Summary
طور البروتوكول الحالي طريقة لتقدير إنتاجية المركبات على لوحة TLC باستخدام تقنية الإضاءة الزرقاء LED. تتمثل مزايا هذا النهج في أنه آمن وفعال وغير مكلف ويسمح للباحث بقياس عينات متعددة في وقت واحد.
Abstract
كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) هي تقنية تحليلية يمكن الوصول إليها تم استخدامها على نطاق واسع في أبحاث الكيمياء العضوية لتحديد عائد العينات غير المعروفة. طورت الدراسة الحالية طريقة فعالة ورخيصة وآمنة لتقدير إنتاجية العينات على لوحة TLC باستخدام مصباح LED الأزرق. كان لوفاستاتين المستخرج من Aspergillus terreus هو المثال المركب المستخدم في الدراسة الحالية. تم استخدام نماذج الانحدار القائمة على معيار لوفاستاتين لتقييم محصول لوفاستاتين. تمت مقارنة ثلاث طرق: الفحص الحيوي ، والكشف عن الأشعة فوق البنفسجية ، وإضاءة LED الزرقاء. أظهرت النتائج أن طريقة إضاءة LED الزرقاء أكثر فعالية من حيث الوقت من طرق الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية والمقايسة الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، كانت إضاءة LED الزرقاء خيارا آمنا نسبيا بسبب القلق من المخاطر البيولوجية في طريقة الفحص الحيوي (مثل العدوى الميكروبية) والتعرض للأشعة فوق البنفسجية في طريقة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية. مقارنة بالطرق باهظة الثمن التي تتطلب أدوات متخصصة وتدريبا طويل الأجل قبل العمل بشكل مستقل ، مثل GC و HPLC و HPTLC ، كان استخدام مصباح LED الأزرق خيارا اقتصاديا لتقدير إنتاجية العينات من لوحة TLC.
Introduction
يستخدم كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) على نطاق واسع كتقنية نوعية وكمية في مجال الكيمياء العضوية1،2،3. تتمثل المزايا الرئيسية ل TLC في أنه يوفر كشفا سريعا ومتطلبات عينة مرنة ولا يتطلب معدات متخصصة4. حتى الآن ، على الرغم من إنشاء العديد من الأساليب المتقدمة ، لا يزال TLC هو الطريقة الرئيسية لتحديد العينات غير المعروفة في الخليط. ومع ذلك ، فإن التحدي الذي يواجهه هذا النهج هو عدم وجود معدات آمنة وغير مكلفة لتحديد عائد العينة ، خاصة لتطوير المختبرات ذات الميزانيات المحدودة. لذلك ، هدفت الدراسة الحالية إلى تطوير طريقة فعالة وآمنة وغير مكلفة تتحد مع TLC لتقدير إنتاجية العينات.
على عكس TLC عالي الأداء (HPTLC) ، والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) ، وكروماتوغرافيا الغاز (GC) مع متطلبات عينة صارمة ، وتستغرق وقتا طويلا ، وإشراك خطوات متعددة لإعداد العينات 1,5 ، أظهر TLC العديد من المزايا. أولا ، لإعداد العينة ، لا يمكن ل HPLC و GC اكتشاف المستخلص الخام لأن المستخلص الخام قد يسد عمود HPLC و GC. ثانيا ، عندما لا تكون العينات مناسبة للأشعة فوق البنفسجية (مهمة لتحليل HPLC) أو ذات تقلب منخفض (مهم لتحليل GC) ، يمكن تطبيق TLC على هذه العينات ، واستخدام كاشف التصور يجعل العينات المعزولة مرئية على طبقات رقيقة6،7،8. ثالثا ، بالنسبة للمستخدمين العاديين ، يتطلب HPLC و GC عموما وقتا طويلا نسبيا قبل التدريب قبل العمل بشكل مستقل ، مقارنة ب TLC. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لتحليل TLC الكمي ، المعروف باسم TLC عالي الأداء (HPTLC) ، رقمنة المعلومات الموجودة على لوحة TLC باستخدام ماسح ضوئي شديد الحساسية. ومع ذلك ، فإن تكلفة نظام HPTLC مكلفة نسبيا. على هذا النحو ، يعد تطوير نهج فعال من حيث التكلفة وسريع لتحديد العينات على لوحة TLC موضوعا مهما.
وقد وضعت أساليب مماثلة لتحديد كمية غلة TLC؛ على سبيل المثال ، أبلغ جونسون9 عن تقنية تسمح بتحديد كمية العينات على لوحة TLC باستخدام ماسح ضوئي مسطح متصل بجهاز كمبيوتر. في عام 2001 ، طور الجندي وآخرون 10 طريقة TLC- قياس الكثافة ، والتي تم استخدامها للكشف عن المركب بكثافة بصرية ، وتم تطبيق هذه التقنية أيضا بواسطة Elkady et al.11. في عام 2007 ، قدم Hess2 طريقة TLC (DE-TLC) المحسنة رقميا المطبقة للكشف عن عائد مركب على لوحة TLC باستخدام كاميرا رقمية مدمجة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. قارن هيس أيضا فروق التكلفة بين طريقة HPTLC و DE-TLC وخلص إلى أنه يمكن استخدام طريقة DE-TLC في مختبرات المدارس الثانوية والكليات بسبب تكلفتها المعقولة2. ومع ذلك ، كانت تكلفة طريقة TLC-densitometric لا تزال باهظة الثمن ، ويتطلب تشغيل الأشعة فوق البنفسجية تدريبا مسبقا كافيا في حالة تعرض المستخدمين للأشعة فوق البنفسجية. لذلك ، متوافق مع TLC ، من المستحسن تطوير طريقة فعالة وآمنة وغير مكلفة لتحديد عائد العينة.
وصفت الدراسة الحالية بروتوكولا للكشف عن العينة على لوحة TLC باستخدام مصباح LED الأزرق ، وطورت نموذج انحدار بموثوقية عالية (قيمة R مربعة عالية) لقياس أبعاد النطاقات ، ثم تحديد العائد المركب. أخيرا ، وجد أن طريقة إضاءة LED الزرقاء آمنة نسبيا (مقابل. طريقة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية) ، رخيصة (مقابل. GC و HPLC و HPTLC) ، ونهج فعال (مقابل طريقة المقايسة الحيوية) لتحديد كمية الغلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يوصف البروتوكول الحالي باستخدام لوفاستاتين كمثال. تم استخراج لوفاستاتين من فطر الرشاشيات تيريوس البالغ من العمر أسبوعا واحدا.
1. استخراج مركب
ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول استخراج المركب ، يرجى الاطلاع على الشكل 1.
- ثقافة الرشاشيات تيريوس على أجار سكر العنب البطاطس (PDA ، انظر جدول المواد) وسط عند 30 درجة مئوية.
- جفف المزرعة عند 40 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. انقل المزرعة المجففة إلى أنبوب سعة 50 مل باستخدام ملاقط معقمة وأضف 15 مل من أسيتات الإيثيل.
- رج الخليط بقوة عن طريق التحريك لمدة دقيقة واحدة واحتضانه لمدة 1 ساعة عند 40 درجة مئوية مع الرج عند 200 دورة في الدقيقة.
- سونيك الخليط باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية 40 كيلو هرتز (انظر جدول المواد) عند 40 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- قم بالطرد المركزي للخليط على حرارة 5000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وقم بالتصفية من خلال ورق ترشيح 11 ميكرومتر.
- استخراج المرشح مع حجم متساو من الماء المعقم في قمع فصل.
- بعد فصل الطور ، اجمع الطبقة العضوية ، ثم تبخر في مبخر دوار (انظر جدول المواد). حل البقايا في 2 مل من خلات الإيثيل.
2. فصل المستخلص الخام بواسطة عمود امتزاز المرحلة العادية (NP)
- قم بتعبئة العمود بهلام السيليكا NP كمرحلة ثابتة ، واستخدم n-hexane: خلات الإيثيل: حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (H: E: T ؛ 80: 20: 0.1 ، v / v / v) كمرحلة متحركة.
- قم بتحميل 2 مل من المستخلص (الخطوة 1) على العمود وأضف مذيب الطور المتحرك بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة لتقليب المستخلص.
ملاحظة: تم التحكم في معدل التدفق يدويا باستخدام محبس. - تحقق من النفايات السائلة بواسطة TLC للتأكد من وجود لوفاستاتين ، ثم تتبخر في مبخر دوار عند 45 درجة مئوية حتى تتم إزالة المذيب. تستغرق هذه الخطوة حوالي 20-25 دقيقة.
- قم بإذابة البقايا في 1 مل من أسيتات الإيثيل ، ثم اخلطها مع حجم متساو من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك بنسبة 1٪.
- الطرد المركزي الخليط في 5000 × غرام لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وجمع الطبقة العضوية في أنبوب زجاجي جديد.
3. تحضير وتحميل ألواح كروماتوجرام رقيقة الطبقة (TLC)
- ضع 5 ميكرولتر من العينات ومعايير لوفاستاتين (انظر جدول المواد) على خط الأساس للوحة TLC باستخدام ماصة شعرية ، تاركا حدا يبلغ 1 سم على جانبي لوحة TLC.
- جفف طبق TLC في غطاء دخان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- ضع اللوحة برفق بواسطة ملقط في غرفة زجاجية مشبعة تحتوي على مذيب الطور المتحرك. قم بتغطية الحجرة بغطاء زجاجي واترك اللوحة تتطور بالكامل.
- أخرج اللوحة من الحجرة عندما يصل خط المذيب إلى 1 سم من أعلى اللوحة.
4. تحليل بواسطة مصباح LED أزرق
- ضع علامة على خط المذيبات بقلم رصاص. جفف الطبق في غطاء الدخان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- بعد التجفيف ، انقع اللوحة على الفور في مذيب 10٪ H2SO4 ، ثم جفف في غطاء الدخان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- ضع اللوحة على لوحة التسخين حتى تظهر البقع البنية. تأكد من عدم ارتفاع درجة حرارة اللوحة ، لأن هذا قد يجعل تصور لوفاستاتين صعبا.
- انقل اللوحة إلى مصباح LED الأزرق وامسحها ضوئيا باستخدام برنامج مجاني متوافق (MiBio Fluo) (انظر جدول المواد).
5. تقدير العائد بواسطة نموذج الانحدار
- قم بقياس أبعاد النطاقات باستخدام برنامج ImageJ (انظر جدول المواد).
- إنشاء نموذج انحدار باستخدام برنامج تحليل البيانات والرسوم البيانية (انظر جدول المواد) بناء على التركيزات التنازلية لمعايير لوفاستاتين ، بما في ذلك 1 مجم / مل و 0.75 مجم / مل و 0.5 مجم / مل و 0.25 مجم / مل.
- تطبيق نموذج الانحدار لتقدير عائد العينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قدمت هذه الدراسة طريقة إضاءة LED الزرقاء لتقدير إنتاجية المركبات ، وتم التحقق من صحة هذه الطريقة ومقارنتها بالطرق المكتشفة للأشعة فوق البنفسجية (الجدول 1). تم تطوير نماذج الانحدار بناء على أبعاد النطاقات وتركيز المعايير لثلاث طرق ، على التوالي ، للتنبؤ بإنتاجية العينات. أولا ، في نتائج طريقة المقايسة الحيوية ، كان مربع R بين أبعاد منطقة التثبيط ومعايير لوفاستاتين 0.99 ، وكان عائد العينة 0.56 مجم تنبأ به نموذج الانحدار (الشكل 2). ثانيا ، في طريقة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية ، كان مربع R بين معايير لوفاستاتين وأبعاد النطاقات على لوحة TLC 0.97 ، وكان عائد العينة الذي تنبأ به نموذج الانحدار 0.53 مجم (الشكل 3). والجدير بالذكر أن حواف النطاق كانت ضبابية ، ولوحظت نطاقات شدة إشارة منخفضة نسبيا (الشكل 3 أ). ثالثا ، في طريقة إضاءة LED الزرقاء ، كان مربع R بين معايير لوفاستاتين وأبعاد النطاقات على لوحة TLC 0.98 ، وكان عائد العينة 0.54 مجم تنبأ به نموذج الانحدار (الشكل 4). كان العائد المتوقع باستخدام مصباح LED الأزرق أقرب إلى طريقة المقايسة الحيوية (تم ضبطها كعنصر تحكم). كان بعد النطاق متناسبا مع كمية لوفاستاتين ، وتم الحصول على النطاقات الواضحة بطريقة الإضاءة الزرقاء LED. بالإضافة إلى ذلك ، كانت ساعات عمل طرق المقايسة الحيوية والأشعة فوق البنفسجية المكتشفة وإضاءة LED الزرقاء حوالي 24 ساعة و 2 ساعة و 1 ساعة على التوالي ؛ (ملاحظة: ساعة العمل تعني إجمالي الوقت المستغرق في فحص العائد من لوفاستاتين).
الشكل 1: تدفق العمل للبروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: طريقة المقايسة الحيوية. (أ) المقايسة الحيوية للوفاستاتين ضد Neurospora crassa (المحتضنة لمدة 24 ساعة عند 30 درجة مئوية). في نهاية التجربة ، تم تصوير لوحات أجار 90 ملم تحت الضوء المرئي. (ب) كانت تركيزات ستة معايير لوفاستاتين: رقم 1 (1 مجم / مل) ، رقم 2 (0.75 مجم / مل) ، رقم 3 (0.5 مجم / مل) ، ورقم 4 (0.25 مجم / مل). تم تخفيف العينة رقم 5 إلى 0.25× (1: 4). تم تخفيف العينة رقم 6 إلى 0.5× (1: 2). تم قياس بعد منطقة التثبيط (مم2) بواسطة برنامج التصوير. (ج) تم تطوير نموذج الانحدار باستخدام تحليل البيانات وبرمجة الرسوم البيانية استنادا إلى بعد منطقة التثبيط للمعايير. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: لوحة كروماتوجرام رقيقة الطبقة (TLC) معرضة لضوء الأشعة فوق البنفسجية. (أ) تم استخدام n-hexane: أسيتات الإيثيل (2: 3 v / v) كمرحلة متحركة في تحليل TLC ، وتم تعريض لوحة TLC لضوء الأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) بعد نقعها في المطور (10٪ H2SO4). (ب) كانت تركيزات ستة معايير لوفاستاتين: رقم 1 (1 مجم / مل) ، رقم 2 (0.75 مجم / مل) ، رقم 3 (0.5 مجم / مل) ، ورقم 4 (0.25 مجم / مل). تم تخفيف العينة رقم 5 إلى 0.25× (1: 4). تم تخفيف العينة رقم 6 إلى 0.5× (1: 2). تم قياس بعد منطقة التثبيط (مم2) بواسطة برنامج التصوير. (ج) تم تطوير نموذج الانحدار باستخدام تحليل البيانات وبرامج الرسوم البيانية بناء على أبعاد نطاقات لوفاستاتين القياسية على لوحة TLC. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: لوحة كروماتوجرام رقيقة الطبقة (TLC) ممسوحة ضوئيا بواسطة مصباح LED الأزرق. (أ) تم استخدام n-hexane: أسيتات الإيثيل (2: 3 v / v) كمرحلة متنقلة في تحليل TLC ، وتم مسح لوحة TLC بواسطة مصباح LED الأزرق. (ب) كانت تركيزات ستة معايير لوفاستاتين: رقم 1 (1 مجم / مل) ، رقم 2 (0.75 مجم / مل) ، رقم 3 (0.5 مجم / مل) ، ورقم 4 (0.25 مجم / مل). تم تخفيف العينة رقم 5 إلى 0.25× (1: 4). تم تخفيف العينة رقم 6 إلى 0.5× (1: 2). تم قياس بعد منطقة التثبيط (مم2) بواسطة برنامج التصوير. (ج) تم تطوير نموذج الانحدار باستخدام تحليل البيانات وبرامج الرسوم البيانية بناء على أبعاد نطاقات لوفاستاتين القياسية على لوحة TLC. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| المقايسة الحيوية | مصباح LED أزرق | الأشعة فوق البنفسجية المكتشفة | |
| مراقبة النتائج | العيون | مصباح LED أزرق وعيون | الأشعة فوق البنفسجية والعينين |
| دقة الصورة | متوسط | عال | منخفض (صورة ضبابية وباهتة) |
| التكلفة التقريبية للوقت | 24 ساعة | 1 ساعة | 2 ساعة |
| مهارة التحليل المطلوبة | متوسط | منخفض | متوسط |
| أمان | العدوى الميكروبية | آمن جدا | التعرض للأشعة فوق البنفسجية |
| معادلة الانحدار | ص = 0.0019x + 0.0304 | ص = 0.0399x - 0.1271 | ص = 0.0657x - 0.6405 |
| R- مربع | 0.99 | 0.98 | 0.97 |
| المنحدر | 0.0019 | 0.0399 | 0.0657 |
| اعتراض | 0.0304 | -0.1271 | -0.6405 |
| الخطأ القياسي للانحدار | 8.94E-05 | 3.54E-03 | 6.28E-03 |
| الخطأ المعياري للاعتراض | 0.03032 | 0.07115 | 0.12375 |
الجدول 1: مقارنة بين طرق الكشف الثلاثة المستخدمة في هذه الدراسة.
| طريقة TLC-densitometric | TLC-تحليل الصور | |||||||
| الجندي وآخرون.10 |
القاضي وآخرون.11 |
مشرف وآخرون.12 |
جونسون9 | هيس2 | طريقة إضاءة LED الزرقاء (هذه الدراسة) |
|||
| عينة | أسيبوتولول هيدروكلورايد | سيبروفلوكساسين هيدروكلورايد | ميترونيدازول | دانازول | كولسترول | فانيلين | نيكوتيناميد | لوفاستاتين |
| النتائج | الاشعه فوق البنفسجيه كاشف |
تي ال سي ماسح ضوئي |
تي ال سي ماسح ضوئي |
ماسح ضوئي مسطح | كاميرا رقمية مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية |
مصباح LED أزرق | ||
| طول الموجة | 230 نيوتن متر | 280 نيوتن متر | 280 نيوتن متر | 291 نيوتن متر | غير متوفر | 254 نيوتن متر | غير متوفر | |
| معامل الارتباط | 0.996أ | 0.9991أ | 0.9994أ | 0.996أ | 0.998أ | 0.971ب | 0.987ب | 0.99أ 0.98ب |
| معادلة الانحدار | غير متوفر | ذ = 5.7853x +19.9383 |
ص = 1.1104x + 6.9755 |
ص = 7.949س + 2460 | ص = 0.96س | غير متوفر | غير متوفر | ص = 0.0399س -0.1271 |
| أ: معامل ارتباط بيرسون | ||||||||
| ب: مربع R | ||||||||
الجدول 2: مقارنة بين الطرق السابقة والدراسة الحالية.
الشكل التكميلي 1: تم مسح لوحة كروماتوجرام الطبقة الرقيقة (TLC) مع الأمبيسلين بطريقة إضاءة LED الزرقاء. (أ) أسيتات الإيثيل: تم استخدام الميثانول (9:13 فولت / فولت) كمرحلة متنقلة في تحليل TLC ، وتم مسح لوحة TLC بواسطة مصباح LED الأزرق. (ب) كان تركيز أربعة معايير للأمبيسيلين: رقم 1 (100 مجم / مل) ، رقم 2 (75 مجم / مل) ، رقم 3 (50 مجم / مل) ، ورقم 4 (25 مجم / مل). تم قياس أبعاد النطاقات بواسطة برنامج التصوير. (ج) تم تطوير نموذج الانحدار باستخدام تحليل البيانات وبرمجيات الرسوم البيانية استنادا إلى أبعاد نطاقات الأمبيسيلين القياسية على لوحة TLC. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: لوحة كروماتوجرام رقيقة الطبقة (TLC) مع أبراميسين ممسوحة ضوئيا بطريقة إضاءة LED الزرقاء. (أ) الميثانول: تم استخدام الماء (6: 5 فولت / فولت) كمرحلة متحركة في تحليل TLC وتم مسح لوحة TLC بواسطة مصباح LED الأزرق. (ب) كان تركيز أربعة معايير أبرامايسين: رقم 1 (50 مجم / مل) ، رقم 2 (40 مجم / مل) ، رقم 3 (30 مجم / مل) ، ورقم 4 (20 مجم / مل). تم قياس أبعاد النطاقات بواسطة برنامج التصوير. (ج) تم تطوير نموذج الانحدار باستخدام تحليل البيانات وبرمجيات الرسوم البيانية استنادا إلى أبعاد نطاقات الأبراميسين القياسية على لوحة TLC. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفت الدراسة الحالية نهجا جديدا ، وهو مصباح LED الأزرق ، لقياس المركبات دون استخدام معدات باهظة الثمن ومتخصصة ، مثل طريقة HPTLC و HPLC و GC ، وتمت مقارنة الطريقة مع طرق المقايسة الحيوية والأشعة فوق البنفسجية المكتشفة لتقييم أداء القياس الكمي. نتيجة لذلك ، تم استنتاج أن طريقة إضاءة LED الزرقاء هي بروتوكول آمن وفعال نسبيا يستخدم لتحديد إنتاجية المركبات المستهدفة على لوحة TLC.
أفادت الدراسات السابقة عن عدة طرق كمية دون استخدام معدات كمية متخصصة ، وأظهرت جميع الدراسات أن دقة القياس الكمي كانت قريبة من دقة استخدام المعدات المتخصصة 2،9،10،11،12 (الجدول 2). على سبيل المثال ، قارن El-Gindy et al.10 دقة العائد المقدر بناء على طريقتي قياس كثافة HPLC و TLC ، وأظهرت النتائج أنه لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية بين الطريقتين (القيمة الاحتمالية < 0.05). بالمقارنة مع طريقة إضاءة LED الزرقاء في هذه الدراسة ، تطلبت طريقة قياس كثافة TLC التي طورها El-Gindy et al.10 كاشفا خاصا للطول الموجي ، بينما تطلبت طريقة إضاءة LED الزرقاء ماسحا ضوئيا بسيطا وغير مكلف باللون الأزرق LED. وفي الوقت نفسه ، يمكن أيضا استخدام الماسح الضوئي blue-LED لأغراض أخرى ، مثل المسح الكهربائي الهلامي ، ولكن الماسح الضوئي TLC المتخصص الذي طوره Elkady et al.11 تم استخدامه فقط لطريقة TLC-densitometry.
بالإضافة إلى طريقة TLC-densitometric10,11 ، تم تطوير الماسح الضوئي المسطح وطريقة الكاميرا الرقمية للكشف عن إنتاجية العينات. على سبيل المثال ، أنشأ Johnson9 طريقة اكتشاف TLC سريعة باستخدام الماسح الضوئي المسطح ، ثم قام بقياس الامتصاص باستخدام برنامج الصور التجارية. ومع ذلك ، كان برنامج الصور المستخدم في طريقة إضاءة LED الزرقاء مجانيا وسهل الاستخدام. طور Hess2 برنامج "محلل TLC" لتقدير أبعاد النطاقات على صور لوحة TLC التي تم التقاطها بواسطة كاميرا رقمية ، والتي كانت مشابهة لطريقة الأشعة فوق البنفسجية المكتشفة في هذه الدراسة. ومع ذلك ، قد تتفاعل كلتا الطريقتين مع مخاطر الأشعة فوق البنفسجية.
تم تطوير نماذج الانحدار القائمة على أبعاد نطاقات المعايير للمقايسة الحيوية ، ومصباح LED الأزرق ، وطريقة الأشعة فوق البنفسجية المكتشفة ، وكانت قيمة مربع R 0.99 و 0.98 و 0.97 على التوالي (الجدول 1). مع تحقيق خطية عالية (R-square) ، يقترح أن نموذج الانحدار يمكن أن يقيس عائد العينات. تم استبدال قيمة X في نموذج الانحدار بأبعاد نطاقات المعايير ، وكان العائد المقدر (قيمة Y المتوقعة في نموذج الانحدار) حوالي 5.6 و 5.4 و 5.3 ، تم تحديده بواسطة طرق المقايسة الحيوية و blue-LED و UV ، على التوالي. أشارت النتائج إلى أن مربع R والعائد المقدر باستخدام مصباح LED الأزرق كان أقرب إلى طريقة المقايسة الحيوية (المحددة كعنصر تحكم) من الطريقة المكتشفة بالأشعة فوق البنفسجية (الجدول 1).
لفهم قيود هذا النهج ، تم تطبيق النهج أيضا للكشف عن مركبين آخرين ، بما في ذلك الأمبيسلين والأبراميسين. النتائج موضحة في الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2. يجب ملاحظة خطوتين مهمتين في هذا النهج: (1) بعد التجفيف ، يجب تصور اللوحة على الفور ؛ قد يؤثر التصور المتأخر على اكتشاف البقعة ؛ (2) لا ينصح بالتعرض المفرط للوحة لأن الصورة الممسوحة ضوئيا من اللوحة تأتي بخلفية عالية وتجعل من الصعب قياس مناطق البقع.
في الختام ، تعد طريقة الإضاءة الزرقاء LED طريقة آمنة نسبيا وموفرة للوقت وغير مكلفة وأقل شاقة لتسريع القياس الكمي لعائد العينات مقارنة بالطرق الكروماتوغرافية الكمية الأخرى ؛ لذلك ، يعد هذا النهج بروتوكولا مثاليا للاستخدام في تطوير المختبرات ذات الميزانيات المحدودة. وفي الوقت نفسه ، كانت صور لوحة TLC المستردة من طريقة إضاءة LED الزرقاء أكثر وضوحا من تلك الموجودة في طريقة الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 3A مقابل الشكل 4 أ) ، مما ساعد أيضا في تحديد أبعاد النطاقات على لوحة TLC بدقة ، وكذلك لتقدير عائد العينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا ، تايوان (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078 (2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
- Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
- Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
- Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
- Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
- Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
- Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
- Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
- Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).
