Summary
Syngena ortotopiska allotransplantat från mus av pankreas duktalt adenokarcinom (PDAC) rekapitulerar biologin, fenotyperna och terapeutiska svaren hos sjukdomssubtyper. På grund av deras snabba, reproducerbara tumörprogression används de ofta i prekliniska studier. Här visar vi vanliga metoder för att generera dessa modeller, injicera syngena murina PDAC-kulturer i bukspottkörteln.
Abstract
Pankreas duktalt adenokarcinom (PDAC) är en mycket komplex sjukdom som kännetecknas av en heterogen tumörmikromiljö som består av ett varierat stroma, immunceller, kärl, nerver och extracellulära matriskomponenter. Under årens lopp har olika musmodeller av PDAC utvecklats för att hantera de utmaningar som dess progression, metastatiska potential och fenotypiska heterogenitet ställer. Immunkompetenta musortotopiska allotransplantat av PDAC har visat gott löfte på grund av deras snabba och reproducerbara tumörprogression jämfört med genetiskt modifierade musmodeller. Dessutom, i kombination med deras förmåga att efterlikna de biologiska egenskaper som observerats i autokton PDAC, möjliggör cellinjebaserade ortotopiska allograftmusmodeller storskaliga in vivo-experiment . Således används dessa modeller i stor utsträckning i prekliniska studier för snabba genotyp-fenotyp- och läkemedelsresponsanalyser. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla ett reproducerbart och robust tillvägagångssätt för att framgångsrikt injicera primära PDAC-cellkulturer i musen hos syngena mottagarmöss. Förutom de tekniska detaljerna ges viktig information som måste beaktas innan dessa experiment utförs.
Introduction
Nyligen blev PDAC den tredje ledande orsaken till cancerrelaterade dödsfall i västvärlden1. Det orsakar den högsta dödligheten bland alla cancerformer och en 10-årig total överlevnad på ~ 1%, vilket inte har förändrats i årtionden2. På grund av bristen på framsteg i PDAC-behandling förväntas denna sjukdom bli den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterade dödsfall under det kommande decenniet3.
PDAC-tumörer är komplexa enheter som kännetecknas av en mångsidig tumörmikromiljö (TME) bestående av en heterogen sammansättning av stroma-, vaskulär-, immun- och extracellulära matriskomponenter4. Skillnader i TME:s sammansättning påverkar sjukdomsprognos och behandlingssvar 4,5,6. Faktum är att många studier har visat att den basalliknande, mesenkymala subtypen av PDAC är associerad med ett mycket immunsuppressivt TME och visar minskad överlevnad och brist på svar på terapier 7,8,9,10,11,12. Därför är en djupare förståelse av skillnaderna i TME-sammansättning och hur dessa egenskaper påverkar tumörbiologin fortfarande en viktig faktor för utvecklingen av molekylärt exakta terapier. För att bättre förstå biologin bakom denna komplexa fenotyp och identifiera terapeutiska strategier som kan övervinna den barriär som TME för PDAC utgör, är in vivo-modeller oumbärliga.
En viktig aspekt för alla prekliniska cancermodellsystem är att det ska efterlikna humana fenotyper och rekapitulera både den genetiska heterogeniteten och miljön som innehåller de många stroma- och immunpopulationer som utgör TME. Därför måste flera aspekter beaktas vid val av musmodeller för preklinisk forskning. För att undersöka tumör-immuninteraktionen kan histokompatibla cancercellinjer injiceras i syngena immunkompetenta möss. I de flesta fall injiceras dessa subkutant i musens flank, vilket möjliggör enkel tumörövervakning genom palpation eller visuell inspektion. De resulterande modellerna efterliknar emellertid inte tillväxten av tumörceller i deras ursprungsorgan. Därför blev ortotopiska transplantationer guldstandarden för allograftmodeller.
Musortotopiska allotransplantat har flera fördelar: de är kostnadseffektiva, kan genereras med en relativt enkel procedur och resulterar i modeller med känd molekylär smink, samt en reproducerbar och förutsägbar tumörprogression och fenotyp. Faktum är att medan patienthärledda xenograftmodeller representerar beteendet hos humana PDAC-celler exakt, begränsar behovet av implantation i immunbristfälliga möss för att undvika transplantatavstötning analysen av tumörimmun- och tumör-stroma-interaktionerna, vilket gör det möjligt för forskare att fånga endast en partiell bild av komplexiteten hos dessa tumörer. Syngena ortotopiska allotransplantat av PDAC har en fördel i detta avseende även i jämförelse med genetiskt modifierade musmodeller (GEMM). GEMM rekapitulerar noggrant human PDAC-tumörgenes och den heterogenitet som observerats hos PDAC-patienter. På grund av dessa egenskaper kan dock GEMM-tumörer uppvisa hög varians i sin genetiska sammansättning, tumörprogression, aggressivitet, histologisk differentiering och TME-sammansättning. Även om detta kan vara en fördel i vissa studier, begränsar det genotyp-till-fenotypstudier och den fokuserade undersökningen av PDAC-fenotyper13. Därför utgör ortotopiska allotransplantat på möss en bra avvägning och modell för att utföra tumörvärd- och behandlingsstudier in vivo. Detta dokument beskriver ett protokoll för ortotopiska transplantationsexperiment av murina PDAC-celler i musbukspottkörteln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsöken godkändes av de institutionella kommittéerna för djurvård och användning (IACUCs) vid de lokala myndigheterna vid Münchens tekniska universitet och Regierung von Oberbayern.
1. Information att beakta före förfarandet
- Se till att djurprotokollet och personalen godkänns av de lokala myndigheterna innan djurförsök påbörjas.
- Välj mottagarmöss.
- Välj möss i liknande åldrar för implantation (C57Bl/6J-mottagarmöss med ett åldersintervall mellan 2 månader och 4 månader).
- Se till att mottagardjurens kön och genetiska bakgrund överensstämmer med könet och den genetiska bakgrunden hos de djur från vilka cellinjen som används för implantationen härstammar (syngena transplantat).
- Förbered mössen för implantation.
OBS: Hantera mössen enligt hygienkraven i den lokala djuranläggningen.- På implantationsdagen, mata inte mössen 4 timmar före proceduren för att undvika komplikationer på grund av administrering av anestetika.
- Väg mössen före implantation för att beräkna mängden nödvändiga anestetika.
- Överför mössen till operationssalen.
- Välj PDAC-cellinjerna.
- Se till att den genetiska bakgrunden och könet hos mössen från vilka cellinjerna härrör matchar mottagarmössens bakgrund och kön (t.ex. PDAC-cellinjerna PDAC 1-3 som tidigare genererats från PDAC GEMM på en C57Bl/6J-bakgrund i laboratoriet med följande genotyper, som beskrivits tidigare14: PDAC 1 och 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53 R172H/R172H).
- Välj de cellinjer som inte uttrycker proteiner som är potentiellt immunogena.
- Odla PDAC-cellinjerna.
OBS: Utför cellodlingsarbetet under en laminär flödeshuv. Desinficera handskar, arbetsutrymme och material innan du arbetar.- Tina cellerna 1 vecka före implantation genom att resuspendera pelleten i 5 ml cellodlingsmedium. Snurra ner cellerna, aspirera supernatanten, resuspendera pelleten i 5 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och snurra ner cellerna igen. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i 5 ml Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 0,1% penicillin-streptomycin (PS). Överför cellsuspensionen till en 25 cm² kolv.
- Passera cellinjerna minst en gång före implantation.
- Ta bort cellmediet, tvätta 1x med PBS och tillsätt 0,5 ml trypsin för att lossa cellerna från kolven. Inkubera cellerna vid 37 °C tills de lossnar från kolven (beroende på cellinjen tar detta vanligtvis 5-10 minuter). När cellerna lossnar, suspendera cellerna igen i 10 ml DMEM med 10% FBS och 0,1% PS och överför cellsuspensionen till en 75 cm² kolv.
OBS: Eftersom FBS inaktiverar trypsin skulle det hindra trypsinisering.
- Ta bort cellmediet, tvätta 1x med PBS och tillsätt 0,5 ml trypsin för att lossa cellerna från kolven. Inkubera cellerna vid 37 °C tills de lossnar från kolven (beroende på cellinjen tar detta vanligtvis 5-10 minuter). När cellerna lossnar, suspendera cellerna igen i 10 ml DMEM med 10% FBS och 0,1% PS och överför cellsuspensionen till en 75 cm² kolv.
- Säkerställ sammanflöde på ~ 70% -80% på implantationsdagen.
- Material som behövs för implantation
- Autoklav alla kirurgiska instrument.
- Håll bedövningsmedel redo baserat på djurförsökslicensen.
- Använd meloxikam för analgesi minst 5 min i förväg som ett långvarigt smärtstillande medel med antiinflammatoriska egenskaper.
- För kirurgi, använd en kombination av midazolam, medetomidin och fentanyl (MMF) för analgosedering.
- Använd en kombination av atipamezol, flumazenil och naloxon (AFN) för att motverka MMF-analgosedering efter implantation.
- Förbered ett sterilt draperi, en värmematta, en rakapparat, handskar, ögonkräm, 0,9% natriumklorid, jod eller klorhexidinbaserad kirurgisk skrubba, 80% etanol, löslig sutur, sårklämmor, en 50 μL injektionsvolym spruta och tejp.
2. Förbereda cellinjerna före implantation
OBS: Förbered tumörcellerna endast när mössen är redo för implantation. Säkerställ en kort tidsram mellan skörd eller insamling av celler och implantation.
- Värm alla vätskor till 37 °C före användning.
- Bered cellerna (från 1x T75 (en 75 cm 2-odlingskolv) enligt beskrivningen i steg 1.5.2.1 tills de lossnar från kolven. Resuspendera cellerna i 10 ml DMEM med 10% FBS och 0,1% PS och överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör.
- Snurra ner cellerna vid 200 × g i 5 minuter i en centrifug. Aspirera supernatanten och resuspendera cellpelleten i en tillräcklig volym DMEM utan tillsatser baserat på den slutliga koncentrationen av cellerna som krävs för injektion. Använd 10 μL av cellsuspensionen för att räkna cellerna med hjälp av en Neubauer-kammare och beräkna antalet tillgängliga celler.
- Späd cellerna till det slutliga antal celler som krävs för injektion (t.ex. 2 500 celler i 20 μl) i DMEM utan tillsatser. Överför 1 ml av den utspädda cellsuspensionen till ett 1,5 ml rör. Placera röret på en rotator tills implantation för att förhindra att cellerna aggregerar.
3. Ortotopisk implantation av PDAC-celler
OBS: Vid otillräcklig kirurgisk erfarenhet, öva med kadaver först och få adekvat utbildning, till exempel inom ett djurträningsprotokoll. Personalen som utför operationen och djurförsöken måste uppfylla respektive myndighets kriterier och institutionernas riktlinjer.
- Använd meloxikam som ett perioperativt smärtstillande medel och applicera 5 mg / kg kroppsvikt subkutant.
- Injicera MMF intraperitonealt enligt varje muss kroppsvikt (midazolam [5,0 mg/kg], medetomidin [0,5 mg/kg] och fentanyl [0,05 mg/kg]).
- Sätt tillbaka musen i buren i 10-15 minuter.
- Applicera ögonkräm när musen sover.
- Kontrollera tillräcklig analgosedering efter 10 minuter genom att testa pedalabstinensreflexen (nyp på fotkuddarna på båda bakfötterna). Vid svar, applicera 1/3 av den ursprungliga dosen av analgosedering. Efter 10 minuter, upprepa proceduren och fortsätt endast i frånvaro av en pedaluttagsreflex.
- Raka musens vänstra laterala bukflank. Placera musen som ligger på höger sida på en steril värmematta och tejpa benen på ytan. Desinficera buken med en jod- eller klorhexidinbaserad kirurgisk skrubb följt av 80% etanol i en cirkulär rörelse och upprepa proceduren tre gånger. För att upprätthålla steriliteten hos det kirurgiska fältet, använd ett kirurgiskt draperi.
- Använd nya handskar och desinficera dem. Använd kirurgisk sax för att skära huden och subkutan fettvävnad längsgående på vänster flank där mjälten projiceras. Utför ett snitt på ca 1 cm i längd.
- Använd sax och pincett, separera huden från bukhinnan för att få en lättare tillgång till bukhinnan.
- Byt sax. Öppna bukhinnan på mjältens plats med ett 1 cm längsgående snitt.
- Mobilisera mjälten och den bifogade bukspottkörteln med trubbiga, finspetsade pincett. Se till att organen inte är fästa vid annan vävnad och kontrollera om det finns blodkärl för att undvika att skada kärlen eller den omgivande vävnaden vid hantering av bukspottkörteln.
OBS: Ta inte tag i mjälten direkt för att förhindra blödning. - Dra försiktigt bukspottkörteln ur snittet för att möjliggöra enklare åtkomst till organets svans och observera mjälten efter bukspottkörteln. Använd den icke-dominerande handen för att ta tag i bukspottkörteln med pincett och klipp försiktigt ligamenten som förhindrar bukspottkörteln från extrakorporalisering. Se till att organet inte viks under injektionen och att organets kapsel hålls under spänning på nålpenetrationsstället för att undvika spill.
- Använd den dominerande handen för att utföra injektionen. Penetrera försiktigt organets kapsel med sprutans nål efter organets längdaxel. Sikta på en bit bukspottskörtelvävnad mellan synliga blodkärl för att minimera risken för punktering eller injektion i ett kärl. Injicera långsamt ett tillräckligt antal celler enligt experimentplanen (här 2 500 celler i 20 μL DMEM) med en 27 G kanyl och en 50 μL spruta i bukspottkörtelns svansområde.
OBS: En transparent bubbla bildas vid framgångsrik injektion i vävnaden. - Håll bukspottkörteln och den införda sprutan stilla i cirka 1 minut för att undvika spill av tumörcellerna. Ta försiktigt bort nålen från injektionsstället.
OBS: Byt nålar mellan möss och använd en ny steril spruta för injektion av en ny cellinje. - Omorganisera organen inuti buken försiktigt. Var försiktig så att du inte skadar vävnaden för att undvika spill av cellerna. Häll 1 ml 0,9% natriumklorid på organen för att undvika organvidhäftning.
- Suturera försiktigt bukhinnan med den enkla avbrutna suturtekniken och stäng huden med två till tre 9 mm lindade klämmor i rostfritt stål.
OBS: Ta bort sårklämmorna 7 dagar efter implantation om det kirurgiska snittet har läkt. - Om nödvändigt, förhindra uttorkning av djuren på grund av proceduren och anestesin genom att injicera 0,5 ml natriumklorid subkutant.
- Efter implantation antagonisera analysen med MMF med en subkutan injektion av AFN (atipamezol [2,5 mg/kg], flumazenil [0,5 mg/kg], naloxon [1,2 mg/kg]), beroende på musens kroppsvikt.
- Placera musen i en uppvärmd kammare på 37 °C tills den är vaken och helt aktiv. Placera sedan musen tillbaka i sin ursprungliga bur. Övervaka musens hälsotillstånd genom att kontrollera päls, hudfärg och aktivitet och upprepa detta 3-4 timmar efter operationen.
4. Eftervård för mössen
- Ge mössen tillgång till vatten och mat när de är tillbaka i djuranläggningen.
- Fortsätt subkutan eller oral applicering av meloxikam (5 mg/kg) var 6-12 h i 2-3 dagar efter operationen.
- Övervaka mössens hälsostatus regelbundet enligt djurprotokollet och de institutionella riktlinjerna.
- Beroende på experimentets mål, övervaka tumörtillväxt varje vecka eller oftare genom palpering, ultraljudsavbildning, bioluminescens (BLI) eller magnetisk resonanstomografi (MRT).
OBS: Baserat på den valda metoden, tillväxthastigheten och antalet celler som implanteras kan en tumör detekteras så tidigt som 1 vecka efter injektionen.
5. Skörda tumörtransplantat
- Skörda tumörerna i slutet av experimentet eller när mössen behöver avlivas enligt kriterierna för institutionella djurvårds- och användningskommittéer eller djurförsökslicens.
- Avliva musen med en metod som är tillåten enligt djurförsökslicensen.
OBS: Utför steg med minimal tidsförlust för att minimera ischemitiden. Därför rekommenderas cervikal dislokation eftersom det är en snabb metod och dödstiden kan bestämmas exakt, i motsats till terminal blödning eller kemiska metoder. - Placera musen på en steril matta och tejpa benen på ytan. Använd 80% etanol för att desinficera buken.
- Använd nya handskar och desinficera dem. Använd kirurgisk sax för att skära huden i längdriktningen på centrala buken.
- Använd sax och pincett, separera huden från bukhinnan för att få en lättare tillgång till bukhinnan.
- Byt sax. Öppna bukhinnan vid centrala buken med ett 5 cm längsgående snitt.
- Mobilisera mjälten och den bifogade bukspottkörteln med trubbiga, finspetsade pincett. Lossa försiktigt tumören från den omgivande vävnaden med pincett och kirurgisk sax.
- Förvara tumörvävnaden i ett medium som är lämpligt för nedströms experiment. Bearbeta vävnaderna omedelbart eller, om nödvändigt, håll provet vid 4 °C i högst 6 timmar tills vidare bearbetning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I samband med en storskalig läkemedelsresponsstudie implanterade vi framgångsrikt mer än 170 möss (C75Bl6 / J-mottagarmöss, manliga och kvinnliga möss kön matchade med PDAC-cellinjerna injicerade) med hjälp av det ovan beskrivna protokollet, exemplifierat i dess huvudsteg i figur 112. I detta protokoll implanterade vi ortotopiskt tre KrasG12D-drivna PDAC-cellinjer (PDAC 1 och 2: Ptf1aCre / +; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H), som tidigare genererats i laboratoriet. Engraftment av PDAC-celler kan palperas abdominalt tidigast cirka 7 dagar efter operationen, beroende på det injicerade cellantalet och aggressiviteten och tillväxtegenskaperna hos den inokulerade cellinjen. MR (Figur 2A), ultraljud och BLI i musbuken kan användas för kvantitativa mätningar av tumörvolymen. Beroende på cellinjernas tumörcellinneboende egenskaper kan överlevnaden hos de resulterande implanterade mössen variera (figur 2B). Framgångsrika intrapankreasinjektioner leder till fullblåsta tumörer i musbukspottkörteln (figur 2C, D). Däremot kan misslyckade implantationer resultera i frånvaro av bukspottskörteltumörer på grund av a) injektion av icke-viabla celler, b) avstötning av de implanterade cellerna (t.ex. om cellerna inte var syngena för mottagarmusen) eller c) ett otillräckligt antal celler injicerade. Alternativa negativa resultat kan leda till frånvaro av en primär tumör i bukspottkörteln men närvaron av en tumör vid bukhinnan, motsvarande injektionsstället (t.ex. genom spill av tumörcellsuspensionen från bukspottskörtelns injektionsställe).
Figur 1: Schematisk representation av protokollets huvudsteg . (A) PDAC-celler bör passeras minst en gång före implantation. (B) Cellerna trypsiniseras för att lossna dem från kolven, överförs till ett 15 ml rör och räknas. (C) Lämplig cellutspädning placeras i ett rör och förs till implantationsrummet. (D) Den mottagande musen bedövas, rakas och desinficeras i det område där operationen kommer att äga rum. (E) Ett snitt på 1 cm görs på musens buk som motsvarar bukspottkörtelns svansläge. (F) Det önskade antalet celler injiceras i bukspottkörtelns svans. Förkortning: PDAC = pankreas duktalt adenokarcinom. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Exempel på framgångsrika resultat på syngena ortotopiska allotransplantat från möss. (A) Representativ MRT av en mus 2 veckor efter ortotopisk transplantation av primära PDAC-celler från mus. Dashed kontur betecknar tumören. Skalstång = 5 mm. (B) Kaplan-Meier överlevnadskurva för tre olika PDAC-cellinjer i mus (PDAC 1-3) ortotopiskt transplanterade i bukspottkörteln hos syngena immunkompetenta möss (C57Bl/6J-bakgrund). (C) Representativ bild av en tumör isolerad vid slutpunkten från den ortortotopiskt injicerade PDAC1-cellinjen. Både en bukspottskörteltumör som härrör från en framgångsrik intrapankreasinjektion av tumörceller och mjälten visas på fotografiet. Skalstång = 5 mm. (D) Barplot som visar den genomsnittliga tumörvikten för ortotopiskt transplanterade tumörer från PDAC 1-3. Prickar representerar enskilda möss. Förkortningar: PDAC = pankreas duktalt adenokarcinom; MRT = magnetisk resonanstomografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syngena ortotopiska allotransplantat från möss utgör en robust modell för prekliniska studier på grund av deras kostnadseffektivitet, reproducerbarhet och relativt enkla experimentella procedurer13,15. Dessa modeller tillåter inte bara studier av tumör-värdinteraktioner utan garanterar också bevarandet av den genetiska heterogeniteten hos tumörerna de härstammar från när primära muscellkulturer används för experimentet.
Detta protokoll presenterar en enkel och snabb procedur för ortotopisk implantation av mus-PDAC-cellkulturer i bukspottkörteln. För att få reproducerbara resultat måste flera tekniska överväganden hållas i åtanke, inklusive kvaliteten på den kirurgiska tekniken. Eftersom kirurgiska metoder varierar är det lämpligt att en person utför alla ortotopiska injektioner inom samma experiment.
Injektionen av celler i bukspottkörteln bör utföras med försiktighet. Spillda celler, piercing bukspottkörteln, eller skada vävnaden kan orsaka cellerna att ympa på andra organ platser utanför bukspottkörteln. Detta kan komplicera den kliniska utvärderingen (t.ex. storlek och lokal infiltration) av den primära tumören, liksom dess lokala och avlägsna metastatiska spridning. Därför rekommenderas att dokumentera och bedöma bubbelbildning och all information om cellspill för varje implanterad mus. Nedskärningar i huden och bukhinnan bör göras i lämplig storlek för att möjliggöra optimal åtkomst till bukspottkörteln samtidigt som såren hålls så små som möjligt.
Antalet implanterade celler kan justeras beroende på experimentplanen. Medan ett större antal implanterade celler leder till fysiologiskt snabbväxande tumörer och snabb progression av kliniska symtom, ökar mindre cellantal risken för att tumörer inte kommer att engraft. Vidare rekommenderas små volymer cellsuspensioner eftersom större volymer (>20 μL) är förknippade med en ökad potential för bildandet av en cystisk kärna13. Vi fann att implantering av 2 500-5 000 celler i en volym av 20 μL cellodlingsmedium är en optimal mängd för prekliniska terapeutiska studier genom att säkerställa tumörtillväxt under flera veckor. Men för andra applikationer kan upp till 1,6 × 106 celler implanteras.
Förutom cellodlingsmedium kan Matrigel användas som ett näringsrikt medium för att resuspendera PDAC-cellerna, vilket också ökar injektionslösningens viskositet och därigenom förhindrar läckage av tumörcellerna13. Injektioner i bukspottkörtelns svansområde föredras med detta protokoll eftersom bukspottkörtelns svans är lättillgänglig och tillgången till bukspottkörtelns huvud är begränsad. Protokoll för att framgångsrikt injicera celler i bukspottkörtelhuvudet beskrivs någon annanstans13,15. För att utföra det kirurgiska ingreppet hålls möss under analgosedering med användning av en läkemedelskombination, inklusive midazolam, medetomidin och fentanyl, samt meloxikam som peri- och postoperativt smärtstillande medel. Alternativt kan isofluran i kombination med lämpliga analgetika användas som inhalationsanestesi under konstant flöde. Valet av analysmetod för djurlicensen beror på de institutionella riktlinjerna och respektive lokala myndigheter.
Noggrant val av cellinjer och mottagarmöss är absolut nödvändigt. Det är faktiskt viktigt att se till att den genetiska bakgrunden hos mottagarmössen matchar den genetiska bakgrunden för de valda cellinjerna för att undvika immunogenicitet och transplantatavstötning av PDAC-cellerna. Vidare påverkar immunogena exogena proteiner, såsom fluorescerande reporteralleler eller Cas9, uttryckta av implanterade tumörceller värdens svar och kan leda till en immunogen reaktion. Därför kan tumörtillväxt och TME:s sammansättning påverkas och orsaka bias.
I jämförelse med GEM visar syngena ortotopiska musallotransplantat en minskad mängd desmoplasi och i vissa fall en lägre metastatisk spridningshastighet, vilket delvis begränsar likheten med humana tumörer. Dessutom ökar behovet av kirurgisk ingrepp komplexiteten i proceduren. Misslyckade implantationer som resulterar i frånvaro av bukspottskörteltumörer på önskad plats på grund av icke-livskraftig cellinjektion, avstötning av implanterade celler, lågt antal injicerade celler och injektionsläckage kan förhindra slutförandet av experimentproceduren.
Trots dessa begränsningar har syngena ortotopiska musallograftmodeller av PDAC visat sig effektivt hantera många av utmaningarna med att studera PDAC och dess heterogenitet. Med sina mycket reproducerbara fenotyper och tumörtillväxtmönster, liksom tumör-TME-interaktioner, representerar de en ovärderlig resurs som kan erhållas snabbt efter ett relativt enkelt protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka djuranläggningen TUM och kärnanläggningen för bilddiagnostik vid avdelningen för nuklearmedicin, Klinikum rechts der Isar, för utmärkt teknisk support. Denna studie stöddes av German Cancer Consortium (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 och S01) till D.S., Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 och 2017.091.2) till D.S. och Europeiska forskningsrådet (ERC CoG No. 648521, till D.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D.
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
