Summary
El presente protocolo desarrolló un método para estimar el rendimiento de compuestos en la placa TLC utilizando la técnica de iluminación azul-LED. Las ventajas de este enfoque son que es seguro, efectivo, económico y permite al investigador medir múltiples muestras simultáneamente.
Abstract
La cromatografía en capa fina (TLC) es una técnica analítica accesible que se ha utilizado ampliamente en la investigación de química orgánica para cuantificar el rendimiento de muestras desconocidas. El presente estudio desarrolló un método efectivo, barato y seguro para estimar el rendimiento de las muestras en una placa TLC utilizando el iluminador LED azul. La lovastatina extraída de Aspergillus terreus fue el compuesto de ejemplo utilizado en el presente estudio. Se utilizaron modelos de regresión basados en el estándar de lovastatina para evaluar el rendimiento de lovastatina. Se compararon tres métodos: bioensayo, detección UV e iluminación LED azul. El resultado mostró que el método de iluminación LED-azul es significativamente más efectivo en el tiempo que los métodos de detección UV y bioensayo. Además, la iluminación LED azul fue una opción relativamente segura debido a la preocupación por los peligros biológicos en el método de bioensayo (por ejemplo, infección microbiana) y la exposición ultravioleta en el método de detección UV. En comparación con los métodos costosos que requieren instrumentos especializados y capacitación a largo plazo antes de trabajar de forma independiente, como GC, HPLC y HPTLC, el uso del iluminador LED azul fue una opción económica para estimar el rendimiento de las muestras de una placa TLC.
Introduction
La cromatografía en capa fina (TLC) es ampliamente utilizada como técnica cualitativa y cuantitativa en el campo de la química orgánica 1,2,3. Las principales ventajas de TLC son que proporciona una detección rápida, requisitos de muestra flexibles y no requiere equipos especializados4. Hasta la fecha, a pesar de que se han establecido muchos enfoques avanzados, TLC sigue siendo el método principal para identificar muestras desconocidas en una mezcla. Sin embargo, el desafío de este enfoque es la falta de equipos seguros y económicos para cuantificar el rendimiento de la muestra, especialmente para desarrollar laboratorios con presupuestos limitados. El presente estudio, por lo tanto, tuvo como objetivo desarrollar un método eficiente, seguro y económico combinado con TLC para estimar el rendimiento de las muestras.
A diferencia de la TLC de alta resolución (HPTLC), la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la cromatografía de gases (GC) con requisitos estrictos de muestra, tiempo y participación de múltiples pasos para la preparación de muestras1,5, TLC mostró varias ventajas. Primero, para la preparación de la muestra, la HPLC y el GC no pueden detectar el extracto crudo porque el extracto crudo puede tapar la columna de HPLC y GC. En segundo lugar, cuando las muestras no son aptas para UV (importante para el análisis de HPLC) o con baja volatilidad (importante para el análisis de GC), se puede aplicar TLC a estas muestras, y el uso de reactivo de visualización hace que las muestras aisladas sean visibles en capas delgadas 6,7,8. En tercer lugar, para los usuarios generales, HPLC y GC generalmente requieren un tiempo relativamente largo de capacitación previa antes de trabajar de forma independiente, en comparación con TLC. Además, el análisis cuantitativo de TLC, conocido como TLC de alto rendimiento (HPTLC), puede digitalizar la información en una placa TLC con un escáner altamente sensible. Sin embargo, el costo del sistema HPTLC es relativamente caro. Como tal, el desarrollo de un enfoque rentable y rápido para cuantificar muestras en la placa TLC es un tema importante.
Se han desarrollado métodos similares para la cuantificación del rendimiento de TLC; por ejemplo, Johnson9 informó de una técnica que permite la cuantificación de las muestras en una placa TLC mediante el uso de un escáner plano conectado a una computadora. En 2001, El-Gindy et al.10 desarrollaron el método TLC-densitométrico, que fue utilizado para detectar el compuesto con densidad óptica, y la técnica también fue aplicada por Elkady et al.11. En 2007, Hess2 presentó el método digitalmente mejorado TLC (DE-TLC) aplicado para detectar el rendimiento de un compuesto en una placa TLC utilizando una cámara digital combinada con luz UV. Hess también comparó las diferencias de costos entre el método HPTLC y el método DE-TLC y concluyó que el método DE-TLC podría usarse en laboratorios de escuelas secundarias y universidades debido a su costo asequible2. Sin embargo, el costo del método TLC-densitométrico seguía siendo caro, y la operación de la luz ultravioleta requiere un entrenamiento previo adecuado en caso de que los usuarios puedan exponerse a la radiación ultravioleta. Por lo tanto, compatible con TLC, es deseable desarrollar un método eficiente, seguro y económico para cuantificar el rendimiento de la muestra.
El presente estudio describió un protocolo para detectar la muestra en una placa TLC utilizando el iluminador LED-azul, y desarrolló un modelo de regresión con alta confiabilidad (alto valor R-cuadrado) para medir las dimensiones de las bandas y luego determinar el rendimiento compuesto. Finalmente, se encontró que el método de iluminación azul-LED es relativamente seguro (vs. Método de detección UV), barato (vs. GC, HPLC y HPTLC), y un enfoque efectivo (frente al método de bioensayo) para la cuantificación del rendimiento.
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Protocol
El presente protocolo se describe utilizando lovastatina como ejemplo. La lovastatina se extrajo de Aspergillus terreus de una semana de edad.
1. Extracción de compuestos
NOTA: Para obtener detalles sobre la extracción de compuestos, consulte la Figura 1.
- Cultivo de Aspergillus terreus en el medio de agar dextrosa de patata (PDA, ver Tabla de materiales) a 30 °C.
- Secar el cultivo a 40 °C durante 24 h. Transfiera el cultivo seco a un tubo de 50 ml con pinzas esterilizadas y agregue 15 ml de acetato de etilo.
- Agitar vigorosamente la mezcla haciendo vórtice durante 1 min e incubar durante 1 h a 40 °C agitando a 200 rpm.
- Sonicar la mezcla con un baño ultrasónico de 40 kHz (ver Tabla de materiales) a 40 °C durante 1 h.
- Centrifugar la mezcla a 5.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y filtrar a través de un papel de filtro de 11 μm.
- Extraiga el filtrado con un volumen igual de agua estéril en un embudo separador.
- Después de la separación de fases, recoja la capa orgánica y luego evapore en un evaporador rotativo (consulte la Tabla de materiales). Disolver el residuo en 2 mL de acetato de etilo.
2. Separación del extracto crudo por columna de adsorción en fase normal (NP)
- Empaque la columna con gel de sílice NP como fase estacionaria y use n-hexano: acetato de etilo: ácido trifluoroacético (H: E: T; 80: 20: 0.1, v / v / v) como fase móvil.
- Cargue 2 ml del extracto (paso 1) en la columna y agregue el disolvente de fase móvil a un caudal de 1 ml / min para eluyir el extracto.
NOTA: El caudal se controló manualmente mediante una llave de paso. - Verifique el efluente mediante TLC para confirmar la presencia de lovastatina y luego evapore en un evaporador rotativo a 45 °C hasta que se elimine el disolvente. Este paso dura aproximadamente 20-25 min.
- Disuelva el residuo en 1 ml de acetato de etilo y luego mezcle con un volumen igual de ácido trifluoroacético al 1%.
- Centrifugar la mezcla a 5.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente y recoger la capa orgánica en un nuevo tubo de vidrio.
3. Preparación y carga de placas de cromatograma en capa fina (TLC)
- Coloque 5 μL de muestras y patrones de lovastatina (ver Tabla de materiales) en la línea de base de la placa TLC usando una pipeta capilar, dejando un borde de 1 cm en los lados de la placa TLC.
- Seque la placa TLC en una campana extractora durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- Coloque la placa suavemente con pinzas en una cámara de vidrio saturado que contenga el disolvente de fase móvil. Cubra la cámara con una tapa de vidrio y permita que la placa se desarrolle completamente.
- Retire la placa de la cámara cuando la línea de disolvente alcance 1 cm de la parte superior de la placa.
4. Análisis por el iluminador LED-azul
- Marque la línea del disolvente con un lápiz. Seque la placa en la campana extractora durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Después del secado, remoje inmediatamente la placa en un disolvente deH2SO4 al 10% y luego seque en la campana extractora durante 10 minutos a temperatura ambiente.
- Coloque la placa en el panel calefactor hasta que aparezcan las manchas marrones. Asegúrese de que la placa no esté sobrecalentada, ya que esto podría dificultar la visualización de lovastatina.
- Transfiera la placa al iluminador LED azul y escanee utilizando un software gratuito compatible (MiBio Fluo) (consulte la Tabla de materiales).
5. Estimación del rendimiento por el modelo de regresión
- Mida la dimensión de las bandas utilizando el software ImageJ (consulte Tabla de materiales).
- Establecer un modelo de regresión utilizando software de análisis de datos y gráficos (consulte la Tabla de materiales) basado en las concentraciones descendentes de los estándares de lovastatina, incluidos 1 mg / ml, 0.75 mg / ml, 0.5 mg / ml y 0.25 mg / ml.
- Aplicar el modelo de regresión para estimar el rendimiento de las muestras.
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Representative Results
Este estudio presentó el método de iluminación azul-LED para estimar el rendimiento de los compuestos, y este método fue validado y comparado con los métodos de bioensayo y detección UV (Tabla 1). Los modelos de regresión se desarrollaron en base a las dimensiones de las bandas y la concentración de patrones para tres métodos, respectivamente, para predecir el rendimiento de las muestras. En primer lugar, en los resultados del método de bioensayo, el R-cuadrado entre las dimensiones de la zona de inhibición y los patrones de lovastatina fue de 0,99, y el rendimiento de la muestra fue de 0,56 mg predicho por el modelo de regresión (Figura 2). En segundo lugar, en el método de detección UV, el R-cuadrado entre los estándares de lovastatina y la dimensión de las bandas en la placa TLC fue de 0,97, y el rendimiento de la muestra predicho por el modelo de regresión fue de 0,53 mg (Figura 3). En particular, los bordes de la banda estaban borrosos y se observaron bandas de intensidad de señal relativamente bajas (Figura 3A). En tercer lugar, en el método de iluminación LED-azul, el R-cuadrado entre los estándares de lovastatina y la dimensión de las bandas en la placa TLC fue de 0,98, y el rendimiento de la muestra fue de 0,54 mg predicho por el modelo de regresión (Figura 4). El rendimiento previsto utilizando el iluminador LED azul estaba más cerca del método de bioensayo (establecido como control). La dimensión de la banda fue proporcional a la cantidad de lovastatina, y las bandas claras se obtuvieron por el método de iluminación azul-LED. Además, las horas de trabajo de los métodos de bioensayo, detección UV e iluminación LED azul fueron de aproximadamente 24 h, 2 h y 1 h, respectivamente; (Nota: hora de trabajo significa el tiempo total dedicado al examen de rendimiento de lovastatina).
Figura 1: El flujo de trabajo del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Método de bioensayo. (A) Bioensayo de lovastatina contra Neurospora crassa (incubado durante 24 h a 30 °C). Al final de la prueba, las placas de agar de 90 mm fueron fotografiadas bajo luz visible. (B) Las concentraciones de seis patrones de lovastatina fueron: No. 1 (1 mg/mL), No. 2 (0.75 mg/mL), No. 3 (0.5 mg/mL) y No. 4 (0.25 mg/mL). La muestra nº 5 se diluyó a 0,25× (1:4). La muestra No. 6 se diluyó a 0,5× (1:2). La dimensión de la zona de inhibición (mm2) se midió mediante el software de imágenes. (C) Se desarrolló un modelo de regresión utilizando análisis de datos y software de gráficos basado en la dimensión de la zona de inhibición de los estándares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Placa de cromatograma de capa fina (TLC) expuesta a luz UV. (A) El n-hexano:acetato de etilo (2:3 v/v) se utilizó como fase móvil en el análisis TLC, y la placa TLC se expuso a luz UV (365 nm) después de sumergirse en el revelador (10%H2SO4). (B) Las concentraciones de seis patrones de lovastatina fueron: No. 1 (1 mg/mL), No. 2 (0.75 mg/mL), No. 3 (0.5 mg/mL) y No. 4 (0.25 mg/mL). La muestra nº 5 se diluyó a 0,25× (1:4). La muestra No. 6 se diluyó a 0,5× (1:2). La dimensión de la zona de inhibición (mm2) se midió mediante el software de imágenes. (C) Se desarrolló un modelo de regresión utilizando análisis de datos y software gráfico basado en la dimensión de las bandas estándar de lovastatina en la placa TLC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Placa de cromatograma de capa fina (TLC) escaneada por el iluminador LED-azul. (A) El n-hexano:acetato de etilo (2:3 v/v) se utilizó como fase móvil en el análisis TLC, y la placa TLC fue escaneada por el iluminador LED-azul. (B) Las concentraciones de seis patrones de lovastatina fueron: No. 1 (1 mg/mL), No. 2 (0.75 mg/mL), No. 3 (0.5 mg/mL) y No. 4 (0.25 mg/mL). La muestra nº 5 se diluyó a 0,25× (1:4). La muestra No. 6 se diluyó a 0,5× (1:2). La dimensión de la zona de inhibición (mm2) se midió mediante el software de imágenes. (C) Se desarrolló un modelo de regresión utilizando análisis de datos y software gráfico basado en la dimensión de las bandas estándar de lovastatina en la placa TLC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Bioensayo | Iluminador LED-azul | Detectado por UV | |
| Observación de resultados | Ojos | Iluminador y ojos azul-LED | Luz UV y ojos |
| Resolución de imagen | Medio | Alto | Bajo (imagen borrosa y débil) |
| Costo de tiempo aproximado | 24 h | 1 h | 2 h |
| Habilidad de análisis requerida | Medio | Bajo | Medio |
| Seguridad | Infección microbiana | Muy seguro | Exposición a la luz UV |
| Ecuación de regresión | y = 0,0019x + 0,0304 | y = 0,0399x - 0,1271 | y = 0,0657x - 0,6405 |
| R-cuadrado | 0.99 | 0.98 | 0.97 |
| Cuesta | 0.0019 | 0.0399 | 0.0657 |
| Interceptar | 0.0304 | -0.1271 | -0.6405 |
| Error estándar de pendiente | 8.94E-05 | 3.54E-03 | 6.28E-03 |
| Error estándar de intercepción | 0.03032 | 0.07115 | 0.12375 |
Tabla 1: Comparación de los tres métodos de detección utilizados en este estudio.
| Método TLC-densitométrico | Análisis de imágenes TLC | |||||||
| El-Gindy et al.10 |
Elkady et al.11 |
Musharraf et al.12 |
Johnson9 | Hess2 | Método del iluminador LED-azul (Este estudio) |
|||
| Muestra | Acebutolol HCL | Ciprofloxacina HCL | Metronidazol | Danazol | Colesterol | Vainillina | Nicotinamida | Lovastatina |
| Resultados | UV detector |
TLC escáner |
TLC escáner |
Escáner plano | Cámara digital con lámpara UV |
Iluminador LED-azul | ||
| Longitud de onda | 230 nm | 280 nm | 280 nm | 291 nm | NA | 254 nm | NA | |
| Coeficiente de correlación | 0,996a | 0,9991a | 0,9994A | 0,996a | 0,998a | 0,971mil millones | 0,987mil millones | 0,99a 0,98b |
| Ecuación de regresión | NA | y = 5,7853x +19.9383 |
y = 1,1104x + 6.9755 |
y = 7,949x + 2460 | y = 0,96x | NA | NA | y = 0,0399x -0.1271 |
| a: Coeficiente de correlación de Pearson | ||||||||
| b: R-cuadrado | ||||||||
Tabla 2: Comparación de métodos anteriores y el estudio actual.
Figura complementaria 1: La placa de cromatograma de capa fina (TLC) con ampicilina fue escaneada por el método de iluminación LED-azul. (A) Acetato de etilo: metanol (9:13 v / v) se utilizó como fase móvil en el análisis TLC, y la placa TLC fue escaneada por el iluminador LED azul. (B) La concentración de cuatro patrones de ampicilina fueron: No. 1 (100 mg/mL), No. 2 (75 mg/mL), No. 3 (50 mg/mL) y No. 4 (25 mg/mL). La dimensión de las bandas fue medida por el software de imágenes. (C) Se desarrolló un modelo de regresión utilizando análisis de datos y software gráfico basado en la dimensión de las bandas estándar de ampicilina en la placa TLC. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Placa de cromatograma en capa fina (TLC) con apramicina escaneada por el método de iluminación LED-azul. (A) Metanol: agua (6:5 v/v) se utilizó como fase móvil en el análisis TLC y la placa TLC fue escaneada por el iluminador LED-azul. (B) La concentración de cuatro patrones de apramicina fueron: No. 1 (50 mg/mL), No. 2 (40 mg/mL), No. 3 (30 mg/mL) y No. 4 (20 mg/mL). La dimensión de las bandas fue medida por el software de imágenes. (C) Se desarrolló un modelo de regresión utilizando análisis de datos y software gráfico basado en la dimensión de las bandas estándar de apramicina en la placa TLC. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El presente estudio describió un nuevo enfoque, el iluminador azul-LED, para cuantificar compuestos sin utilizar equipos costosos y especializados, como HPTLC, HPLC y GC, y el método se comparó con los métodos de bioensayo y UV detectados para evaluar el rendimiento de cuantificación. Como resultado, se concluyó que el método de iluminación blue-LED es un protocolo relativamente seguro y efectivo utilizado para cuantificar el rendimiento de compuestos específicos en la placa TLC.
Estudios previos han reportado varios métodos cuantitativos sin utilizar equipo cuantitativo especializado, y todos los estudios mostraron que la precisión de la cuantificación fue cercana a la del uso de equipo especializado 2,9,10,11,12 (Tabla 2). Por ejemplo, El-Gindy et al.10 compararon la precisión del rendimiento estimado basado en los métodos HPLC y TLC-densitométrico, y los resultados mostraron que no había diferencias significativas entre los dos métodos (valor de p < 0,05). En comparación con el método de iluminación LED-azul en este estudio, el método TLC-densitométrico desarrollado por El-Gindy et al.10 requería un detector de longitud de onda especial, mientras que el método de iluminación azul-LED requería un escáner LED-azul simple y económico. Mientras tanto, el escáner de LED azul también podría usarse para otros fines, como el escaneo de electroforesis en gel, pero el escáner TLC especializado desarrollado por Elkady et al.11 se usó solo para el método TLC-densitométrico.
Además del método TLC-densitométrico10,11, se desarrollaron el escáner plano y el método de cámara digital para detectar el rendimiento de las muestras. Por ejemplo, Johnson9 estableció un método de detección rápida de TLC utilizando el escáner plano, y luego midió la absorción utilizando software de imagen comercial. Sin embargo, el software de imagen utilizado en el método de iluminación LED azul era gratuito y fácil de usar. Hess2 desarrolló el software "analizador TLC" para estimar la dimensión de las bandas en las imágenes de placas TLC tomadas por una cámara digital, que era similar al método detectado por UV en este estudio. Sin embargo, ambos métodos pueden interactuar potencialmente con los peligros de la luz UV.
Los modelos de regresión basados en la dimensión de las bandas de los estándares se desarrollaron para el bioensayo, el iluminador LED azul y el método detectado por UV, y el valor R-cuadrado fue de 0,99, 0,98 y 0,97, respectivamente (Tabla 1). Como se logró una alta linealidad (R-cuadrado), se sugiere que el modelo de regresión podría medir el rendimiento de las muestras. El valor X en el modelo de regresión fue sustituido por la dimensión de las bandas de los estándares, y el rendimiento estimado (valor Y previsto en el modelo de regresión) fue de aproximadamente 5,6, 5,4 y 5,3, determinado por los métodos de bioensayo, LED-azul y detección UV, respectivamente. Los resultados indicaron que el R-cuadrado y el rendimiento estimado utilizando el iluminador LED-azul estaban más cerca del método de bioensayo (establecido como control) que el método detectado por UV (Tabla 1).
Para comprender las limitaciones de este enfoque, también se aplicó el enfoque para detectar otros dos compuestos, incluyendo ampicilina y apramicina; los resultados se muestran en la Figura Suplementaria 1 y en la Figura Suplementaria 2. Se deben tener en cuenta dos pasos importantes en este enfoque: (1) después del secado, la placa debe visualizarse inmediatamente; La visualización retardada puede afectar la detección de puntos; (2) No se recomienda la sobreexposición de la placa ya que la imagen escaneada de la placa viene con un fondo alto y dificulta la medición de las áreas de las manchas.
Para concluir, el método de iluminación blue-LED es un enfoque relativamente seguro, que ahorra tiempo, es económico y menos laborioso para acelerar la cuantificación del rendimiento de las muestras en comparación con otros métodos cromatográficos cuantitativos; Por lo tanto, este enfoque es un protocolo ideal para su uso en el desarrollo de laboratorios con presupuestos limitados. Mientras tanto, las imágenes de la placa TLC recuperadas del método de iluminación LED azul fueron mucho más claras que las del método de detección UV (Figura 3A vs. Figura 4A), que también ayudó a determinar con precisión la dimensión de las bandas en la placa TLC, y también a estimar el rendimiento de las muestras.
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Disclosures
Todos los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología de Taiwán (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
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