Summary
Сингенные мышиные ортотопные аллотрансплантаты аденокарциномы протоков поджелудочной железы (PDAC) повторяют биологию, фенотипы и терапевтические реакции подтипов заболевания. Благодаря быстрому и воспроизводимому прогрессированию опухоли они широко используются в доклинических исследованиях. Здесь мы показываем общие методы создания этих моделей, вводя сингенные мышиные культуры PDAC в поджелудочную железу.
Abstract
Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) является очень сложным заболеванием, характеризующимся гетерогенным микроокружением опухоли, состоящим из разнообразной стромы, иммунных клеток, сосудов, нервов и компонентов внеклеточного матрикса. На протяжении многих лет были разработаны различные мышиные модели PDAC для решения проблем, связанных с его прогрессированием, метастатическим потенциалом и фенотипической гетерогенностью. Иммунокомпетентные мышиные ортотопические аллотрансплантаты PDAC показали хорошие перспективы благодаря их быстрому и воспроизводимому прогрессированию опухоли по сравнению с генетически модифицированными моделями мышей. Более того, в сочетании с их способностью имитировать биологические особенности, наблюдаемые в автохтонных PDAC, модели мышей с ортотопическим аллотрансплантатом на основе клеточной линии позволяют проводить крупномасштабные эксперименты in vivo . Таким образом, эти модели широко используются в доклинических исследованиях для быстрого анализа генотипа-фенотипа и лекарственного ответа. Целью этого протокола является обеспечение воспроизводимого и надежного подхода к успешному введению первичных клеточных культур PDAC мыши в поджелудочную железу сингенных мышей-реципиентов. В дополнение к техническим деталям дается важная информация, которую необходимо учитывать перед проведением этих экспериментов.
Introduction
В последнее время PDAC стал третьей по значимости причиной смертности от рака в западном мире1. Это вызывает самый высокий уровень смертности среди всех видов рака и 10-летнюю общую выживаемость ~ 1%, которая не менялась десятилетиями2. Ожидается, что из-за отсутствия прогресса в лечении PDAC это заболевание станет второй по значимости причиной смертности от рака к следующему десятилетию3.
Опухоли PDAC представляют собой сложные образования, характеризующиеся разнообразным микроокружением опухоли (TME), состоящим из гетерогенной сборки компонентов стромы, сосудистых, иммунных и внеклеточного матрикса4. Различия в составе ТМЭ влияют на прогноз заболевания и ответ на терапию 4,5,6. Действительно, многие исследования показали, что базально-подобный мезенхимальный подтип PDAC связан с высокоиммуносупрессивным TME и показывает снижение выживаемости и отсутствие ответа на терапию 7,8,9,10,11,12. Таким образом, более глубокое понимание различий в составе TME и того, как эти особенности влияют на биологию опухоли, остается важным фактором для разработки молекулярно точных методов лечения. Чтобы лучше понять биологию, лежащую в основе этого сложного фенотипа, и определить терапевтические стратегии, способные преодолеть барьер, который представляет собой TME PDAC, необходимы модели in vivo.
Ключевым аспектом любой доклинической модельной системы рака является то, что она должна имитировать фенотипы человека, повторяя как генетическую гетерогенность, так и среду, включающую множество стромальных и иммунных популяций, составляющих TME. Поэтому при выборе моделей мышей для доклинических исследований необходимо учитывать несколько аспектов. Для исследования опухолево-иммунного взаимодействия гистосовместимые линии раковых клеток могут быть введены сингенным иммунокомпетентным мышам. В большинстве случаев они подкожно вводятся в бок мыши, что позволяет легко контролировать опухоль путем пальпации или визуального осмотра. Однако полученные модели не имитируют рост опухолевых клеток в их органе происхождения. Таким образом, ортотопическая трансплантация стала золотым стандартом для моделей аллотрансплантатов.
Мышиные ортотопические аллотрансплантаты имеют ряд преимуществ: они экономически эффективны, могут быть получены с помощью относительно простой процедуры и приводят к моделям с известным молекулярным составом, а также воспроизводимой и предсказуемой прогрессией опухоли и фенотипом. Действительно, в то время как модели ксенотрансплантатов, полученные от пациентов, точно представляют поведение клеток PDAC человека, необходимость имплантации иммунодефицитным мышам, чтобы избежать отторжения трансплантата, ограничивает анализ взаимодействия опухоли с иммунитетом и опухолью со стромой, позволяя исследователям получить лишь частичное изображение сложности этих опухолей. Сингенные ортотопные аллотрансплантаты PDAC имеют преимущество в этом отношении также по сравнению с генно-инженерными моделями мышей (GEMM). GEMM точно повторяют онкогенез PDAC человека и гетерогенность, наблюдаемую у пациентов с PDAC. Однако из-за этих особенностей опухоли GEMM могут демонстрировать высокую дисперсию в своем генетическом составе, прогрессировании опухоли, агрессивности, гистологической дифференцировке и составе TME. Хотя это может быть преимуществом в некоторых исследованиях, это ограничивает исследования генотипа к фенотипу и целенаправленное исследование фенотипов PDAC13. Таким образом, мышиные ортотопические аллотрансплантаты представляют собой хороший компромисс и модель для проведения исследований опухоли-хозяина и лечения in vivo. В этой статье изложен протокол экспериментов по ортотопической трансплантации клеток PDAC мышей в поджелудочную железу мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных были одобрены институциональными комитетами по уходу за животными и их использованию (IACUC) местных властей Мюнхенского технического университета и Regierung von Oberbayern.
1. Информация, которую необходимо рассмотреть перед процедурой
- Перед началом любых экспериментов на животных обеспечьте одобрение протокола и персонала на животных местными властями.
- Выберите мыши-получатели.
- Выберите мышей аналогичного возраста для имплантации (мыши-реципиенты C57Bl / 6J с возрастным диапазоном от 2 месяцев до 4 месяцев).
- Убедитесь, что пол и генетический фон животных-реципиентов совпадают с полом и генетическим фоном животных, от которых произошла клеточная линия, используемая для имплантации (сингенные аллотрансплантаты).
- Подготовьте мышей к имплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обращайтесь с мышами в соответствии с гигиеническими стандартами местного животноводческого учреждения.- В день имплантации не кормите мышей за 4 ч до процедуры, чтобы избежать осложнений из-за введения анестетиков.
- Взвесьте мышей перед имплантацией, чтобы рассчитать количество необходимых анестетиков.
- Перенесите мышей в операционную.
- Выберите клеточные линии PDAC.
- Убедитесь, что генетический фон и пол мышей, от которых получены клеточные линии, совпадают с фоном и полом мышей-реципиентов (например, клеточные линии PDAC PDAC 1-3, ранее полученные из PDAC GEMM на фоне C57Bl/6J в лаборатории со следующими генотипами, как описано ранее14: PDAC 1 и 2: PDAC 1 и 2: Ptf1aCre/+; ЛСЛ-КрасГ12Д/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; ЛСЛ-КрасГ12Д/+; LSL-Trp53 R172H/R172H).
- Выберите клеточные линии, которые не экспрессируют белки, которые являются потенциально иммуногенными.
- Культивируйте клеточные линии PDAC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте работу по культивированию клеток под колпаком с ламинарным потоком. Перед работой продезинфицируйте перчатки, рабочее пространство и материалы.- Размораживают клетки за 1 неделю до имплантации, ресуспендируя гранулу в 5 мл питательной среды клеток. Вращайте клетки, аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте гранулу в 5 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) и снова вращайте клетки. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 5 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Дульбекко с 10% эмбриональной бычьей сывороткой (FBS) и 0,1% пенициллин-стрептомицином (PS). Переложите клеточную суспензию в колбу объемом 25 см².
- Прохождение клеточных линий хотя бы один раз перед имплантацией.
- Удалите клеточную среду, промойте 1x PBS и добавьте 0,5 мл трипсина, чтобы отделить клетки от колбы. Инкубируют клетки при 37 °C до тех пор, пока они не отсоединятся от колбы (в зависимости от клеточной линии это обычно занимает 5-10 минут). Когда клетки отделены, ресуспендируют клетки в 10 мл DMEM с 10% FBS и 0,1% PS и переносят клеточную суспензию в колбу объемом 75 см².
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку FBS инактивирует трипсин, он будет препятствовать трипсинизации.
- Удалите клеточную среду, промойте 1x PBS и добавьте 0,5 мл трипсина, чтобы отделить клетки от колбы. Инкубируют клетки при 37 °C до тех пор, пока они не отсоединятся от колбы (в зависимости от клеточной линии это обычно занимает 5-10 минут). Когда клетки отделены, ресуспендируют клетки в 10 мл DMEM с 10% FBS и 0,1% PS и переносят клеточную суспензию в колбу объемом 75 см².
- Обеспечьте слияние ~70%-80% в день имплантации.
- Материал, необходимый для имплантации
- Автоклав все хирургические инструменты.
- Держите анестетики наготове в соответствии с лицензией на эксперименты на животных.
- Используйте мелоксикам для обезболивания не менее чем за 5 минут в качестве анальгетика длительного действия с противовоспалительными свойствами.
- Для хирургического вмешательства используйте комбинацию мидазолама, медетомидина и фентанила (MMF) для анальгоседации.
- Используйте комбинацию атипамезола, флумазенила и налоксона (AFN) для противостояния анальгоседации MMF после имплантации.
- Подготовьте стерильную простыню, нагревательный коврик, бритву, перчатки, крем для глаз, 0,9% хлорид натрия, хирургический скраб на основе йода или хлоргексидина, 80% этанол, растворимый шов, зажимы для раны, шприц для инъекций 50 мкл и ленту.
2. Подготовка клеточных линий перед имплантацией
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготавливайте опухолевые клетки только тогда, когда мыши готовы к имплантации. Обеспечьте короткий промежуток времени между сбором или сбором клеток и имплантацией.
- Перед употреблением нагрейте все жидкости до 37 °C.
- Подготовьте клетки (начиная с 1x T75 (колба для культуры 75 см 2), как описано в шаге 1.5.2.1, до тех пор, пока они не отсоединится от колбы. Ресуспендируют клетки в 10 мл DMEM с 10% FBS и 0,1% PS и переносят клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл.
- Отжимают клетки при 200 × г в течение 5 мин в центрифуге. Аспирируют надосадочную жидкость и ресуспендируют клеточную гранулу в достаточном объеме DMEM без добавок в зависимости от требуемой конечной концентрации клеток для инъекции. Используйте 10 мкл клеточной суспензии для подсчета клеток с помощью камеры Нейбауэра и расчета количества доступных клеток.
- Разбавьте клетки до конечного необходимого количества клеток для инъекции (например, 2,500 клеток в 20 мкл) в DMEM без добавок. Перенесите 1 мл разбавленной клеточной суспензии в пробирку объемом 1,5 мл. Поместите трубку на ротатор до имплантации, чтобы предотвратить агрегацию клеток.
3. Ортотопическая имплантация клеток PDAC
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае недостаточного хирургического опыта сначала потренируйтесь с трупами и пройдите соответствующую подготовку, например, в рамках протокола дрессировки животных. Персонал, выполняющий операции и эксперименты на животных, должен соответствовать критериям соответствующих органов власти и институциональным руководящим принципам.
- Используйте мелоксикам в качестве периоперационного анальгетика и наносите 5 мг / кг массы тела подкожно.
- Внутрибрюшинно вводят MMF в соответствии с массой тела каждой мыши (мидазолам [5,0 мг / кг], медетомидин [0,5 мг / кг] и фентанил [0,05 мг / кг]).
- Поместите мышь обратно в клетку на 10-15 минут.
- Наносите крем для глаз, когда мышь спит.
- Проверьте достаточную анальгоседию через 10 минут, проверив рефлекс отвода педали (ущипните подушечки обеих задних лап). В случае ответа применяют 1/3 исходной дозы анальгоседирования. Через 10 мин повторите процедуру и приступайте только при отсутствии рефлекса отвода педали.
- Побрейте левый боковой брюшной бок мыши. Положите мышь, лежащую на правом боку, на стерильный нагревательный коврик и прикрепите ее лапки к поверхности. Продезинфицируйте брюшную полость хирургическим скрабом на основе йода или хлоргексидина, затем круговыми движениями нанесите 80% этанола и повторите процедуру три раза. Для поддержания стерильности операционного поля используют хирургическую простыню.
- Наденьте новые перчатки и продезинфицируйте их. Используйте хирургические ножницы, чтобы разрезать кожу и подкожно-жировую клетчатку в продольном направлении на левом боку, где проецируется селезенка. Выполняют срез длиной около 1 см.
- С помощью ножниц и щипцов отделите кожу от брюшины, чтобы получить более легкий доступ к брюшине.
- Поменяйте ножницы. Вскрывают брюшину в месте расположения селезенки продольным разрезом 1 см.
- Мобилизуйте селезенку и прикрепленную поджелудочную железу с помощью тупых щипцов с тонкими наконечниками. Убедитесь, что органы не прикреплены к другим тканям, и проверьте наличие кровеносных сосудов, чтобы не повредить сосуды или окружающие ткани при работе с поджелудочной железой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не захватывайте селезенку напрямую, чтобы предотвратить кровотечение. - Осторожно вытащите поджелудочную железу из разреза, чтобы облегчить доступ к хвосту органа, и наблюдайте за селезенкой, следующей за поджелудочной железой. Используйте недоминантную руку, чтобы захватить поджелудочную железу щипцами и осторожно разрезать связки, которые предотвращают экстракорпорализацию поджелудочной железы. Убедитесь, что орган не сложен во время инъекции и что капсула органа удерживается под натяжением в месте проникновения иглы, чтобы избежать утечки.
- Используйте доминирующую руку для проведения инъекции. Осторожно проникните в капсулу органа иглой шприца по продольной оси органа. Стремитесь к кусочку ткани поджелудочной железы между видимыми кровеносными сосудами, чтобы свести к минимуму риск прокола или инъекции в сосуд. Медленно вводите достаточное количество клеток в соответствии с планом эксперимента (здесь 2,500 клеток в 20 мкл DMEM) с помощью канюли 27 г и шприца 50 мкл в хвостовую область поджелудочной железы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прозрачный пузырь образуется при успешном введении в ткань. - Держите поджелудочную железу и вставленный шприц неподвижно в течение примерно 1 минуты, чтобы избежать разлива опухолевых клеток. Осторожно извлеките иглу из места инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поменяйте иглы между мышами и используйте новый стерильный шприц для инъекции новой клеточной линии. - Аккуратно переставляйте органы внутри брюшной полости. Следите за тем, чтобы не повредить ткани, чтобы избежать разлива клеток. Налейте 1 мл 0,9% хлорида натрия на органы, чтобы избежать адгезии органов.
- Аккуратно зашите брюшину, используя простую технику прерывистого шва, и закройте кожу с помощью двух-трех зажимов из нержавеющей стали диаметром 9 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите зажимы для раны через 7 дней после имплантации, если хирургический разрез зажил. - При необходимости предотвратите обезвоживание животных из-за процедуры и анестезии, вводя 0,5 мл хлорида натрия подкожно.
- После имплантации противодействуют анальгоседации ММФ с помощью подкожной инъекции АФН (атипамезол [2,5 мг/кг], флумазенил [0,5 мг/кг], налоксон [1,2 мг/кг]), в зависимости от массы тела мыши.
- Поместите мышь в камеру с подогревом 37 °C, пока она не проснется и не станет полностью активной. Затем поместите мышь обратно в исходную клетку. Следите за состоянием здоровья мыши, проверяя шерсть, цвет кожи и активность, и повторите это через 3-4 часа после операции.
4. Последующий уход за мышами
- Предоставьте мышам доступ к воде и пище, когда они вернутся в помещение для животных.
- Продолжайте подкожное или пероральное применение мелоксикама (5 мг / кг) каждые 6-12 ч в течение 2-3 дней после операции.
- Регулярно контролируйте состояние здоровья мышей в соответствии с протоколом для животных и институциональными рекомендациями.
- В зависимости от цели эксперимента контролируйте рост опухоли каждую неделю или чаще с помощью пальпации, ультразвуковой визуализации, биолюминесценции (BLI) или магнитно-резонансной томографии (МРТ).
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от метода выбора, скорости роста и количества имплантированных клеток опухоль может быть обнаружена уже через 1 неделю после инъекции.
5. Забор опухолевых трансплантатов
- Собирайте опухоли в конце эксперимента или когда мышей необходимо усыпить в соответствии с критериями институциональных комитетов по уходу за животными и их использованию или лицензии на эксперименты на животных.
- Усыпьте мышь, используя метод, разрешенный лицензией на эксперименты на животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте шаги с минимальными потерями времени, чтобы свести к минимуму время ишемии. Поэтому рекомендуется вывих шейки матки, так как это быстрый метод, и время смерти может быть точно определено, в отличие от терминального кровотечения или химических методов. - Положите мышь на спину на стерильный коврик и прикрепите ее лапки к поверхности. Используйте 80% этанол для дезинфекции брюшной полости.
- Наденьте новые перчатки и продезинфицируйте их. Используйте хирургические ножницы, чтобы разрезать кожу в продольном направлении на центральной части живота.
- С помощью ножниц и щипцов отделите кожу от брюшины, чтобы получить более легкий доступ к брюшине.
- Поменяйте ножницы. Вскрывают брюшину в центральной части живота продольным разрезом 5 см.
- Мобилизуйте селезенку и прикрепленную поджелудочную железу с помощью тупых щипцов с тонкими наконечниками. Аккуратно отделите опухоль от окружающих тканей с помощью щипцов и хирургических ножниц.
- Храните опухолевую ткань в среде, подходящей для последующих экспериментов. Немедленно обработайте ткани или, при необходимости, держите образец при температуре 4 °C не более 6 часов до дальнейшей обработки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В контексте крупномасштабного исследования лекарственного ответа мы успешно имплантировали более 170 мышей (мышей-реципиентов C75Bl6 / J, пол самцов и самок мышей, соответствующий введенным клеточным линиям PDAC) с использованием вышеописанного протокола, проиллюстрированного на его основных этапах на рисунке 112. В этом протоколе мы ортотопически имплантировали три клеточные линии PDAC, управляемые KrasG12D (PPAC 1 и 2: Ptf1aCre/+; ЛСЛ-КрасГ12Д/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; ЛСЛ-КрасГ12Д/+; LSL-Trp53 R172H/R172H), которые ранее были сгенерированы в лаборатории. Приживление клеток PDAC можно абдоминально пальпировать на ранней стадии примерно через 7 дней после операции, в зависимости от количества введенных клеток, а также агрессивности и характеристик роста инокулированной клеточной линии. МРТ (рис. 2А), УЗИ и BLI брюшной полости мыши могут быть использованы для количественных измерений объема опухоли. В зависимости от присущих опухолевым клеткам характеристик клеточных линий выживаемость полученных имплантированных мышей может варьироваться (рис. 2B). Успешные внутрипанкреатические инъекции приводят к полномасштабным опухолям в поджелудочной железе мыши (рис. 2C, D). Напротив, неудачная имплантация может привести к отсутствию опухолей поджелудочной железы из-за: а) инъекции нежизнеспособных клеток, б) отторжения имплантированных клеток (например, если клетки не были сингенными для мыши-реципиента) или в) недостаточное количество введенных клеток. Альтернативные негативные исходы могут привести к отсутствию первичной опухоли в поджелудочной железе, но к наличию опухоли на брюшине, соответствующей месту инъекции (например, через утечку суспензии опухолевых клеток из места инъекции поджелудочной железы).
Рисунок 1: Схематическое изображение основных этапов протокола . (A) Клетки PDAC должны быть пройдены по крайней мере один раз перед имплантацией. (B) Клетки трипсинизируют, чтобы отделить их от колбы, переносят в пробирку объемом 15 мл и подсчитывают. (C) Соответствующее разведение клеток помещают в трубку и доставляют в комнату для имплантации. (D) Мышь-реципиент обезболивается, бреется и дезинфицируется в области, где будет проводиться операция. (E) На брюшке мыши делается разрез на 1 см, соответствующий расположению хвоста поджелудочной железы. (F) Желаемое количество клеток вводится в хвост поджелудочной железы. Аббревиатура: PDAC = аденокарцинома протоков поджелудочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Примеры успешных результатов при сингенных ортотопических аллотрансплантатах мышей. (A) Репрезентативная МРТ мыши через 2 недели после ортотопической трансплантации первичных клеток PDAC мыши. Пунктирным контуром обозначена опухоль. Масштабная линейка = 5 мм. (B) Кривая выживаемости Каплана-Мейера трех различных клеточных линий PDAC мыши (PDAC 1-3), ортотопически трансплантированных в поджелудочную железу сингенных иммунокомпетентных мышей (фон C57Bl/6J). (C) Репрезентативное изображение опухоли, выделенной в конечной точке из ортотопически введенной клеточной линии PDAC1. На фотографии показана как опухоль поджелудочной железы, возникшая в результате успешной внутрипанкреатической инъекции опухолевых клеток, так и селезенка. Масштабная линейка = 5 мм. (D) Штрих-диаграмма, показывающая среднюю массу ортотопически трансплантированных опухолей из PDAC 1-3. Точки представляют отдельных мышей. Сокращения: PDAC = аденокарцинома протоков поджелудочной железы; МРТ = магнитно-резонансная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сингенные мышиные ортотопические аллотрансплантаты представляют собой надежную модель для доклинических исследований благодаря своей экономической эффективности, воспроизводимости и относительно простым экспериментальным процедурам13,15. Эти модели не только позволяют изучать взаимодействия опухоли и хозяина, но и гарантируют сохранение генетической гетерогенности опухолей, из которых они происходят, когда для эксперимента используются первичные культуры клеток мыши.
Этот протокол представляет собой простую и быструю процедуру ортотопической имплантации культур клеток PDAC мыши в поджелудочную железу. Для получения воспроизводимых результатов необходимо учитывать несколько технических соображений, в том числе качество хирургической техники. Поскольку хирургическая практика различается, рекомендуется, чтобы один человек выполнял все ортотопические инъекции в рамках одного и того же эксперимента.
Инъекции клеток в поджелудочную железу следует проводить с осторожностью. Пролитые клетки, прокалывающие поджелудочную железу или повреждающие ткань, могут привести к тому, что клетки приживутся на других участках органов за пределами поджелудочной железы. Это может осложнить клиническую оценку (например, размер и локальную инфильтрацию) первичной опухоли, а также ее локальное и отдаленное метастатическое распространение. Поэтому рекомендуется документировать и оценивать образование пузырьков и любую информацию о разливе клеток для каждой имплантированной мыши. Разрезы на коже и брюшине должны быть сделаны соответствующего размера, чтобы обеспечить оптимальный доступ к поджелудочной железе, сохраняя при этом раны как можно меньше.
Количество имплантируемых клеток может быть скорректировано в зависимости от плана эксперимента. В то время как большее количество имплантированных клеток приводит к физиологически быстрорастущим опухолям и быстрому прогрессированию клинических симптомов, меньшее количество клеток увеличивает риск того, что опухоли не приживутся. Кроме того, рекомендуются небольшие объемы клеточных суспензий, так как большие объемы (>20 мкл) связаны с повышенным потенциалом образования кистозного ядра13. Мы обнаружили, что имплантация 2 500-5 000 клеток в объеме 20 мкл среды для культивирования клеток является оптимальным количеством для доклинических терапевтических исследований, обеспечивая рост опухоли в течение нескольких недель. Однако для других применений можно имплантировать до 1,6 × 106 клеток.
В дополнение к среде для культивирования клеток Матригель можно использовать в качестве богатой питательными веществами среды для ресуспендирования клеток PDAC, что также увеличивает вязкость раствора для инъекций, тем самым предотвращая утечку опухолевых клеток13. Инъекции в хвостовую область поджелудочной железы предпочтительны с этим протоколом, так как хвост поджелудочной железы легко доступен, а доступ к головке поджелудочной железы ограничен. Протоколы успешного введения клеток в головку поджелудочной железы описаны в другом месте13,15. Для выполнения хирургической процедуры мышей держат под анальгоседией с использованием комбинации лекарств, включая мидазолам, медетомидин и фентанил, а также мелоксикам в качестве пери- и послеоперационного анальгетика. В качестве альтернативы изофлуран в сочетании с соответствующими анальгетиками можно использовать в качестве ингаляционной анестезии при постоянном потоке. Выбор метода анальгоседации для лицензии на животных зависит от руководящих принципов учреждения и соответствующих местных органов власти.
Тщательный выбор клеточных линий и мышей-реципиентов является обязательным условием. Действительно, важно убедиться, что генетический фон мышей-реципиентов совпадает с генетическим фоном выбранных клеточных линий, чтобы избежать иммуногенности и отторжения трансплантата клеток PDAC. Кроме того, иммуногенные экзогенные белки, такие как флуоресцентные репортерные аллели или Cas9, экспрессируемые имплантированными опухолевыми клетками, влияют на реакцию хозяина и могут привести к иммуногенной реакции. Таким образом, рост опухоли и состав TME могут быть затронуты и вызвать смещение.
По сравнению с GEMM, сингенные ортотопические аллотрансплантаты мышей демонстрируют уменьшенное количество десмоплазии и, в некоторых случаях, более низкую скорость метастатической диссеминации, что частично ограничивает сходство с опухолями человека. Более того, необходимость хирургического вмешательства увеличивает сложность процедуры. Неудачные имплантации, приводящие к отсутствию опухолей поджелудочной железы в желаемом месте из-за нежизнеспособной инъекции клеток, отторжения имплантированных клеток, низкого количества введенных клеток и утечки инъекции, могут помешать завершению экспериментальной процедуры.
Несмотря на эти ограничения, было показано, что сингенные ортотопические модели аллотрансплантата мыши PDAC эффективно решают многие проблемы изучения PDAC и его гетерогенности. Обладая высоковоспроизводимыми фенотипами и паттернами роста опухоли, а также взаимодействиями опухоли и TME, они представляют собой бесценный ресурс, который можно быстро получить, следуя относительно простому протоколу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить животноводческий центр ТУМ и центр визуализации отделения нуклеарной медицины Klinikum rechts der Isar за отличную техническую поддержку. Это исследование было поддержано Немецким онкологическим консорциумом (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 и S01) для D.S., Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 и 2017.091.2) для D.S. и Европейским исследовательским советом (ERC CoG No 648521, для D.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D.
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
