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Cancer Research

अग्नाशय के कैंसर के मॉडल के लिए सिंजेनिक माउस ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट्स

Published: October 4, 2022 doi: 10.3791/64253
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3,4, *1,2,3, *1,2,3
1Division of Translational Cancer Research, German Cancer Research Center (DKFZ) and German Cancer Consortium (DKTK), 2Translational Cancer Research and Institute of Experimental Cancer Therapy, Klinikum rechts der Isar, School of Medicine, Technical University of Munich, 3Center for Translational Cancer Research (TranslaTUM), School of Medicine, Technical University of Munich, 4Department of Internal Medicine II, Klinikum rechts der Isar, Technical University of Munich
* These authors contributed equally

Summary

अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) के सिंजेनिक माउस ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट्स रोग उपप्रकारों के जीव विज्ञान, फेनोटाइप और चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं को पुन: उत्पन्न करते हैं। उनकी तेज, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ट्यूमर प्रगति के कारण, वे प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। यहां, हम इन मॉडलों को उत्पन्न करने के लिए सामान्य प्रथाओं को दिखाते हैं, अग्न्याशय में सिंजेनिक मुराइन पीडीएसी संस्कृतियों को इंजेक्ट करते हैं।

Abstract

अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) एक बहुत ही जटिल बीमारी है जो एक विषम ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की विशेषता है जो एक विविध स्ट्रोमा, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, वाहिकाओं, तंत्रिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स घटकों से बना है। वर्षों से, पीडीएसी के विभिन्न माउस मॉडल इसकी प्रगति, मेटास्टैटिक क्षमता और फेनोटाइपिक विषमता से उत्पन्न चुनौतियों का समाधान करने के लिए विकसित किए गए हैं। पीडीएसी के इम्यूनोकॉम्पिटेंट माउस ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट्स ने आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल की तुलना में अपनी तेज और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ट्यूमर प्रगति के कारण अच्छा वादा दिखाया है। इसके अलावा, ऑटोक्थोनस पीडीएसी में देखी गई जैविक विशेषताओं की नकल करने की उनकी क्षमता के साथ, सेल लाइन-आधारित ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट माउस मॉडल विवो प्रयोगों में बड़े पैमाने पर सक्षम हैं। इस प्रकार, इन मॉडलों का व्यापक रूप से तेजी से जीनोटाइप-फेनोटाइप और दवा-प्रतिक्रिया विश्लेषण के लिए प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सिंजेनिक प्राप्तकर्ता चूहों के अग्न्याशय में प्राथमिक माउस पीडीएसी सेल संस्कृतियों को सफलतापूर्वक इंजेक्ट करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत दृष्टिकोण प्रदान करना है। तकनीकी विवरणों के अलावा, महत्वपूर्ण जानकारी दी गई है जिसे इन प्रयोगों को करने से पहले विचार किया जाना चाहिए।

Introduction

हाल ही में, पीडीएसीपश्चिमी दुनिया में कैंसर से संबंधित मौतों का तीसरा प्रमुख कारण बन गया। यह सभी कैंसर में सबसे अधिक मृत्यु दर और ~ 1% की 10 साल की समग्र जीवित रहने की दर का कारण बनता है,जो दशकों से नहीं बदला है। पीडीएसी उपचार में प्रगति की कमी के कारण, यह बीमारीअगले दशक तक कैंसर से संबंधित मौतों का दूसरा प्रमुख कारण बनने की उम्मीद है।

पीडीएसी ट्यूमर एक विविध ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) की विशेषता वाली जटिल संस्थाएं हैं जो स्ट्रोमा, संवहनी, प्रतिरक्षा और बाह्यमैट्रिक्स घटकों की विषम विधानसभा से बनी होती हैं। टीएमई की संरचना में अंतर रोग के पूर्वानुमान और चिकित्सा की प्रतिक्रिया को प्रभावित करता है 4,5,6. दरअसल, कई अध्ययनों से पता चला है कि पीडीएसी का बेसल जैसा, मेसेनकाइमल उपप्रकार एक अत्यधिक इम्यूनोसप्रेसिव टीएमई से जुड़ा हुआ है और 7,8,9,10,11,12 उपचारों के लिए जीवित रहने और प्रतिक्रिया की कमी को दर्शाता है। इसलिए, टीएमई संरचना में अंतर की गहरी समझ और ये विशेषताएं ट्यूमर जीव विज्ञान को कैसे प्रभावित करती हैं, आणविक रूप से सटीक उपचारों के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण कारक बनी हुई है। इस जटिल फेनोटाइप के पीछे जीव विज्ञान को बेहतर ढंग से समझने और पीडीएसी के टीएमई की बाधा को दूर करने में सक्षम चिकित्सीय रणनीतियों की पहचान करने के लिए, विवो मॉडल में अपरिहार्य हैं।

किसी भी कैंसर प्रीक्लिनिकल मॉडल सिस्टम के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि इसे मानव फेनोटाइप्स की नकल करनी चाहिए, आनुवंशिक विषमता और टीएमई बनाने वाले स्ट्रोमल और प्रतिरक्षा आबादी की भीड़ को शामिल करने वाले परिवेश दोनों को पुन: परिभाषित करना चाहिए। इसलिए, प्रीक्लिनिकल अनुसंधान के लिए माउस मॉडल चुनते समय, कई पहलुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। ट्यूमर-प्रतिरक्षा बातचीत की जांच करने के लिए, हिस्टोकम्पैटिबल कैंसर सेल लाइनों को सिंजेनिक इम्यूनोसक्षम चूहों में इंजेक्ट किया जा सकता है। ज्यादातर मामलों में, इन्हें माउस के फ्लैंक में चमड़े के नीचे इंजेक्ट किया जाता है, जिससे पैल्पेशन या दृश्य निरीक्षण द्वारा आसान ट्यूमर की निगरानी की जा सकती है। हालांकि, परिणामी मॉडल उनके मूल अंग में ट्यूमर कोशिकाओं के विकास की नकल नहीं करते हैं। इसलिए, ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण एलोग्राफ्ट मॉडल के लिए स्वर्ण मानक बन गया।

माउस ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट्स के कई फायदे हैं: वे लागत प्रभावी हैं, अपेक्षाकृत सरल प्रक्रिया के साथ उत्पन्न किए जा सकते हैं, और इसके परिणामस्वरूप ज्ञात आणविक मेकअप के साथ-साथ एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और अनुमानित ट्यूमर प्रगति और फेनोटाइप के साथ मॉडल होते हैं। दरअसल, जबकि रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मॉडल मानव पीडीएसी कोशिकाओं के व्यवहार का सटीक रूप से प्रतिनिधित्व करते हैं, ग्राफ्ट अस्वीकृति से बचने के लिए इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों में आरोपण की आवश्यकता ट्यूमर-प्रतिरक्षा और ट्यूमर-स्ट्रोमा इंटरैक्शन के विश्लेषण को सीमित करती है, जिससे शोधकर्ताओं को इन ट्यूमर की जटिलता की केवल आंशिक छवि को पकड़ने की अनुमति मिलती है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (जीईएमएम) की तुलना में पीडीएसी के सिंजेनिक ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट ्स इस संबंध में भी एक लाभ रखते हैं। जीईएमएम मानव पीडीएसी ट्यूमरजेनिसिस और पीडीएसी रोगियों में देखी गई विषमता को सटीक रूप से पुन: परिभाषित करता है। हालांकि, इन विशेषताओं के कारण, जीईएमएम ट्यूमर अपने आनुवंशिक मेकअप, ट्यूमर प्रगति, आक्रामकता, हिस्टोलॉजिकल भेदभाव और टीएमई संरचना में उच्च भिन्नता दिखा सकते हैं। हालांकि यह कुछ अध्ययनों में एक फायदा हो सकता है, यह जीनोटाइप-टू-फेनोटाइप अध्ययन और पीडीएसी फेनोटाइप13 की केंद्रित जांच को सीमित करता है। इसलिए, माउस ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट्स विवो में ट्यूमर-होस्ट और उपचार अध्ययन करने के लिए एक अच्छा व्यापार और मॉडल बनाते हैं। यह पेपर माउस अग्न्याशय में मुराइन पीडीएसी कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण प्रयोगों के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करता है।

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Protocol

पशु प्रयोगों को म्यूनिख के तकनीकी विश्वविद्यालय और रेगीरुंग वॉन ओबेरबायर्न के स्थानीय अधिकारियों की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. प्रक्रिया से पहले विचार करने के लिए जानकारी

  1. किसी भी पशु प्रयोग को शुरू करने से पहले स्थानीय अधिकारियों द्वारा पशु प्रोटोकॉल और कर्मियों का अनुमोदन सुनिश्चित करें।
  2. प्राप्तकर्ता चूहों का चयन करें।
    1. प्रत्यारोपण के लिए समान उम्र के चूहों का चयन करें (सी 57बीएल / 6 जे प्राप्तकर्ता चूहे 2 महीने और 4 महीने के बीच आयु सीमा के साथ)।
    2. सुनिश्चित करें कि प्राप्तकर्ता जानवरों की लिंग और आनुवंशिक पृष्ठभूमि उन जानवरों के लिंग और आनुवंशिक पृष्ठभूमि से मेल खाती है जिनसे आरोपण के लिए उपयोग की जाने वाली सेल लाइन उत्पन्न हुई थी (सिंजेनिक एलोग्राफ्ट्स)।
  3. आरोपण के लिए चूहों को तैयार करें।
    नोट: स्थानीय पशु सुविधा के स्वच्छता मानकों के अनुसार चूहों को संभालें।
    1. प्रत्यारोपण के दिन, एनेस्थेटिक्स के प्रशासन के कारण जटिलताओं से बचने के लिए प्रक्रिया से 4 घंटे पहले चूहों को न खिलाएं।
    2. आवश्यक एनेस्थेटिक्स की मात्रा की गणना करने के लिए आरोपण से पहले चूहों का वजन करें।
    3. चूहों को ऑपरेशन कक्ष में स्थानांतरित करें।
  4. PDAC सेल लाइनों का चयन करें।
    1. सुनिश्चित करें कि चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि और लिंग जिसमें से सेल लाइनें प्राप्त होती हैं, प्राप्तकर्ता चूहों की पृष्ठभूमि और लिंग से मेल खाती हैं (उदाहरण के लिए, पीडीएसी सेल लाइनें पीडीएसी 1-3 पहले निम्नलिखित जीनोटाइप के साथ प्रयोगशाला में सी 57बीएल /6 जे पृष्ठभूमि पर पीडीएसी जीईएमएम से उत्पन्न होती हैं, जैसा कि पहले वर्णित है14: पीडीएसी 1 और 2: PTF1a Cre / +; LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: PTF1aCre/+; LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53 R172H/R172H)।
    2. उन सेल लाइनों का चयन करें जो प्रोटीन को व्यक्त नहीं करते हैं जो संभावित इम्युनोजेनिक हैं।
  5. पीडीएसी सेल लाइनों को कल्चर करें।
    नोट: एक लामिनर प्रवाह हुड के तहत सेल संस्कृति कार्य करें। काम करने से पहले दस्ताने, काम करने की जगह और सामग्री को कीटाणुरहित करें।
    1. सेल कल्चर माध्यम के 5 एमएल में गोली को निलंबित करके प्रत्यारोपण से 1 सप्ताह पहले कोशिकाओं को पिघलाएं। कोशिकाओं को नीचे घुमाएं, सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, 5 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में गोली को फिर से निलंबित करें, और कोशिकाओं को फिर से घुमाएं। सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 0.1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पीएस) के साथ डलबेकको के संशोधित ईगल ्स मीडियम (डीएमईएम) के 5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। सेल सस्पेंशन को 25 सेमी² फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
    2. प्रत्यारोपण से पहले कम से कम एक बार सेल लाइनों को पारित करें।
      1. सेल माध्यम को हटा दें, पीबीएस के साथ 1x धोएं, और फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 0.5 मिलीलीटर ट्रिप्सिन जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें जब तक कि वे फ्लास्क से अलग न हो जाएं (सेल लाइन के आधार पर, इसमें आमतौर पर 5-10 मिनट लगते हैं)। जब कोशिकाओं को अलग किया जाता है, तो 10% एफबीएस और 0.1% पीएस के साथ डीएमईएम के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सेल निलंबन को 75 सेमी² फ्लास्क में स्थानांतरित करें।
        नोट: जैसा कि एफबीएस ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करता है, यह ट्रिप्सिनाइजेशन में बाधा डालेगा।
    3. प्रत्यारोपण के दिन ~ 70% -80% की स्थिरता सुनिश्चित करें।
  6. आरोपण के लिए आवश्यक सामग्री
    1. सभी सर्जिकल उपकरणों को ऑटोक्लेव करें।
    2. पशु प्रयोग लाइसेंस के आधार पर एनेस्थेटिक्स तैयार रखें।
      1. एंटी-इंफ्लेमेटरी गुणों के साथ लंबे समय तक चलने वाले एनाल्जेटिक के रूप में कम से कम 5 मिनट पहले एनाल्जेसिया के लिए मेलोक्सिकैम का उपयोग करें।
      2. सर्जरी के लिए, एनाल्गोसेडेशन के लिए मिडाज़ोलम, मेडेटोमिडीन और फेंटेनिल (एमएमएफ) के संयोजन का उपयोग करें।
      3. प्रत्यारोपण के बाद एमएमएफ एनाल्गोसेडेशन को रोकने के लिए एटिपामेज़ोल, फ्लुमाज़ेनिल और नालोक्सोन (एएफएन) के संयोजन का उपयोग करें।
    3. एक बाँझ ड्रेप, एक हीटिंग मैट, एक शेवर, दस्ताने, आंखों की क्रीम, 0.9% सोडियम क्लोराइड, आयोडीन या क्लोरहेक्सिडिन-आधारित सर्जिकल स्क्रब, 80% इथेनॉल, घुलनशील सीवन, घाव क्लिप, 50 μL इंजेक्शन वॉल्यूम सिरिंज और टेप तैयार करें।

2. आरोपण से पहले सेल लाइनों को तैयार करना

नोट: ट्यूमर कोशिकाओं को केवल तभी तैयार करें जब चूहे आरोपण के लिए तैयार हों। कोशिकाओं की कटाई या संग्रह और आरोपण के बीच एक छोटी समय सीमा सुनिश्चित करें।

  1. उपयोग करने से पहले सभी तरल पदार्थों को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. चरण 1.5.2.1 में वर्णित कोशिकाओं (1x T75 (75 सेमी2 कल्चर फ्लास्क) से शुरू होकर) तैयार करें जब तक कि वे फ्लास्क से अलग न हो जाएं। 10% एफबीएस और 0.1% पीएस के साथ डीएमईएम के 10 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सेल निलंबन को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. एक सेंट्रीफ्यूज में 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर कोशिकाओं को घुमाएं। सुपरनैटेंट को एस्पिरेट करें और इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं की आवश्यक अंतिम एकाग्रता के आधार पर एडिटिव्स के बिना डीएमईएम की पर्याप्त मात्रा में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। न्यूबॉयर कक्ष का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करने और उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए सेल निलंबन के 10 μL का उपयोग करें।
  4. एडिटिव्स के बिना डीएमईएम में इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं की अंतिम आवश्यक संख्या (जैसे, 20 μL में 2,500 कोशिकाएं) तक कोशिकाओं को पतला करें। पतला सेल निलंबन के 1 एमएल को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को एकत्रित होने से रोकने के लिए आरोपण तक ट्यूब को एक घूर्णन पर रखें।

3. पीडीएसी कोशिकाओं का ऑर्थोटोपिक आरोपण।

नोट: अपर्याप्त शल्य चिकित्सा अनुभव के मामले में, पहले शवों के साथ अभ्यास करें और पर्याप्त प्रशिक्षण प्राप्त करें, उदाहरण के लिए, एक पशु प्रशिक्षण प्रोटोकॉल के भीतर। सर्जरी और पशु प्रयोग करने वाले कर्मियों को संबंधित अधिकारियों के मानदंडों और संस्थागत दिशानिर्देशों को पूरा करने की आवश्यकता होती है।

  1. पेरीओपरेटिव एनाल्जेसिक के रूप में मेलॉक्सिकैम का उपयोग करें और शरीर के वजन को चमड़े के नीचे लागू करें।
  2. इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रत्येक माउस के शरीर के वजन के अनुसार एमएमएफ इंजेक्ट करें (मिडाज़ोलम [5.0 मिलीग्राम / किग्रा], मेडेटोमिडिन [0.5 मिलीग्राम / किग्रा], और फेंटानिल [0.05 मिलीग्राम / किग्रा])।
  3. माउस को 10-15 मिनट के लिए पिंजरे में वापस रखें।
  4. जब माउस सो रहा हो तो आई क्रीम लगाएं।
    1. पेडल विदड्रॉल रिफ्लेक्स (दोनों पिछले पैरों के पैर पैड पर चुटकी) का परीक्षण करके 10 मिनट के बाद पर्याप्त एनाल्गोसेडेशन की जांच करें। प्रतिक्रिया के मामले में, एनाल्गोसेडेशन की मूल खुराक का 1/3 लागू करें। 10 मिनट के बाद, प्रक्रिया को दोहराएं और पेडल वापसी रिफ्लेक्स की अनुपस्थिति में ही आगे बढ़ें।
  5. माउस के बाएं पार्श्व पेट के फ्लैंक को शेव करें। एक बाँझ हीटिंग मैट पर दाईं ओर लेटे हुए माउस को रखें और उसके पैरों को सतह पर टेप करें। आयोडीन या क्लोरहेक्सिडाइन-आधारित सर्जिकल स्क्रब का उपयोग करके पेट को कीटाणुरहित करें, इसके बाद एक परिपत्र गति में 80% इथेनॉल लें और प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं। सर्जिकल क्षेत्र की बाँझपन बनाए रखने के लिए, सर्जिकल ड्रेप का उपयोग करें।
  6. नए दस्ताने पहनें और उन्हें कीटाणुरहित करें। बाएं फ्लैंक पर त्वचा और चमड़े के नीचे के वसा ऊतक को अनुदैर्ध्य रूप से काटने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें जहां प्लीहा का अनुमान लगाया जाता है। लंबाई में लगभग 1 सेमी का कट करें।
  7. कैंची और बल का उपयोग करके, पेरिटोनियम तक आसान पहुंच प्राप्त करने के लिए पेरिटोनियम से त्वचा को अलग करें।
  8. कैंची की जोड़ी बदलें। 1 सेमी अनुदैर्ध्य कट के साथ प्लीहा के स्थान पर पेरिटोनियम खोलें।
  9. कुंद, बारीक बल का उपयोग करके प्लीहा और संलग्न अग्न्याशय को जुटाएं। सुनिश्चित करें कि अंग अन्य ऊतक से जुड़े नहीं हैं और अग्न्याशय को संभालते समय वाहिकाओं या आसपास के ऊतक को घायल करने से बचने के लिए रक्त वाहिकाओं की आपूर्ति की जांच करें।
    नोट: रक्तस्राव को रोकने के लिए सीधे प्लीहा को न पकड़ें।
  10. अंग की पूंछ तक आसान पहुंच को सक्षम करने और अग्न्याशय के बाद प्लीहा का निरीक्षण करने के लिए अग्न्याशय को चीरे से सावधानीपूर्वक बाहर निकालें। अग्न्याशय को बल के साथ पकड़ने के लिए गैर-प्रमुख हाथ का उपयोग करें और सावधानी से स्नायुबंधन को काटें जो अग्न्याशय को एक्स्ट्राकॉर्पोरलाइजेशन से रोकते हैं। सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन के दौरान अंग को मोड़ा नहीं जाता है और अंग के कैप्सूल को फैलने से बचने के लिए सुई प्रवेश की साइट पर तनाव में रखा जाता है।
  11. इंजेक्शन को पूरा करने के लिए प्रमुख हाथ का उपयोग करें। अंग के अनुदैर्ध्य अक्ष के बाद सिरिंज की सुई के साथ अंग के कैप्सूल में सावधानीपूर्वक प्रवेश करें। किसी पोत में पंचरिंग या इंजेक्शन के जोखिम को कम करने के लिए दिखाई देने वाली रक्त वाहिकाओं के बीच अग्नाशय के ऊतकों के एक टुकड़े का लक्ष्य रखें। धीरे-धीरे प्रयोगात्मक योजना के अनुसार पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को इंजेक्ट करें (यहां, डीएमईएम के 20 μL में 2,500 कोशिकाएं) अग्न्याशय के पूंछ क्षेत्र में 27 ग्राम कैनुला और 50 μL सिरिंज के साथ।
    नोट: ऊतक में सफल इंजेक्शन पर एक पारदर्शी बुलबुला बनता है।
  12. ट्यूमर कोशिकाओं के फैलने से बचने के लिए अग्न्याशय और सम्मिलित सिरिंज को लगभग 1 मिनट तक रखें। इंजेक्शन साइट से सुई को सावधानी से निकालें।
    नोट: चूहों के बीच सुइयों को बदलें और एक नई सेल लाइन के इंजेक्शन के लिए एक नई बाँझ सिरिंज का उपयोग करें।
  13. पेट के अंदर के अंगों को सावधानी से पुनर्व्यवस्थित करें। कोशिकाओं के फैलने से बचने के लिए ऊतक को चोट न पहुंचाने का ध्यान रखें। अंग आसंजन से बचने के लिए अंगों पर 0.9% सोडियम क्लोराइड का 1 मिलीलीटर डालें।
  14. सरल बाधित सीवन तकनीक का उपयोग करके पेरिटोनियम को सावधानीपूर्वक सीवन करें और दो से तीन 9 मिमी स्टेनलेस स्टील घाव क्लिप का उपयोग करके त्वचा को बंद करें।
    नोट: यदि सर्जिकल चीरा ठीक हो गया है तो प्रत्यारोपण के 7 दिन बाद घाव क्लिप को हटा दें।
  15. यदि आवश्यक हो, तो प्रक्रिया और संज्ञाहरण के कारण जानवरों के निर्जलीकरण को 0.5 एमएल सोडियम क्लोराइड को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करके रोकें।
  16. प्रत्यारोपण के बाद, माउस के शरीर के वजन के अनुसार, एएफएन (एटिपामेज़ोल [2.5 मिलीग्राम / किग्रा], फ्लुमाजेनिल [0.5 मिलीग्राम / किग्रा], नालोक्सन [1.2 मिलीग्राम / किग्रा]) के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ एमएमएफ द्वारा एनाल्गोसेडेशन का विरोध करें।
  17. माउस को 37 डिग्री सेल्सियस गर्म कक्ष में रखें जब तक कि यह जागृत और पूरी तरह से सक्रिय न हो जाए। फिर, माउस को उसके मूल पिंजरे में वापस रखें। फर, त्वचा के रंग और गतिविधि की जांच करके माउस की स्वास्थ्य स्थिति की निगरानी करें और सर्जरी के बाद इसे 3-4 घंटे दोहराएं।

4. चूहों के लिए देखभाल

  1. पशु सुविधा में वापस आने पर चूहों को पानी और भोजन तक पहुंच दें।
  2. सर्जरी के बाद 2-3 दिनों के लिए हर 6-12 घंटे में मेलॉक्सिकैम (5 मिलीग्राम / किग्रा) के चमड़े के नीचे या मौखिक आवेदन जारी रखें।
  3. पशु प्रोटोकॉल और संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार नियमित रूप से चूहों की स्वास्थ्य स्थिति की निगरानी करें।
  4. प्रयोग के लक्ष्य के आधार पर, पैल्पेटिंग, अल्ट्रासाउंड इमेजिंग, बायोल्यूमिनेसेंस (बीएलआई), या चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) द्वारा हर हफ्ते या अधिक बार ट्यूमर के विकास की निगरानी करें।
    नोट: पसंद की विधि, विकास दर और प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या के आधार पर, इंजेक्शन के 1 सप्ताह बाद एक ट्यूमर का पता लगाया जा सकता है।

5. ट्यूमर ग्राफ्ट की कटाई

  1. प्रयोग के अंत में ट्यूमर की कटाई करें या जब चूहों को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों या पशु प्रयोग लाइसेंस के मानदंडों का पालन करते हुए इच्छामृत्यु की आवश्यकता हो।
  2. पशु प्रयोग लाइसेंस द्वारा अनुमत विधि का उपयोग करके माउस को इच्छामृत्यु करें।
    नोट: इस्किमिया समय को कम करने के लिए न्यूनतम समय हानि के साथ कदम उठाएं। इसलिए, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था की सिफारिश की जाती है क्योंकि यह एक त्वरित विधि है और टर्मिनल रक्तस्राव या रासायनिक तरीकों के विपरीत मृत्यु का समय बिल्कुल निर्धारित किया जा सकता है।
  3. माउस को एक बाँझ चटाई पर रखें और उसके पैरों को सतह पर टेप करें। पेट को कीटाणुरहित करने के लिए 80% इथेनॉल का उपयोग करें।
  4. नए दस्ताने पहनें और उन्हें कीटाणुरहित करें। केंद्रीय पेट पर त्वचा को अनुदैर्ध्य रूप से काटने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें।
  5. कैंची और बल का उपयोग करके, पेरिटोनियम तक आसान पहुंच प्राप्त करने के लिए पेरिटोनियम से त्वचा को अलग करें।
  6. कैंची की जोड़ी बदलें। 5 सेमी अनुदैर्ध्य कट के साथ केंद्रीय पेट पर पेरिटोनियम खोलें।
  7. कुंद, बारीक बल का उपयोग करके प्लीहा और संलग्न अग्न्याशय को जुटाएं। बल और सर्जिकल कैंची का उपयोग करके ट्यूमर को आसपास के ऊतक से सावधानीपूर्वक अलग करें।
  8. डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए उपयुक्त माध्यम में ट्यूमर ऊतक को स्टोर करें। ऊतकों को तुरंत संसाधित करें या, यदि आवश्यक हो, तो आगे की प्रक्रिया तक अधिकतम 6 घंटे के लिए नमूने को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

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Representative Results

एक बड़े पैमाने पर दवा-प्रतिक्रिया अध्ययन के संदर्भ में, हमने उपरोक्त वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके 170 से अधिक चूहों (सी 75बीएल 6 / जे प्राप्तकर्ता चूहों, पुरुष और महिला चूहों के लिंग को पीडीएसी सेल लाइनों इंजेक्शन से मिलाया) को सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित किया, जिसका उदाहरण चित्र 112 में इसके मुख्य चरणों में दिया गया है। इस प्रोटोकॉल में, हमने ऑर्थोटोपिकल रूप से तीन क्रासजी 12 डी-संचालित पीडीएसी सेल लाइनों (पीडीएसी 1 और 2: पीटीएफ 1 एसीआरई / +; LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: PTF1aCre/+; LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / R172H, जो पहले प्रयोगशाला में उत्पन्न हुए थे। पीडीएसी कोशिकाओं के एनग्राफमेंट को सर्जरी के लगभग 7 दिनों के बाद पेट से जल्दी निकाला जा सकता है, जो इंजेक्शन वाली सेल संख्या और टीका लगाए गए सेल लाइन की आक्रामकता और विकास विशेषताओं पर निर्भर करता है। एमआरआई (चित्रा 2 ए), अल्ट्रासाउंड, और माउस पेट के बीएलआई का उपयोग ट्यूमर की मात्रा के मात्रात्मक माप के लिए किया जा सकता है। सेल लाइनों की ट्यूमर सेल-आंतरिक विशेषताओं के आधार पर, परिणामी प्रत्यारोपित चूहों का अस्तित्व भिन्न हो सकता है (चित्रा 2 बी)। सफल इंट्रापैनक्रिएटिक इंजेक्शन माउस अग्न्याशय (चित्रा 2 सी, डी) में पूर्ण विकसित ट्यूमर का कारण बनते हैं। इसके विपरीत, असफल आरोपण के परिणामस्वरूप अग्नाशय ी ट्यूमर की अनुपस्थिति हो सकती है क्योंकि ए) गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं का इंजेक्शन, बी) प्रत्यारोपित कोशिकाओं की अस्वीकृति (उदाहरण के लिए, यदि कोशिकाएं प्राप्तकर्ता माउस के लिए सिंजेनिक नहीं थीं), या सी) इंजेक्शन वाली कोशिकाओं की अपर्याप्त संख्या। वैकल्पिक नकारात्मक परिणाम अग्न्याशय में एक प्राथमिक ट्यूमर की अनुपस्थिति का कारण बन सकते हैं, लेकिन पेरिटोनियम में एक ट्यूमर की उपस्थिति, इंजेक्शन की साइट के अनुरूप (उदाहरण के लिए, अग्नाशय ी इंजेक्शन साइट से ट्यूमर सेल निलंबन के फैलाव के माध्यम से)।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल के मुख्य चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (ए) पीडीएसी कोशिकाओं को प्रत्यारोपण से पहले कम से कम एक बार पारित किया जाना चाहिए। (बी) कोशिकाओं को फ्लास्क से अलग करने के लिए ट्रिप्सिनाइज्ड किया जाता है, 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है, और गिना जाता है। (सी) उपयुक्त सेल कमजोर पड़ने को एक ट्यूब में रखा जाता है और आरोपण कक्ष में लाया जाता है। (डी) प्राप्तकर्ता माउस को उस क्षेत्र में एनेस्थेटाइज्ड, शेव और कीटाणुरहित किया जाता है जहां सर्जरी होगी। (ई) अग्न्याशय पूंछ स्थान के अनुरूप माउस पेट में 1 सेमी कट किया जाता है। (एफ) अग्न्याशय की पूंछ में वांछित संख्या में कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है। संक्षिप्त नाम: पीडीएसी = अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सिंजेनिक माउस ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट्स पर सफल परिणामों के उदाहरण। (ए) प्राथमिक माउस पीडीएसी कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण के 2 सप्ताह बाद माउस का प्रतिनिधि एमआरआई। डैश्ड आउटलाइन ट्यूमर को दर्शाता है। स्केल बार = 5 मिमी (बी) तीन अलग-अलग माउस पीडीएसी सेल लाइनों (पीडीएसी 1-3) के कपलान-मीयर उत्तरजीविता वक्र को सिंजेनिक इम्यूनोसक्षम चूहों (सी 57बीएल / 6 जे पृष्ठभूमि) के अग्न्याशय में ऑर्थोटोपिकल रूप से प्रत्यारोपित किया गया। (सी) ऑर्थोटोपिकल रूप से इंजेक्ट किए गए पीडीएसी 1 सेल लाइन से एंडपॉइंट पर अलग किए गए ट्यूमर की प्रतिनिधि छवि। ट्यूमर कोशिकाओं और प्लीहा के सफल इंट्रापैनक्रिएटिक इंजेक्शन से उत्पन्न अग्नाशय ी ट्यूमर दोनों को तस्वीर में दिखाया गया है। स्केल बार = 5 मिमी (डी) बारप्लॉट पीडीएसी 1-3 से ऑर्थोटोपिकल रूप से प्रत्यारोपित ट्यूमर के औसत ट्यूमर वजन को दर्शाता है। डॉट्स व्यक्तिगत चूहों का प्रतिनिधित्व करते हैं। संक्षेप: पीडीएसी = अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा; एमआरआई = चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सिंजेनिक माउस ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट्स उनकी लागत-प्रभावशीलता, प्रजनन क्षमता और अपेक्षाकृत सरलप्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के कारण प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए एक मजबूत मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। ये मॉडल न केवल ट्यूमर-होस्ट इंटरैक्शन के अध्ययन की अनुमति देते हैं, बल्कि ट्यूमर की आनुवंशिक विषमता के संरक्षण की गारंटी भी देते हैं जब प्रयोग के लिए प्राथमिक माउस सेल संस्कृतियों का उपयोग किया जाता है।

यह प्रोटोकॉल अग्न्याशय में माउस पीडीएसी सेल संस्कृतियों के ऑर्थोटोपिक आरोपण के लिए एक सरल और तेज़ प्रक्रिया प्रस्तुत करता है। प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए, सर्जिकल तकनीक की गुणवत्ता सहित कई तकनीकी विचारों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। चूंकि सर्जिकल प्रथाएं भिन्न होती हैं, इसलिए यह सलाह दी जाती है कि एक व्यक्ति एक ही प्रयोग के भीतर सभी ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन करता है।

अग्न्याशय में कोशिकाओं का इंजेक्शन सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। फैली हुई कोशिकाएं, अग्न्याशय को छेदना, या ऊतक को घायल करना कोशिकाओं को अग्न्याशय के बाहर अन्य अंग स्थलों पर संलग्न करने का कारण बन सकता है। यह प्राथमिक ट्यूमर के नैदानिक मूल्यांकन (जैसे, आकार और स्थानीय घुसपैठ) को जटिल कर सकता है, साथ ही साथ इसके स्थानीय और दूर के मेटास्टैटिक प्रसार को भी जटिल कर सकता है। इसलिए, प्रत्येक प्रत्यारोपित माउस के लिए बुलबुला गठन और सेल स्पिलेज के बारे में किसी भी जानकारी का दस्तावेजीकरण और आकलन करने की सिफारिश की जाती है। त्वचा और पेरिटोनियम में कटौती उचित आकार में की जानी चाहिए ताकि घावों को यथासंभव छोटा रखते हुए अग्न्याशय तक इष्टतम पहुंच हो सके।

प्रयोगात्मक योजना के आधार पर प्रत्यारोपित कोशिकाओं की संख्या को समायोजित किया जा सकता है। जबकि प्रत्यारोपित कोशिकाओं की बड़ी संख्या शारीरिक रूप से तेजी से बढ़ते ट्यूमर और नैदानिक लक्षणों की तेजी से प्रगति का कारण बनती है, छोटी सेल संख्या इस जोखिम को बढ़ाती है कि ट्यूमर एन्ग्राफ्ट नहीं करेंगे। इसके अलावा, सेल निलंबन की छोटी मात्रा की सिफारिश की जाती है क्योंकि बड़ी मात्रा (>20 μL) सिस्टिक कोर13 के गठन की बढ़ती क्षमता से जुड़ी होती है। हमने पाया कि सेल कल्चर माध्यम के 20 μL की मात्रा में 2,500-5,000 कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करना कई हफ्तों में ट्यूमर के विकास को सुनिश्चित करके प्रीक्लिनिकल चिकित्सीय अध्ययन के लिए एक इष्टतम राशि है। हालांकि, अन्य अनुप्रयोगों के लिए, 1.6 × 106 कोशिकाओं तक प्रत्यारोपित किया जा सकता है।

सेल कल्चर माध्यम के अलावा, मैट्रिगेल का उपयोग पीडीएसी कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए पोषक तत्वों से भरपूर माध्यम के रूप में किया जा सकता है, जो इंजेक्शन समाधान की चिपचिपाहट को भी बढ़ाता है, जिससेट्यूमर कोशिकाओं के रिसाव को रोका जा सकता है। अग्न्याशय के पूंछ क्षेत्र में इंजेक्शन को इस प्रोटोकॉल के साथ पसंद किया जाता है क्योंकि अग्न्याशय की पूंछ आसानी से सुलभ है और अग्न्याशय सिर तक पहुंच सीमित है। अग्न्याशय सिर में कोशिकाओं को सफलतापूर्वक इंजेक्ट करने के लिए प्रोटोकॉल कहीं और वर्णित हैं13,15. सर्जिकल प्रक्रिया करने के लिए, चूहों को एक दवा संयोजन का उपयोग करके एनाल्गोसेडेशन के तहत रखा जाता है, जिसमें मिडाज़ोलम, मेडेटोमिडिन और फेंटेनाइल शामिल हैं, साथ ही साथ मेलॉक्सिकैम एक पेरी- और पोस्टऑपरेटिव एनाल्जेसिक के रूप में है। वैकल्पिक रूप से, उचित एनाल्जेसिक के साथ संयोजन में आइसोफ्लुरेन का उपयोग निरंतर प्रवाह के तहत इनहेलेंट संज्ञाहरण के रूप में किया जा सकता है। पशु लाइसेंस के लिए पसंद की एनाल्गोसेडेशन विधि का चयन संस्थागत दिशानिर्देशों और संबंधित स्थानीय अधिकारियों पर निर्भर करता है।

सेल लाइनों और प्राप्तकर्ता चूहों का सावधानीपूर्वक चयन अनिवार्य है। दरअसल, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि प्राप्तकर्ता चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि पीडीएसी कोशिकाओं की इम्युनोजेनेसिटी और ग्राफ्ट अस्वीकृति से बचने के लिए चयनित सेल लाइनों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि से मेल खाती है। इसके अलावा, इम्युनोजेनिक बहिर्जात प्रोटीन, जैसे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर एलील्स या कैस 9, प्रत्यारोपित ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा व्यक्त मेजबान की प्रतिक्रिया को प्रभावित करते हैं और एक इम्युनोजेनिक प्रतिक्रिया का कारण बन सकते हैं। इसलिए, ट्यूमर की वृद्धि और टीएमई की संरचना प्रभावित हो सकती है और पूर्वाग्रह का कारण बन सकती है।

जीईएमएम की तुलना में, सिंजेनिक ऑर्थोटोपिक माउस एलोग्राफ्ट्स डेस्मोप्लासिया की कम मात्रा दिखाते हैं और, कुछ उदाहरणों में, मेटास्टैटिक प्रसार की कम दर, आंशिक रूप से, मानव ट्यूमर की समानता को सीमित करते हैं। इसके अलावा, सर्जिकल हस्तक्षेप की आवश्यकता प्रक्रिया की जटिलता को बढ़ाती है। असफल प्रत्यारोपण के परिणामस्वरूप गैर-व्यवहार्य सेल इंजेक्शन के कारण वांछित स्थान पर अग्नाशय के ट्यूमर की अनुपस्थिति, प्रत्यारोपित कोशिकाओं की अस्वीकृति, इंजेक्शन कोशिकाओं की कम संख्या और इंजेक्शन रिसाव प्रयोगात्मक प्रक्रिया को पूरा करने से रोक सकते हैं।

इन सीमाओं के बावजूद, पीडीएसी के सिंजेनिक ऑर्थोटोपिक माउस एलोग्राफ्ट मॉडल को पीडीएसी और इसकी विषमता का अध्ययन करने की कई चुनौतियों को प्रभावी ढंग से संबोधित करने के लिए दिखाया गया है। उनके अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फेनोटाइप और ट्यूमर विकास पैटर्न के साथ-साथ ट्यूमर-टीएमई इंटरैक्शन के साथ, वे एक अमूल्य संसाधन का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसे अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल के बाद जल्दी से प्राप्त किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम टीयूएम पशु सुविधा और परमाणु चिकित्सा विभाग की इमेजिंग कोर सुविधा, क्लिनिकम रेच्ट्स डेर इसर को उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस अध्ययन को जर्मन कैंसर कंसोर्टियम (डीकेटीके), ड्यूश फोर्सचुंगस्जेमिनशाफ्ट (डीएफजी एसए 1374/4-2, डीएफजी एसए 1374/6-1, एसएफबी 1321 प्रोजेक्ट-आईडी 329628492 पी06, पी 11 और एस01) द्वारा डी.एस., विल्हेम सैंडर-स्टिफटंग (2020.174.1 और 2017.091.2) द्वारा समर्थित किया गया था 648521।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
27 G cannula B.Braun 08915992
Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) Orion Corporation 23554.00.00
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm Braintree Scientific NC9334081
Dulbecco`s Modified Eagle Medium  Sigma-Aldrich D5796-500ML
Eye cream (Bepanthen) Bayer Vital GmbH 1578675
FBS Sigma-Aldrich S0615
Fentanyl (50 µg/mL) Eurovet Animal Health BV 9113473
Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) Hameln pharma 09611975
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) Eurovet Animal Health BV 400926.00.00
Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH 3937902
Microliter syringe Hamilton HT80908
Midazolam (5 mg/mL) Hexal 00886423
NaCl B. Braun 2737756
Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) hameln pharma 04464535
PBS Sigma-Aldrich P7059-1L
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100ML
Suture (Ethilon) Ethicon 9999034
TrypZean Solution 1x Sigma-Aldrich T3449

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References

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Schmitt, C., Saur, D., Bärthel, … More

Schmitt, C., Saur, D., Bärthel, S., Falcomatà, C. Syngeneic Mouse Orthotopic Allografts to Model Pancreatic Cancer. J. Vis. Exp. (188), e64253, doi:10.3791/64253 (2022).

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