Summary
הפרוטוקול הנוכחי פיתח שיטה להערכת התפוקה של תרכובות על לוח TLC באמצעות טכניקת התאורה הכחולה-LED. היתרונות של גישה זו הם שהיא בטוחה, יעילה, זולה, ומאפשרת לחוקר למדוד מספר דגימות בו זמנית.
Abstract
כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) היא טכניקה אנליטית נגישה שנעשה בה שימוש נרחב במחקר בכימיה אורגנית כדי לכמת את התשואה של דגימות לא ידועות. המחקר הנוכחי פיתח שיטה יעילה, זולה ובטוחה להעריך את תפוקת הדגימות על צלחת TLC באמצעות תאורת ה-LED הכחולה. לובסטטין שהופק מאספרגילוס טראוס היה התרכובת לדוגמה ששימשה במחקר הנוכחי. מודלים של רגרסיה המבוססים על תקן lovastatin שימשו להערכת התשואה של lovastatin. הושוו שלוש שיטות: ביו-אסאי, גילוי UV ותאורת LED כחולה. התוצאה הראתה כי שיטת התאורה blue-LED יעילה הרבה יותר בזמן מאשר שיטות זיהוי UV ובדיקת ביולוגיה. בנוסף, תאורת ה-LED הכחולה הייתה אופציה בטוחה יחסית בגלל החשש מסכנות ביולוגיות בשיטת הביו-אסאי (למשל, זיהום מיקרוביאלי) וחשיפה לקרינה אולטרה סגולה בשיטת גילוי ה-UV. בהשוואה לשיטות היקרות הדורשות מכשירים מיוחדים והכשרה ארוכת טווח לפני עבודה עצמאית, כגון GC, HPLC ו- HPTLC, השימוש בתאורת Blue-LED היה אפשרות חסכונית להעריך את תפוקת הדגימות מצלחת TLC.
Introduction
כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) נמצאת בשימוש נרחב כטכניקה איכותית וכמותית בתחום הכימיה האורגנית 1,2,3. היתרונות העיקריים של TLC הם שהיא מספקת זיהוי מהיר, דרישות מדגם גמישות, ואינה דורשת ציוד מיוחד4. עד כה, למרות שגישות מתקדמות רבות הוקמו, TLC היא עדיין השיטה העיקרית לזיהוי דגימות לא ידועות בתערובת. עם זאת, האתגר של גישה זו הוא היעדר ציוד בטוח וזול לכימות תפוקת הדגימה, במיוחד לפיתוח מעבדות עם תקציבים מוגבלים. המחקר הנוכחי, אם כן, נועד לפתח שיטה יעילה, בטוחה וזולה בשילוב עם TLC כדי להעריך את התשואה של הדגימות.
שלא כמו TLC בעל ביצועים גבוהים (HPTLC), כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) וכרומטוגרפיית גז (GC) עם דרישות דגימה מחמירות, זמן רב ומעורבות של multistep להכנת דגימה 1,5, TLC הראה מספר יתרונות. ראשית, לצורך הכנת הדגימה, HPLC ו- GC אינם יכולים לזהות את התמצית הגולמית מכיוון שהתמצית הגולמית עשויה לחבר את העמודה של HPLC ו- GC. שנית, כאשר הדגימות אינן מתאימות ל- UV (חשוב לניתוח HPLC) או עם תנודתיות נמוכה (חשוב לניתוח GC), ניתן להחיל TLC על דגימות אלה, והשימוש במגיב הדמיה הופך את הדגימות המבודדות לגלויות על שכבות דקות 6,7,8. שלישית, עבור משתמשים כלליים, HPLC ו- GC דורשים בדרך כלל זמן רב יחסית לפני שהם עובדים באופן עצמאי, בהשוואה ל- TLC. בנוסף, ניתוח TLC כמותי, המכונה TLC בעל ביצועים גבוהים (HPTLC), יכול להפוך את המידע על לוח TLC לדיגיטלי באמצעות סורק רגיש במיוחד. עם זאת, העלות של מערכת HPTLC הוא יקר יחסית. ככזה, פיתוח גישה חסכונית ומהירה לכימות דגימות על צלחת TLC הוא נושא חשוב.
שיטות דומות פותחו לכימות תפוקת TLC; לדוגמה, Johnson9 דיווח על טכניקה המאפשרת לכמת את הדגימות על צלחת TLC באמצעות סורק שטוח המחובר למחשב. בשנת 2001, El-Gindy et al.10 פיתחו את השיטה TLC- densitometric, אשר שימשה לאיתור התרכובת עם צפיפות אופטית, והטכניקה יושמה גם על ידי Elkady et al.11. בשנת 2007, הס2 הציג את שיטת ה-TELC (DE-TLC) המשופרת דיגיטלית המיושמת כדי לזהות את התפוקה של תרכובת על צלחת TLC באמצעות מצלמה דיגיטלית בשילוב עם אור UV. הס גם השווה את הבדלי העלויות בין שיטת HPTLC לשיטת DE-TLC והגיע למסקנה כי ניתן להשתמש בשיטת DE-TLC במעבדות תיכון ומכללות בגלל עלותה הזולה2. עם זאת, העלות של שיטת TLC-densitometric עדיין הייתה יקרה, והפעלת אור אולטרה סגול דורשת הכשרה מקדימה מספקת למקרה שהמשתמשים עלולים להיחשף לקרינה אולטרה סגולה. לכן, בהתאם ל- TLC, רצוי לפתח שיטה יעילה, בטוחה וזולה לכימות תפוקת המדגם.
המחקר הנוכחי תיאר פרוטוקול לגילוי הדגימה על צלחת TLC באמצעות תאורת ה-LED הכחולה, ופיתח מודל רגרסיה עם אמינות גבוהה (ערך ריבועי R גבוה) כדי למדוד את מידות הפסים ולאחר מכן לקבוע את התפוקה המורכבת. לבסוף, נמצא כי שיטת התאורה blue-LED היא בטוחה יחסית (לעומת שיטת גילוי UV), זולה (לעומת. GC, HPLC ו-HPTLC), וגישה יעילה (לעומת שיטת bioassay) לכימות תשואה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הנוכחי מתואר באמצעות lovastatin כדוגמה. לובסטטין הופק מאספרגילוס טראוס בן שבוע.
1. מיצוי תרכובת
הערה: לפרטים על מיצוי תרכובת, ראו איור 1.
- תרבית אספרגילוס טראוס על אגר דקסטרוז תפוחי אדמה (PDA, ראו טבלת חומרים) בינונית ב-30 מעלות צלזיוס.
- ייבשו את התרבית בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. העבירו את התרבית המיובשת לצינור של 50 מ"ל באמצעות פינצטה מעוקרת והוסיפו 15 מ"ל אתיל אצטט.
- נערו את התערובת במרץ על ידי מערבולת במשך דקה אחת ודגרה במשך שעה אחת בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד.
- סוניקו את התערובת באמצעות אמבט אולטראסוני של 40 קילוהרץ (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 40°C למשך שעה אחת.
- סובבו את התערובת בגודל 5,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר וסננו באמצעות נייר סינון של 11 מיקרומטר.
- מוציאים את התסנין בנפח שווה של מים סטריליים במשפך מפריד.
- לאחר הפרדת פאזה, אספו את השכבה האורגנית, ולאחר מכן התאדו במאייד סיבובי (ראו טבלת חומרים). ממיסים את השאריות ב-2 מ"ל של אתיל אצטט.
2. הפרדת התמצית הגולמית לפי עמודת ספיחה בפאזה רגילה (NP)
- ארזו את העמודה עם ג'ל סיליקה NP כפאזה נייחת, והשתמשו ב-n-הקסאן:אתיל אצטט:חומצה טריפלואורואצטית (H:E:T; 80:20:0.1, v/v/v) כשלב הנייד.
- טען 2 מ"ל של התמצית (שלב 1) על העמודה והוסף את ממס הפאזה הנייד בקצב זרימה של 1 מ"ל לדקה כדי לחמוק מהתמצית.
הערה: קצב הזרימה נשלט באופן ידני באמצעות stopcock. - אמת את השפכים על ידי TLC כדי לאשר את נוכחותו של lovastatin, ולאחר מכן להתאדות במאייד סיבובי ב 45 מעלות צלזיוס עד שהממס מוסר. צעד זה אורך כ-20-25 דקות.
- ממיסים את השאריות ב-1 מ"ל של אתיל אצטט, ואז מערבבים עם נפח שווה של 1% חומצה טריפלואורואצטית.
- צנטריפוגות התערובת בגודל 5,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר ואוספים את השכבה האורגנית בצינור זכוכית חדש.
3. הכנה וטעינה של לוחות כרומטוגרמה בשכבה דקה (TLC)
- יש לזהות 5 μL של דגימות ותקני לובסטטין (ראו טבלת חומרים) על קו הבסיס של לוח TLC באמצעות פיפטה נימית, ולהשאיר גבול של 1 ס"מ בצידי לוח TLC.
- יבשו את צלחת ה- TLC במכסה אדים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הניחו את הצלחת בעדינות על ידי מלקחיים בתא זכוכית רוויה המכיל את ממס הפאזה הנייד. מכסים את התא במכסה זכוכית ומאפשרים לצלחת להתפתח במלואה.
- הסר את הצלחת מהתא כאשר קו הממס מגיע ל -1 ס"מ מראש הצלחת.
4. ניתוח על ידי תאורת ה- LED הכחולה
- סמן את קו הממס בעיפרון. יבשו את הצלחת במכסה האדים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר הייבוש, יש להשרות מיד את הצלחת בממס 10% H2SO4 , ולאחר מכן לייבש במכסה האדים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- מניחים את הצלחת על לוח החימום עד להופעת הכתמים החומים. ודא שהצלחת אינה מחוממת יתר על המידה, מכיוון שהדבר עלול להקשות על הדמיה של לובסטטין.
- העבירו את הלוחית לתאורת ה-LED הכחולה וסרקו באמצעות תוכנה חופשית תואמת (MiBio Fluo) (ראו טבלת חומרים).
5. הערכת תשואה לפי מודל הרגרסיה
- מדוד את ממד הפסים באמצעות תוכנת ImageJ (ראה טבלת חומרים).
- צור מודל רגרסיה באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים (ראה טבלת חומרים) המבוססת על הריכוזים היורדים של תקני לובסטטין, כולל 1 מ"ג/מ"ל, 0.75 מ"ג/מ"ל, 0.5 מ"ג/מ"ל ו-0.25 מ"ג/מ"ל.
- החל את מודל הרגרסיה כדי להעריך את התשואה של הדגימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מחקר זה הציג את שיטת תאורת ה-LED הכחולה כדי להעריך את תפוקת התרכובות, ושיטה זו אומתה והושוותה לשיטות ביו-אסאי ו-UV שזוהו (טבלה 1). מודלי הרגרסיה פותחו על בסיס ממדי הפסים וריכוז התקנים לשלוש שיטות, בהתאמה, כדי לחזות את תפוקת הדגימות. ראשית, בתוצאות שיטת הביו-אסאי, ריבוע ה-R בין ממדי אזור העיכוב לתקני לובסטטין היה 0.99, ותפוקת הדגימה הייתה 0.56 מ"ג שנחזתה על ידי מודל הרגרסיה (איור 2). שנית, בשיטת גילוי UV, ריבוע ה-R בין תקני הלובסטטין לבין ממד הפסים על לוחית ה-TLC היה 0.97, ותפוקת הדגימה שנחזתה על-ידי מודל הרגרסיה הייתה 0.53 מ"ג (איור 3). יש לציין ששולי הרצועה היו מטושטשים, ונצפו פסים בעוצמת אות נמוכה יחסית (איור 3A). שלישית, בשיטת תאורת ה-LED הכחולה, ריבוע ה-R בין תקני לובסטטין לממד הפסים בלוח ה-TLC היה 0.98, ותפוקת הדגימה הייתה 0.54 מ"ג שנחזתה על-ידי מודל הרגרסיה (איור 4). התפוקה החזויה באמצעות תאורת ה-LED הכחולה הייתה קרובה יותר לשיטת הביו-אסאי (שנקבעה כבקרה). הממד של הלהקה היה פרופורציונלי לכמות הלובסטטין, והפסים הברורים התקבלו בשיטת התאורה הכחולה-LED. בנוסף, שעות העבודה של שיטות התאורה bioassay, UV-detected ו- blue-LED היו בערך 24 שעות, 2 שעות, ו 1 שעות, בהתאמה; (הערה: שעת עבודה פירושה הזמן הכולל שהושקע בבדיקת התשואה של lovastatin).
איור 1: זרימת העבודה של הפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: שיטת הבדיקה הביולוגית. (A) ביו-אסאי של לובסטטין נגד נוירוספורה קראסה (דגירה במשך 24 שעות ב-30 מעלות צלזיוס). בסוף הניסוי צולמו לוחות האגר בקוטר 90 מ"מ תחת אור נראה. (B) הריכוזים של שישה תקני לובסטטין היו: מס' 1 (1 מ"ג/מ"ל), מס' 2 (0.75 מ"ג/מ"ל), מס' 3 (0.5 מ"ג/מ"ל) ומס' 4 (0.25 מ"ג/מ"ל). מדגם מס' 5 דולל ל-0.25× (1:4). מדגם מס' 6 דולל ל-0.5× (1:2). ממד אזור העיכוב (מ"מ2) נמדד על ידי תוכנת ההדמיה. (C) מודל רגרסיה פותח באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים המבוססת על ממד אזור העיכוב של התקנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: צלחת כרומטוגרמה בשכבה דקה (TLC) שנחשפה לאור UV. (A) ה-n-הקסאן:אתיל אצטט (2:3 v/v) שימש כשלב הנייד בניתוח TLC, ולוחית ה-TLC נחשפה לאור UV (365 ננומטר) לאחר השרייה במפתח (10% H2SO4). (B) הריכוזים של שישה תקני לובסטטין היו: מס' 1 (1 מ"ג/מ"ל), מס' 2 (0.75 מ"ג/מ"ל), מס' 3 (0.5 מ"ג/מ"ל) ומס' 4 (0.25 מ"ג/מ"ל). מדגם מס' 5 דולל ל-0.25× (1:4). מדגם מס' 6 דולל ל-0.5× (1:2). ממד אזור העיכוב (מ"מ2) נמדד על ידי תוכנת ההדמיה. (C) מודל רגרסיה פותח באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים המבוססת על הממד של הפסים הסטנדרטיים של לובסטטין על לוח TLC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: צלחת כרומטוגרמה בשכבה דקה (TLC) שנסרקה על-ידי מאיר ה-LED הכחול. (A) n-הקסאן:אתיל אצטט (2:3 v/v) שימש כשלב הנייד בניתוח TLC, ולוחית ה-TLC נסרקה על-ידי מאיר ה-LED הכחול. (B) הריכוזים של שישה תקני לובסטטין היו: מס' 1 (1 מ"ג/מ"ל), מס' 2 (0.75 מ"ג/מ"ל), מס' 3 (0.5 מ"ג/מ"ל) ומס' 4 (0.25 מ"ג/מ"ל). מדגם מס' 5 דולל ל-0.25× (1:4). מדגם מס' 6 דולל ל-0.5× (1:2). ממד אזור העיכוב (מ"מ2) נמדד על ידי תוכנת ההדמיה. (C) מודל רגרסיה פותח באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים המבוססת על הממד של הפסים הסטנדרטיים של לובסטטין על לוח TLC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| ביו-אסאי | תאורת LED כחולה | זוהה UV | |
| תצפית תוצאות | העיניים | תאורת LED כחולה ועיניים | אור UV ועיניים |
| רזולוציית תמונה | בינוני | גבוה | נמוך (תמונה מטושטשת וקלושה) |
| עלות זמן משוערת | 24 שעות | 1 שעה | שעתיים |
| נדרשת מיומנות ניתוח | בינוני | נמוך | בינוני |
| בטיחות | זיהום מיקרוביאלי | בטוח מאוד | חשיפה לאור UV |
| משוואת רגרסיה | y = 0.0019x + 0.0304 | y = 0.0399x - 0.1271 | y = 0.0657x - 0.6405 |
| ריבוע R | 0.99 | 0.98 | 0.97 |
| מדרון | 0.0019 | 0.0399 | 0.0657 |
| יירוט | 0.0304 | -0.1271 | -0.6405 |
| שגיאת תקן של שיפוע | 8.94E-05 | 3.54E-03 | 6.28E-03 |
| שגיאת תקן של יירוט | 0.03032 | 0.07115 | 0.12375 |
טבלה 1: השוואה בין שלוש שיטות האיתור ששימשו במחקר זה.
| שיטה דנסיטומטרית TLC | ניתוח תמונות TLC | |||||||
| אל-גינדי ואח' 10 |
אלקדי ואח'.11 |
מושארף ואח'.12 |
ג'ונסון9 | הס2 | שיטת תאורת LED כחולה (מחקר זה) |
|||
| לדוגמה | אצבוטולול HCL | ציפרופלוקסצין HCL | מטרונידזול | דאנאזול | כולסטרול | ונילין | ניקוטינמיד | לובסטטין |
| תוצאות | UV גלאי |
TLC סורק |
TLC סורק |
סורק שטוח | מצלמה דיגיטלית עם מנורת UV |
תאורת LED כחולה | ||
| אורך גל | 230 נאנומטר | 280 נאנומטר | 280 נאנומטר | 291 נאנומטר | נה | 254 נאנומטר | נה | |
| מקדם מתאם | 0.996אמפר | 0.9991א | 0.9994א | 0.996אמפר | 0.998א | 0.971ב' | 0.987ב' | 0.99א 0.98ב' |
| משוואת רגרסיה | נה | y = 5.7853x +19.9383 |
y = 1.1104x + 6.9755 |
y = 7.949x + 2460 | y = 0.96x | נה | נה | y = 0.0399x -0.1271 |
| a: מקדם המתאם של פירסון | ||||||||
| b: ריבוע R | ||||||||
לוח 2: השוואה בין שיטות קודמות לבין המחקר הנוכחי.
איור משלים 1: צלחת הכרומטוגרמה בעלת השכבה הדקה (TLC) עם אמפיצילין נסרקה בשיטת תאורת ה-LED הכחולה. (A) אתיל אצטט:מתנול (9:13 v/v) שימש כשלב הנייד בניתוח TLC, ולוחית ה-TLC נסרקה על ידי תאורת ה-LED הכחולה. (B) הריכוז של ארבעה תקני אמפיצילין היה: מס' 1 (100 מ"ג/מ"ל), מס' 2 (75 מ"ג/מ"ל), מס' 3 (50 מ"ג/מ"ל) ומס' 4 (25 מ"ג/מ"ל). ממדי הפסים נמדדו על ידי תוכנת ההדמיה. (C) מודל רגרסיה פותח באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים המבוססת על הממד של הפסים הסטנדרטיים של אמפיצילין על לוח TLC. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים 2: צלחת כרומטוגרמה בשכבה דקה (TLC) עם אפרמיצין שנסרקה בשיטת תאורת ה-LED הכחולה. (A) מתנול: מים (6:5 v/v) שימשו כשלב הנייד בניתוח TLC ולוחית ה- TLC נסרקה על ידי תאורת ה- LED הכחולה. (B) הריכוז של ארבעה תקני אפרמיצין היה: מס' 1 (50 מ"ג/מ"ל), מס' 2 (40 מ"ג/מ"ל), מס' 3 (30 מ"ג/מ"ל) ומס' 4 (20 מ"ג/מ"ל). ממדי הפסים נמדדו על ידי תוכנת ההדמיה. (C) מודל רגרסיה פותח באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים המבוססת על הממד של הפסים הסטנדרטיים של אפרמיצין על לוח TLC. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחקר הנוכחי תיאר גישה חדשה, תאורת ה-LED הכחולה, לכמת תרכובות ללא שימוש בציוד יקר ומתמחה, כגון שיטת HPTLC, HPLC ו-GC, והשיטה הושוותה לשיטות הביו-אסאי וה-UV שזוהו כדי להעריך את ביצועי הכימות. כתוצאה מכך, הוסק כי שיטת התאורה הכחולה-LED היא פרוטוקול בטוח ויעיל יחסית המשמש לכימות התפוקה של תרכובות ממוקדות על צלחת TLC.
מחקרים קודמים דיווחו על מספר שיטות כמותיות ללא שימוש בציוד כמותי מיוחד, וכל המחקרים הראו כי דיוק הכמות היה קרוב לזה של השימוש בציוד מיוחד 2,9,10,11,12 (לוח 2). לדוגמה, El-Gindy et al.10 השוו את הדיוק של התפוקה המשוערת בהתבסס על השיטות HPLC ו- TLC-densitometric, והתוצאות הראו כי לא היו הבדלים משמעותיים בין שתי השיטות (ערך p < 0.05). בהשוואה לשיטת התאורה הכחולה-LED במחקר זה, שיטת TLC-densitometric שפותחה על ידי El-Gindy et al.10 דרשה גלאי באורך גל מיוחד, בעוד ששיטת התאורה הכחולה-LED דרשה סורק Blue-LED פשוט וזול. בינתיים, סורק ה-blue-LED יכול לשמש גם למטרות אחרות, כגון סריקת אלקטרופורזה בג'ל, אך סורק ה-TLC המיוחד שפותח על ידי Elkady et al.11 שימש רק לשיטה ה-TLC-densitometric.
בנוסף לשיטת TLC-densitometric10,11, הסורק השטוח ושיטת המצלמה הדיגיטלית פותחו כדי לזהות את תפוקת הדגימות. לדוגמה, ג'ונסון9 הקים שיטת זיהוי TLC מהירה באמצעות הסורק השטוח, ולאחר מכן מדד את הקליטה באמצעות תוכנת תמונה מסחרית. עם זאת, תוכנת התמונה ששימשה בשיטת התאורה הכחולה-LED הייתה חופשית וקלה לשימוש. הס2 פיתח את תוכנת "מנתח TLC" כדי להעריך את ממד הפסים על תמונות צלחת TLC שצולמו על ידי מצלמה דיגיטלית, שהייתה דומה לשיטה שזוהתה UV במחקר זה. עם זאת, שתי השיטות עלולות לקיים אינטראקציה פוטנציאלית עם סכנות אור UV.
מודלי הרגרסיה המבוססים על ממד רצועות התקנים פותחו עבור ביו-אסאי, תאורת LED כחולה ושיטה שזוהתה על-ידי UV, וערך ריבוע R היה 0.99, 0.98 ו-0.97, בהתאמה (טבלה 1). כאשר הושגה ליניאריות גבוהה (ריבוע R), מוצע כי מודל הרגרסיה יכול למדוד את תפוקת הדגימות. ערך ה-X במודל הרגרסיה הוחלף בממד רצועות התקנים, והתפוקה המשוערת (ערך Y חזוי במודל הרגרסיה) הייתה כ-5.6, 5.4 ו-5.3, שנקבעה על ידי שיטות גילוי ביו-אסאי, נורית כחולה וגילוי UV, בהתאמה. התוצאות הצביעו על כך שהתפוקה הריבועית והמשוערת של R באמצעות תאורת ה-LED הכחולה הייתה קרובה יותר לשיטת הביו-אסאי (שנקבעה כבקרה) מאשר לשיטה שזוהתה על-ידי UV (טבלה 1).
כדי להבין את המגבלות של גישה זו, הגישה יושמה גם כדי לזהות שתי תרכובות אחרות, כולל אמפיצילין ואפרמיצין; התוצאות מוצגות באיור משלים 1 ובאיור משלים 2. יש לציין שני שלבים חשובים בגישה זו: (1) לאחר הייבוש, יש לדמיין את הצלחת באופן מיידי; הדמיה מאוחרת עלולה להשפיע על זיהוי הנקודה; (2) חשיפת יתר של הצלחת אינה מומלצת מכיוון שהתמונה הסרוקה מהצלחת מגיעה עם רקע גבוה ומקשה על מדידת אזורי הכתמים.
לסיכום, שיטת התאורה הכחולה-LED היא גישה בטוחה יחסית, חסכונית בזמן, זולה ופחות מייגעת להאצת כימות התשואה של דגימות בהשוואה לשיטות כרומטוגרפיות כמותיות אחרות; לכן, גישה זו היא פרוטוקול אידיאלי לשימוש בפיתוח מעבדות עם תקציבים מוגבלים. בינתיים, תמונות לוח ה-TLC שנלקחו משיטת התאורה הכחולה-LED היו הרבה יותר ברורות מאלו של שיטת גילוי ה-UV (איור 3A לעומת איור 4A), שגם עזר לקבוע במדויק את הממד של הפסים על לוח ה-TLC, וגם להעריך את התפוקה של הדגימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי משרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן (MOST 108-2320-B-110-007-MY3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| American bacteriological Agar | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| Blue-LED illuminator | MICROTEK | Bio-1000F | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| Compact UV lamp | UVP | UVGL-25 | |
| Ethyl Acetate | MACRON | MA-H078-10 | |
| Filter Paper 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | Freeware | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Lovastatin standard | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| n-Hexane | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| Potato dextrose broth H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| Rotary evaporator | EYELA | SB-1000 | |
| Sulfuric acid | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| TLC silica gel 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | 10229873 | |
| Ultrasonic vibration machine | DELTA | DC600 |
References
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078 (2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
- Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
- Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
- Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
- Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
- Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
- Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
- Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
- Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).
