Summary
İnfluenza A virüsü (IAV) enfeksiyonu, konakçı ve viral proteinleri parçalayan kaspazları aktive eder ve bunlar da pro- ve antiviral fonksiyonlara sahiptir. İnhibitörler, RNA girişimi, bölgeye yönelik mutagenez ve batı lekelenme ve RT-qPCR teknikleri kullanılarak, konakçı kortaktin ve histon deasetilazları parçalayan enfekte memeli hücrelerinde kaspazlar tanımlandı.
Abstract
Sistein proteazlarının bir ailesi olan kaspazlar, mikrobiyal enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara yanıt olarak programlanmış hücre ölümünü düzenler. Başlangıçta apoptoz ile ortaya çıktığı tanımlanan programlanmış hücre ölümünün şimdi birbirine bağlı üç yolu kapsadığı bilinmektedir: pirotoz, apoptoz ve nekroptoz, birlikte tek bir süreç olarak adlandırılan PANoptoz. Etki Bir virüs (IAV) enfeksiyonu, farklı kaspazların aktivasyonunu indükleyerek memeli hücrelerinde PANoptozu indükler, bu da çeşitli konakçıların yanı sıra viral proteinleri de parçalara ayırır ve konakçının doğuştan gelen antiviral yanıtının aktivasyonu veya antagonistik konakçı proteinlerinin bozulması gibi süreçlere yol açar. Bu bağlamda, IAV enfeksiyonuna yanıt olarak hem hayvan hem de insan epitel hücrelerinde konakçı kortaktin, histon deasetilaz 4 (HDAC4) ve histon deasetilaz 6'nın (HDAC6) kaspaz 3 aracılı bölünmesi keşfedilmiştir. Bunu göstermek için, inhibitörler, RNA girişimi ve bölgeye yönelik mutagenez kullanıldı ve daha sonra, bölünmeye karşı bölünme veya direnç ve kortaktin, HDAC4 ve HDAC6 polipeptitlerinin geri kazanımı batı lekelenmesi ile ölçüldü. Bu yöntemler, RT-qPCR ile birlikte, IAV veya diğer insan ve hayvan virüslerinin enfeksiyonu sırasında kaspaz aracılı bölünmeye maruz kalan viral proteinlerin yanı sıra konakçıyı tanımlamak için basit ama etkili bir strateji oluşturur. Mevcut protokol, bu stratejinin temsili sonuçlarını detaylandırmakta ve daha etkili hale getirmenin yolları da tartışılmaktadır.
Introduction
İnfluenza A virüsü (IAV), Orthomyxoviridae ailesinin prototipik üyesidir ve küresel salgınlara ve öngörülemeyen pandemilere neden olduğu bilinmektedir. IAV, genellikle "grip" olarak bilinen insan solunum yolu hastalığına, influenzaya neden olur. Grip, konakçı pro- ve anti-inflamatuar doğuştan gelen immün yanıtların indüksiyonu ve insan solunum yollarında epitel hücrelerinin ölümü ile sonuçlanan akut bir hastalıktır. Her iki süreç de programlanmış hücre ölümü1 adı verilen bir fenomen tarafından yönetilir. Programlanmış hücre ölümü için sinyalizasyon, çeşitli patojen tanıma reseptörleri konakçı hücrelerde gelen virüs parçacıklarını algıladığı anda indüklenir. Bu, enfekte olmuş hücrelerin ölümünün programlanmasına ve komşu sağlıklı hücrelere, pirotoz, apoptoz ve nekroptoz adı verilen birbirine bağlı üç yolla sinyal verilmesine yol açar - son zamanlarda tek bir süreç olarak adlandırılan PANoptoz1.
PANoptoz, indüksiyondan uygulamaya kadar birçok konakçı ve viral proteinin proteolitik olarak işlenmesini içerir. Proteinlerin bu şekilde işlenmesine öncelikle kaspazlar 1,2 adı verilen bir sistein proteaz ailesi öncülük eder. 18'e kadar kaspaz (kaspaz 1'den kaspaz 18'e)3 olarak bilinir. Çoğu kaspaz pro-kaspaz olarak ifade edilir ve virüs enfeksiyonu gibi bir uyarana yanıt olarak otokataliz veya diğer kaspazlar4 ile kendi proteolitik işlemlerinden geçirilerek aktive edilir. IAV ile enfekte olmuş hücrelerin PANoptozunun bir konakçı savunma mekanizması olduğu düşünülüyordu, ancak IAV, replikasyonunu kolaylaştırmak için ondan kaçınmanın ve yararlanmanın yollarını geliştirdi 1,2,5,6. Bunlardan biri, konakçı faktörleri, doğal olarak antiviral olan veya IAV yaşam döngüsünün adımlarından birine müdahale eden kaspaz aracılı bölünme veya bozunma yoluyla antagonize etmektir. Bu amaçla, konakçı faktörler, kortaktin, HDAC4 ve HDAC6'nın IAV ile enfekte epitel hücrelerinde kaspaz aracılı bölünme veya bozulmaya uğradığı keşfedilmiştir 7,8,9. HDAC4 ve HDAC6, anti-IAV faktörleri 8,10'dur ve kortaktin, enfeksiyonun sonraki bir aşamasında, potansiyel olarak viral montaj ve tomurcuklanma sırasında IAV replikasyonuna müdahale eder 11.
Ek olarak, çeşitli kaspazlar da aktive edilir, bu da IAV enfeksiyonu 1,2 sırasında konakçı enflamatuar yanıtını aktive etmek için birden fazla proteini parçalar. Ayrıca, nükleoprotein (NP), IAV 12,13,14'ün iyon kanallı M2 proteini ve diğer virüslerin çeşitli proteinleri 3,15,16 da enfeksiyon sırasında kaspaz aracılı bölünmeye uğrar ve bu da viral patogenezi etkiler. Bu nedenle, viral patogenezin moleküler temelini anlamak için IAV ve diğer virüs enfeksiyonları sırasında konakçı ve viral proteinlerin kaspaz aracılı bölünmesini veya parçalanmasını incelemeye sürekli ihtiyaç vardır. Burada, yöntemler (1) bu tür proteinlerin kaspazlar tarafından bölünmesini veya parçalanmasını değerlendirmek, (2) bu kaspazları tanımlamak ve (3) bölünme bölgelerini bulmak için sunulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
IAV ve memeli hücreleriyle çalışmak için Otago Üniversitesi Kurumsal Biyolojik Güvenlik Komitesi'nden düzenleyici onaylar alındı. Bu çalışmada Madin-Darby Köpek Böbreği (MDCK) veya insan akciğer alveoler epitel A549 hücreleri ve IAV H1N1 alt tipleri kullanılmıştır. IAV, başka bir yerde açıklandığı gibi tavuk yumurtasında yetiştirildi17. Memeli hücreleriyle çalışmak için steril ve aseptik koşullar kullanıldı ve IAV alt tipleriyle çalışmak için bir Biyogüvenlik Seviye 2 (veya Fiziksel Muhafaza 2) tesisi ve Sınıf II biyogüvenlik kabini kullanıldı.
1. IAV ile enfekte olmuş hücrelerdeki proteinlerin kaspazlar tarafından bölünmesinin veya parçalanmasının değerlendirilmesi
- 12 delikli bir hücre kültürü plakasında kuyu başına 3 x 105 MDCK veya A549 hücrelerini tohumlayın.
NOT: MDCK hücreleri kullanıyorsanız, ilgili proteine karşı antikorun köpek türlerini tanıdığından emin olun. - Kuyucukları çiftler halinde tohumlayın, yani enfekte edilmemiş sahte numune için bir kontrol çifti - bir kuyu ve enfekte edilmiş-sahte numune için bir kuyu - ve enfekte edilmemiş inhibitör A numunesi için bir test çifti - bir kuyu ve enfekte inhibitör A numunesi için bir tane. Her ek inhibitör ile çift sayısını artırın (bkz. referans 7,8).
- Hücreleri gece boyunca% 5 CO2 atmosferi altında 37 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, hücreleri IAV (bir H1N1 alt tipi veya başka bir alt tip) ile enfekte edin.
- Bunun için, virüs stokunu 400 μL serumsuz minimum esansiyel ortamda (MEM) seyrelterek virüs inokulunu, 0.5-3.0 plak oluşturan birim (pfu) / hücre 7,11 (MOI'yi hesaplarken hücre sayısının iki katına çıkmasının bir faktörü) çokluğunda (MOI) seyrelterek hazırlayın.
NOT: MDCK hücrelerini enfekte etmek için, virüs inokulumunu, 1 μg / mL'lik son konsantrasyonda tosil fenilalanil klorometil keton (TPCK)-tripsin ile destekleyin.
- Bunun için, virüs stokunu 400 μL serumsuz minimum esansiyel ortamda (MEM) seyrelterek virüs inokulunu, 0.5-3.0 plak oluşturan birim (pfu) / hücre 7,11 (MOI'yi hesaplarken hücre sayısının iki katına çıkmasının bir faktörü) çokluğunda (MOI) seyrelterek hazırlayın.
- Eski kültür ortamını hücrelerden çıkarın (adım 1.3) ve hücreleri 1 mL / serumsuz MEM 2x kuyucuğu ile yıkayın.
- Hücrelere 400 μL virüs inokulumu (adım 1.4.1) ekleyin ve% 5'lik bir CO2 atmosferi altında 35 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
- Bu arada, bir kaspaz inhibitörü (örneğin, Z-DEVD-FMK), bir lizozom İnhibitörü (örneğin, NH4Cl) veya bir proteazom inhibitörü (örneğin, MG132) (bakınız Malzeme Tablosu) serumsuz MEM7'de sırasıyla 40 μM, 20 mM veya 10 μM'lik bir son konsantrasyonda seyreltin (bkz. Son iki inhibitör bir kontrol görevi görür. İnhibitörlerden birini serumsuz ortamda alay olarak yeniden oluşturmak için kullanılan çözücünün eşit hacmini (su dışındaysa) seyreltin.
- Virüs inokulumunu çıkarın ve hücreleri adım 1.5'te (1x) olduğu gibi yıkayın.
- Serumsuz MEM'i, 1 mL / kuyucuk, sahte veya bir inhibitör ile takviye edilmiş hücrelere ekleyin ve hücreleri adım 1.6'da olduğu gibi inkübe edin. Bu zaman noktası 0 saatlik enfeksiyon olarak kabul edilir.
- 24 saat sonra, hücreleri 1 mL'lik bir şırınga pistonu (kauçuk taraf) ile kazıyarak toplayın ve 1,5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.
- Tüpü oda sıcaklığında 1-2 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın. Bir pipet kullanarak süpernatantı toplayın.
NOT: Bu süpernatant, salınan virüs soyunun titresini ölçmek için bir plak testi8 için atılabilir, kullanılabilir. - Hücre peletini 250 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile adım 1.11'de olduğu gibi yeniden santrifüjleme ile yıkayın.
- 80-100 μL hücre lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl,% 0.5 sodyum dodesil sülfat (SDS),% 0.5 sodyum deoksikolat,% 1 Triton X-100 ve 1x proteaz inhibitörü kokteyli, Malzeme Tablosuna bakınız) ve vorteks ekleyerek süpernatantı çıkarın ve hücreleri lize edin.
- Tamamen lize etmek ve toplam hücre lizatını hazırlamak için tüpü 98 ° C'de 10 dakika ısıtın. Ertesi gün 1.15-1.17 adımlarını gerçekleştirmek için lizatları 4 ° C'de saklayın, ancak en iyi sonuç için bu adımları aynı gün içinde tamamlayın.
- Bir BCA tahlil kiti kullanarak her numunedeki protein miktarını tahmin edin (bkz.
- Enfekte olmamış ve enfekte olmuş numunelerden eşit miktarda proteini, standart SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE)11 ve moleküler ağırlık belirteçleri 11 ile çözün.
- Proteini bir nitroselüloz veya poliviniliden diflorür (PVDF) membranına aktarın (bkz.
NOT: PVDF membran bazı batı leke görüntüleyicilerinde yüksek bir arka plan verebilir; uyumluluğu kontrol edin. - Başka bir yerde açıklanan yöntemi kullanarak ilgilenilen proteini tespit etmek için batı lekelemesi yapın11.
- Alay ile tedavi edilmiş ve inhibitör ile muamele edilmiş enfekte numune şeritlerindeki protein seviyelerini karşılaştırın.
NOT: Protein seviyesi, kaspaz inhibitörü ile tedavi edilen enfekte numune şeridinde iyileşmişse, protein kaspazlar tarafından parçalanır veya parçalanır. Aksi takdirde, lizozom veya proteazom tarafından parçalanır. - Her şeritteki bant yoğunluğunu aynı deneyin en az üç kopyasından ölçerek ve karşılık gelen yükleme kontrol bandı ile normalleştirerek protein geri kazanımını ölçün.
- Batı lekelerini görüntülemek ve protein geri kazanımını ölçmek için herhangi bir çağdaş görüntüleyiciyi ve ilgili yazılımı kullanın (bkz.
2. RNA girişimi ile IAV ile enfekte olmuş hücrelerde kaspaz aracılı bölünmenin veya proteinlerin parçalanmasının doğrulanması
- Köpek veya insan kaspaz 3, kaspaz 6 ve kaspaz 7'yi (cellat kaspazları1) ve hedeflemeyen bir kontrol siRNA'sını (bkz.
- Her bir siRNA'yı MDCK veya A549 hücrelerine ters transfeksiyon 8,11 ile iletin.
- Bunun için, 100 nM kontrol siRNA veya kaspaz siRNA veya önerilen hacimde transfeksiyon reaktifini ( bakınız Malzeme Tablosu) ayrı tüplerde 100 μL uygun ortamda (OptiMEM gibi, Malzeme Tablosuna bakınız) seyreltin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Her seyreltmeyi çift olarak hazırlayın.
NOT: Bu kopya, RT-qPCR veya batı lekelenmesi (kaspazlara karşı antikorlar varsa) ile kaspaz ekspresyonunun nakavtını analiz etmek için bir kopya ve batı lekeleme ile ilgili proteinin geri kazanımını değerlendirmek için bir başka kopya içerir. - Her siRNA çözeltisinin 100 μL'sini 100 μL transfeksiyon reaktif çözeltisi (adım 2.3) ile karıştırın ve siRNA-transfeksiyon reaktif kompleksini oluşturmak için oda sıcaklığında 20-45 dakika inkübe edin.
- Bu arada, tam büyüme ortamının 800 μL'sine 1 x 105 MDCK veya A549 hücrelerini bölün ve ekleyin, 200 μL siRNA-transfeksiyon reaktif kompleksi ile karıştırın (adım 2.5) ve süspansiyonun 1 mL'sini 12 kuyucuklu bir kültür plakasının bir kuyucuğuna ekleyin. Bu seyreltme, kontrol siRNA veya kaspaz siRNA'nın son konsantrasyonunu 10 nM'ye getirir.
- Hücreleri 37 ° C'de% 5'lik bir CO 2 atmosferi altında72 saat boyunca inkübe edin.
- Hücreleri adım 1.10'da olduğu gibi bir replikasyondan toplayın ve standart yöntemler ve protokoller8,11 kullanarak, sırasıyla RT-qPCR veya batı lekelenmesi ile kaspaz 3, kaspaz 6 ve kaspaz 7 ekspresyonunun nakavtını doğrulamak veya onaylamak için bunları işleyin.
- Diğerindeki hücreleri enfekte etmek, adım 1.4-1.9'da (inhibitörler olmadan) açıklandığı gibi IAV ile çoğalır.
- 24 saat sonra, batı lekelemesi ile hücreleri hasat edin, işleyin ve analiz edin ve 1.10-1.20 adımlarında açıklandığı gibi protein geri kazanımını ölçün ve ölçün.
3. Polipeptitteki kaspaz bölünme bölgelerini bulmak için bölgeye yönelik mutagenez
- İlgilenilen gen kodlayıcı proteini bir memeli ekspresyonu plazmidi11'e klonlayın veya bir araştırma laboratuvarından veya ticari kaynaktan elde edin (bkz.
NOT: Gen, ektopik olarak eksprese edilen polipeptiti batı lekelenmesi sırasında endojen olarak eksprese edilenden ayırt etmek için bir epitop etiketi ile veya GFP füzyonu olarak klonlanırsa tercih edilir. - Kaspaz substrat veritabanları4 veya protein hizalama araçlarını kullanarak, polipeptit üzerindeki konsensüs kaspaz bölünme motiflerini, XXXD ve DXXD'yi bulun. Hemen hemen tüm kaspaz bölünme motifleri bölünme bölgesinde aspartik aside sahiptir (P1)3,4.
- Varsayılan P1 aspartik asidi glutamik aside veya polar olmayan bir amino aside (alanin, valin) bölgeye yönelik mutagenez ile mutasyona uğratın ve ardından standart yöntemler ve protokolleri kullanarak DNA dizilimi11 yapın.
- Vahşi tip (WT) ve mutant plazmid DNA'sını ters transfeksiyon11 ile MDCK veya A549 hücrelerine iletin.
- Bunun için, 2 μg plazmid DNA'sını veya transfeksiyon reaktifinin önerilen hacmini, uygun bir ortamın 100 μL'sinde (bkz. adım 2.3 ve Malzeme Tablosu) ayrı tüplerde seyreltin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Her plazmid DNA çözeltisinin 100 μL'sini transfeksiyon reaktif çözeltisinin 100 μL'si ile karıştırın ve DNA-transfeksiyon reaktif kompleksini oluşturmak için oda sıcaklığında 20-45 dakika inkübe edin.
- Bu arada, tam büyüme ortamının 800 μL'sine 3 x 105 MDCK veya A549 hücrelerini bölün ve ekleyin, 200 μL DNA transfeksiyon reaktif kompleksi ile karıştırın ve 1 mL süspansiyonu 12 delikli bir kültür plakasının bir kuyucuğuna ekleyin.
- Hücreleri% 5'lik bir CO 2 atmosferi altında 37 ° C'deinkübe edin.
- 48 saat sonra, hücreleri adım 1.4-1.9'da açıklandığı gibi IAV ile enfekte edin (inhibitörleri eklemeden).
- 24 saat sonra, hücreleri batı lekelenmesiyle toplayın, işleyin ve analiz edin (varsa, bir epitop etiketine veya GFP'ye karşı antikoru kullanarak). Ardından, 1.10-1.20 adımlarında açıklandığı gibi protein geri kazanımını ölçün ve ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kaspaz 3 inhibitörü ile tedavi
Konakçı kortaktin, HDAC4 ve HDAC6 polipeptitlerinin hem köpek (MDCK) hem de insan (A549, NHBE) hücrelerinde IAV enfeksiyonuna yanıt olarak bozulmaya uğradığı keşfedilmiştir 7,8,9. Yukarıdaki yaklaşımlar kullanılarak, IAV kaynaklı konak kaspazlarının, özellikle kaspaz 3'ün, 7,8,9 oranında bozulmalarına neden olduğu ortaya çıkarılmıştır. Kortaktin, enfeksiyon dozuna ve zamana bağımlı bir şekilde ve konakçı hücre ve IAV suşundan bağımsız bir şekilde parçalandı7. HDAC48 ve HDAC69 için de benzer sonuçlar elde edildi. İlginç bir şekilde, her üç konakçı proteinin de parçalanması, kaspaz aracılı bölünme14'e maruz kaldığı bilinen viral NP 7,8,9'un bölünmesiyle çakıştı. Bu nedenle, kortaktin, HDAC4 ve HDAC6'nın da kaspaz aracılı bölünmeye ve ardından bozulmaya uğradığı varsayılmıştır. Bunu test etmek için, ilk olarak, IAV ile enfekte olmuş hücreler bir kaspaz 3 inhibitörü ile tedavi edildi ve kortaktin, HDAC4 ve HDAC6 polipeptitlerinin kurtarılması batı lekelenmesi ile analiz edildi. Her üç polipeptit de (viral NP'nin yanı sıra), kaspaz 3 inhibitörü tedavisi 7,8,9'dan sonra IAV enfeksiyonuna bağlı bozulmadan kurtuldu. Kortaktin için temsili veri7 Şekil 1A'da gösterilmiştir. Bu geri kazanım, protein bantlarının yoğunluğunu ölçerek ve kortaktin bandının değerini, karşılık gelen aktin (yükleme kontrolü) bandının değeri ile normalleştirerek ölçüldü. Daha sonra, enfekte olmamış örneklerdeki kortaktin normalleştirilmiş değeri, enfekte olmuş örneklerdeki değerini belirlemek için% 100 olarak kabul edildi. Bu kantitasyon yöntemi, kaspaz 3 inhibitörü ile tedavi edilen enfekte hücrelerde kortaktin polipeptitin geri kazanımını, tedavi edilmemiş enfekte hücrelerde% 20.7'den% 78.8 olarak hesapladı7 (Şekil 1B).
RNA girişim aracılı kaspaz 3 ekspresyonunun yıkılması
Daha sonra, genetik bir araç olan RNA girişimi (RNAi) kullanıldı, ardından kortaktin11 ve HDAC48'in IAV enfeksiyonuna bağlı bozunmasında kaspazların rolünü doğrulamak için batı lekelenmesi yapıldı. Kaspazın 3 ile tükenmiş hücrelerinde (Şekil 2C)11, hem kortaktin (Şekil 2A)11 hem de HDAC48 polipeptitleri IAV enfeksiyonuna bağlı bozunmadan kurtuldu. Bununla birlikte, kaspaz 6- veya kaspaz 7-tükenmiş hücrelerde (Şekil 2C)11, kortaktin polipeptit düzeylerinde anlamlı bir iyileşme gözlenmedi (Şekil 2A)11. Spesifik olarak, yukarıda belirtildiği gibi karşılık gelen enfekte olmamış hücrelerdeki seviyeleri ile karşılaştırıldığında ve karşılaştırıldığında, tükenmiş kaspaz 3 ekspresyonuna sahip enfekte hücrelerdeki kortaktin polipeptit seviyesi, normal kaspaz 3 ekspresyonuna sahip enfekte hücrelerde% 28.6'dan% 83'e geri kazanılmıştır (Şekil 2B)11.
Kortaktin ve HDAC6 polipeptitlerinde kaspaz bölünme motifleri
Son olarak, kortaktin ve HDAC6 polipeptitlerindeki amino asit dizisi tarandı ve varsayılan kaspaz bölünme motiflerinde, P1 pozisyonundaki aspartik asit, glutamik asit 9,11'e mutasyona uğradı. Bu yaklaşım, kortaktin polipeptit 11'deki aspartik asit 116'yı ve HDAC6 polipeptit9'daki aspartik asit 1088'i bir kaspaz bölünme bölgesi olarak tanımladı. Her iki aspartik asit kalıntısının glutamik aside mutasyonu, kortaktin (Şekil 3A)11 ve HDAC69 polipeptitlerini IAV enfeksiyonuna bağlı bozunmaya dirençli hale getirmiştir. Spesifik olarak, yukarıda belirtildiği gibi karşılık gelen enfekte olmamış hücrelerdeki seviyeleri ile karşılaştırıldığında ve nicelleştirildiğinde ve karşılaştırıldığında, enfekte olmuş hücrelerde plazmid eksprese edilen mutant kortaktin polipeptit seviyesi% 77.9 iken, enfekte hücrelerde plazmid eksprese edilen vahşi tip kortaktin polipeptit seviyesi% 23.6 idi (Şekil 3B)11.
Şekil 1: Kortaktin polipeptit, IAV ile enfekte olmuş hücrelerde kaspaz 3 aracılı bozunmaya uğrar . (A) MDCK hücreleri, 0.5'lik bir MOI'de influenza virüsü A / Yeni Kaledonya / 20/1999 / H1N1 suşu ile enfekte olmuş ve daha sonra sahte olarak veya kaspaz 3 inhibitörü (Cas3-I, 40 μM) ile tedavi edilmiştir. 24 saat sonra, kortaktin, viral NP ve aktin polipeptitleri batı lekelenmesi ile total hücre lizatlarında tespit edildi. UNI, enfekte olmamış; INF, enfekte olmuş. Oklar tam uzunlukta ve yarık NP'ye işaret eder. (B) Kortaktin ve aktin bantlarının yoğunluğu ölçüldü. Daha sonra kortaktin değeri aktin değeri ile normalleştirildi. UNI örneklerinde normalleştirilmiş kortaktin miktarı, karşılık gelen INF örneklerinde miktarını belirlemek için% 100 olarak kabul edildi. Sunulan veriler, üç biyolojik replikasyonun SE'± anlamına gelir. P = 0.0006, iki yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanmıştır. ns, önemli değil. Bu rakam Chen ve ark.7'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kaspaz 3 ekspresyonunun yıkılması, IAV ile enfekte hücrelerde kortaktin polipeptit yıkımını kurtardı. (A) A549 hücreleri, 10 nM kontrol (Ctrl), kaspaz 3 (Cas3), kaspaz 6 (Cas6) veya kaspaz 7 (Cas7) siRNA ile kopyalar halinde transfekte edildi. 72 saat sonra, bir replikasyondaki hücreler toplandı ve toplam RNA'yı çıkarmak için işlendi. Diğer replikasyondaki hücreler, 3.0'lık bir MOI'de influenza virüsü A / WSN / 1933 / H1N1 alt tipi ile enfekte olmuştur. 24 saat sonra, kortaktin, viral NP ve aktin polipeptitleri batı lekelenmesi ile tespit edildi. UNI, enfekte olmamış; INF, enfekte olmuş. (B) Kortaktin ve aktin bantlarının yoğunluğu ölçüldü ve kortaktin değeri aktin değeri ile normalleştirildi. Daha sonra, UNI örneklerinde normalleştirilmiş kortaktin miktarı, karşılık gelen INF örneklerinde miktarını belirlemek için% 100 olarak kabul edildi. Sunulan veriler, üç biyolojik replikasyonun SE'± anlamına gelir. P < 0.0001, ***P = 0.0007, ***P = 0.0002, iki yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanmıştır. ns, önemli değil. (C) Yukarıda ekstrakte edilen toplam RNA, cDNA'ya dönüştürüldü ve daha sonra RT-qPCR ile kaspaz 3, kaspaz 6, kaspaz 7 ve aktin mRNA seviyelerini tespit etmek için bir şablon olarak kullanıldı. Aktin mRNA seviyesi referans olarak kullanıldı ve kontrol siRNA (Ctrl) ve ilgili kaspaz siRNA (Cas) transfekte hücrelerindeki her bir kaspazın mRNA seviyesi standart 2-ΔΔCT yöntemi kullanılarak hesaplandı. P, iki yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanan 0.0001 <. Bu rakam Chen ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Aspartik asit 116'nın glutamik aside mutasyonu, kortaktin polipeptitini IAV enfeksiyonuna bağlı bozunmaya dirençli hale getirmiştir . (A) MDCK hücreleri, vahşi tip (WT) veya mutasyona uğramış (D116E) GFP-kortaktin füzyonunu ifade eden bir plazmid ile transfekte edildi. 48 saat sonra, hücreler 3.0'lık bir MOI'de influenza virüsü A / WSN / 1933 / H1N1 alt tipi ile enfekte oldu. 24 saat sonra, GFP-kortaktin, viral NP ve aktin polipeptitleri batı lekelenmesi ile tespit edildi. UNI, enfekte olmamış; INF, enfekte olmuş. (B) Kortaktin ve aktin bantlarının yoğunluğu ölçüldü ve kortaktin değeri aktin değeri ile normalleştirildi. Daha sonra, UNI örneklerinde normalleştirilmiş kortaktin miktarı, karşılık gelen INF örneklerinde miktarını belirlemek için% 100 olarak kabul edildi. Sunulan veriler, üç biyolojik replikasyonun SE'± anlamına gelir. **P = 0.001, iki yönlü ANOVA kullanılarak hesaplanmıştır. ns, önemli değil. Bu rakam Chen ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virüslerin konakçı faktörleri ve yolları kendi yararlarına göre uyarladıkları tespit edilmiştir. Buna karşılık, konakçı hücreler çeşitli stratejiler kullanarak buna direnirler. Bu stratejilerden biri, konakçı hücrelerin virüs enfeksiyonlarına karşı antiviral bir strateji olarak kullandıkları PANoptozdur. Bununla birlikte, IAV gibi virüsler, PANoptoza karşı koymak ve onu kendi avantajlarına göre kullanmak için kendi stratejilerini geliştirmiştir 1,3,6. Bu etkileşim, çeşitli konakçı ve viral proteinlerin kaspazlar tarafından bölünmesini içerir. Bu kaspazların ve substrat proteinlerindeki bölünme bölgelerinin tanımlanması, bu etkileşimin mekanizmalarını ve önemini aydınlatmak için önemlidir.
Bu amaçla, konakçı kortaktin, HDAC4 ve HDAC6 7,8,9,11'deki kaspazları ve bölünme bölgelerini tanımlamak için standart biyokimyasal ve moleküler yöntemler kullanılmıştır. Yukarıda açıklanan protokoller, influenza virüslerini, diğer memeli virüslerini, diğer mikropları ve toksinler ve kimyasallar gibi dış uyaranları içeren bu tür çalışmalar için kullanılabilir. Ayrıca, bu yöntemler standart bir moleküler biyoloji laboratuvarında ilgili becerilerle çoğaltılabilir ve özel ekipman ve yazılım eğitimi gerektirmez. 12 kuyucuklu hücre kültürü plaka formatı, batı lekelenmesi ve RT-qPCR ile aşağı akış analizleri için yeterli numune miktarı üretmek üzere bu ve benzeri çalışmalara başarıyla uyarlanmıştır. Bununla birlikte, gerektiğinde, bu biçim buna göre küçültülebilir veya yükseltilebilir. İlk kez bir kaspaz inhibitörünü içeren bir deney yaparken, ilgilenilen proteinin kaspaz aracılı bozunmaya uğrayıp uğramadığını değerlendirmek için bir lizozom ve proteazom inhibitörü ile birlikte bir pan-kaspaz inhibitörü (Z-VAD-FMK) kullanılması önerilmektedir. Ayrıca, NH4Cl ve MG132'ye ek olarak, sırasıyla Bafilomisin A ve Epoksomin gibi diğer lizozom ve proteazom inhibitörleri kullanılabilir. Bir pan-kaspaz inhibitörü ile pozitif sonuçlardan sonra, bireysel kaspazların spesifik inhibitörleri kullanılabilir veya RNA girişimi kullanılabilir. İlki için, hedef hücre tipine toksisiteyi ve spesifik olmayan sonuçları önlemek için etkili inhibitör konsantrasyonları optimize etmek önemlidir.
Kaspazların tutulumunu doğrulamak için RNA girişimi veya CRISPR gibi genetik bir araç kullanılmalıdır, çünkü inhibitörler çapraz reaksiyon yapar. Alternatif olarak, bilinen tüm kaspazları ayrı ayrı hedefleyen bir RNA girişimi veya CRISPR ekranı gerçekleştirilebilir. Bilinen tüm kaspazlara siRNA, gRNA ve RT-qPCR primer çiftleri, çevrimiçi araçlar kullanılarak önceden tasarlanmış veya tasarlanmış olarak tedarik edilebilir. Ek olarak, polipeptitlerin sıralı veya işbirlikçi bölünmesini değerlendirmek için iki veya daha fazla kaspaz aynı anda tükenebilir (bu strateji yakın zamanda henüz yayınlanmamış bir çalışmada kullanılmıştır). RNA girişiminin virüs-konakçı hücre etkileşimi araştırması için ideal bir araç olduğuna inanılmaktadır. İkincisi, konakçı gen ekspresyonunun kontrollü bir manipülasyonunu gerektirir, böylece konakçı hücreler virüs enfeksiyonu için nispeten uygun kalır ve bu manipülasyonun fenotipini göstermek için yaşam döngüsünün tamamlanmasını sağlar. Bununla birlikte, etkili bir siRNA konsantrasyonunun ve siRNA-transfeksiyon reaktif kombinasyonunun optimize edilmesi, sonraki enfeksiyon için optimal bir nakavt ve canlılık oranı için her hücre tipi için gereklidir.
Sözde kaspaz bölünme motiflerini bulmak için, CASBAH18, CaspDB19, CutDB20, DegraBase 21, MEROPS22 ve TopFIND23,24 gibi birçok veritabanı geliştirilmiştir. Bu motifleri HDAC6 polipetid9 üzerinde bulmak için görsel bir tarama yapıldı, ancak kortaktin11 için CaspDB kullanıldı (CaspDB web sitesine son zamanlarda erişilememesine rağmen). Bu motifler, P1 aspartik asidi glutamik aside mutasyona uğratarak kaspaz bölünme bölgeleri olarak başarıyla doğrulandı. Bununla birlikte, aspartik asidin önce polar olmayan amino asit benzeri bir alanine veya valine mutasyona uğraması önerilmektedir, çünkü bazı kaspazlar P1 glutamik asit4'ten sonra ayrılabilir. Bu alıştırma derhal kaspaz bölünme bölgelerinin tanımlanmasına neden olabilir, ancak hedef polipeptit aspartik asitler bakımından zenginse ve varsayılan hedef motifler kanonik değilse, onlarca mutant üretilmesini gerektirebilir. Plazmidlerin (ve siRNA'nın) hücrelere verilmesi için, ters yerine ileriye doğru transfeksiyon yapılabilir. Ayrıca, enfeksiyon dozu ve zaman kinetiği, polipeptitlerin bozunma kinetiğini değerlendirmek ve daha küçük boyutlu bölünme ürünlerini tanımlamak için batı lekelenmesi için% 4-20 gradyan SDS-PAGE kullanılarak yapılmalıdır. Son olarak, ilgilenilen proteini doğrudan bir kaspaz substratı olarak doğrulamak için, saflaştırılmış kaspazlar ve hedef proteinler (WT veya mutant) içeren in vitro biyokimyasal testler ve herhangi bir kofaktör geliştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarın açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazar, Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Kaynakları (NIAID), Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi, Maurice ve Phyllis Paykel Vakfı (Yeni Zelanda), HS ve J.C. Anderson Trust (Dunedin) ve Mikrobiyoloji ve İmmünoloji Bölümü ve Biyomedikal Bilimler Okulu'nu (Otago Üniversitesi) kabul ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | Human, epithelial, lung |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Caspase 3 Inhibitor | Sigma-Aldrich | 264156-M | Also known as 'InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem' |
| cOmplete, Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Goat anti-NP antibody | Gift from Richard Webby (St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, USA) to MH | ||
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| MDCK cells | ATCC | CCL-34 | Dog, epithelial, kidney |
| MG132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | ThermoFisher Scientific | 11095080 | Add L-glutamine, antibiotics or other supplements as required |
| MISSION siRNA Universal Negative Control #1 | Sigma-Aldrich | SIC001 | |
| Odyssey Fc imager with Image Studio Lite software 5.2 | LI-COR | Odyssey Fc has been replaced with Odyssey XF and Image Studio Lite software has been replaced with Empiria Studio software. | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| Plasmid expressing human cortactin-GFP fusion | Addgene | 50728 | Gift from Kenneth Yamada to Addgene |
| Pre-designed small interferring RNA (siRNA) to caspase 3 | Sigma-Aldrich | NM_004346 | siRNA ID: SASI_Hs01_00139105 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 6 | Sigma-Aldrich | NM_001226 | siRNA ID: SASI_Hs01_00019062 |
| Pre-designed small interferring RNA to caspase 7 | Sigma-Aldrich | NM_001227 | siRNA ID: SASI_Hs01_00128361 |
| Pre-designed SYBR Green RT-qPCR Primer pairs | Sigma-Aldrich | KSPQ12012 | Primer Pair IDs: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1 |
| Protran Premium nitrocellulose membrane | Cytiva (Fomerly GE Healthcare) | 10600003 | |
| Rabbit anti-actin antibody | Abcam | ab8227 | |
| Rabbit anti-cortactin antibody | Cell Signaling | 3502 | |
| Rabbit anti-GFP antibody | Takara | 632592 | |
| SeeBlue Pre-stained Protein Standard | ThermoFisher Scientific | LC5625 | |
| Transfection medium, Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Triton X-100 | Merck | ||
| Trypsin, TPCK-Treated | Sigma-Aldrich | 4370285 |
References
- Place, D. E., Lee, S., Kanneganti, T. -D.
- Zheng, M., Kanneganti, T. -D. The regulation of the ZBP1-NLRP3 inflammasome and its implications in pyroptosis, apoptosis, and necroptosis (PANoptosis). Immunological Reviews. 297 (1), 26-38 (2020).
- Connolly, P. F., Fearnhead, H. O. Viral hijacking of host caspases: An emerging category of pathogen-host interactions. Cell Death & Differentiation. 24 (8), 1401-1410 (2017).
- Julien, O., Wells, J. A.
- Balachandran, S., Rall, G. F., Gack, M. U. Benefits and perils of necroptosis in influenza virus infection. Journal of Virology. 94 (9), 01101-01119 (2020).
- Ampomah, P. B., Lim, L. H. K. Influenza A virus-induced apoptosis and virus propagation. Apoptosis. 25 (1-2), 1-11 (2020).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated degradation of host cortactin that promotes influenza A virus infection in epithelial cells. Virology. 497, 146-156 (2016).
- Galvin, H. D., Husain, M. Influenza A virus-induced host caspase and viral PA-X antagonize the antiviral host factor, histone deacetylase 4. Journal of Biological Chemistry. 294 (52), 20207-20221 (2019).
- Husain, M., Harrod, K. S. Influenza A virus-induced caspase-3 cleaves the histone deacetylase 6 in infected epithelial cells. FEBS Letters. 583 (15), 2517-2520 (2009).
- Husain, M., Cheung, C. Y. Histone deacetylase 6 inhibits influenza A virus release by downregulating the trafficking of viral components to the plasma membrane via its substrate, acetylated microtubules. Journal of Virology. 88 (19), 11229-11239 (2014).
- Chen, D. Y., Husain, M. Caspase-mediated cleavage of human cortactin during influenza A virus infection occurs in its actin-binding domains and is associated with released virus titres. Viruses. 12 (1), 87 (2020).
- Zhirnov, O. P., Syrtzev, V. V. Influenza virus pathogenicity is determined by caspase cleavage motifs located in the viral proteins. Journal of Molecular and Genetic Medicine. 3 (1), 124-132 (2009).
- Zhirnov, O. P., Klenk, H. -D. Alterations in caspase cleavage motifs of NP and M2 proteins attenuate virulence of a highly pathogenic avian influenza virus. Virology. 394 (1), 57-63 (2009).
- Zhirnov, O. P., Konakova, T. E., Garten, W., Klenk, H. Caspase-dependent N-terminal cleavage of influenza virus nucleocapsid protein in infected cells. Journal of Virology. 73 (12), 10158-10163 (1999).
- Robinson, B. A., Van Winkle, J. A., McCune, B. T., Peters, A. M., Nice, T. J. Caspase-mediated cleavage of murine norovirus NS1/2 potentiates apoptosis and is required for persistent infection of intestinal epithelial cells. PLOS Pathogens. 15 (7), 1007940 (2019).
- Richard, A., Tulasne, D. Caspase cleavage of viral proteins, another way for viruses to make the best of apoptosis. Cell Death & Disease. 3 (3), 277 (2012).
- Brauer, R., Chen, P. Influenza virus propagation in embryonated chicken eggs. Journal of Visualized Experiments. (97), e52421 (2015).
- Lüthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: A searchable database of caspase substrates. Cell Death & Differentiation. 14 (4), 641-650 (2007).
- Kumar, S., van Raam, B. J., Salvesen, G. S., Cieplak, P. Caspase cleavage sites in the human proteome: CaspDB, a database of predicted substrates. PLoS One. 9 (10), 110539 (2014).
- Igarashi, Y., et al. CutDB: A proteolytic event database. Nucleic Acids Research. 35 (Database issue). 35, 546-549 (2007).
- Crawford, E. D., et al. The DegraBase: A database of proteolysis in healthy and apoptotic human cells. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (3), 813-824 (2013).
- Rawlings, N. D., Tolle, D. P., Barrett, A. J.
- Lange, P. F., Overall, C. M. TopFIND, a knowledgebase linking protein termini with function. Nature Methods. 8 (9), 703-704 (2011).
- Fortelny, N., Yang, S., Pavlidis, P., Lange, P. F., Overall, C. M. Proteome TopFIND 3.0 with TopFINDer and PathFINDer: Database and analysis tools for the association of protein termini to pre- and post-translational events. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 290-297 (2015).
