Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identifisere Caspases og deres motiver som spalter proteiner under influensa A-virusinfeksjon

Published: July 21, 2022 doi: 10.3791/64189
Automatic Translation
1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Otago

Summary

Influensa A-virus (IAV) infeksjon aktiverer caspases som spalter vert og virale proteiner, som igjen har pro- og antivirale funksjoner. Ved å bruke inhibitorer, RNA-interferens, stedsrettet mutagenese og western blotting og RT-qPCR-teknikker, ble caspases i infiserte pattedyrceller som spalter vertskortaktin og histondeacetylaser identifisert.

Abstract

Caspases, en familie av cysteinproteaser, orkestrerer programmert celledød som respons på ulike stimuli, inkludert mikrobielle infeksjoner. Opprinnelig beskrevet å forekomme ved apoptose, er programmert celledød nå kjent for å omfatte tre sammenhengende veier: pyroptose, apoptose og nekroptose, sammen laget som en prosess, PANoptosis. Påvirkning Et virus (IAV) infeksjon induserer PANoptosis i pattedyrceller ved å indusere aktivering av forskjellige caspases, som igjen spalter forskjellige vert så vel som virale proteiner, noe som fører til prosesser som aktivering av vertens medfødte antivirale respons eller nedbrytning av antagonistiske vertsproteiner. I denne forbindelse har caspase 3-mediert spaltning av vertskortaktin, histon deacetylase 4 (HDAC4) og histon deacetylase 6 (HDAC6) blitt oppdaget i både dyre- og humane epitelceller som respons på IAV-infeksjonen. For å demonstrere dette ble inhibitorer, RNA-interferens og stedsrettet mutagenese brukt, og deretter ble spaltning eller motstand mot spaltning og gjenvinning av kortaktin-, HDAC4- og HDAC6-polypeptider målt ved vestlig blotting. Disse metodene, sammen med RT-qPCR, danner en enkel, men effektiv strategi for å identifisere verten så vel som virale proteiner som gjennomgår caspase-mediert spaltning under en infeksjon av IAV eller andre humane og animalske virus. Denne protokollen utdyper de representative resultatene av denne strategien, og måtene å gjøre den mer effektiv diskuteres også.

Introduction

Influensa A-virus (IAV) er det prototypiske medlemmet av Orthomyxoviridae-familien og er kjent for å forårsake globale epidemier og uforutsigbare pandemier. IAV forårsaker menneskelig luftveissykdom, influensa, kjent som "influensa". Influensa er en akutt sykdom som resulterer i induksjon av vertspro- og antiinflammatoriske medfødte immunresponser og død av epitelceller i menneskets luftveier. Begge prosessene styres av et fenomen som kalles programmert celledød1. Signaleringen for programmert celledød induseres så snart forskjellige patogengjenkjenningsreseptorer fornemmer de innkommende viruspartiklene i vertsceller. Dette fører til programmering av død av infiserte celler og signalering til de nærliggende friske cellene ved tre sammenhengende veier kalt pyroptose, apoptose og nekroptose - nylig laget som en prosess, PANoptosis1.

PANoptose innebærer proteolytisk behandling av mange verts- og virusproteiner fra induksjon til utførelse. Slik behandling av proteiner ledes primært av en familie av cysteinproteaser kalt caspases 1,2. Opptil 18 caspases (fra caspase 1 til caspase 18) er kjent3. De fleste caspases uttrykkes som pro-caspases og aktiveres ved å gjennomgå sin egen proteolytiske behandling enten ved autokatalyse eller andre caspases4 som svar på en stimulus som en virusinfeksjon. PANoptosis av IAV-infiserte celler ble antatt å være en vertsforsvarsmekanisme, men IAV har utviklet måter å unngå og utnytte den for å lette replikasjonen 1,2,5,6. En av dem er å motvirke vertsfaktorene via caspase-mediert spaltning eller nedbrytning som enten er iboende antivirale eller forstyrrer et av trinnene i IAV-livssyklusen. Til dette formål har vertsfaktorer, cortactin, HDAC4 og HDAC6 blitt oppdaget å gjennomgå caspase-mediert spaltning eller nedbrytning i IAV-infiserte epitelceller 7,8,9. HDAC4 og HDAC6 er anti-IAV-faktorer 8,10, og kortaktin forstyrrer IAV-replikasjon på et senere stadium av infeksjon, potensielt under viral montering og spirende 11.

I tillegg aktiveres også forskjellige caspaser, som igjen spalter flere proteiner for å aktivere vertsinflammatorisk respons under IAV-infeksjon 1,2. Videre gjennomgår nukleoprotein (NP), ionkanal M2-protein av IAV 12,13,14 og forskjellige proteiner av andre virus 3,15,16 også caspasemediert spaltning under infeksjon, noe som påvirker viral patogenese. Derfor er det et kontinuerlig behov for å studere caspase-mediert spaltning eller nedbrytning av verts- og virusproteiner under IAV og andre virusinfeksjoner for å forstå det molekylære grunnlaget for viral patogenese. Her presenteres metodene for å (1) vurdere spaltning eller nedbrytning av slike proteiner av caspases, (2) identifisere disse caspasene og (3) lokalisere spaltningsstedene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Regulatoriske godkjenninger ble innhentet fra University of Otago Institutional Biological Safety Committee for å jobbe med IAV og pattedyrceller. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) eller humane lungealveolære epitel A549-celler og IAV H1N1-subtyper ble brukt til denne studien. IAV ble dyrket i kyllingegg, som beskrevet andre steder17. Sterile og aseptiske forhold ble brukt til å arbeide med pattedyrceller, og et biosikkerhetsnivå 2 (eller fysisk inneslutning 2) anlegg og klasse II biosikkerhetsskap ble brukt til å arbeide med IAV-undertyper.

1. Vurdering av spaltning eller nedbrytning av proteiner i IAV-infiserte celler av caspases

  1. Frø 3 x 105 MDCK- eller A549-celler per brønn i en 12-brønns cellekulturplate.
    MERK: Hvis du bruker MDCK-celler, må du sørge for at antistoffet mot proteinet av interesse gjenkjenner hundens arter.
  2. Frø brønnene i par, dvs. en kontrollpar-en brønn for den uinfiserte-mock-prøven og en for den infiserte-mock-prøven- og et testpar-en brønn for uinfisert-inhibitor En prøve og en for den infiserte hemmeren A-prøven. Øke antall par med hver ekstra hemmer (se referanse 7,8).
  3. Inkuber cellene ved 37 °C under en 5 % CO2-atmosfære over natten.
  4. Neste dag, infisere cellene med IAV (en H1N1 subtype eller en annen subtype).
    1. For dette, forbered virus inoculum ved å fortynne virusstammen i 400 μL serumfritt minimum essensielt medium (MEM) (se materialtabell) ved et mangfold av infeksjon (MOI) på 0,5-3,0 plakkdannende enheter (pfu) / celle 7,11 (en faktor for dobling av celletall ved beregning av MOI).
      MERK: For infeksjon av MDCK-celler, suppler viruset inoculum med tosylfenylfenylklormetylketon (TPCK)-trypsin ved en endelig konsentrasjon på 1 μg / ml.
  5. Fjern det gamle kulturmediet fra cellene (trinn 1.3) og vask cellene med 1 ml/brønn serumfri MEM 2x.
  6. Tilsett 400 μL virus inokulum (trinn 1.4.1) til cellene og inkuber dem i 1 time ved 35 °C under en 5% CO2 atmosfære.
  7. I mellomtiden fortynnes en caspasehemmer (f.eks. Z-DEVD-FMK), en lysosomhemmer (f.eks. NH4Cl) eller en proteasomhemmer (f.eks. MG132) (se materialtabell) ved en endelig konsentrasjon på henholdsvis 40 μM, 20 mM eller 10 μM i serumfri MEM7 (se materialtabell). De to sistnevnte hemmerne tjener som en kontroll. Fortynn et likt volum av oppløsningsvæsken (hvis annet enn vann) som brukes til å rekonstituere en av inhibitorene i serumfritt medium som en mock.
  8. Fjern virusets inokulum og vask cellene som i trinn 1.5 (1x).
  9. Tilsett serumfri MEM, 1 ml / brønn, mock eller supplert med en inhibitor, til cellene og inkuber cellene som i trinn 1.6. Dette tidspunktet regnes som 0 timers infeksjon.
  10. Etter 24 timer, høst cellene ved å skrape dem med et 1 ml sprøytestempel (gummiside) og overfør dem til et 1,5 ml polypropylenrør.
  11. Sentrifuger røret ved 12.000 x g i 1-2 minutter ved romtemperatur. Samle supernatanten ved hjelp av en pipette.
    MERK: Denne supernatanten kan kastes eller brukes til en plakkanalyse8 for å måle titeren til det frigjorte virusavkommet.
  12. Vask cellepelleten med 250 μL fosfatbufret saltvann (PBS) ved re-sentrifugering som i trinn 1.11.
  13. Fjern supernatanten og lyse cellene ved å tilsette 80-100 μL cellelysebuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdodecylsulfat (SDS), 0,5% natriumdeoksykolat, 1% Triton X-100 og 1x proteasehemmercocktail, se Materialtabell) og vortexing.
  14. Varm opp røret ved 98 °C i 10 minutter for å lyse helt opp og klargjøre det totale cellelysatet. Oppbevar lysatene ved 4 °C for å utføre trinn 1,15-1,17 neste dag, men for best resultat, fullfør disse trinnene samme dag.
  15. Beregn proteinmengden i hver prøve ved hjelp av et BCA-analysesett (se materialtabell).
  16. Løs like mengder protein fra uinfiserte og infiserte prøver ved standard SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE)11 sammen med molekylvektmarkører 11.
  17. Overfør proteinet til en nitrocellulose- eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (se materialtabell).
    MERK: PVDF-membran kan gi en høy bakgrunn i noen vestlige blotbilder; Se etter kompatibilitet.
  18. Utfør western blotting for å oppdage proteinet av interesse ved hjelp av metoden beskrevet andre steder11.
  19. Sammenlign proteinnivåene i de mock-behandlede og inhibitorbehandlede infiserte prøvebanene.
    MERK: Hvis proteinnivået har gjenopprettet i den caspaseinhibitorbehandlede infiserte prøvebanen, spaltes eller nedbrytes proteinet av caspases. Ellers nedbrytes det av enten lysosom eller proteasom.
  20. Kvantifiser proteinutvinningen ved å måle båndintensiteten i hver bane fra minst tre replikasjoner av det samme eksperimentet og normalisere det med det tilsvarende lastkontrollbåndet.
  21. Bruk en hvilken som helst moderne bildeapparat og tilhørende programvare (se Materialtabell) for å avbilde de vestlige flekkene og kvantifisere proteinutvinningen.

2. Bekreftelse av caspase-mediert spaltning eller nedbrytning av proteiner i IAV-infiserte celler ved RNA-interferens

  1. Design eller oppnå en pre-design small-interfering RNA (siRNA) rettet mot enten hund eller human caspase 3, caspase 6 og caspase 7 (bøddel caspases1) og en ikke-målrettet kontroll siRNA (se tabell over materialer).
  2. Lever hvert siRNA til MDCK- eller A549-celler ved omvendt transfeksjon 8,11.
  3. For dette, fortynn i separate rør 100 nM kontroll-siRNA eller caspase siRNA eller et anbefalt volum transfeksjonsreagens (se materialtabell) i 100 μL passende medium (som OptiMEM, se materialtabell), og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
  4. Forbered hver fortynning i duplikat.
    MERK: Dette duplikatet inkluderer en replikasjon for å analysere knockdown av caspase uttrykk ved RT-qPCR eller western blotting (hvis antistoffer mot caspases er tilgjengelige) og en annen for å vurdere utvinningen av proteinet av interesse ved vestlig blotting.
  5. Bland 100 μL av hver siRNA-løsning med 100 μL transfeksjonsreagensløsning (trinn 2.3) og inkuber i 20-45 minutter ved romtemperatur for å danne siRNA-transfeksjonsreagenskomplekset.
  6. I mellomtiden, del og tilsett 1 x 10 5 MDCK- eller A549-celler i 800 μL av hele vekstmediet, bland med 200 μL siRNA-transfeksjonsreagenskompleks (trinn2,5 ), og tilsett 1 ml suspensjon til en brønn på en 12-brønns kulturplate. Denne fortynningen bringer den endelige konsentrasjonen av kontroll siRNA eller caspase siRNA til 10 nM.
  7. Inkuber cellene ved 37 °C under en 5 % CO2-atmosfære i 72 timer.
  8. Høst cellene fra en replikere som i trinn 1.10, og behandle dem for å validere eller bekrefte knockdown av uttrykket av caspase 3, caspase 6 og caspase 7 enten ved RT-qPCR eller western blotting, henholdsvis ved hjelp av standardmetoder og protokoller 8,11.
  9. Infisere cellene i den andre replikasjonen med IAV som beskrevet i trinn 1.4-1.9 (uten inhibitorer).
  10. Etter 24 timer høstes, bearbeides og analyseres cellene ved western blotting og måler og kvantifiserer proteingjenvinningen som beskrevet i trinn 1.10-1.20.

3. Site-rettet mutagenese for å lokalisere caspase spaltningsstedet (e) i polypeptidet

  1. Klon det genkodende proteinet av interesse i et pattedyruttrykksplasmid11 eller få det fra et forskningslaboratorium eller en kommersiell kilde (se materialtabell).
    MERK: Det er foretrukket hvis genet er klonet med en epitop-tag eller som GFP-fusjon for å skille det ektopisk uttrykte polypeptidet fra det endogent uttrykte under vestlig blotting.
  2. Ved hjelp av caspase substratdatabaser4 eller proteinjusteringsverktøy, finn konsensus caspase spaltningsmotiver, XXXD og DXXD, på polypeptidet. Nesten alle caspase spaltningsmotiver har asparaginsyren på spaltningsstedet (P1)3,4.
  3. Muter den antatte P1-asparaginsyren til glutaminsyre eller en ikke-polær aminosyre (alanin, valin) ved stedsrettet mutagenese etterfulgt av DNA-sekvensering11 ved bruk av standardmetoder og protokoller.
  4. Lever villtype (WT) og mutant plasmid-DNA til MDCK- eller A549-celler ved omvendt transfeksjon11.
    1. For dette, fortynn 2 μg plasmid-DNA eller et anbefalt volum av transfeksjonsreagenset i 100 μL av et passende medium (se trinn 2.3 og materialtabell) i separate rør, og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur.
    2. Bland 100 μL av hver plasmid DNA-løsning med 100 μL av transfeksjonsreagensløsningen og inkuber i 20-45 minutter ved romtemperatur for å danne DNA-transfeksjonsreagenskomplekset.
  5. I mellomtiden, del og tilsett 3 x 105 MDCK- eller A549-celler til 800 μL av hele vekstmediet, bland med 200 μL DNA-transfeksjonsreagenskompleks, og tilsett 1 ml suspensjonen til en brønn på en 12-brønns kulturplate.
  6. Inkuber cellene ved 37 °C under en 5 % CO2-atmosfære .
  7. Etter 48 timer, infiser cellene med IAV som beskrevet i trinn 1.4-1.9 (uten å legge til hemmerne).
  8. Etter 24 timer, høst, behandle og analysere cellene ved western blotting (hvis aktuelt, ved hjelp av antistoffet til en epitop tag eller GFP). Deretter måler og kvantifiserer du proteingjenvinningen som beskrevet i trinn 1.10-1.20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Behandling med caspase 3-hemmer
Det har blitt oppdaget at verts kortaktin, HDAC4 og HDAC6 polypeptider gjennomgår nedbrytning som svar på IAV-infeksjon i både hund (MDCK) og humane (A549, NHBE) celler 7,8,9. Ved å bruke de ovennevnte tilnærmingene ble det avdekket at IAV-induserte vertskaspaser, spesielt caspase 3, forårsaker nedbrytning 7,8,9. Kortaktinet ble degradert på en infeksjonsdose- og tidsavhengig måte og en vertscelle- og IAV-stammeuavhengig måte7. Lignende resultater ble oppnådd for HDAC48 og HDAC69. Interessant nok falt nedbrytningen av alle tre vertsproteinene sammen med spaltningen av viral NP 7,8,9, som er kjent for å gjennomgå caspase-mediert spaltning14. Dermed ble det antatt at cortactin, HDAC4 og HDAC6 også gjennomgår caspase-mediert spaltning og påfølgende nedbrytning. For å teste dette ble de IAV-infiserte cellene først behandlet med en caspase 3-hemmer, og redningen av kortaktin-, HDAC4- og HDAC6-polypeptider ble analysert ved vestlig blotting. Alle tre polypeptider (så vel som viral NP) gjenopprettet fra IAV-infeksjonsindusert nedbrytning etter caspase 3-hemmerbehandling 7,8,9. De representative dataene7 for kortaktin er vist i figur 1A. Denne utvinningen ble kvantifisert ved å måle intensiteten av proteinbånd og normalisere verdien av kortaktinbåndet med verdien av det tilsvarende aktin (lastkontroll) båndet. Deretter ble den normaliserte verdien av kortaktin i de tilsvarende uinfiserte prøvene ansett som 100% for å bestemme verdien i de infiserte prøvene. Denne kvantifiseringsmetoden utgjorde utvinningen av kortaktinpolypeptid i caspase 3-hemmerbehandlede infiserte celler som 78,8% fra 20,7% i ubehandlede infiserte celler7 (figur 1B).

RNA-interferensmediert knockdown av caspase 3-uttrykk
Deretter ble et genetisk verktøy, RNA-interferens (RNAi), brukt, etterfulgt av vestlig blotting for å bekrefte rollen som caspases i IAV-infeksjonsindusert nedbrytning av kortaktin11 og HDAC48. I caspase 3-utarmede celler (figur 2C)11 ble både kortaktin (figur 2A)11 og HDAC48 polypeptider gjenfunnet fra IAV-infeksjonsindusert nedbrytning. I caspase 6- eller caspase 7-utarmede celler (figur 2C)11 ble det imidlertid ikke observert signifikant restitusjon i kortaktinpolypeptidnivåer (figur 2A)11. Spesielt, når kvantifisert og sammenlignet med deres nivåer i tilsvarende uinfiserte celler som nevnt ovenfor, gjenvunnet kortaktinpolypeptidnivået i infiserte celler med utarmet caspase 3-uttrykk til 83% fra 28,6% i infiserte celler med normalt caspase 3-uttrykk (figur 2B) 11.

Caspase spaltningsmotiver i kortaktin og HDAC6 polypeptider
Til slutt ble aminosyresekvensen i kortaktin- og HDAC6-polypeptider screenet, og i antatte caspasespaltningsmotiver ble asparaginsyren ved P1-posisjonen mutert til glutaminsyre 9,11. Denne tilnærmingen identifiserte asparaginsyre 116 i kortaktinpolypeptid11 og asparaginsyre 1088 i HDAC6 polypeptid9 som et kaspasespaltningssted. Mutasjonen av begge asparaginsyrerester til glutaminsyre gjorde kortaktin (figur 3A)11 og HDAC69 polypeptider resistente mot IAV-infeksjonsindusert nedbrytning. Spesielt, når kvantifisert og sammenlignet med deres nivåer i tilsvarende uinfiserte celler som nevnt ovenfor, var nivået av plasmid-uttrykt mutant kortaktinpolypeptid i infiserte celler 77,9%, mens nivået av plasmid-uttrykt villtype kortaktinpolypeptid i infiserte celler var 23,6% (figur 3B) 11.

Figure 1
Figur 1: Kortaktinpolypeptid gjennomgår caspase 3-mediert nedbrytning i IAV-infiserte celler. (A) MDCK-celler ble infisert med influensavirus A/Ny-Caledonia/20/1999/H1N1-stamme ved en MOI på 0,5 og deretter behandlet som mock eller med caspase 3-hemmer (Cas3-I, 40 μM). Etter 24 timer ble kortatin-, virus-NP- og aktinpolypeptidene påvist i totale cellelysater ved western blotting. UNI, uinfisert; INF, infisert. Pilene peker mot full lengde og spaltet NP. (B) Intensiteten av kortaktin- og aktinbånd ble kvantifisert. Deretter ble verdien av kortaktin normalisert med verdien av aktin. Den normaliserte mengden kortaktin i UNI-prøver ble ansett som 100% for å bestemme mengden i de tilsvarende INF-prøvene. Data presentert er midler ± SE av tre biologiske replikasjoner. P = 0,0006, beregnet ved hjelp av toveis ANOVA. ns, ikke signifikant. Dette tallet er modifisert fra Chen et al.7. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Knockdown av caspase 3-ekspresjon reddet nedbrytning av kortaktinpolypeptid i IAV-infiserte celler. (A) A549-celler ble transfisert i duplikater med 10 nM kontroll (Ctrl), caspase 3 (Cas3), caspase 6 (Cas6) eller caspase 7 (Cas7) siRNA. Etter 72 timer ble cellene i en replikasjon høstet og behandlet for å trekke ut totalt RNA. Cellene i den andre replikasjonen ble infisert med influensavirus A/WSN/1933/H1N1 subtype ved en MOI på 3,0. Etter 24 timer ble kortaktin-, virus-NP- og aktinpolypeptidene påvist ved western blotting. UNI, uinfisert; INF, infisert. (B) Intensiteten av kortaktin- og aktinbånd ble kvantifisert, og verdien av kortaktin ble normalisert med verdien av aktin. Deretter ble den normaliserte mengden kortaktin i UNI-prøvene ansett som 100% for å bestemme mengden i de tilsvarende INF-prøvene. Data presentert er midler ± SE av tre biologiske replikasjoner. P < 0,0001, ***P = 0,0007, ***P = 0,0002, beregnet ved hjelp av toveis ANOVA. ns, ikke signifikant. (C) Totalt RNA ekstrahert ovenfor ble konvertert til cDNA, som deretter ble brukt som en mal for å oppdage caspase 3, caspase 6, caspase 7 og aktin mRNA nivåer av RT-qPCR. Aktin mRNA-nivået ble brukt som referanse, og mRNA-nivået for hver caspase i kontroll siRNA (Ctrl) og respektive caspase siRNA (Cas) transfiserte celler ble beregnet ved hjelp av standard 2-ΔΔCT-metoden. P < 0,0001, beregnet ved hjelp av toveis ANOVA. Dette tallet er modifisert fra Chen et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Mutasjon av asparaginsyre 116 til glutaminsyre gjorde kortaktinpolypeptidet resistent mot nedbrytning forårsaket av IAV-infeksjon . (A) MDCK-celler ble transfisert med et plasmid som uttrykker villtype (WT) eller mutert (D116E) GFP-kortaktinfusjon. Etter 48 timer ble cellene infisert med influensavirus A/WSN/1933/H1N1 subtype ved en MOI på 3,0. Etter 24 timer ble GFP-kortattin, viral NP og aktinpolypeptider påvist ved western blotting. UNI, uinfisert; INF, infisert. (B) Intensiteten av kortaktin- og aktinbånd ble kvantifisert, og verdien av kortaktin ble normalisert med verdien av aktin. Deretter ble den normaliserte mengden kortaktin i UNI-prøver ansett som 100% for å bestemme mengden i de tilsvarende INF-prøvene. Data presentert er midler ± SE av tre biologiske replikasjoner. **P = 0,001, beregnet ved hjelp av toveis ANOVA. ns, ikke signifikant. Dette tallet er modifisert fra Chen et al.11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er fastslått at virus skreddersyr vertsfaktorene og veiene til deres fordel. I sin tur motstår vertscellene det ved å bruke ulike strategier. En av disse strategiene er PANoptosis, som vertsceller bruker som en antiviral strategi mot virusinfeksjoner. Imidlertid har virus som IAV utviklet sine egne strategier for å motvirke PANoptose og utnytte det til deres fordel 1,3,6. Dette samspillet innebærer spaltning av forskjellige verts- og virusproteiner av caspases. Identifisering av disse caspasene og deres spaltningssteder i substratproteiner er viktig for å belyse mekanismene og betydningen av slikt samspill.

Til dette formål ble standard biokjemiske og molekylære metoder brukt til å identifisere caspasene og deres spaltningssteder i vertskortaktin, HDAC4 og HDAC6 7,8,9,11. Protokollene beskrevet ovenfor kan brukes til slike studier som involverer influensavirus, andre pattedyrvirus, andre mikrober og ytre stimuli som toksiner og kjemikalier. Videre kan disse metodene replikeres i et standard molekylærbiologisk laboratorium med relevante ferdigheter og krever ikke spesialisert utstyr og programvareopplæring. 12-brønns cellekulturplateformatet ble vellykket tilpasset for disse og lignende studier for å generere tilstrekkelige prøvemengder for nedstrømsanalyser ved western blotting og RT-qPCR. Likevel, etter behov, kan dette formatet nedskaleres eller oppskaleres tilsvarende. Når du gjør et eksperiment som involverer en caspaseinhibitor for første gang, foreslås bruk av en pan-caspase-hemmer (Z-VAD-FMK) sammen med en lysosom- og proteasomhemmer for å vurdere om proteinet av interesse gjennomgår caspase-mediert nedbrytning. Videre, i tillegg til NH4Cl og MG132, kan andre lysosom- og proteasomhemmere som henholdsvis Bafilomycin A og Epoxomicin, brukes. Etter positive resultater med en pan-caspase-hemmer, kan enten spesifikke hemmere av individuelle caspases brukes, eller RNA-interferens kan brukes. For førstnevnte er det viktig å optimalisere de effektive hemmende konsentrasjonene for å unngå toksisitet for målcelletypen og ikke-spesifikke resultater.

Et genetisk verktøy som RNA-interferens eller CRISPR må brukes ved siden av for å bekrefte involvering av caspases fordi inhibitorer kryssreagerer. Alternativt kan en RNA-interferens eller CRISPR-skjerm individuelt rettet mot alle kjente caspaser utføres. SiRNA-, gRNA- og RT-qPCR-primerparene til alle kjente caspaser kan anskaffes som forhåndsdesignet eller designet ved hjelp av elektroniske verktøy. I tillegg kan to eller flere caspases utarmes samtidig for å vurdere sekvensiell eller kooperativ spaltning av polypeptider (denne strategien ble nylig brukt i en ennå ikke publisert studie). RNA-interferens antas å være et ideelt verktøy for virus-vertscelleinteraksjonsforskning. Sistnevnte krever en kontrollert manipulering av vertsgenuttrykk slik at vertscellene forblir relativt levedyktige for virusinfeksjon og fullføring av livssyklusen for å vise fenotypen til den manipulasjonen. Imidlertid er optimalisering av en effektiv siRNA-konsentrasjon og siRNA-transfeksjonsreagenskombinasjon nødvendig for hver celletype for et optimalt knockdown og levedyktighetsforhold for påfølgende infeksjon.

For å finne de antatte caspase-spaltningsmotivene er det utviklet mange databaser som CASBAH18, CaspDB19, CutDB 20, DegraBase 21, MEROPS 22 og TopFIND23,24. En visuell screening ble utført for å lokalisere disse motivene på HDAC6 polypetide9, men for kortaktin11 ble CaspDB brukt (selv om CaspDB-nettstedet har vært utilgjengelig i det siste). Disse motivene ble vellykket bekreftet som caspase spaltningssteder ved å mutere P1 asparaginsyre til glutaminsyre. Imidlertid anbefales det å mutere asparaginsyren til en ikke-polær aminosyrelignende alanin eller valin først fordi noen caspaser kan spalte etter P1 glutaminsyre4. Denne øvelsen kan raskt resultere i identifisering av caspase spaltningssted (er), men kan kreve generering av titalls mutanter hvis målpolypeptidet er rik på asparaginsyrer og de antatte målmotivene er ikke-kanoniske. For levering av plasmider (og siRNA) til celler, fremover, i stedet for omvendt, kan transfeksjon utføres. Videre bør infeksjonsdosen og tidskinetikken utføres ved bruk av en 4% -20% gradient SDS-PAGE for western blotting for å vurdere nedbrytningskinetikken til polypeptidene og identifisere eventuelle mindre spaltningsprodukter. Til slutt, for å bekrefte proteinet av interesse som et direkte caspasesubstrat, kan in vitro biokjemiske analyser som inneholder rensede caspases og målproteiner (WT eller mutant) og eventuelle kofaktorer utvikles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Forfatteren anerkjenner Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), Health Research Council of New Zealand, Maurice og Phyllis Paykel Trust (New Zealand), HS og JC Anderson Trust (Dunedin), og Institutt for mikrobiologi og immunologi og School of Biomedical Sciences (University of Otago).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A549 cells ATCC CRM-CCL-185 Human, epithelial, lung
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434
Caspase 3 Inhibitor Sigma-Aldrich 264156-M Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem'
cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail Roche 11836153001
Goat anti-NP antibody Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 31985062
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher Scientific 13778150
MDCK cells ATCC CCL-34 Dog, epithelial, kidney
MG132 Sigma-Aldrich M7449
Minimum Essential Medium (MEM) ThermoFisher Scientific 11095080 Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required
MISSION siRNA Universal Negative Control #1 Sigma-Aldrich SIC001
Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2  LI-COR Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software.
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23225
Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion  Addgene 50728 Gift from Kenneth Yamada to Addgene
Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 Sigma-Aldrich NM_004346 siRNA ID: SASI_Hs01_00139105
Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 Sigma-Aldrich NM_001226 siRNA ID: SASI_Hs01_00019062
Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 Sigma-Aldrich NM_001227 siRNA ID: SASI_Hs01_00128361
Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs Sigma-Aldrich KSPQ12012 Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1
Protran Premium nitrocellulose membrane Cytiva (Fomerly GE Healthcare) 10600003
Rabbit anti-actin antibody Abcam ab8227
Rabbit anti-cortactin antibody Cell Signaling 3502
Rabbit anti-GFP antibody Takara 632592
SeeBlue Pre-stained Protein Standard ThermoFisher Scientific LC5625
Transfection medium, Opti-MEM ThermoFisher Scientific 11668019
Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 Merck
Trypsin, TPCK-Treated Sigma-Aldrich 4370285

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D. PANoptosis in microbial infection. Current Opinion in Microbiology. 59, 42-49 (2021).
  2. Zheng, M., Kanneganti, T. -D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
  3. Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
  4. Julien, O., Wells, J. A. Caspases and their substrates. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1380-1389 (2017).
  5. Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
  6. Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
  7. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
  8. Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
  9. Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
  10. Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
  11. Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
  12. Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
  13. Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
  14. Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
  15. Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
  16. Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
  17. Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
  18. Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
  19. Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
  20. Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
  21. Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
  22. Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J. MEROPS: The peptidase database. Nucleic Acids Research. 32, Database issue 160-164 (2004).
  23. Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
  24. Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 185
Identifisere Caspases og deres motiver som spalter proteiner under influensa A-virusinfeksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Husain, M. Identifying Caspases and… More

Husain, M. Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection. J. Vis. Exp. (185), e64189, doi:10.3791/64189 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter