Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

זיהוי קספאזות והמוטיבים שלהן שמבקעים חלבונים במהלך הידבקות בנגיף שפעת A

Published: July 21, 2022 doi: 10.3791/64189
Automatic Translation
1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Otago

Summary

זיהום בנגיף שפעת A (IAV) מפעיל את הקספאזות שמבקעות חלבונים פונדקאיים ונוגפיים, אשר בתורם הם בעלי תפקידים פרו-ויראליים. על ידי שימוש במעכבים, הפרעות RNA, מוטגנזה מכוונת אתר, וטכניקות כתם מערביות ו- RT-qPCR, זוהו קספאזות בתאי יונקים נגועים המבקעים קורטקטין מארח והיסטון דאקטילאזות.

Abstract

Caspases, משפחה של פרוטאזות ציסטאין, מתזמרת מוות תאי מתוכנת בתגובה לגירויים שונים, כולל זיהומים מיקרוביאליים. מוות תאי מתוכנת, שתואר בתחילה כמתרחש על ידי אפופטוזיס, ידוע כיום כמקיף שלושה מסלולים הקשורים זה בזה: פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס, יחד נטבעו כתהליך אחד, PANoptosis. השפעה זיהום בנגיף (IAV) משרה PANoptosis בתאי יונקים על ידי גרימת הפעלה של קספאזות שונות, אשר בתורן מבקעות חלבונים מארחים שונים כמו גם ויראליים, מה שמוביל לתהליכים כמו הפעלת התגובה האנטי-ויראלית המולדת של המארח או השפלה של חלבונים מארחים אנטגוניסטיים. בהקשר זה, ביקוע קספאז 3 בתיווך של קורטקטין מארח, היסטון דאצטילאז 4 (HDAC4) והיסטון דאצטילאז 6 (HDAC6) התגלה הן בתאי אפיתל של בעלי חיים והן בתאי אפיתל אנושיים בתגובה לזיהום ב- IAV. כדי להדגים זאת, נעשה שימוש במעכבים, הפרעות RNA ומוטגנזה מכוונת אתר, ולאחר מכן, הבקיעה או ההתנגדות לביקוע וההתאוששות של פוליפפטידים של קורטקטין, HDAC4 ו- HDAC6 נמדדו על ידי כתם מערבי. שיטות אלה, בשילוב עם RT-qPCR, יוצרות אסטרטגיה פשוטה אך יעילה לזיהוי הפונדקאי, כמו גם חלבונים נגיפיים העוברים ביקוע בתיווך קספאז במהלך זיהום של IAV או נגיפים אחרים בבני אדם ובבעלי חיים. הפרוטוקול הנוכחי מפרט את התוצאות המייצגות של אסטרטגיה זו, והדרכים להפוך אותה ליעילה יותר נדונות גם הן.

Introduction

נגיף שפעת A (IAV) הוא חבר אב טיפוס במשפחת Orthomyxoviridae וידוע כגורם למגפות עולמיות ולמגפות בלתי צפויות. IAV גורם למחלה נשימתית אנושית, שפעת, הידועה בכינויה "שפעת". שפעת היא מחלה חריפה הגורמת להשראת תגובות חיסוניות מולדות פרו-דלקתיות ואנטי-דלקתיות ולמוות של תאי אפיתל בדרכי הנשימה האנושיות. שני התהליכים נשלטים על ידי תופעה הנקראת מוות תאי מתוכנת1. האיתות למוות תאי מתוכנת מושרה ברגע שקולטני זיהוי פתוגנים שונים חשים את חלקיקי הנגיף הנכנסים בתאים המארחים. זה מוביל לתכנות של מוות של תאים נגועים ואיתות לתאים בריאים שכנים על ידי שלושה מסלולים מחוברים הנקראים פירופטוזיס, אפופטוזיס ונקרופטוזיס - שנטבעו לאחרונה כתהליך אחד, PANoptosis1.

PANoptosis כרוך בעיבוד פרוטאוליטי של חלבונים רבים של פונדקאים ונגיפים משלב האינדוקציה ועד לביצוע. עיבוד כזה של חלבונים מובל בעיקר על ידי משפחה של פרוטאזות ציסטאין הנקראות קספאזות 1,2. עד 18 קספאזות (מקספאזה 1 עד קספאזה 18) ידועות3. רוב הקספאזות מבוטאות כפרו-קספאזות ומופעלות על ידי עיבוד פרוטאוליטי משלהן על ידי אוטוקטליזה או קספאזותאחרות 4 בתגובה לגירוי כמו זיהום בווירוס. ה-PANoptosis של תאים נגועים ב-IAV נחשב למנגנון הגנה מארח, אך IAV פיתח דרכים להתחמק ממנו ולנצל אותו כדי להקל על שכפולו 1,2,5,6. אחד מהם הוא לנטרל את הגורמים המארחים באמצעות ביקוע או השפלה בתיווך קספאז שהם אנטי-ויראליים מטבעם או מפריעים לאחד השלבים במחזור החיים של ה-IAV. לשם כך התגלו גורמים מארחים, קורטקטין, HDAC4 ו-HDAC6 שעברו ביקוע או השפלה בתיווך קספאז בתאי אפיתל נגועים ב-IAV 7,8,9. ה-HDAC4 וה-HDAC6 הם גורמים אנטי-IAV8,10, והקורטקטין מפריע לשכפול ה-IAV בשלב מאוחר יותר של ההדבקה, באופן פוטנציאלי במהלך הרכבת הנגיף וניצנים 11.

בנוסף, מופעלות גם קספאזות שונות, אשר בתורן מבקעות חלבונים מרובים כדי להפעיל את התגובה הדלקתית של המארח במהלך זיהום ב- IAV 1,2. יתר על כן, נוקליאופרוטאין (NP), חלבון M2 תעלת יונים של IAV 12,13,14, וחלבונים שונים של נגיפים אחרים 3,15,16 עוברים גם הם ביקוע בתיווך קספאז במהלך ההדבקה, המשפיע על פתוגנזה נגיפית. לכן, יש צורך מתמשך לחקור ביקוע בתיווך קספאז או השפלה של חלבונים מארחים ונגיפיים במהלך IAV וזיהומים נגיפיים אחרים כדי להבין את הבסיס המולקולרי של פתוגנזה נגיפית. כאן מוצגות השיטות כדי (1) להעריך את הבקיעה או הפירוק של חלבונים כאלה על ידי קספאזות, (2) לזהות את הקספאזות האלה, ו-(3) לאתר את אתרי הבקיעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

אישורים רגולטוריים התקבלו מוועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית של אוניברסיטת אוטגו לעבודה עם IAV ותאי יונקים. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בכליות כלבים של Madin-Darby (MDCK) או בתאי אפיתל A549 של ריאה אנושית ובתת-סוגים של IAV H1N1. IAV גודל בביצי עוף, כפי שתואר במקום אחר17. תנאים סטריליים ואספטיים שימשו לעבודה עם תאי יונקים, ומתקן Biosafety רמה 2 (או בלימה פיזית 2) וארון בטיחות ביולוגית מדרגה II שימשו לעבודה עם תת-סוגים של IAV.

1. הערכת ביקוע או פירוק של חלבונים בתאים נגועים ב-IAV על ידי קספאזות

  1. זרע 3 x 105 תאי MDCK או A549 לכל באר בצלחת תרבית תאים של 12 בארות.
    הערה: אם אתם משתמשים בתאי MDCK, ודאו שהנוגדן כנגד החלבון המעניין מזהה את המין הכלבי שלו.
  2. זרעו את הבארות בזוגות, כלומר, זוג בקרה - אחת טובה עבור הדגימה הלא נגועה ואחת עבור הדגימה הנגועה-מדומה - וזוג בדיקה - אחת טובה עבור מעכב לא נגוע דגימה ואחת עבור מעכב נגוע דגימה A. הגדל את מספר הזוגות עם כל מעכב נוסף (ראה הפניות 7,8).
  3. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 במהלך הלילה.
  4. למחרת, להדביק את התאים עם IAV (תת-סוג H1N1 או תת-סוג אחר).
    1. לשם כך, הכינו את החיסון של הנגיף על ידי דילול מלאי הנגיף ב-400 μL של מדיום חיוני מינימלי ללא סרום (MEM) (ראו טבלת חומרים) בריבוי של זיהום (MOI) של 0.5-3.0 יחידות יוצרות פלאק (pfu)/תא 7,11 (גורם להכפלת מספר התא בעת חישוב ה-MOI).
      הערה: להדבקת תאי MDCK, השלימו את הנגיף אינוקולום בטוסיל פנילאניל כלורומתיל קטון (TPCK)-טריפסין בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל.
  5. הסר את מדיום התרבית הישן מהתאים (שלב 1.3) ושטוף את התאים עם 1 מ"ל/באר של MEM 2x ללא סרום.
  6. הוסיפו 400 μL של נגיף אינוקולום (שלב 1.4.1) לתאים ודגרו אותם במשך שעה אחת ב-35 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% CO2 .
  7. בינתיים, יש לדלל מעכב קספאז (לדוגמה, Z-DEVD-FMK), מעכב ליזוזום (לדוגמה, NH4Cl), או מעכב פרוטאזום (לדוגמה, MG132) (ראו טבלת חומרים) בריכוז סופי של 40 מיקרומטר, 20 mM או 10 μM, בהתאמה, ב-MEM7 נטול סרום (ראו טבלת חומרים). שני המעכבים האחרונים משמשים כבקרה. לדלל נפח שווה של הממס (אם אינו מים) המשמש לשחזור אחד המעכבים בתווך נטול סרום כדמה.
  8. הסר את הנגיף inoculum ולשטוף את התאים כמו בשלב 1.5 (1x).
  9. הוסיפו לתאים את ה-MEM נטול הסרום, 1 מ"ל/טוב, לעג או תוסף עם מעכב, והדגירו את התאים כמו בשלב 1.6. נקודת זמן זו נחשבת כהדבקה של 0 שעות.
  10. לאחר 24 שעות, לקצור את התאים על ידי גירוד אותם עם בוכנה מזרק 1 מ"ל (צד גומי) ולהעביר אותם לתוך צינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל.
  11. צנטריפוגה את הצינור ב 12,000 x גרם במשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר. לאסוף את supernatant באמצעות פיפטה.
    הערה: ניתן להשליך את ה-supernatant הזה או להשתמש בולבדיקת רובד 8 כדי למדוד את הטיטר של צאצאי הנגיף ששוחררו.
  12. שטפו את כדור התא עם 250 μL של תמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS) על ידי צנטריפוגה מחדש כמו בשלב 1.11.
  13. הסר את הסופרנטנט וליטף את התאים על ידי הוספת 80-100 μL של חיץ תזה של התא (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% נתרן דודציל סולפט (SDS), 0.5% נתרן דאוקסיכולאט, 1% טריטון X-100, וקוקטייל מעכב פרוטאז 1x, ראה טבלת חומרים) ומערבולות.
  14. מחממים את הצינור בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לליז לחלוטין ולהכין את סך התא ליזאט. אחסן את הליזטים בטמפרטורה של 4 °C לביצוע שלבים 1.15-1.17 למחרת, אך לקבלת התוצאות הטובות ביותר, סיים שלבים אלה באותו יום.
  15. הערך את כמות החלבון בכל דגימה באמצעות ערכת בדיקה של חומצות אמינו מסועפות שרשרת (ראו טבלת חומרים).
  16. פתור כמויות שוות של חלבון מדגימות לא נגועות ונגועות על ידי אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל SDS-פוליאקרילאמיד (SDS-PAGE)11 יחד עם סמני משקל מולקולריים 11.
  17. מעבירים את החלבון לממברנת ניטרוצלולוז או פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) (ראו טבלת חומרים).
    הערה: קרום PVDF עשוי לתת רקע גבוה בחלק מתמונות הכתם המערביות; בדוק תאימות.
  18. בצע כתם מערבי כדי לזהות את החלבון המעניין בשיטה המתוארת במקום אחר11.
  19. השווה את רמות החלבון בנתיבי הדגימה הנגועים שטופלו במדומה ובמעכבים.
    הערה: אם רמת החלבון התאוששה במסלול הדגימה הנגועה שטופלה במעכבי קספאז, החלבון נבקע או מתפרק על ידי קספאזות. אחרת, הוא מושפל על ידי ליזוזום או פרוטאזום.
  20. כימות התאוששות החלבון על ידי מדידת עוצמת הפסים שלו בכל נתיב מלפחות שלושה שכפולים של אותו ניסוי ונרמול שלו עם רצועת בקרת ההעמסה המתאימה.
  21. השתמש בכל תמונה עכשווית ובתוכנה הקשורה אליה (ראה טבלת חומרים) כדי לדמות את הכתמים המערביים ולכמת את התאוששות החלבון.

2. אישור על ביקוע בתיווך קספאז או פירוק חלבונים בתאים נגועים ב-IAV על ידי הפרעות RNA

  1. תכנון או השגה של RNA (siRNA) מתערב קטן בתכנון מראש המכוון לכלבים או לבני אדם caspase 3, caspase 6 ו-caspase 7 (caspases1 של התליין) ו-siRNA בקרה שאינו ממוקד (ראו טבלת חומרים).
  2. העבר כל siRNA לתאי MDCK או A549 על-ידי העברה הפוכהשל 8,11.
  3. לשם כך, יש לדלל בצינורות נפרדים 100 ננומטר של siRNA בקרה או caspase siRNA או נפח מומלץ של מגיב טרנספקציה (ראו טבלת חומרים) ב-100 μL של מדיום מתאים (כמו OptiMEM, ראו טבלת חומרים), ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. הכינו כל דילול בשכפול.
    הערה: שכפול זה כולל שכפול אחד לניתוח ההדחה של ביטוי קספאז על ידי RT-qPCR או כתם מערבי (אם קיימים נוגדנים לקספאזות) ושכפול אחר להערכת ההתאוששות של החלבון המעניין על ידי כתם מערבי.
  5. יש לערבב 100 μL של כל תמיסת siRNA עם 100 μL של תמיסת ריאגנט טרנספקציה (שלב 2.3) ולדגור במשך 20-45 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את קומפלקס הריאגנטים siRNA-transfection.
  6. בינתיים, פצלו והוסיפו 1 x 105 תאי MDCK או A549 ב-800 μL של מדיום הגידול השלם, ערבבו עם 200 μL של קומפלקס מגיבי siRNA-transfection (שלב 2.5), והוסיפו 1 מ"ל של המתלה לבאר של צלחת תרבית של 12 בארות. דילול זה מביא את הריכוז הסופי של siRNA בקרה או caspase siRNA ל 10 ננומטר.
  7. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% CO2 למשך 72 שעות.
  8. קצור את התאים משכפול אחד כמו בשלב 1.10, ועבד אותם כדי לאמת או לאשר את ההפלה של הביטוי של caspase 3, caspase 6 ו- caspase 7 על ידי RT-qPCR או כתם מערבי, בהתאמה, באמצעות שיטות סטנדרטיות ופרוטוקולים 8,11.
  9. להדביק את התאים באחרים להשתכפל עם IAV כמתואר בשלבים 1.4-1.9 (ללא מעכבים).
  10. לאחר 24 שעות, קציר, עיבוד וניתוח התאים על ידי כתם מערבי ומדידה וכימות של התאוששות החלבון כמתואר בשלבים 1.10-1.20.

3. מוטגנזה מכוונת אתר לאיתור אתרי הבקיעה הקספאזית בפוליפפטיד

  1. שכפלו את החלבון המקודד גנים בעל עניין בפלסמיד11 של ביטוי יונקים או השיגו אותו ממעבדת מחקר או ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
    הערה: עדיף אם הגן משובט בתג אפיטופ או כאיחוי GFP כדי להבחין בין הפוליפפטיד המתבטא באופן אקטופי לבין זה המובע באופן אנדוגני במהלך הכתם המערבי.
  2. באמצעות מסדי נתונים של מצע קספאז4 או כלי יישור חלבונים, אתר את מוטיבים הקונצנזוס של מחשוף קספאז, XXXD ו- DXXD, על הפוליפפטיד. כמעט כל מוטיבים של מחשוף קספאז מכילים את החומצה האספרטית באתר המחשוף (P1)3,4.
  3. מוטציה של חומצה אספרטית P1 פוטטיבית לחומצה גלוטמית או חומצת אמינו לא קוטבית (אלנין, ואלין) על ידי מוטגנזה מכוונת אתר ואחריה ריצוף DNA11 באמצעות שיטות ופרוטוקולים סטנדרטיים.
  4. העבירו את הדנ"א מסוג בר (WT) ופלסמיד מוטנטי לתאי MDCK או A549 על-ידי העברה הפוכה11.
    1. לשם כך, יש לדלל 2 מיקרוגרם של דנ"א פלסמיד או נפח מומלץ של מגיב הטרנספקציה ב-100 μL של מדיום מתאים (ראו שלב 2.3 וטבלת חומרים) בצינורות נפרדים, ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. יש לערבב 100 μL של כל תמיסת DNA פלסמידית עם 100 μL של תמיסת מגיב הטרנספקציה ולדגור במשך 20-45 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור את קומפלקס מגיב ה- DNA-transfection.
  5. בינתיים, פצלו והוסיפו 3 x 10 5תאי MDCK או A549 ל-800 μL של מדיום הגידול השלם, ערבבו עם 200 μL של קומפלקס ריאגנטים של DNA-transfection, והוסיפו את התרחיף של 1 מ"ל לבאר של צלחת תרבית של 12 בארות.
  6. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת אטמוספירה של 5% CO2 .
  7. לאחר 48 שעות, הדביקו את התאים ב-IAV כמתואר בשלבים 1.4-1.9 (מבלי להוסיף את המעכבים).
  8. לאחר 24 שעות, קציר, עיבוד וניתוח התאים על ידי כתם מערבי (אם רלוונטי, באמצעות הנוגדן לתג אפיטופ או GFP). לאחר מכן, מדוד וכמת את התאוששות החלבון כמתואר בשלבים 1.10-1.20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טיפול במעכב קספז 3
התגלה כי פוליפפטידים של קורטקטין מארח, HDAC4 ו-HDAC6 עוברים פירוק בתגובה לזיהום ב-IAV הן בתאי הכלבים (MDCK) והן בתאי האדם (A549, NHBE) 7,8,9. על ידי שימוש בגישות הנ"ל, נחשף כי קספאזות מארחות המושרות על ידי IAV, במיוחד caspase 3, גורמות להשפלתן 7,8,9. הקורטקטין התפרק באופן תלוי-מינון זיהום ותלוי-זמן, ובאופן שאינו תלוי בזן של התא המארח ושל ה-IAV7. תוצאות דומות התקבלו עבור HDAC48 ו- HDAC69. באופן מעניין, ההתפרקות של כל שלושת החלבונים המארחים התרחשה במקביל לביקוע של NP 7,8,9 נגיפי, שידוע כי הוא עובר ביקוע בתיווך קספאז14. לפיכך, הועלתה השערה כי קורטקטין, HDAC4 ו-HDAC6 עוברים גם הם מחשוף בתיווך קספאז והשפלה לאחר מכן. כדי לבחון זאת, ראשית, התאים הנגועים ב-IAV טופלו במעכב קספאז 3, והצלת פוליפפטידים של קורטקטין, HDAC4 ו-HDAC6 נותחה על ידי כתם מערבי. כל שלושת הפוליפפטידים (כמו גם NP נגיפי) התאוששו מההתפרקות הנגרמת על ידי זיהום ב-IAV לאחר טיפול במעכבי קספאז 3 7,8,9. הנתונים המייצגים7 עבור קורטקטין מוצגים באיור 1A. התאוששות זו כומתה על ידי מדידת עוצמת רצועות החלבון ונרמול הערך של רצועת הקורטקטין על ידי הערך של רצועת האקטין (בקרת העמסה) המתאימה. לאחר מכן, הערך המנורמל של קורטקטין בדגימות הלא נגועות המתאימות נחשב 100% כדי לקבוע את ערכו בדגימות הנגועות. שיטת הכמות הזו הביאה בחשבון את ההתאוששות של פוליפפטיד קורטקטין בתאים נגועים שטופלו בקספאז 3 כ-78.8% מ-20.7% בתאים נגועים לא מטופלים7 (איור 1B).

פגיעה בתיווך RNA של ביטוי קספאז 3
לאחר מכן, נעשה שימוש בכלי גנטי, RNA interference (RNAi), ואחריו כתם מערבי כדי לאשר את תפקידם של קספאזות בפירוק הנגרם על ידי זיהום IAV של קורטקטין11 ו- HDAC48. בתאים מדולדלים 3 של קספאז (איור 2C)11, גם הקורטקטין (איור 2A)11 וגם הפוליפפטידים HDAC48 התאוששו מההתפרקות הנגרמת על-ידי זיהום ב-IAV. עם זאת, בתאים מדולדלים של קספאז 6 או קספאזה 7 (איור 2C)11, לא נצפתה התאוששות משמעותית ברמות הפוליפפטידים של קורטקטין (איור 2A)11. באופן ספציפי, כאשר מכמתים ומשווים אותם לרמות שלהם בתאים לא נגועים מקבילים כפי שצוין לעיל, רמת הפוליפפטיד של קורטקטין בתאים נגועים עם ביטוי קספאז 3 מדולדל התאוששה ל-83% מ-28.6% בתאים נגועים עם ביטוי קספאז 3 תקין (איור 2B)11.

מוטיבים של מחשוף קספז בקורטקטין ובפוליפפטידים של HDAC6
לבסוף, רצף חומצות האמינו בפוליפפטידים של קורטקטין ו-HDAC6 נבדק, ובמוטיבים של ביקוע קספאז, החומצה האספרטית בעמדת P1 עברה מוטציה לחומצה גלוטמית 9,11. גישה זו זיהתה את החומצה האספרטית 116 בפוליפפטיד קורטקטין11 ואת החומצה האספרטית 1088 בפוליפפטיד HDAC69 כאתר ביקוע קספז. המוטציה של שאריות חומצה אספרטית לחומצה גלוטמית הפכה את הקורטקטין (איור 3A)11 ו-HDAC69 לפוליפפטידים עמידים בפני השפלה הנגרמת על ידי זיהום ב-IAV. באופן ספציפי, כאשר מכמתים ומשווים אותם לרמות שלהם בתאים לא נגועים מקבילים כאמור לעיל, רמת הפוליפפטיד המוטנטי של קורטקטין המבוטא בפלסמיד בתאים נגועים הייתה 77.9%, בעוד שרמת הפוליפפטיד מסוג קורטקטין פראי המתבטא בפלסמיד בתאים נגועים הייתה 23.6% (איור 3B)11.

Figure 1
איור 1: פוליפפטיד קורטקטין עובר השפלה בתיווך קספאז 3 בתאים נגועים ב-IAV . (A) תאי MDCK נדבקו בנגיף שפעת A/New Caledonia/20/1999/H1N1 בזן MOI של 0.5 ולאחר מכן טופלו כדמה או עם מעכב קספאז 3 (Cas3-I, 40 μM). לאחר 24 שעות זוהו פוליפפטידים של קורטקטין, NP נגיפי ואקטין בליזאטים של תאים על ידי כתם מערבי. UNI, לא נגוע; INF, נגוע. החצים מצביעים על NP באורך מלא וקלוע. (B) עוצמת רצועות הקורטקטין והאקטין כומתה. לאחר מכן, הערך של קורטקטין היה מנורמל עם הערך של אקטין. הכמות המנורמלת של קורטקטין בדגימות UNI נחשבה 100% כדי לקבוע את כמותו בדגימות INF המתאימות. הנתונים המוצגים הם אמצעים ± SE של שלושה שכפולים ביולוגיים. P = 0.0006, מחושב באמצעות ANOVA דו-כיווני. ns, לא משמעותי. נתון זה שונה מ- Chen et al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הפלה של ביטוי קספאז 3 הצילה את הפירוק הפוליפפטידי של קורטקטין בתאים נגועים ב-IAV. (A) תאי A549 הועתקו בכפילויות עם 10 ננומטר של בקרה (Ctrl), קספאז 3 (Cas3), קספאזה 6 (Cas6) או קספאז 7 (Cas7) siRNA. לאחר 72 שעות, התאים בשכפול אחד נקטפו ועובדו כדי לחלץ RNA כולל. התאים בשכפול השני הודבקו בתת-סוג של נגיף שפעת A/WSN/1933/H1N1 ב-MOI של 3.0. לאחר 24 שעות זוהו פוליפטידים של קורטקטין, NP נגיפי ואקטין על ידי כתם מערבי. UNI, לא נגוע; INF, נגוע. (B) העוצמה של רצועות קורטקטין ואקטין כומתה, והערך של קורטקטין היה מנורמל עם הערך של אקטין. לאחר מכן, הכמות המנורמלת של קורטקטין בדגימות UNI נחשבה 100% כדי לקבוע את כמותו בדגימות INF המתאימות. הנתונים המוצגים הם אמצעים ± SE של שלושה שכפולים ביולוגיים. P < 0.0001, ***P = 0.0007, ***P = 0.0002, מחושב באמצעות ANOVA דו-כיווני. ns, לא משמעותי. (C) סך כל הרנ"א שחולץ לעיל הומר ל-cDNA, ששימש לאחר מכן כתבנית לזיהוי רמות קספאז 3, קספאז 6, קספאז 7 ואקטין mRNA על ידי RT-qPCR. רמת ה-mRNA של אקטין שימשה כנקודת ייחוס, ורמת ה-mRNA של כל קספאז בבקרה siRNA (Ctrl) ותאי caspase siRNA (Cas) בהתאמה חושבה בשיטת 2−ΔΔCT הסטנדרטית. P < 0.0001, מחושב באמצעות ANOVA דו-כיווני. נתון זה שונה מ- Chen et al.11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מוטציה של חומצה אספרטית 116 לחומצה גלוטמית הפכה את הפוליפפטיד של הקורטקטין לעמיד בפני פירוק הנגרם על ידי זיהום ב-IAV. (A) תאי MDCK עברו טרנספקציה עם פלסמיד המבטא את היתוך GFP-קורטקטין מסוג בר (WT) או מוטציה (D116E). לאחר 48 שעות, תאים הודבקו בתת-סוג של נגיף שפעת A/WSN/1933/H1N1 ב-MOI של 3.0. לאחר 24 שעות, הפוליפטידים GFP-cortactin, NP נגיפיים ואקטין זוהו על ידי כתם מערבי. UNI, לא נגוע; INF, נגוע. (B) העוצמה של רצועות קורטקטין ואקטין כומתה, והערך של קורטקטין היה מנורמל עם הערך של אקטין. לאחר מכן, הכמות המנורמלת של קורטקטין בדגימות UNI נחשבה 100% כדי לקבוע את כמותו בדגימות INF המתאימות. הנתונים המוצגים הם אמצעים ± SE של שלושה שכפולים ביולוגיים. **P = 0.001, מחושב באמצעות ANOVA דו-כיווני. ns, לא משמעותי. נתון זה שונה מ- Chen et al.11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

נקבע כי וירוסים מתאימים את הגורמים והמסלולים המארחים לטובתם. בתורו, התאים המארחים מתנגדים לכך על ידי שימוש באסטרטגיות שונות. אחת מאותן אסטרטגיות היא PANoptosis, שבה משתמשים תאים מארחים כאסטרטגיה אנטי-ויראלית נגד זיהומים בנגיף. עם זאת, וירוסים כמו IAV פיתחו אסטרטגיות משלהם כדי להתמודד עם PANoptosis ולנצל אותו לטובתם 1,3,6. יחסי הגומלין האלה כוללים את הבקיעה של חלבונים פונדקאיים ונגיפיים שונים על ידי קספאזות. זיהוי הקספאזות הללו ואתרי הבקיעה שלהן בחלבוני המצע חשובים כדי להבהיר את המנגנונים והמשמעות של יחסי גומלין כאלה.

לשם כך נעשה שימוש בשיטות ביוכימיות ומולקולריות סטנדרטיות לזיהוי הקספאזות ואתרי הבקיעה שלהן בקורטקטין מארח, HDAC4 ו-HDAC6 7,8,9,11. הפרוטוקולים שתוארו לעיל יכולים לשמש למחקרים כאלה הכוללים נגיפי שפעת, וירוסים אחרים של יונקים, מיקרובים אחרים וגירויים חיצוניים כמו רעלנים וכימיקלים. יתר על כן, ניתן לשכפל שיטות אלה במעבדה סטנדרטית לביולוגיה מולקולרית עם כישורים רלוונטיים ואינן דורשות ציוד מיוחד והכשרה בתוכנה. פורמט צלחת תרבית התאים של 12 בארות הותאם בהצלחה למחקרים אלה ודומים להם כדי לייצר כמויות דגימה מספיקות לניתוחים במורד הזרם על ידי כתמים מערביים ו- RT-qPCR. עם זאת, לפי הצורך, ניתן להקטין או לשדרג פורמט זה בהתאם. כאשר עורכים ניסוי הכולל מעכב קספאז בפעם הראשונה, מומלץ להשתמש במעכב פאן-קספאז (Z-VAD-FMK) לצד מעכב ליזוזום ופרוטאזום כדי להעריך אם החלבון המעניין עובר פירוק בתיווך קספאז. כמו כן, בנוסף NH4Cl ו MG132, מעכבי ליזוזום ופרוטאזומים אחרים כמו Bafilomycin A ו Epoxomicin, בהתאמה, ניתן להשתמש. לאחר תוצאות חיוביות עם מעכב פאן-קספאז, ניתן להשתמש במעכבים ספציפיים של קספאזות בודדות, או בהפרעות RNA. עבור הראשונים, חשוב לייעל את הריכוזים המעכבים היעילים כדי למנוע רעילות לסוג תא היעד ותוצאות לא ספציפיות.

יש להשתמש בכלי גנטי כמו הפרעת RNA או קריספר ליד כדי לאשר את מעורבותם של קספאזות מכיוון שמעכבים אכן מגיבים צולבים. לחלופין, ניתן לבצע הפרעת RNA או מסך קריספר המכוונים בנפרד לכל הקספאזות הידועות. ניתן לרכוש את זוגות הפריימרים siRNA, gRNA ו-RT-qPCR לכל הקספאזות הידועות כמתוכננים מראש או מתוכננים באמצעות כלים מקוונים. בנוסף, ניתן לרוקן בו זמנית שני קספאזות או יותר כדי להעריך את הבקיעה הרציפה או השיתופית של פוליפפטידים (אסטרטגיה זו שימשה לאחרונה במחקר שטרם פורסם). מאמינים כי הפרעות RNA הן כלי אידיאלי לחקר אינטראקציה בין תאים בין וירוסים למארחים. זה האחרון דורש מניפולציה מבוקרת של ביטוי גנים מארחים, כך שהתאים המארחים יישארו בני קיימא יחסית להדבקה בנגיף והשלמת מחזור החיים כדי להציג את הפנוטיפ של אותה מניפולציה. עם זאת, אופטימיזציה של ריכוז siRNA יעיל ושילוב מגיב siRNA-transfection נדרשת עבור כל סוג תא ליחס אופטימלי של פגיעה וכדאיות לזיהום הבא.

כדי לאתר את מוטיבים המחשוף של קספאזה, פותחו מסדי נתונים רבים כגון CASBAH18, CaspDB19, CutDB 20, DegraBase 21, MEROPS 22 ו- TopFIND23,24. בוצעה הקרנה ויזואלית כדי לאתר מוטיבים אלה על HDAC6 polypetide9, אך עבור קורטקטין11, נעשה שימוש ב- CaspDB (אם כי אתר האינטרנט של CaspDB לא היה נגיש לאחרונה). מוטיבים אלה אושרו בהצלחה כאתרי ביקוע קספאז על ידי מוטציה של חומצה אספרטית P1 לחומצה גלוטמית. עם זאת, תחילה מומלץ לבצע מוטציה של החומצה האספרטית לאלנין או וואלין דמויי חומצת אמינו שאינה קוטבית, משום שקספאזות מסוימות עלולות להיבקע לאחר P1 חומצה גלוטמית4. תרגיל זה עשוי לגרום באופן מיידי לזיהוי של אתרי ביקוע קספאז, אך עשוי לדרוש יצירת עשרות מוטציות אם פוליפפטיד המטרה עשיר בחומצות אספרטיות ומוטיבים המטרה אינם קנוניים. עבור משלוח של פלסמידים (ו siRNA) לתאים, קדימה, במקום הפוך, transfection יכול להתבצע. יתר על כן, מינון הזיהום וקינטיקה זמן צריך להתבצע באמצעות SDS-PAGE הדרגתי 4%-20% עבור כתם מערבי כדי להעריך את קינטיקה השפלה של הפוליפפטידים ולזהות כל מוצרי ביקוע בגודל קטן יותר. לבסוף, כדי לאשר את החלבון המעניין כמצע קספאז ישיר, ניתן לפתח מבחנים ביוכימיים במבחנה המכילים קספאזות מטוהרות וחלבוני מטרה (WT או מוטציה) וכל קופקטורים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחבר אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחבר מכיר את ג'ניפר טיפר, בילאן לי, ג'סי ואן ווסטרינן, קווין הרוד, דה-יואן צ'ן, פרג'אנה אחמד, סוניה מרוס, קנת ימאדה, ריצ'רד וובי, משאבי BEI (NIAID), המועצה לחקר הבריאות של ניו זילנד, קרן מוריס ופיליס פייקל (ניו זילנד), קרן H.S. ו- J.C. Anderson (דנידין), והמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה ובית הספר למדעים ביו-רפואיים (אוניברסיטת אוטגו).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 cells ATCC CRM-CCL-185 Human, epithelial, lung
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434
Caspase 3 Inhibitor Sigma-Aldrich 264156-M Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Goat anti-NP antibody Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 13778150
MDCK cells ATCC CCL-34 Dog, epithelial, kidney
MG132 Sigma-Aldrich M7449
Minimum Essential Medium (MEM) ThermoFisher Scientific 11095080 Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 Sigma-Aldrich SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2  LI-COR Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion  Addgene 50728 Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 Sigma-Aldrich NM_004346 siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 Sigma-Aldrich NM_001226 siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 Sigma-Aldrich NM_001227 siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs Sigma-Aldrich KSPQ12012 Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane Cytiva (Fomerly GE Healthcare) 10600003
Rabbit anti-actin antibody Abcam ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody Cell Signaling 3502
Rabbit anti-GFP antibody Takara 632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5625
Transfection medium, Opti-MEM ThermoFisher Scientific 11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 Merck
Trypsin, TPCK-Treated Sigma-Aldrich 4370285

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
  2. Zheng, M., Kanneganti, T. -D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
  3. Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
  4. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
  5. Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
  6. Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
  7. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
  8. Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
  9. Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
  10. Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
  11. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
  12. Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
  13. Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
  14. Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
  15. Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
  16. Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
  17. Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
  18. Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  19. Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
  20. Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
  21. Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
  22. Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, Database issue 160-164 (2004).
  23. Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
  24. Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 185
זיהוי קספאזות והמוטיבים שלהן שמבקעים חלבונים במהלך הידבקות בנגיף שפעת A
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Husain, M. Identifying Caspases and… More

Husain, M. Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection. J. Vis. Exp. (185), e64189, doi:10.3791/64189 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter