9タンパク質が低コストで入手できるようになったため、マウス接合子14へのcrRNA-tracrRNA-Cas9リボ核タンパク質(RNP)の導入が一般的になっています。近年、ノックインが最も起こりやすい細胞周期期において、マウス接合体の両前核にcrRNA-tracrRNA-Cas9 RNPとドナーDNAを導入することにより、高効率でノックインマウスが作製されている15。そこで、本プロトコールは、この方法によって様々なタイプのノックインマウスを作製する技術を記載する。
実験用マウス16には多くの有用な近交系がある。近交系の背景内の遺伝子組み換えは、表現型に対する遺伝的背景の影響を無視することができます。この記事では、最も一般的に使用されている近交系マウス系統であるC57BL / 6J17の接合子に遺伝子カセットノックインおよびフロックス変異を誘導する方法について説明します。さらに、遺伝子改変マウスの作製のタイムラインと、過排卵の誘導や胚移植を含む周辺技術についても説明します。
Protocol
すべての動物実験は、筑波大学動物実験規程及び文部科学省所管の学術研究機関における動物実験等の適正な実施に関する基本指針に基づき、筑波大学機関動物実験委員会の承認を得て人道的に実施されたこと。 日本の文化・スポーツ・科学技術.10〜25週齢の男女のC57BL/6Jマウスを接合子ドナーとして使用した。ICRマウス(10週齢)をレシピエントマウスとして用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。
1. 無細胞系におけるcrRNA切断活性の確認
- 2 nmolのcrRNA(乾燥)および20 nmolのtracrRNA(乾燥)をそれぞれ25 μLおよび250 μLのRNaseフリー水に溶解します( 材料の表を参照)。
注:切断活性が高く、オフターゲットができるだけ少ないと予測されたCRISPRターゲット配列は、CRISPORを使用して選択されます( 材料の表を参照)。遺伝子カセットノックインの場合は、挿入部位を横切って配列を標的にします。フロックスするエクソンは、KOnezumiを使用して選択しました( 材料表を参照)。 - ゲノムPCR9によって標的部位を含むDNA断片(約0.5〜1kb)を増幅します。このPCRアンプリコンを一般的なPCR産物抽出キットで精製します(材料の表を参照)。
- 10 μLのCRISPR混合物を調製します(Cas9ヌクレアーゼ反応バッファーに100 ng/μLのcrRNA、150 ng/μLのtracrRNA、および1 ng/μLのCas9、 材料表を参照)。CRISPR-Cas9複合体を構築するには、CRISPR混合物を37°Cのヒートブロックに30分間入れます。
- ステップ1.2に記載のPCR産物(10 μL、20 ng/μL)にCRISPR混合物の全量(10 μL)を加え、37°Cで1時間インキュベートします。電気泳動中にRNAが存在しないため、1 μLのRNase(500 ng/μL)を加えてcrRNAとtracrRNAを37°Cで30分間分解します。ドデシル硫酸ナトリウム(2% w/v)を含むローディング色素を用いて、上記のサンプルの電気泳動を行います。
注:まれに、切断活性のないcrRNAが観察されます。このような場合は、ゲノム編集デザインを再設計することをお勧めします。
2. 接合子マイクロインジェクションのためのcrRNA、tracrRNA、Cas9タンパク質、およびドナーDNAの混合物の調製
- CRISPR溶液(50 ng/μLのcrRNA、200 ng/μLのtracrRNA、および200 ng/μLのCas9をRNaseフリー水中で)を調製します。ドナーDNA溶液(20 ng/μLの自己構築プラスミドDNAベクター)を調製します。
- ドナーDNA溶液を、孔径0.22μmの滅菌シリンジフィルターでろ過します。等量のCRISPR溶液とろ過されたドナーDNA溶液を混合します。それぞれの最終濃度が25 ng/μLのcrRNA、100 ng/μLのtracrRNA、100 ng/μLのCas9、および10 ng/μLのドナーDNAであることを確認してください。この混合物を以後RNPDと呼ぶことにする。
注:フロックスマウスの作製中など、2つの部位を切断する場合、各crRNAの濃度は25 ng / μLでなければなりません。ドナーDNAは環状プラスミドDNAであり、一般的なミニ分取スピンカラムキットで精製できます( 材料表を参照)。調製した溶液を氷上に置き、できるだけ早くマイクロインジェクションに使用する必要があります。
- ドナーDNA溶液を、孔径0.22μmの滅菌シリンジフィルターでろ過します。等量のCRISPR溶液とろ過されたドナーDNA溶液を混合します。それぞれの最終濃度が25 ng/μLのcrRNA、100 ng/μLのtracrRNA、100 ng/μLのCas9、および10 ng/μLのドナーDNAであることを確認してください。この混合物を以後RNPDと呼ぶことにする。
3. 自然交配によるマウス接合体の入手
- マイクロインジェクションの3日前に、妊娠中の牝馬の血清ゴナドトロピン(PMSG、 材料の表を参照)をC57BL / 6J雌マウス(10〜25週齢)に皮下注射します。.約46〜48時間後、5IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG、 材料の表を参照)を腹腔内に投与する。PMSGおよびhCG処理された雌マウスを雄のC57BL / 6Jマウスと共存させ、翌朝膣栓をチェックします。
注:1匹の雌C57BL / 6Jマウスから約15〜25個の接合子を得ることができます。タイムラインを 図 1 に示します。 - 図2に示すように、接合子培養用の35 mmペトリ皿を 2枚用意します。使用するまでインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れます。これらは一晩保管することができます。
- 頸部脱臼によって確認された膣栓で雌マウスを安楽死させ、小さなハサミを使用して、下腹部の正中線から肋骨の下まで腹部の皮膚と筋肉層を切開します。
注:安楽死については、地元の動物倫理委員会の推奨事項に従ってください。 - 卵管を収集し、ペトリ皿の蓋にある0.75 mg / mLのヒアルロニダーゼ( 材料の表を参照)を含むM2培地の20 μL滴に入れます。細い先端鉗子で卵管を1つピックアップし、約50 μLのM2培地をヒアルロニダーゼとともにフィンブリエに灌流します。
注:現時点では、接合子は多数の積雲細胞に緩やかに囲まれています。 - 30秒後、ガラスキャピラリーを使用して少量の培地で形態学的に正常な接合子をピックアップし、新鮮なM16培地液滴に移して洗浄します。洗浄した接合子をペトリ皿(図2)に移してプーリングします。
メモ: タイムラインを 図 1 に示します。形態学的に正常な接合子は、雄と雌の前核と、球形をひどく損なっていない2つの極体を持っています15。接合子の形態は、系統や種によってかなり異なります。 - すべての接合子が取得されるまで、手順 3.3 と 3.4 を繰り返します。約100個の接合子を培養皿に1つのM16ドロップにプールできます。マイクロインジェクションまでインキュベーター(37°C、5%CO2)にディッシュを保存する。
4.マイクロインジェクションニードルの調製
- プログラム可能なピペットプーラーを使用して、いくつかのガラスピペットを引きます(材料の表を参照)。
注意: マイクロインジェクションニードルは、細い先端と長いテーパーを備えている必要があります。プーラーが細胞質内精子注入用の針を作るためのプログラムを持っている場合、同じプログラムを使用してマイクロインジェクション用の針を作ることができます。 - マイクロフォージ先端に付いているガラス玉を叩いてマイクロ注入針の先端を折る。マイクロインジェクションニードルの先端サイズが直径約1μmであることを確認してください。顕微鏡で先端サイズを1000倍の倍率で確認してください。
- マイクロフォージを使用して、先端から約2〜3 mmでマイクロ注入針を曲げます。
注意: 曲げの角度は、マイクロマニピュレーターのセットアップによって異なります。曲げすぎると、ピエゾパルスの効果が低下します。
5.接合子マイクロインジェクション
- 1〜1.5cmの操作液(水銀の代わりにピエゾ効果が穴を開けるために必要な慣性体、 材料の表を参照)をマイクロインジェクションニードルの中央に注入し、ピエゾアクチュエータで手動マイクロインジェクターホルダーに取り付けます。
- さらに、保持針を反対側の手動マイクロインジェクターホルダーに取り付けます。操作液をマイクロインジェクション針先に徐々に圧力で移動させます。両方の手動マイクロインジェクターホルダーをマイクロマニピュレーターに固定します。
注:マイクロインジェクションニードルの先端から出てくる手術液は、顕微鏡で50倍の倍率で観察できます。放出される液体の量を調整した後、ピエゾパルスが印加されたときに液体の飛散を観察することができ、ピエゾパルスが有効であることが確認されます。これが確認できない場合は、マイクロインジェクションニードルを再準備してください。
- さらに、保持針を反対側の手動マイクロインジェクターホルダーに取り付けます。操作液をマイクロインジェクション針先に徐々に圧力で移動させます。両方の手動マイクロインジェクターホルダーをマイクロマニピュレーターに固定します。
- 3つの液滴を含む注入チャンバーを準備します:(1)10μLのM2培地;(2)M2培地中の5μLの12%ポリビニルピロリドン(PVP);(3)crRNA、tracrRNA、Cas9タンパク質、およびドナーDNA(RNPD)溶液の5 μL混合物。ステップ3.2と同様に液滴を鉱物油で覆い、注入チャンバーを倒立顕微鏡ステージにセットします。
- 倒立顕微鏡で50倍の倍率で、マイクロインジェクションピペットを12%PVPドロップまで下げます。12%PVPを吸引して分注し、マイクロインジェクション針先の内側を洗浄し、RNPD液滴に移します。
- 手動マイクロインジェクターを負圧下に置き、RNPD溶液をマイクロインジェクションニードルに吸い上げます。十分な音量が吸引されるまで数分待ちます。50倍に拡大した顕微鏡下で、マイクロインジェクションニードルの内側全体を液体で満たします。
- 吸気を停止し、手動マイクロインジェクターを陽圧に設定してRNPD溶液を徐々に排出できるようにします。マイクロインジェクションニードルの先端をオイルに動かします。
注意: 手動マイクロインジェクターのノブを反時計回りに回して吸入します。吸入を停止するには、ノブを時計回りに回し、顕微鏡で観察しながら徐々に圧力を上げます。RNPD溶液は徐々に排出されます。マイクロインジェクションニードル内の液面移動により、流出の確認が可能です。
- 吸気を停止し、手動マイクロインジェクターを陽圧に設定してRNPD溶液を徐々に排出できるようにします。マイクロインジェクションニードルの先端をオイルに動かします。
- M2液滴に50個の接合子を入れ、保持ピペットを同じ液滴に静かに下げます。マイクロインジェクションニードルを接合子を含むM2ドロップに移します。20倍の対物レンズに切り替えて、マイクロインジェクションピペットの先端に焦点を合わせます。
注:10分で注入できる接合子をできるだけ多く入れます。 - 接合子を持ち、マイクロマニピュレーターを動かして前核に焦点を合わせます。マイクロインジェクションニードルを接合子に挿入し、先端を前核に近づけます。先端が前核膜に到達したら、ピエゾパルス(強度:6-10、速度:1)を印加して穴を開けます。
- マイクロインジェクション針が前核に穿刺したら、RNPD溶液を注入し、前核の腫れを観察します。前核が完全に膨らんだら、すぐに針を引き抜きます。女性と男性の両方の前核で同じ手順を実行します。
注:注射による前核の膨張は、顕微鏡ではっきりと見ることができます。このインフレの程度を言語化することは困難ですが、以前のレポートを参照することで確認できます15。
- マイクロインジェクション針が前核に穿刺したら、RNPD溶液を注入し、前核の腫れを観察します。前核が完全に膨らんだら、すぐに針を引き抜きます。女性と男性の両方の前核で同じ手順を実行します。
- 注入した接合子をM2液滴内の別の場所に移動して、注入前後の接合子を特定します。
- M5.5液滴内のすべての接合子が注入されるまで、手順5.6〜2を繰り返します。注射後、接合子を新鮮なM16皿に移します。
- 注射の10分後に生き残った接合子を選択します。注射によって損傷した溶解した接合子を取り除き、生き残った接合子をM16皿の各液滴に分配します。各液滴は、1人の偽妊娠女性に対して20〜24個の接合子を含まなければなりません。これにより、M16ディッシュが胚移植中にインキュベーター外の環境にさらされる時間が短縮されます。
注意: 最適な注入条件下では、生存率は90%〜95%です。これは、針先のサイズ、ピエゾパルスの強さ、およびRNPD溶液の流出圧力に依存します。
6.卵管への胚移植
- 偽妊娠マウスを得るために、発情前期の各雌ICRマウスを血管結紮した雄ICRマウスと交配させる。翌日プラグを確認してください。
注:約15匹の偽妊娠マウスが20組の交配ペアから得られます。 - 3種類の混合麻酔薬(0.2 mg / kgのメデトミジン、4.0 mg / kgのミダゾラム、および2.5 mg / kgのブトルファノール、 材料の表を参照)を偽妊娠中の雌マウスに皮下投与します。.呼吸数の低下と尾挟みと後肢ペダルの離脱反射の消失により、適切な麻酔を確認します。眼科用軟膏を塗布して、地元の動物倫理委員会の推奨事項に従って目を滑らかにします。
- マウスの背部を腹臥位で剃り、手術部位をヨウ素またはクロルヘキシジンベースのスクラブとアルコールを交互に3回消毒した後、背側皮膚を脊椎に沿って約1 cm切開します。
- 背側切開創を腹側の片側に移動し、卵巣が見える筋肉層を切開し、ピンセットで卵巣の上の脂肪をつかみ、卵巣、卵管、子宮を抜く。
- セレファインクランプで脂肪を固定します( 材料表を参照)。コートとの直接接触を避けるために、生殖組織を滅菌ガーゼの上に置きます。
- 次の順序で、少量の培養液(M2またはM16)、マーカーとして気泡を入れ、接合子をピペットに入れて移します。
注:卵管あたり約10〜12個の接合子を移します。 - 膨大部と卵管の線毛の間にマイクロせん断( 材料の表を参照)を使用して切開を行い(ガラスピペットが入るのに十分な長さ)、接合子を切開部に導入し、同時に気泡が導入されていることを確認します。
- 同様に他の卵管への移植を行う(ステップ6.6)。
- オートクリップで外皮を縫合します( 材料表を参照)。
注:切開創がやむを得ず大きくない限り、切開された筋肉層を縫合しないでください。切開された筋肉層の理想的なサイズは2〜3 mm未満でなければなりません。切開が5 mmを超える場合は、滅菌した縫合針と糸を使用して筋肉層を縫合する必要があります( 材料の表を参照)。
7.動物の回復
- 塩酸アチパメゾール(0.3 mg / kg)をマウスに皮下投与します。.
注:術後鎮痛については、地元の動物倫理委員会の推奨事項に従ってください。 - 次に、マウスをケージに入れ、37°Cのホットプレートで保温します。
- マウスが目覚めた後、約2時間暖かく保ちます。マウスの異常な行動がないことを確認したら、ケージを飼育ラックに戻します。
Representative Results
このプロトコルを用いた遺伝子カセットノックインおよびフロックスマウスの産生結果を表 1 および 表2に示す。各ゲノム編集マウス系統は現在、独立した未発表のプロジェクトで使用されているため、標的遺伝子は述べられていません。代わりに、標的染色体領域が記載された。
ジェノタイピング分析は、以前に報告された方法18を使用して実行されました。このジェノタイピング法では、意図しない染色体部位にドナーDNAが挿入されたマウスは、所望のゲノム編集が誘導されても陽性個体としてカウントされない。したがって、ゲノム編集自体の効率ではなく、実際の目的に真に有用な創始マウスの生産効率が示されました。
13匹の独立した遺伝子カセットノックインマウスの生産効率の中央値は20.8%であり、最大39.5%、最小7.9%でした(表1)。この効率は十分に実用的であると考えられた。致死的な胚性遺伝子は、遺伝子カセットノックイン中に標的にされませんでした。この非致死性遺伝子標的条件下での出生率の中央値は34.0%(最大43.3%、最小15.9%)でした。これは遺伝子操作なしの胚移植における出生率に匹敵することから、導入されたゲノム編集要素の毒性や接合子マイクロインジェクションの物理的損傷が胚発生に影響を与える可能性は低いと考えた。
10匹の独立したフロックスマウスの生産効率の中央値は7.7%であり、最大20.7%、最小2.1%でした(表2)。いくつかの標的遺伝子の機能は不明であったが、出生率の中央値は30.2%であり、最大43.8%、最小17.3%であった。この速度は遺伝子カセットノックインマウスと同等であり、マイクロインジェクション操作がフロックスマウスの胚発生に与える影響はごくわずかであることが示唆されました。
図1:接合子マイクロインジェクションのタイムライン。 白と暗い色は、それぞれ明るいサイクルと暗いサイクルを示します。マウスは、14時間の明/ 10時間の暗サイクルで維持されました。PMSG:妊娠中の牝馬の血清ゴナドトロピン;hCG: ヒト絨毛性ゴナドトロピン この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:培養皿の調製 。 (a)注射前の接合子用の培養皿。M16培地(それぞれ20〜25μL)を2滴、35mmのプラスチックペトリ皿に入れます。(B)注射後の接合子用の培養皿。M10を10滴(各滴につき20〜35μL)を35mmのプラスチックペトリ皿に入れます。滴を鉱油(3mL)で覆う。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 標的染色体領域 | の数 | ノックイン挿入長さ (kb) | 相同性アームの長さ (kb) | ||||||
| 胚 | 新生児 | 検査(離乳) | ノックインw/O rTG | rTGc | |||||
| 注入 | 転送 | 5フィートアーム | 3フィートアーム | ||||||
| 2qE2 | 349 | 331 | 114人(34.4%)a | 114 | 9 (7.9%) | 5 (4.4%) | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 2qE2 | 231 | 215 | 78 (36.3%) | 74 | 15 (20.3%) | 23人(31.1%) | 2.2 | 1.0 | 1.1 |
| 5qG2 | 288 | 262 | 90人(34.4%)a | 81 | 19 (23.5%) | 18人(22.2%) | 1.6 | 2.0 | 2.0 |
| 6qB1 | 278 | 259 | 58人(22.4%)a | 46 | 11 (23.9%) | 11人 (23.9%) | 4.2 | 1.2 | 1.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 295 | 277 | 97人(35.0%)a | 23 | 2 (8.7%) | 4 (17.4%) | 6.5 | 1.1 | 3.0 |
| 6qE3 [ROSA26] | 246 | 219 | 87人(39.7%)a | 83 | 22 (26.5%) | 18人 (21.7%) | 5.8 | 1.1 | 3.0 |
| 7qF5 | 279 | 268 | 116人(43.3%)a | 114 | 45 (39.5%) | 44人(38.6%) | 1.4 | 3.1 | 1.0 |
| 11qB4 | 405 | 353 | 56人(15.9%)a | 47 | 8 (17.0%) | 12人 (25.5%) | 1.7 | 1.0 | 0.8 |
| 11qD | 310 | 294 | 100人(34.4%)a | 98 | 15 (15.3%) | 76人(77.6%) | 1.0 | 1.8 | 2.4 |
| 12qE | 368 | 320 | 86人(26.9%)a | 84 | 12 (14.3%) | 19人(22.6%) | 3.4 | 1.1 | 1.3 |
| 12qF1 | 315 | 265 | 76人(28.7%)a | 72 | 17 (23.6%) | 28人(38.9%) | 1.0 | 1.1 | 1.1 |
| 14qE5 | 256 | 215 | 48人(22.3%)a | 48 | 11 (22.9%) | 21人(43.8%) | 3.1 | 1.0 | 0.9 |
| 14qE5 | 287 | 285 | 85人(29.8%)A | 72 | 15 (20.8%) | 19人(26.4%) | 2.6 | 1.0 | 0.9 |
表1:マイクロインジェクションによるノックインマウス作製。 この表は、ドナーDNAの(W / O)ランダム統合(rTG)なしで意図したノックイン対立遺伝子を運ぶマウスの出生率と産生効率を示しています。すべてのプロジェクトで意図したノックイン対立遺伝子を持つマウスを得ることができました。a:新生児数/移植胚数;b:ノックイン対立遺伝子を運ぶマウスの数/検査されたマウスの数;C:意図した対立遺伝子があるかどうかは定かではありません。d:rTG対立遺伝子担持マウスの数/検査マウスの数;rTG:ドナーベクターのランダム積分。W / O:なし。
| 標的染色体領域 | の数 | フロックスの長さ (KB) | 相同性アームの長さ (kb) | |||||
| 胚 | 新生児 | 検査(離乳) | フロックス w/o rTG | |||||
| 注入 | 転送 | 5フィートアーム | 3フィートアーム | |||||
| 3qC | 325 | 313 | 93人(29.7%)a | 87 | 9 (10.3%) | 1.3 | 1.2 | 1.1 |
| 4qB1 | 210 | 200 | 36人(18.0%)a | 29 | 6 (20.7%) | 1.6 | 1.2 | 0.9 |
| 4qC4 | 272 | 256 | 112人(43.8%)a | 100 | 5 (5.0%) | 2.4 | 1.0 | 1.4 |
| 5qF | 143 | 137 | 40人(29.2%)a | 40 | 6 (15.0%) | 1.8 | 1.0 | 1.1 |
| 5qF | 255 | 227 | 80人(35.2%)a | 76 | 2 (2.6%) | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 9qE3.1 | 289 | 261 | 80 (30.7%)a | 77 | 9 (11.7%) | 1.2 | 1.2 | 1.2 |
| 10qB3 | 284 | 269 | 88人(32.7%)a | 78 | 3 (3.8%) | 1.3 | 1.1 | 0.9 |
| 10qC1 | 243 | 231 | 40 (17.3%)a | 38 | 4 (10.5%) | 2.1 | 1.0 | 1.3 |
| 14qE5 | 390 | 372 | 139人(37.4%)a | 135 | 5 (3.7%) | 1.1 | 0.8 | 0.9 |
| 17qA3.3 | 383 | 374 | 99人(26.5%)a | 95 | 2 (2.1%) | 2.1 | 0.6 | 0.8 |
表2:マイクロインジェクションによるフロックスマウスの作製。 この表は、ドナーDNAの(W / O)ランダム統合(rTG)なしで意図したフロックス対立遺伝子を運ぶマウスの出生率と産生効率を示しています。すべてのプロジェクトで意図したフロックス対立遺伝子を持つマウスを得ることができました。a:新生児数/移植胚数;B:FLOX対立遺伝子担持マウス数/検査マウス数。rTG:またはドナーベクターのランダムな統合;W / O:なし。
Discussion
本研究では、自然交配から得られた新鮮な(凍結融解していない)C57BL/6Jマウス接合子をゲノム編集マウスの作製に使用しました。ノックインが最も起こりやすい細胞周期期に、これらの接合体の両前核にcrRNA-tracrRNA-Cas9とドナーDNA(RNPD)を注入することにより、高い出生率と十分なゲノム編集効率で遺伝子カセットノックインマウスとフロックスマウスを作製しました。本研究は、SPRINT-CRISPR法15の拡張性を強化し、C57BL/6Jの遺伝的背景においても十分なノックイン効率を確保し、フロックスマウスの作製に適用することができる。
エレクトロポレーションは、実験装置の低コストと技術の習得の容易さのために、ゲノム編集マウスを作製するための高度に一般化された方法です8。さらに、卵管に存在する着床前胚を用いてゲノム編集を行うi-GONAD法19は、レシピエントマウスを必要としない。これらの方法に比べ、本手法は、実験環境をハードウェアとソフトウェアの両面で準備・維持する際にコストと時間がかかる。しかし、実験設備を設置すれば、市販のCRISPRエレメント(crRNA、tracrRNA、Cas9タンパク質)と、ドナーDNAとして使用される単純で少量の環状プラスミドベクターのみで、複雑な遺伝子カセットノックインマウスやフロックスマウスを作製することができます。これは、多くの複雑なゲノム編集マウス株を、時間のかかる(または比較的高価な)lsODN5、6またはアデノ随伴ウイルスベクター20を調製することなく作製することができることを意味する。
元のSPRINT-CRISPR法15とは異なり、新鮮な(凍結融解)接合子が使用されました。自然交配によって新鮮な接合子を得る場合、 体外 受精または凍結融解中に発生する可能性のある技術的エラーは無視できます。また、胚操作プロセスは、現在のアプローチに従って約半日で完了することができます(図1)。一方、本手法には、多数の雄マウスを必要とすること、受精時期の制御が緩いこと、マイクロインジェクション用の接合子の数を完全に予測する能力が限られていることなどがある。元のSPRINT-CRISPR法と比較して、この方法は出生率が高い可能性があります(表1)。しかし、実験の指揮者、標的遺伝子、遺伝的背景、胚確認のタイミングの違いから、出生率の点では本手法の方が優れているとは言えない。
表1に示すように、ほとんどの遺伝子カセットノックインプロジェクトにおいて多数のマウスがランダム組込み対立遺伝子を有していた。ランダム統合は、内因性遺伝子の意図しない破壊および導入遺伝子の異所性発現につながる可能性があるため、排除する必要があります。将来の課題は、十分なノックイン効率を維持しながら、ランダムな積分イベントの数を減らす実験条件を見つけることです。
DNA二本鎖切断をもたらすゲノム編集エフェクターを用いたほとんどすべてのマウス接合子ゲノム編集は、オンターゲット部位に意図しない突然変異を誘発する可能性が高い9,21。これらの意図しないオンターゲット変異の結果は、次世代のマウスが明確な証拠を提示するために管理できる状況にないため、ここでは説明しません。意図しないオンターゲット突然変異誘発によって引き起こされる混乱の懸念を排除する最良の方法は、創始者を交配するのではなく、創始者と野生型マウスを交配することによって次世代のマウスを得ることである。原則として、この交配から生じるN1マウスは、対立遺伝子の片側の野生型(WT)であるため、意図したノックイン(KI)対立遺伝子が検出された場合、それらはWT / KIヘテロ接合型です。したがって、オンターゲット突然変異誘発は、比較的速いライフサイクルを持ち、多産な動物である実験用マウスでは重大な問題ではありません。しかし、この技術を比較的大型の哺乳類に適用する場合は、さらなる改善が必要です。
この技術は、C57BL/6J以外の近交系系統で遺伝子カセットノックインマウスを作製できることが確認されているが、十分な数のプロジェクトが確保されておらず、データは非常に多様である。このため、この情報は本研究には含まれていません。マウスの遺伝学と疾患モデル研究を進めるためには、このテーマに関するさらなる研究が必要であると考えられています。
Disclosures
著者らは、競合する利益はないと宣言しています。
Acknowledgments
本研究は、文部科学省の基盤研究(B)(19H03142:SMへ)、科学研究(A)(20H00444:FSへ)、科学研究(A)(21H04838:SMへ)、および新学術領域研究「先端動物モデル支援プラットフォーム」(16H06276:ST)の支援を受けて行われました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も果たしていませんでした。森良一氏には、ゲノム編集設計に関する有益な議論をしていただき、感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | - | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | - | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | - | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | - | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | - | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | - | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | - | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | - | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | - | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | - |
References
- Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
- Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
- Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
- Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
- Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
- Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
- Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
- Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
- Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
- Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
- Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).
