Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحديد الكاسباس وزخارفه التي تشق البروتينات أثناء عدوى فيروس الأنفلونزا أ

Published: July 21, 2022 doi: 10.3791/64189
Automatic Translation
1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Otago

Summary

تنشط عدوى فيروس الأنفلونزا A (IAV) الكاسباز الذي يشق المضيف والبروتينات الفيروسية ، والتي بدورها لها وظائف مؤيدة ومضادة للفيروسات. من خلال استخدام مثبطات ، وتداخل الحمض النووي الريبي ، والطفرات الموجهة للموقع ، والنشاف الغربي وتقنيات RT-qPCR ، تم تحديد الكاسباز في خلايا الثدييات المصابة التي تشق الكورتاكتين المضيف و deacetylases هيستون.

Abstract

Caspases ، وهي عائلة من بروتياز السيستين ، تنظم موت الخلايا المبرمج استجابة للمحفزات المختلفة ، بما في ذلك الالتهابات الميكروبية. وصف موت الخلايا المبرمج في البداية بأنه يحدث عن طريق موت الخلايا المبرمج ، ومن المعروف الآن أنه يشمل ثلاثة مسارات مترابطة: pyroptosis ، وموت الخلايا المبرمج ، و necroptosis ، والتي صيغت معا كعملية واحدة ، PANoptosis. تأثير عدوى الفيروس (IAV) يحفز PANoptosis في خلايا الثدييات عن طريق تحفيز تنشيط caspases مختلفة ، والتي بدورها تشق العديد من البروتينات المضيفة وكذلك الفيروسية ، مما يؤدي إلى عمليات مثل تنشيط الاستجابة الفطرية المضادة للفيروسات المضيفة أو تدهور البروتينات المضيفة المعادية. في هذا الصدد ، تم اكتشاف انشقاق كاسباز 3 بوساطة كورتاكتين المضيف ، وهيستون ديسيتيلاز 4 (HDAC4) ، وهيستون ديسيتيلاز 6 (HDAC6) في كل من الخلايا الظهارية الحيوانية والبشرية استجابة لعدوى IAV. لإثبات ذلك ، تم استخدام مثبطات ، وتداخل الحمض النووي الريبي ، والطفرات الموجهة للموقع ، وبعد ذلك ، تم قياس الانقسام أو مقاومة الانقسام واستعادة الكورتاكتين ، HDAC4 ، و HDAC6 polypeptide بواسطة النشاف الغربي. تشكل هذه الطرق ، جنبا إلى جنب مع RT-qPCR ، استراتيجية بسيطة ولكنها فعالة لتحديد المضيف وكذلك البروتينات الفيروسية التي تخضع للانقسام بوساطة caspase أثناء الإصابة ب IAV أو الفيروسات البشرية والحيوانية الأخرى. ويفصل هذا البروتوكول النتائج التمثيلية لهذه الاستراتيجية، كما تناقش سبل جعلها أكثر فعالية.

Introduction

فيروس الأنفلونزا A (IAV) هو العضو النموذجي في عائلة Orthomyxoviridae ومن المعروف أنه يسبب أوبئة عالمية وأوبئة لا يمكن التنبؤ بها. يسبب IAV أمراض الجهاز التنفسي البشرية ، والأنفلونزا ، والمعروفة باسم "الأنفلونزا". الأنفلونزا مرض حاد يؤدي إلى تحريض الاستجابات المناعية الفطرية المؤيدة والمضادة للالتهابات وموت الخلايا الظهارية في الجهاز التنفسي البشري. تخضع كلتا العمليتين لظاهرة تسمى موت الخلايا المبرمج1. يتم تحفيز إشارات موت الخلايا المبرمج بمجرد أن تستشعر مستقبلات التعرف على مسببات الأمراض المختلفة جزيئات الفيروس الواردة في الخلايا المضيفة. هذا يؤدي إلى برمجة موت الخلايا المصابة والإشارة إلى الخلايا السليمة المجاورة من خلال ثلاثة مسارات مترابطة تسمى pyroptosis ، موت الخلايا المبرمج ، و necroptosis - تمت صياغتها مؤخرا كعملية واحدة ، PANoptosis1.

يتضمن PANoptosis المعالجة المحللة للبروتين للعديد من البروتينات المضيفة والفيروسية من الحث إلى التنفيذ. هذه المعالجة للبروتينات تقودها في المقام الأول عائلة من بروتياز السيستين تسمى caspases 1,2. ما يصل إلى 18 كاسباس (من كاسباز 1 إلى كاسباز 18) معروفة3. يتم التعبير عن معظم الكاسباس على أنها مؤيدة للكاسباس ويتم تنشيطها من خلال الخضوع للمعالجة المحللة للبروتين الخاصة بها إما عن طريق التحفيز الذاتي أو الكاسباسات الأخرى4 استجابة لمحفز مثل عدوى الفيروس. كان يعتقد أن PANoptosis للخلايا المصابة ب IAV هي آلية دفاع مضيفة ، لكن IAV طورت طرقا للتهرب منها واستغلالها لتسهيل تكرارها1،2،5،6. أحدها هو استعداء العوامل المضيفة عن طريق الانقسام بوساطة caspase أو التدهور الذي يكون إما مضادا للفيروسات بطبيعته أو يتداخل مع إحدى خطوات دورة حياة IAV. تحقيقا لهذه الغاية ، تم اكتشاف عوامل المضيف ، الكورتاكتين ، HDAC4 ، و HDAC6 للخضوع للانقسام بوساطة caspase أو التدهور في الخلايا الظهارية المصابة IAV7،8،9. HDAC4 و HDAC6 هما عاملان مضادان ل IAV 8,10 ، ويتداخل الكورتاكتين مع تكرار IAV في مرحلة لاحقة من العدوى ، ربما أثناء التجميع الفيروسي والتبرعم11.

بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا تنشيط العديد من caspases ، والتي بدورها تشق بروتينات متعددة لتنشيط الاستجابة الالتهابية للمضيف أثناء عدوى IAV 1,2. علاوة على ذلك ، فإن البروتين النووي (NP) ، وبروتين القناة الأيونية M2 من IAV12،13،14 ، والبروتينات المختلفة للفيروسات الأخرى3،15،16 تخضع أيضا للانقسام بوساطة caspase أثناء العدوى ، مما يؤثر على التسبب في الفيروس. لذلك ، هناك حاجة مستمرة لدراسة الانقسام بوساطة caspase أو تدهور البروتينات المضيفة والفيروسية أثناء IAV والتهابات الفيروسات الأخرى لفهم الأساس الجزيئي للتسبب الفيروسي. هنا ، يتم تقديم الطرق من أجل (1) تقييم انشقاق أو تدهور هذه البروتينات بواسطة الكاسباز ، (2) تحديد تلك الكاسباس ، و (3) تحديد مواقع الانقسام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم الحصول على الموافقات التنظيمية من لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية بجامعة أوتاجو للعمل مع IAV وخلايا الثدييات. تم استخدام كلية مادين داربي للكلاب (MDCK) أو الخلايا الظهارية السنخية الرئوية البشرية A549 والأنواع الفرعية IAV H1N1 للدراسة الحالية. نمت IAV في بيض الدجاج ، كما هو موضح في مكان آخر17. واستخدمت الظروف المعقمة والمعقمة للعمل مع خلايا الثدييات، واستخدم مرفق السلامة الأحيائية من المستوى 2 (أو الاحتواء المادي 2) وخزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية للعمل مع الأنواع الفرعية من IAV.

1. تقييم انشقاق أو تدهور البروتينات في الخلايا المصابة ب IAV بواسطة الكاسباز

  1. بذرة 3 × 105 خلايا MDCK أو A549 لكل بئر في لوحة زراعة خلايا مكونة من 12 بئرا.
    ملاحظة: في حالة استخدام خلايا MDCK ، تأكد من أن الجسم المضاد ضد البروتين محل الاهتمام يتعرف على أنواع الكلاب.
  2. بذر الآبار في أزواج ، أي زوج تحكم - بئر واحد للعينة الوهمية غير المصابة وواحد للعينة المصابة - وزوج اختبار - بئر واحد لعينة المثبط A غير المصابة وواحد للعينة المثبطة المصابة A. زيادة عدد الأزواج مع كل مثبط إضافي (انظر المراجع7،8).
  3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت جو 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  4. في اليوم التالي ، تصيب الخلايا ب IAV (نوع فرعي H1N1 أو نوع فرعي آخر).
    1. لهذا ، قم بإعداد لقاح الفيروس عن طريق تخفيف مخزون الفيروس في 400 ميكرولتر من الحد الأدنى من الوسط الأساسي الخالي من المصل (MEM) (انظر جدول المواد) عند تعدد العدوى (MOI) من 0.5-3.0 وحدات تشكيل البلاك (pfu) / الخلية 7,11 (عامل مضاعفة عدد الخلايا عند حساب MOI).
      ملاحظة: لإصابة خلايا MDCK ، استكمل لقاح الفيروس بتوسيل فينيل ألانيل كلوروميثيل كيتون (TPCK) - تربسين بتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل.
  5. قم بإزالة وسط المزرعة القديم من الخلايا (الخطوة 1.3) واغسل الخلايا ب 1 مل / بئر من MEM 2x الخالي من المصل.
  6. أضف 400 ميكرولتر من لقاح الفيروس (الخطوة 1.4.1) إلى الخلايا واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 35 درجة مئوية تحت جو 5٪ CO2 .
  7. في غضون ذلك ، قم بتخفيف مثبط الكاسباز (على سبيل المثال ، Z-DEVD-FMK) ، أو مثبط الليزوزوم (على سبيل المثال ، NH4Cl) ، أو مثبط البروتيازوم (على سبيل المثال ، MG132) (انظر جدول المواد) بتركيز نهائي قدره 40 ميكرومتر أو 20 مللي مول أو 10 ميكرومتر ، على التوالي ، في MEM7 الخالي من المصل (انظر جدول المواد). المثبطان الأخيران بمثابة عنصر تحكم. تمييع حجم متساو من المذيب (إذا كان غير الماء) المستخدمة لإعادة تشكيل أحد المثبطات في وسط خال من المصل كوهمي.
  8. قم بإزالة لقاح الفيروس واغسل الخلايا كما في الخطوة 1.5 (1x).
  9. أضف MEM الخالي من المصل ، 1 مل / بئر ، وهميا أو مكملا بمثبط ، إلى الخلايا واحتضان الخلايا كما في الخطوة 1.6. تعتبر هذه النقطة الزمنية بمثابة عدوى 0 ساعة.
  10. بعد 24 ساعة ، احصد الخلايا عن طريق كشطها باستخدام مكبس حقنة سعة 1 مل (جانب مطاطي) ونقلها إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 1.5 مل.
  11. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 12000 × جم لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جمع طافت باستخدام ماصة.
    ملاحظة: يمكن التخلص من هذا الطافي أو استخدامه في فحص اللويحات8 لقياس عيار ذرية الفيروس المنبعثة.
  12. اغسل حبيبات الخلية ب 250 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق إعادة الطرد المركزي كما في الخطوة 1.11.
  13. قم بإزالة المادة الطافية وقم بتحليل الخلايا عن طريق إضافة 80-100 ميكرولتر من محلول تحلل الخلية (50 mM Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.4 ، 150 mM كلوريد الصوديوم ، 0.5٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، 0.5٪ ديوكسي كولات الصوديوم ، 1٪ Triton X-100 ، وكوكتيل مثبط الأنزيم البروتيني 1x ، انظر جدول المواد) والدوامة.
  14. سخني الأنبوب عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتحلل تماما وتحضير محللة الخلية الكلية. قم بتخزين المحلل في 4 درجات مئوية لتنفيذ الخطوات 1.15-1.17 في اليوم التالي ، ولكن للحصول على أفضل النتائج ، قم بإنهاء هذه الخطوات في نفس اليوم.
  15. قم بتقدير كمية البروتين في كل عينة باستخدام مجموعة فحص BCA (انظر جدول المواد).
  16. حل كميات متساوية من البروتين من العينات غير المصابة والمصابة عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام SDS-polyacrylamide القياسي (SDS-PAGE)11 جنبا إلى جنب مع علامات الوزن الجزيئي11.
  17. انقل البروتين إلى غشاء نيتروسليلوز أو بولي فينيليدين ثنائي فلوريد (PVDF) (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: قد يعطي غشاء PVDF خلفية عالية في بعض أجهزة تصوير البقع الغربية. تحقق من التوافق.
  18. قم بإجراء النشاف الغربي للكشف عن البروتين محل الاهتمام باستخدام الطريقة الموضحة في مكان آخر11.
  19. قارن مستويات البروتين في ممرات العينات المصابة المعالجة والمعالجة بالمثبطات.
    ملاحظة: إذا تعافى مستوى البروتين في حارة العينة المصابة المعالجة بمثبطات الكاسباز ، فإن البروتين يشق أو يتحلل بواسطة الكاسباز. خلاف ذلك ، يتم تحلله إما عن طريق الليزوزوم أو البروتيازوم.
  20. حدد كمية استعادة البروتين عن طريق قياس شدة نطاقه في كل حارة من ثلاث نسخ متماثلة على الأقل من نفس التجربة وتطبيعها مع نطاق التحكم في التحميل المقابل.
  21. استخدم أي جهاز تصوير معاصر والبرامج المرتبطة به (انظر جدول المواد) لتصوير البقع الغربية وتحديد كمية استعادة البروتين.

2. تأكيد الانقسام بوساطة كاسباز أو تدهور البروتينات في الخلايا المصابة ب IAV عن طريق تداخل الحمض النووي الريبي

  1. تصميم أو الحصول على تصميم مسبق للحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) الذي يستهدف إما الكلاب أو الكاسباز البشري 3 وكاسباز 6 وكاسباز 7 (الجلاد كاسباس1) و siRNA للتحكم غير المستهدف (انظر جدول المواد).
  2. قم بتوصيل كل siRNA إلى خلايا MDCK أو A549 عن طريق النقل العكسي 8,11.
  3. لهذا ، قم بتخفيف 100 نانومتر من siRNA للتحكم أو caspase siRNA في أنابيب منفصلة أو حجم موصى به من كاشف النقل (انظر جدول المواد) في 100 ميكرولتر من الوسط المناسب (مثل OptiMEM ، انظر جدول المواد) ، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. تحضير كل تخفيف في نسختين.
    ملاحظة: تتضمن هذه النسخة المكررة نسخة متماثلة واحدة لتحليل ضربة قاضية لتعبير caspase بواسطة RT-qPCR أو النشاف الغربي (في حالة توفر الأجسام المضادة للكاسباز) وآخر لتقييم استعادة البروتين محل الاهتمام عن طريق النشاف الغربي.
  5. امزج 100 ميكرولتر من كل محلول siRNA مع 100 ميكرولتر من محلول كاشف النقل (الخطوة 2.3) واحتضانه لمدة 20-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتشكيل مجمع كاشف siRNA-transfection.
  6. في غضون ذلك ، قم بتقسيم وإضافة 1 × 10 5 خلايا MDCK أو A549 في 800 ميكرولتر من وسط النمو الكامل ، واخلطها مع 200 ميكرولتر من مجمع كاشف siRNA-transfection (الخطوة2.5 ) ، وأضف 1 مل من المعلق إلى بئر من لوحة استزراع 12 بئرا. هذا التخفيف يرفع التركيز النهائي للتحكم siRNA أو caspase siRNA إلى 10 نانومتر.
  7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت جو 5٪ CO2 لمدة 72 ساعة.
  8. احصد الخلايا من نسخة متماثلة واحدة كما في الخطوة 1.10 ، وقم بمعالجتها للتحقق من صحة أو تأكيد ضربة قاضية لتعبير caspase 3 و caspase 6 و caspase 7 إما عن طريق RT-qPCR أو النشاف الغربي ، على التوالي ، باستخدام الطرق والبروتوكولات القياسية 8,11.
  9. تصيب الخلايا في النسخ المتماثل الآخر ب IAV كما هو موضح في الخطوات 1.4-1.9 (بدون مثبطات).
  10. بعد 24 ساعة ، قم بحصاد الخلايا ومعالجتها وتحليلها عن طريق النشاف الغربي وقياس وقياس وقياس استرداد البروتين كما هو موضح في الخطوات 1.10-1.20.

3. الطفرات الموجهة للموقع لتحديد موقع (مواقع) انقسام الكاسباز في عديد الببتيد

  1. استنساخ البروتين المشفر للجين المهم في بلازميد تعبير الثدييات11 أو الحصول عليه من مختبر أبحاث أو مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يفضل إذا تم استنساخ الجين بعلامة epitope أو كاندماج GFP لتمييز عديد الببتيد المعبر عنه خارج الرحم عن الببتيد المعبر عنه داخليا أثناء النشاف الغربي.
  2. باستخدام قواعد بيانات الركيزةcaspase 4 أو أدوات محاذاة البروتين ، حدد موقع أشكال الانقسام caspase التوافقية ، XXXD و DXXD ، على عديد الببتيد. تمتلك جميع أشكال الانقسام الكاسباس تقريبا حمض الأسبارتيك في موقع الانقسام (P1) 3،4.
  3. تحور حمض الأسبارتيك P1 المفترض إلى حمض الجلوتاميك أو حمض أميني غير قطبي (ألانين ، فالين) عن طريق الطفرات الموجهة للموقع متبوعة بتسلسل الحمض النووي11 باستخدام الطرق والبروتوكولات القياسية.
  4. قم بتوصيل الحمض النووي للبلازميد من النوع البري (WT) والحمض النووي البلازميد الطافر إلى خلايا MDCK أو A549 عن طريق النقل العكسي11.
    1. لهذا ، قم بتخفيف 2 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد أو الحجم الموصى به من كاشف النقل في 100 ميكرولتر من وسط مناسب (انظر الخطوة 2.3 وجدول المواد) في أنابيب منفصلة ، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. امزج 100 ميكرولتر من كل محلول بلازميد DNA مع 100 ميكرولتر من محلول كاشف النقل واحتضانه لمدة 20-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتشكيل مجمع كاشف نقل الحمض النووي.
  5. في غضون ذلك ، قم بتقسيم وإضافة 3 × 105 خلايا MDCK أو A549 إلى 800 ميكرولتر من وسط النمو الكامل ، واخلطها مع 200 ميكرولتر من مركب كاشف نقل الحمض النووي ، وأضف معلق 1 مل إلى بئر من لوحة استزراع 12 بئرا.
  6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية تحت جو CO2 بنسبة 5٪.
  7. بعد 48 ساعة ، تصيب الخلايا ب IAV كما هو موضح في الخطوات 1.4-1.9 (دون إضافة المثبطات).
  8. بعد 24 ساعة ، قم بحصاد الخلايا ومعالجتها وتحليلها عن طريق النشاف الغربي (إن أمكن ، باستخدام الجسم المضاد لعلامة epitope أو GFP). بعد ذلك ، قم بقياس وتحديد تعافي البروتين كما هو موضح في الخطوات 1.10-1.20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

العلاج مع مثبطات كاسباز 3
لقد تم اكتشاف أن الكورتاكتين المضيف ، HDAC4 ، و HDAC6 polyptides تخضع للتدهور استجابة لعدوى IAV في كل من خلايا الكلاب (MDCK) والبشرية (A549 ، NHBE)7،8،9. باستخدام الأساليب المذكورة أعلاه ، تم الكشف عن أن كاسباسات المضيف التي يسببها IAV ، وخاصة caspase 3 ، تسبب تدهورها7،8،9. تم تحلل الكورتاكتين بطريقة تعتمد على جرعة العدوى والوقت والخلية المضيفة - وطريقة IAV المستقلة عن السلالة7. تم الحصول على نتائج مماثلة ل HDAC48 و HDAC69. ومن المثير للاهتمام ، أن تدهور جميع البروتينات المضيفة الثلاثة تزامن مع انشقاق NPالفيروسي 7،8،9 ، والذي من المعروف أنه يخضع للانقسام بوساطة caspase14. وهكذا ، تم افتراض أن الكورتاكتين و HDAC4 و HDAC6 يخضعون أيضا للانقسام بوساطة الكاسباز والتدهور اللاحق. لاختبار ذلك ، أولا ، تم علاج الخلايا المصابة ب IAV بمثبط caspase 3 ، وتم تحليل إنقاذ الكورتاكتين و HDAC4 و HDAC6 بواسطة النشاف الغربي. تعافت جميع عديدات الببتيد الثلاثة (وكذلك NP الفيروسية) من التدهور الناجم عن عدوى IAV بعد علاج مثبطات caspase 37،8،9. البيانات التمثيلية7 للكورتاكتين موضحة في الشكل 1 أ. تم قياس هذا الانتعاش عن طريق قياس شدة نطاقات البروتين وتطبيع قيمة نطاق الكورتاكتين بقيمة نطاق الأكتين المقابل (التحكم في التحميل). في وقت لاحق ، تم اعتبار القيمة الطبيعية للكورتاكتين في العينات غير المصابة المقابلة 100 ٪ لتحديد قيمتها في العينات المصابة. شكلت طريقة القياس الكمي هذه استعادة عديد الببتيد الكورتاكتين في الخلايا المصابة المعالجة بمثبطات الكاسباز 3 بنسبة 78.8٪ من 20.7٪ في الخلايا المصابةغير المعالجة 7 (الشكل 1 ب).

ضربة قاضية بوساطة تداخل الحمض النووي الريبي لتعبير كاسباس 3
بعد ذلك ، تم استخدام أداة وراثية ، تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ، تليها النشاف الغربي لتأكيد دور الكاسباز في التدهور الناجم عن عدوى IAV للكورتاكتين11 و HDAC48. في الخلايا المستنفدة من الكاسباز 3 (الشكل 2C)11 ، تعافى كل من الكورتاكتين (الشكل 2A)11 و HDAC48 عديدات الببتيد من التدهور الناجم عن عدوى IAV. ومع ذلك ، في خلايا كاسباز 6 أو كاسباز 7 المستنفدة (الشكل 2C)11 ، لم يلاحظ أي انتعاش كبير في مستويات عديد الببتيد الكورتاكتين (الشكل 2 أ) 11. على وجه التحديد ، عند قياسها كميا ومقارنتها بمستوياتها في الخلايا المقابلة غير المصابة كما هو مذكور أعلاه ، تعافى مستوى عديد الببتيد الكورتاكتين في الخلايا المصابة بتعبير كاسباز 3 المستنفد إلى 83٪ من 28.6٪ في الخلايا المصابة بتعبير كاسباز 3 الطبيعي (الشكل 2 ب)11.

زخارف انقسام Caspase في الكورتاكتين وعديد الببتيد HDAC6
أخيرا ، تم فحص تسلسل الأحماض الأمينية في الكورتاكتين وعديد الببتيدات HDAC6 ، وفي أشكال انقسام الكاسباز المفترضة ، تم تحور حمض الأسبارتيك في موضع P1 إلى حمض الجلوتاميك 9,11. حدد هذا النهج حمض الأسبارتيك 116 في عديد الببتيد الكورتاكتين11 وحمض الأسبارتيك 1088 في عديد الببتيدHDAC6 9 كموقع انشقاق كاسباز. أدت طفرة كل من بقايا حمض الأسبارتيك إلى حمض الجلوتاميك إلى جعل الكورتاكتين (الشكل 3 أ) 11 و HDAC69 عديدات الببتيد مقاومة للتدهور الناجم عن عدوى IAV. على وجه التحديد ، عند قياسها كميا ومقارنتها بمستوياتها في الخلايا غير المصابة المقابلة كما هو مذكور أعلاه ، كان مستوى عديد الببتيد الكورتاكتين الطافر المعبر عنه بالبلازميد في الخلايا المصابة 77.9٪ ، في حين أن مستوى عديد الببتيد من النوع البري المعبر عنه بالبلازميد في الخلايا المصابة كان 23.6٪ (الشكل 3B)11.

Figure 1
الشكل 1: يخضع عديد ببتيد الكورتاكتين لتحلل كاسباز 3 بوساطة الخلايا المصابة بالفيروس النووي الدولي . (ألف) أصيبت خلايا MDCK بفيروس الأنفلونزا A/New Caledonia/20/1999/H1N1 عند MOI قدره 0.5 وعولجت بعد ذلك على أنها وهمية أو بمثبط caspase 3 (Cas3-I، 40 ميكرومتر). بعد 24 ساعة ، تم الكشف عن الكورتاكتين ، NP الفيروسي ، وببتيدات الأكتين في محللات الخلايا الكلية عن طريق النشاف الغربي. يوني ، غير مصابة ؛ INF ، مصابة. تشير الأسهم إلى NP كامل الطول والمشقوق. (ب) تم تحديد شدة نطاقي الكورتاكتين والأكتين. ثم ، تم تطبيع قيمة الكورتاكتين مع قيمة الأكتين. تم اعتبار الكمية الطبيعية من الكورتاكتين في عينات UNI 100٪ لتحديد مقدارها في عينات INF المقابلة. البيانات المقدمة هي وسائل ± SE لثلاث نسخ بيولوجية. P = 0.0006 ، محسوبة باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. NS ، ليست كبيرة. تم تعديل هذا الرقم من Chen et al.7. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: ضربة قاضية لتعبير كاسباس 3 أنقذت تحلل عديد الببتيد الكورتاكتين في الخلايا المصابة ب IAV. (أ) تم نقل خلايا A549 في نسخ مكررة مع 10 نانومتر من التحكم (Ctrl) أو caspase 3 (Cas3) أو caspase 6 (Cas6) أو caspase 7 (Cas7) siRNA. بعد 72 ساعة ، تم حصاد الخلايا في نسخة متماثلة واحدة ومعالجتها لاستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي. أصيبت الخلايا في النسخة المتماثلة الأخرى بفيروس الأنفلونزا A / WSN / 1933 / H1N1 في MOI من 3.0. بعد 24 ساعة ، تم الكشف عن الكورتاكتين ، NP الفيروسي ، وببتيدات الأكتين عن طريق النشاف الغربي. يوني ، غير مصابة ؛ INF ، مصابة. (ب) تم تحديد شدة نطاقي الكورتاكتين والأكتين كميا ، وتم تسوية قيمة الكورتاكتين مع قيمة الأكتين. بعد ذلك ، تم اعتبار الكمية الطبيعية من الكورتاكتين في عينات UNI 100٪ لتحديد مقدارها في عينات INF المقابلة. البيانات المقدمة هي وسائل ± SE لثلاث نسخ بيولوجية. P < 0.0001 ، *** P = 0.0007 ، ***P = 0.0002 ، محسوبة باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. NS ، ليست كبيرة. (ج) تم تحويل إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج أعلاه إلى cDNA ، والذي تم استخدامه بعد ذلك كقالب للكشف عن مستويات caspase 3 و caspase 6 و caspase 7 و actin mRNA بواسطة RT-qPCR. تم استخدام مستوى الأكتين mRNA كمرجع، وتم حساب مستوى mRNA لكل كاسباز في التحكم siRNA (Ctrl) والخلايا المنقولة caspase siRNA (Cas) باستخدام الطريقة القياسية 2−ΔΔCT. P < 0.0001 ، محسوبة باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. تم تعديل هذا الرقم من Chen et al.11. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: طفرة حمض الأسبارتيك 116 إلى حمض الجلوتاميك جعلت عديد الببتيد الكورتاكتين مقاوما للتدهور الناجم عن عدوى IAV. (أ) تم نقل خلايا MDCK باستخدام بلازميد يعبر عن النوع البري (WT) أو اندماج GFP-cortactin المتحور (D116E). بعد 48 ساعة ، أصيبت الخلايا بفيروس الأنفلونزا A / WSN / 1933 / H1N1 في MOI من 3.0. بعد 24 ساعة ، تم الكشف عن GFP-cortactin، NP الفيروسي، وببتيدات الأكتين عن طريق النشاف الغربي. يوني ، غير مصابة ؛ INF ، مصابة. (ب) تم تحديد شدة نطاقي الكورتاكتين والأكتين كميا ، وتم تسوية قيمة الكورتاكتين مع قيمة الأكتين. بعد ذلك ، تم اعتبار الكمية الطبيعية من الكورتاكتين في عينات UNI 100٪ لتحديد مقدارها في عينات INF المقابلة. البيانات المقدمة هي وسائل ± SE لثلاث نسخ بيولوجية. ** P = 0.001 ، محسوبة باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه. NS ، ليست كبيرة. تم تعديل هذا الرقم من Chen et al.11. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ثبت أن الفيروسات تصمم العوامل والمسارات المضيفة لصالحها. في المقابل ، تقاوم الخلايا المضيفة ذلك من خلال استخدام استراتيجيات مختلفة. واحدة من هذه الاستراتيجيات هي PANoptosis ، والتي تستخدمها الخلايا المضيفة كاستراتيجية مضادة للفيروسات ضد عدوى الفيروسات. ومع ذلك ، طورت فيروسات مثل IAV استراتيجياتها الخاصة لمواجهة PANoptosis واستغلالها لصالحها1،3،6. يتضمن هذا التفاعل انشقاق مختلف البروتينات المضيفة والفيروسية بواسطة caspases. يعد تحديد تلك الكاسباز ومواقع انقسامها في بروتينات الركيزة أمرا مهما لتوضيح آليات وأهمية هذا التفاعل.

تحقيقا لهذه الغاية ، تم استخدام الطرق الكيميائية الحيوية والجزيئية القياسية لتحديد caspases ومواقع انقسامها في الكورتاكتين المضيف ، HDAC4 ، و HDAC67،8،9،11. يمكن استخدام البروتوكولات الموضحة أعلاه لمثل هذه الدراسات التي تشمل فيروسات الأنفلونزا وفيروسات الثدييات الأخرى والميكروبات الأخرى والمحفزات الخارجية مثل السموم والمواد الكيميائية. علاوة على ذلك ، يمكن تكرار هذه الأساليب في مختبر البيولوجيا الجزيئية القياسي بالمهارات ذات الصلة ولا تتطلب معدات متخصصة وتدريبا على البرمجيات. تم تكييف شكل صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا بنجاح لهذه الدراسات وما شابهها لتوليد كميات كافية من العينات للتحليلات النهائية بواسطة النشاف الغربي و RT-qPCR. ومع ذلك ، حسب الحاجة ، يمكن تقليص حجم هذا التنسيق أو ترقيته وفقا لذلك. عند إجراء تجربة تتضمن مثبط كاسباز لأول مرة ، يقترح استخدام مثبط عموم كاسباز (Z-VAD-FMK) جنبا إلى جنب مع مثبط الليزوزوم والبروتيازوم لتقييم ما إذا كان البروتين محل الاهتمام يخضع لتدهور بوساطة كاسباز. علاوة على ذلك ، بالإضافة إلى NH4Cl و MG132 ، يمكن استخدام مثبطات الليزوزوم والبروتيازوم الأخرى مثل Bafilomycin A و Epoxomicin ، على التوالي. بعد النتائج الإيجابية مع مثبطات عموم الكاسباز ، يمكن استخدام مثبطات محددة من caspases الفردية ، أو يمكن استخدام تداخل الحمض النووي الريبي. بالنسبة للأول ، من المهم تحسين التركيزات المثبطة الفعالة لتجنب السمية لنوع الخلية المستهدفة والنتائج غير المحددة.

يجب استخدام أداة وراثية مثل تداخل الحمض النووي الريبي أو كريسبر بعد ذلك لتأكيد تورط الكاسباز لأن المثبطات تتفاعل بشكل متبادل. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء تداخل الحمض النووي الريبي أو شاشة كريسبر التي تستهدف بشكل فردي جميع الكاسباسات المعروفة. يمكن شراء أزواج siRNA و gRNA و RT-qPCR التمهيدية لجميع caspases المعروفة على أنها مصممة مسبقا أو مصممة باستخدام أدوات عبر الإنترنت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استنفاد اثنين أو أكثر من caspases في وقت واحد لتقييم الانقسام المتسلسل أو التعاوني للببتيدات المتعددة (تم استخدام هذه الاستراتيجية مؤخرا في دراسة لم تنشر بعد). يعتقد أن تداخل الحمض النووي الريبي أداة مثالية لأبحاث تفاعل الخلايا المضيفة للفيروس. يتطلب هذا الأخير معالجة خاضعة للرقابة للتعبير الجيني المضيف بحيث تظل الخلايا المضيفة قابلة للحياة نسبيا لعدوى الفيروس وإكمال دورة الحياة لعرض النمط الظاهري لهذا التلاعب. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تحسين تركيز siRNA الفعال ومزيج كاشف siRNA-transfection لكل نوع من الخلايا للحصول على نسبة ضربة قاضية وقابلية مثالية للعدوى اللاحقة.

لتحديد موقع زخارف الانقسام المفترضة caspase ، تم تطوير العديد من قواعد البيانات مثل CASBAH18 و CaspDB19 و CutDB 20 و DegraBase 21 و MEROPS 22 و TopFIND23,24. تم إجراء فحص مرئي لتحديد موقع هذه الزخارف على HDAC6 polypetide9 ، ولكن بالنسبة للكورتاكتين11 ، تم استخدام CaspDB (على الرغم من تعذر الوصول إلى موقع CaspDB مؤخرا). تم تأكيد هذه الزخارف بنجاح كمواقع انشقاق كاسباز عن طريق تحور حمض الأسبارتيك P1 إلى حمض الجلوتاميك. ومع ذلك ، يقترح تحور حمض الأسبارتيك إلى ألانين أو فالين يشبه الأحماض الأمينية غير القطبية أولا لأن بعض الكاسباس يمكن أن تلتصق بعد حمض الجلوتاميك P14. قد يؤدي هذا التمرين على الفور إلى تحديد موقع (مواقع) انشقاق الكاسباز ولكنه قد يتطلب توليد عشرات الطفرات إذا كان عديد الببتيد المستهدف غنيا بأحماض الأسبارتيك وكانت الزخارف المستهدفة المفترضة غير قانونية. لتوصيل البلازميدات (و siRNA) إلى الخلايا ، إلى الأمام ، بدلا من العكس ، يمكن إجراء النقل. علاوة على ذلك ، يجب إجراء حركية جرعة العدوى والوقت باستخدام SDS-PAGE متدرج بنسبة 4٪ -20٪ للنشاف الغربي لتقييم حركية تحلل عديد الببتيدات وتحديد أي منتجات انشقاق أصغر حجما. أخيرا ، لتأكيد البروتين محل الاهتمام باعتباره ركيزة كاسباز مباشرة ، يمكن تطوير فحوصات كيميائية حيوية في المختبر تحتوي على كاسباس منقى وبروتينات مستهدفة (WT أو متحولة) وأي عوامل مساعدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى صاحب البلاغ أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

يعترف المؤلف بجنيفر تيبر ، وبيلان لي ، وجيسي فان ويسترينين ، وكيفن هارود ، ودا يوان تشين ، وفرجانة أحمد ، وسونيا مروس ، وكينيث يامادا ، وريتشارد ويبي ، وموارد BEI (NIAID) ، ومجلس البحوث الصحية في نيوزيلندا ، وصندوق موريس وفيليس بايكل (نيوزيلندا) ، و HS و JC Anderson Trust (دنيدن) ، وقسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة وكلية العلوم الطبية الحيوية (جامعة أوتاجو).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 cells ATCC CRM-CCL-185 Human, epithelial, lung
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434
Caspase 3 Inhibitor Sigma-Aldrich 264156-M Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Goat anti-NP antibody Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 13778150
MDCK cells ATCC CCL-34 Dog, epithelial, kidney
MG132 Sigma-Aldrich M7449
Minimum Essential Medium (MEM) ThermoFisher Scientific 11095080 Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 Sigma-Aldrich SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2  LI-COR Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion  Addgene 50728 Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 Sigma-Aldrich NM_004346 siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 Sigma-Aldrich NM_001226 siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 Sigma-Aldrich NM_001227 siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs Sigma-Aldrich KSPQ12012 Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane Cytiva (Fomerly GE Healthcare) 10600003
Rabbit anti-actin antibody Abcam ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody Cell Signaling 3502
Rabbit anti-GFP antibody Takara 632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5625
Transfection medium, Opti-MEM ThermoFisher Scientific 11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 Merck
Trypsin, TPCK-Treated Sigma-Aldrich 4370285

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
  2. Zheng, M., Kanneganti, T. -D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
  3. Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
  4. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
  5. Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
  6. Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
  7. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
  8. Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
  9. Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
  10. Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
  11. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
  12. Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
  13. Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
  14. Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
  15. Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
  16. Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
  17. Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
  18. Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  19. Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
  20. Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
  21. Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
  22. Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, Database issue 160-164 (2004).
  23. Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
  24. Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).

Tags

علم المناعة والعدوى ، العدد 185 ،
تحديد الكاسباس وزخارفه التي تشق البروتينات أثناء عدوى فيروس الأنفلونزا أ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Husain, M. Identifying Caspases and… More

Husain, M. Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection. J. Vis. Exp. (185), e64189, doi:10.3791/64189 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter