Summary
Syngene orthotope Allotransplantate der Maus des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse (PDAC) rekapitulieren die Biologie, die Phänotypen und das therapeutische Ansprechen von Krankheitssubtypen. Aufgrund ihrer schnellen, reproduzierbaren Tumorprogression sind sie in präklinischen Studien weit verbreitet. In dieser Arbeit zeigen wir gängige Praktiken zur Generierung dieser Modelle, indem wir syngene murine PDAC-Kulturen in die Bauchspeicheldrüse injizieren.
Abstract
Das duktale Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse (PDAC) ist eine sehr komplexe Erkrankung, die durch eine heterogene Tumormikroumgebung gekennzeichnet ist, die aus einem vielfältigen Stroma, Immunzellen, Gefäßen, Nerven und Komponenten der extrazellulären Matrix besteht. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Mausmodelle von PDAC entwickelt, um die Herausforderungen zu bewältigen, die sich aus seiner Progression, seinem Metastasierungspotenzial und seiner phänotypischen Heterogenität ergeben. Immunkompetente orthotope Maus-Allotransplantate von PDAC haben sich aufgrund ihrer schnellen und reproduzierbaren Tumorprogression im Vergleich zu gentechnisch veränderten Mausmodellen als vielversprechend erwiesen. Darüber hinaus ermöglichen zelllinienbasierte orthotope Allotransplantat-Mausmodelle in Kombination mit ihrer Fähigkeit, die biologischen Merkmale nachzuahmen, die in autochthonen PDAC beobachtet wurden, groß angelegte In-vivo-Experimente . Daher werden diese Modelle in präklinischen Studien häufig für schnelle Genotyp-Phänotyp- und Drug-Response-Analysen eingesetzt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen reproduzierbaren und robusten Ansatz zur erfolgreichen Injektion von primären PDAC-Zellkulturen der Maus in die Bauchspeicheldrüse von syngenen Empfängermäusen bereitzustellen. Neben den technischen Details werden wichtige Informationen gegeben, die vor der Durchführung dieser Experimente beachtet werden müssen.
Introduction
In jüngster Zeit wurde PDAC zur dritthäufigsten krebsbedingten Todesursache in der westlichen Welt1. Es verursacht die höchste Sterblichkeitsrate unter allen Krebsarten und eine 10-Jahres-Gesamtüberlebensrate von ~1%, die sich seit Jahrzehnten nicht geändert hat2. Aufgrund des mangelnden Fortschritts bei der PDAC-Behandlung wird erwartet, dass diese Krankheit in den nächsten zehn Jahren die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache sein wird3.
PDAC-Tumoren sind komplexe Einheiten, die durch eine vielfältige Tumormikroumgebung (TME) gekennzeichnet sind, die aus einer heterogenen Anordnung von Stroma-, vaskulären, immunen und extrazellulären Matrixkomponenten besteht4. Unterschiede in der Zusammensetzung der TME beeinflussen die Krankheitsprognose und das Ansprechen auf die Therapie 4,5,6. In der Tat haben viele Studien gezeigt, dass der basale, mesenchymale Subtyp der PDAC mit einem stark immunsuppressiven TME assoziiert ist und ein verringertes Überleben und mangelndes Ansprechen auf Therapien zeigt 7,8,9,10,11,12. Daher bleibt ein tieferes Verständnis der Unterschiede in der TME-Zusammensetzung und wie diese Merkmale die Tumorbiologie beeinflussen, ein wichtiger Faktor für die Entwicklung molekular präziser Therapien. Um die Biologie hinter diesem komplexen Phänotyp besser zu verstehen und therapeutische Strategien zu identifizieren, die in der Lage sind, die Barriere zu überwinden, die die TME von PDAC darstellt, sind In-vivo-Modelle unverzichtbar.
Ein Schlüsselaspekt für jedes präklinische Krebsmodellsystem ist, dass es menschliche Phänotypen nachahmen und sowohl die genetische Heterogenität als auch das Milieu rekapitulieren sollte, das die Vielzahl von Stroma- und Immunpopulationen umfasst, aus denen sich das TME zusammensetzt. Bei der Auswahl von Mausmodellen für die präklinische Forschung müssen daher mehrere Aspekte berücksichtigt werden. Um die Tumor-Immun-Interaktion zu untersuchen, können histokompatible Krebszelllinien in syngene immunkompetente Mäuse injiziert werden. In den meisten Fällen werden diese subkutan in die Flanke der Maus injiziert, was eine einfache Tumorüberwachung durch Abtasten oder visuelle Inspektion ermöglicht. Die resultierenden Modelle ahmen jedoch nicht das Wachstum von Tumorzellen in ihrem Ursprungsorgan nach. Daher wurden orthotope Transplantationen zum Goldstandard für Allotransplantatmodelle.
Orthotope Allotransplantate der Maus haben mehrere Vorteile: Sie sind kostengünstig, können mit einem relativ einfachen Verfahren erzeugt werden und führen zu Modellen mit bekannter molekularer Zusammensetzung sowie einer reproduzierbaren und vorhersagbaren Tumorprogression und einem Phänotyp. Während patientenabgeleitete Xenotransplantatmodelle das Verhalten menschlicher PDAC-Zellen genau repräsentieren, schränkt die Notwendigkeit der Implantation in immundefiziente Mäuse zur Vermeidung der Transplantatabstoßung die Analyse der Tumor-Immun- und Tumor-Stroma-Interaktionen ein, so dass die Forscher nur ein Teilbild der Komplexität dieser Tumore erfassen können. Syngene orthotope Allotransplantate von PDAC sind in dieser Hinsicht auch im Vergleich zu gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEMMs) im Vorteil. GEMMs rekapitulieren genau die humane PDAC-Tumorgenese und die bei PDAC-Patienten beobachtete Heterogenität. Aufgrund dieser Merkmale können GEMM-Tumoren jedoch eine hohe Varianz in ihrer genetischen Ausstattung, Tumorprogression, Aggressivität, histologischen Differenzierung und TME-Zusammensetzung aufweisen. Während dies in bestimmten Studien von Vorteil sein kann, schränkt es Genotyp-zu-Phänotyp-Studien und die fokussierte Untersuchung von PDAC-Phänotypenein 13. Daher stellen orthotope Allotransplantate der Maus einen guten Kompromiss und ein gutes Modell dar, um Tumor-Wirts- und Behandlungsstudien in vivo durchzuführen. In dieser Arbeit wird ein Protokoll für orthotope Transplantationsexperimente von murinen PDAC-Zellen in die Bauchspeicheldrüse der Maus beschrieben.
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Protocol
Die Tierversuche wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUCs) der Kommunen der Technischen Universität München und der Regierung von Oberbayern genehmigt.
1. Informationen, die vor dem Eingriff zu beachten sind
- Stellen Sie sicher, dass das Tierprotokoll und das Personal von den örtlichen Behörden genehmigt werden, bevor Sie mit Tierversuchen beginnen.
- Wählen Sie Empfängermäuse aus.
- Wählen Sie Mäuse ähnlichen Alters für die Implantation aus (C57Bl/6J-Empfängermäuse mit einem Alter zwischen 2 Monaten und 4 Monaten).
- Stellen Sie sicher, dass das Geschlecht und der genetische Hintergrund der Empfängertiere mit dem Geschlecht und dem genetischen Hintergrund der Tiere übereinstimmen, von denen die für die Implantation verwendete Zelllinie stammt (syngene Allotransplantate).
- Bereiten Sie die Mäuse auf die Implantation vor.
HINWEIS: Behandeln Sie die Mäuse gemäß den Hygienestandards der örtlichen Tierhaltung.- Füttern Sie die Mäuse am Tag der Implantation 4 Stunden vor dem Eingriff nicht, um Komplikationen durch die Verabreichung von Anästhetika zu vermeiden.
- Wiegen Sie die Mäuse vor der Implantation, um die Menge der erforderlichen Anästhetika zu berechnen.
- Bringen Sie die Mäuse in den Operationssaal.
- Wählen Sie die PDAC-Zelllinien aus.
- Stellen Sie sicher, dass der genetische Hintergrund und das Geschlecht der Mäuse, von denen die Zelllinien stammen, mit dem Hintergrund und dem Geschlecht der Empfängermäuse übereinstimmen (z. B. die PDAC-Zelllinien PDAC 1-3, die zuvor aus PDAC-GEMMs auf einem C57Bl/6J-Hintergrund im Labor mit den folgenden Genotypen generiert wurden, wie zuvor beschrieben14: PDAC 1 und 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53 R172H/R172H).
- Wählen Sie die Zelllinien aus, die keine potenziell immunogenen Proteine exprimieren.
- Kultivieren Sie die PDAC-Zelllinien.
Anmerkungen: Führen Sie die Zellkulturarbeit unter einer Laminar-Flow-Haube durch. Desinfizieren Sie die Handschuhe, den Arbeitsbereich und die Materialien vor der Arbeit.- Tauen Sie die Zellen 1 Woche vor der Implantation auf, indem Sie das Pellet in 5 ml Zellkulturmedium resuspendieren. Drehen Sie die Zellen herunter, saugen Sie den Überstand ab, resuspendieren Sie das Pellet in 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und drehen Sie die Zellen wieder herunter. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 0,1 % Penicillin-Streptomycin (PS). Die Zellsuspension wird in einen 25 cm² Kolben überführt.
- Die Zelllinien müssen vor der Implantation mindestens einmal durchlaufen werden.
- Entfernen Sie das Zellmedium, waschen Sie es 1x mit PBS und fügen Sie 0,5 ml Trypsin hinzu, um die Zellen vom Kolben zu lösen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, bis sie sich vom Kolben lösen (je nach Zelllinie dauert dies in der Regel 5-10 min). Wenn die Zellen abgelöst sind, resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml DMEM mit 10 % FBS und 0,1 % PS und überführen Sie die Zellsuspension in einen 75 cm²-Kolben.
HINWEIS: Da FBS Trypsin inaktiviert, würde es die Trypsinisierung behindern.
- Entfernen Sie das Zellmedium, waschen Sie es 1x mit PBS und fügen Sie 0,5 ml Trypsin hinzu, um die Zellen vom Kolben zu lösen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, bis sie sich vom Kolben lösen (je nach Zelllinie dauert dies in der Regel 5-10 min). Wenn die Zellen abgelöst sind, resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml DMEM mit 10 % FBS und 0,1 % PS und überführen Sie die Zellsuspension in einen 75 cm²-Kolben.
- Stellen Sie eine Konfluenz von ~70%-80% am Tag der Implantation sicher.
- Für die Implantation benötigtes Material
- Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente.
- Halten Sie Anästhetika auf der Grundlage der Tierversuchsgenehmigung bereit.
- Verwenden Sie Meloxicam zur Analgesie mindestens 5 Minuten im Voraus als langanhaltendes Analgetikum mit entzündungshemmenden Eigenschaften.
- Verwenden Sie für die Operation eine Kombination aus Midazolam, Mededomid und Fentanyl (MMF) zur Analgosedierung.
- Verwenden Sie eine Kombination aus Atipamezol, Flumazenil und Naloxon (AFN) zur Antagonisierung der MMF-Analgosedierung nach der Implantation.
- Bereiten Sie ein steriles Abdecktuch, eine Heizmatte, einen Rasierer, Handschuhe, Augencreme, 0,9 % Natriumchlorid, ein chirurgisches Peeling auf Jod- oder Chlorhexidinbasis, 80 % Ethanol, lösliches Nahtmaterial, Wundclips, eine Spritze mit 50 μl Injektionsvolumen und Klebeband vor.
2. Vorbereitung der Zelllinien vor der Implantation
HINWEIS: Bereiten Sie die Tumorzellen erst vor, wenn die Mäuse für die Einnistung bereit sind. Sorgen Sie für einen kurzen Zeitrahmen zwischen der Entnahme oder Entnahme von Zellen und der Implantation.
- Erwärmen Sie alle Flüssigkeiten vor Gebrauch auf 37 °C.
- Die Zellen (beginnend mit 1x T75 (ein 75 cm 2 Kulturkolben) wie in Schritt 1.5.2.1 beschrieben vorbereiten, bis sie sich vom Kolben lösen. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL DMEM mit 10 % FBS und 0,1 % PS und überführen Sie die Zellsuspension in ein 15 mL Röhrchen.
- Schleudern Sie die Zellen bei 200 × g für 5 min in einer Zentrifuge herunter. Saugen Sie den Überstand an und resuspendieren Sie das Zellpellet in einer ausreichenden Menge DMEM ohne Zusatzstoffe, basierend auf der erforderlichen Endkonzentration der zu injizierenden Zellen. Verwenden Sie 10 μl der Zellsuspension, um die Zellen mit einer Neubauer-Kammer zu zählen und die Anzahl der verfügbaren Zellen zu berechnen.
- Verdünnen Sie die Zellen auf die für die Injektion erforderliche Endzahl (z. B. 2.500 Zellen in 20 μL) in DMEM ohne Zusatzstoffe. Übertragen Sie 1 ml der verdünnten Zellsuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen. Legen Sie den Schlauch bis zur Implantation auf einen Rotator, um zu verhindern, dass sich die Zellen verklumpen.
3. Orthotope Implantation von PDAC-Zellen
HINWEIS: Bei unzureichender chirurgischer Erfahrung sollten Sie zuerst mit Leichen üben und angemessen geschult werden, z. B. im Rahmen eines Tiertrainingsprotokolls. Das Personal, das die Operation und die Tierversuche durchführt, muss die Kriterien der jeweiligen Behörden und die institutionellen Richtlinien erfüllen.
- Meloxicam als perioperatives Analgetikum verwenden und 5 mg/kg Körpergewicht subkutan auftragen.
- Intraperitoneale Injektion von MMF entsprechend dem Körpergewicht jeder Maus (Midazolam [5,0 mg/kg], Medetomidin [0,5 mg/kg] und Fentanyl [0,05 mg/kg]).
- Legen Sie die Maus für 10-15 Minuten wieder in den Käfig.
- Tragen Sie Augencreme auf, wenn die Maus schläft.
- Überprüfen Sie eine ausreichende Analgosedierung nach 10 min, indem Sie den Pedalrückzugsreflex (Einklemmen der Fußballen beider Hinterfüße) testen. Im Falle eines Ansprechens 1/3 der ursprünglichen Dosis der Analgosedierung auftragen. Wiederholen Sie den Vorgang nach 10 Minuten und fahren Sie nur fort, wenn kein Pedalrückzugsreflex vorliegt.
- Rasieren Sie die linke seitliche Bauchflanke der Maus. Legen Sie die Maus auf der rechten Seite liegend auf eine sterile Heizmatte und kleben Sie ihre Beine an die Oberfläche. Desinfizieren Sie den Bauch mit einem chirurgischen Peeling auf Jod- oder Chlorhexidinbasis, gefolgt von 80%igem Ethanol in kreisenden Bewegungen, und wiederholen Sie den Vorgang dreimal. Um die Sterilität des Operationsfeldes zu erhalten, verwenden Sie ein OP-Tuch.
- Tragen Sie neue Handschuhe und desinfizieren Sie sie. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Haut und das Unterhautfettgewebe in Längsrichtung an der linken Flanke zu schneiden, wo die Milz projiziert wird. Führen Sie einen Schnitt von ca. 1 cm Länge durch.
- Trennen Sie mit Schere und Pinzette die Haut vom Bauchfell, um einen leichteren Zugang zum Bauchfell zu erhalten.
- Wechsle die Schere. Öffnen Sie das Bauchfell an der Stelle der Milz mit einem 1 cm langen Längsschnitt.
- Mobilisieren Sie die Milz und die anhaftende Bauchspeicheldrüse mit einer stumpfen Pinzette mit feiner Spitze. Stellen Sie sicher, dass die Organe nicht mit anderem Gewebe verbunden sind, und prüfen Sie, ob Blutgefäße versorgt werden, um eine Verletzung der Gefäße oder des umliegenden Gewebes beim Umgang mit der Bauchspeicheldrüse zu vermeiden.
Anmerkungen: Fassen Sie die Milz nicht direkt an, um Blutungen zu vermeiden. - Ziehen Sie die Bauchspeicheldrüse vorsichtig aus dem Schnitt, um einen leichteren Zugang zum Schwanz des Organs zu ermöglichen, und beobachten Sie die Milz, die der Bauchspeicheldrüse folgt. Verwenden Sie die nicht-dominante Hand, um die Bauchspeicheldrüse mit einer Pinzette zu greifen und die Bänder, die eine Extrakorporalisierung der Bauchspeicheldrüse verhindern, vorsichtig zu durchtrennen. Achten Sie darauf, dass das Organ während der Injektion nicht gefaltet ist und dass die Organkapsel an der Stelle des Nadelstichs unter Spannung gehalten wird, um ein Verschütten zu vermeiden.
- Verwenden Sie die dominante Hand, um die Injektion durchzuführen. Stechen Sie vorsichtig mit der Nadel der Spritze in die Organkapsel ein und folgen Sie dabei der Längsachse des Organs. Streben Sie ein Stück Bauchspeicheldrüsengewebe zwischen sichtbaren Blutgefäßen an, um das Risiko einer Punktion oder Injektion in ein Gefäß zu minimieren. Injizieren Sie langsam eine ausreichende Anzahl von Zellen gemäß dem Versuchsplan (hier 2.500 Zellen in 20 μL DMEM) mit einer 27 G Kanüle und einer 50 μL Spritze in den Schwanzbereich der Bauchspeicheldrüse.
Anmerkungen: Bei erfolgreicher Injektion in das Gewebe bildet sich eine transparente Blase. - Halten Sie die Bauchspeicheldrüse und die eingeführte Spritze ca. 1 Minute lang still, um ein Verschütten der Tumorzellen zu vermeiden. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig von der Injektionsstelle.
Anmerkungen: Wechseln Sie die Nadeln zwischen den Mäusen und verwenden Sie eine neue sterile Spritze für die Injektion einer neuen Zelllinie. - Ordnen Sie die Organe im Bauch vorsichtig neu an. Achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu verletzen, um ein Verschütten der Zellen zu vermeiden. Gießen Sie 1 ml 0,9%iges Natriumchlorid auf die Organe, um eine Organverklebung zu vermeiden.
- Nähen Sie das Bauchfell vorsichtig mit der einfachen unterbrochenen Nahttechnik und verschließen Sie die Haut mit zwei bis drei 9 mm Edelstahl-Wundclips.
HINWEIS: Entfernen Sie die Wundklammern 7 Tage nach der Implantation, wenn der chirurgische Schnitt verheilt ist. - Falls erforderlich, verhindern Sie eine Austrocknung der Tiere aufgrund des Eingriffs und der Narkose, indem Sie 0,5 ml Natriumchlorid subkutan injizieren.
- Nach der Implantation wird die Analgosedierung durch MMF mit einer subkutanen Injektion von AFN (Atipamezol [2,5 mg/kg], Flumazenil [0,5 mg/kg], Naloxon [1,2 mg/kg]) entsprechend dem Körpergewicht der Maus antagonisiert.
- Legen Sie die Maus in eine bei 37 °C beheizte Kammer, bis sie wach und vollständig aktiv ist. Setzen Sie die Maus dann wieder in ihren ursprünglichen Käfig. Überwachen Sie den Gesundheitszustand der Maus, indem Sie das Fell, die Hautfarbe und die Aktivität überprüfen, und wiederholen Sie dies 3-4 Stunden nach der Operation.
4. Nachsorge für die Mäuse
- Geben Sie den Mäusen Zugang zu Wasser und Futter, wenn sie wieder in der Tieranlage sind.
- Setzen Sie die subkutane oder orale Anwendung von Meloxicam (5 mg/kg) alle 6-12 Stunden für 2-3 Tage nach der Operation fort.
- Überwachen Sie regelmäßig den Gesundheitszustand der Mäuse gemäß dem Tierprotokoll und den institutionellen Richtlinien.
- Je nach Ziel des Experiments wird das Tumorwachstum wöchentlich oder häufiger durch Abtasten, Ultraschallbildgebung, Biolumineszenz (BLI) oder Magnetresonanztomographie (MRT) überwacht.
HINWEIS: Abhängig von der gewählten Methode, der Wachstumsrate und der Anzahl der implantierten Zellen kann ein Tumor bereits 1 Woche nach der Injektion erkannt werden.
5. Entnahme von Tumortransplantaten
- Ernten Sie die Tumore am Ende des Experiments oder wenn die Mäuse nach den Kriterien der institutionellen Tierpflege- und -nutzungsausschüsse oder der Tierversuchslizenz eingeschläfert werden müssen.
- Schläfern Sie die Maus mit einer Methode ein, die von der Tierversuchslizenz zugelassen ist.
HINWEIS: Führen Sie Schritte mit minimalem Zeitverlust durch, um die Ischämiezeit zu minimieren. Daher wird eine Zervixluxation empfohlen, da es sich um eine schnelle Methode handelt und der Todeszeitpunkt im Gegensatz zu terminalen Blutungen oder chemischen Methoden genau bestimmt werden kann. - Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine sterile Matte und kleben Sie ihre Beine an die Oberfläche. Verwenden Sie 80% Ethanol, um den Bauch zu desinfizieren.
- Tragen Sie neue Handschuhe und desinfizieren Sie sie. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Haut in Längsrichtung am zentralen Bauch zu schneiden.
- Trennen Sie mit Schere und Pinzette die Haut vom Bauchfell, um einen leichteren Zugang zum Bauchfell zu erhalten.
- Wechsle die Schere. Öffnen Sie das Bauchfell am Mittelbauch mit einem 5 cm langen Längsschnitt.
- Mobilisieren Sie die Milz und die anhaftende Bauchspeicheldrüse mit einer stumpfen Pinzette mit feiner Spitze. Lösen Sie den Tumor vorsichtig mit einer Pinzette und einer chirurgischen Schere vom umgebenden Gewebe.
- Lagern Sie das Tumorgewebe in einem Medium, das für nachgelagerte Experimente geeignet ist. Verarbeiten Sie die Gewebe sofort oder halten Sie die Probe bei Bedarf bis zur Weiterverarbeitung maximal 6 h bei 4 °C.
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Representative Results
Im Rahmen einer groß angelegten Drug-Response-Studie haben wir erfolgreich mehr als 170 Mäuse (C75Bl6/J-Empfängermäuse, männliches und weibliches Mäusegeschlecht, das auf die injizierten PDAC-Zelllinien abgestimmt ist) unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls implantiert, das in den Hauptschritten in Abbildung 112 beispielhaft dargestellt ist. In diesem Protokoll wurden drei KrasG12D-getriebene PDAC-Zelllinien (PDAC 1 und 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H), die zuvor im Labor erzeugt wurden. Das Transplantat von PDAC-Zellen kann frühestens ca. 7 Tage nach der Operation abdominal abgetastet werden, abhängig von der injizierten Zellzahl und den Aggressivitäts- und Wachstumseigenschaften der inokulierten Zelllinie. MRT (Abbildung 2A), Ultraschall und BLI des Mausabdomens können zur quantitativen Messung des Tumorvolumens verwendet werden. Abhängig von den tumorzellintrinsischen Merkmalen der Zelllinien kann das Überleben der daraus resultierenden implantierten Mäuse variieren (Abbildung 2B). Erfolgreiche intrapankreatische Injektionen führen zu ausgewachsenen Tumoren in der Bauchspeicheldrüse der Maus (Abbildung 2C,D). Im Gegensatz dazu können erfolglose Implantationen zum Ausbleiben von Bauchspeicheldrüsentumoren führen, weil a) nicht lebensfähige Zellen injiziert werden, b) die implantierten Zellen abgestoßen werden (z. B. wenn die Zellen nicht syngen zur Empfängermaus sind) oder c) eine unzureichende Anzahl von Zellen injiziert wird. Alternative negative Ergebnisse können dazu führen, dass kein Primärtumor in der Bauchspeicheldrüse vorhanden ist, aber ein Tumor am Peritoneum, der der Injektionsstelle entspricht (z. B. durch Verschütten der Tumorzellsuspension aus der Injektionsstelle der Bauchspeicheldrüse).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Hauptschritte des Protokolls . (A) PDAC-Zellen sollten vor der Implantation mindestens einmal durchgelassen werden. (B) Die Zellen werden trypsinisiert, um sie aus dem Kolben zu lösen, in ein 15-ml-Röhrchen überführt und gezählt. (C) Die entsprechende Zellverdünnung wird in ein Röhrchen gegeben und in den Implantationsraum gebracht. (D) Die Empfängermaus wird in der Region, in der die Operation stattfinden wird, betäubt, rasiert und desinfiziert. (E) Am Bauch der Maus wird ein 1 cm großer Schnitt gemacht, der der Position des Pankreasschwanzes entspricht. (F) Die gewünschte Anzahl von Zellen wird in den Schwanz der Bauchspeicheldrüse injiziert. Abkürzung: PDAC = duktales Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beispiele für erfolgreiche Ergebnisse bei syngenen orthotopen Allotransplantaten der Maus. (A) Repräsentative MRT einer Maus 2 Wochen nach orthotoper Transplantation von primären PDAC-Zellen der Maus. Der gestrichelte Umriss kennzeichnet den Tumor. Maßstabsbalken = 5 mm. (B) Kaplan-Meier-Überlebenskurve von drei verschiedenen Maus-PDAC-Zelllinien (PDAC 1-3), die orthotopisch in die Bauchspeicheldrüse syngener immunkompetenter Mäuse transplantiert wurden (C57Bl/6J-Hintergrund). (C) Repräsentatives Bild eines Tumors, der am Endpunkt aus der orthotopisch injizierten PDAC1-Zelllinie isoliert wurde. Auf dem Foto sind sowohl ein Bauchspeicheldrüsentumor, der aus einer erfolgreichen intrapankreatischen Injektion von Tumorzellen resultiert, als auch die Milz zu sehen. Maßstabsleiste = 5 mm. (D) Balkendiagramm mit den durchschnittlichen Tumorgewichten orthotopisch transplantierter Tumoren aus PDAC 1-3. Punkte stehen für einzelne Mäuse. Abkürzungen: PDAC = duktales Adenokarzinom der Bauchspeicheldrüse; MRT = Magnetresonanztomographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Syngene orthotope Allotransplantate der Maus stellen aufgrund ihrer Kosteneffektivität, Reproduzierbarkeit und relativ einfachen experimentellen Verfahren ein robustes Modell für präklinische Studiendar 13,15. Diese Modelle erlauben nicht nur die Untersuchung von Tumor-Wirt-Interaktionen, sondern garantieren auch den Erhalt der genetischen Heterogenität der Tumoren, aus denen sie stammen, wenn primäre Mauszellkulturen für das Experiment verwendet werden.
Dieses Protokoll stellt ein einfaches und schnelles Verfahren zur orthotopen Implantation von PDAC-Zellkulturen der Maus in die Bauchspeicheldrüse dar. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, müssen einige technische Überlegungen berücksichtigt werden, darunter die Qualität der Operationstechnik. Da die chirurgischen Praktiken unterschiedlich sind, ist es ratsam, dass eine Person alle orthotopen Injektionen innerhalb desselben Experiments durchführt.
Die Injektion von Zellen in die Bauchspeicheldrüse sollte mit Vorsicht erfolgen. Verschüttete Zellen, das Durchstechen der Bauchspeicheldrüse oder das Verletzen des Gewebes können dazu führen, dass sich die Zellen an anderen Organstellen außerhalb der Bauchspeicheldrüse ansiedeln. Dies kann die klinische Beurteilung (z. B. Größe und lokale Infiltration) des Primärtumors sowie seine lokale und entfernte Metastasierung erschweren. Daher wird empfohlen, die Blasenbildung und alle Informationen über den Zellaustritt für jede implantierte Maus zu dokumentieren und zu bewerten. Schnitte in Haut und Bauchfell sollten in einer angemessenen Größe vorgenommen werden, um einen optimalen Zugang zur Bauchspeicheldrüse zu ermöglichen und gleichzeitig die Wunden so klein wie möglich zu halten.
Die Anzahl der implantierten Zellen kann je nach Versuchsplan angepasst werden. Während eine größere Anzahl implantierter Zellen zu physiologisch schnell wachsenden Tumoren und einem schnellen Fortschreiten der klinischen Symptome führt, erhöht eine geringere Zellzahl das Risiko, dass sich Tumore nicht einnisten. Darüber hinaus werden kleine Volumina von Zellsuspensionen empfohlen, da größere Volumina (>20 μL) mit einem erhöhten Potenzial für die Bildung eines zystischen Kerns verbunden sind13. Wir fanden heraus, dass die Implantation von 2.500-5.000 Zellen in einem Volumen von 20 μl Zellkulturmedium eine optimale Menge für präklinische Therapiestudien ist, da das Tumorwachstum über mehrere Wochen sichergestellt wird. Für andere Anwendungen können jedoch bis zu 1,6 × 106 Zellen implantiert werden.
Neben Zellkulturmedium kann Matrigel als nährstoffreiches Medium zur Resuspendierung der PDAC-Zellen verwendet werden, wodurch auch die Viskosität der Injektionslösung erhöht und dadurch ein Austreten der Tumorzellen verhindertwird 13. Injektionen in den Schwanzbereich der Bauchspeicheldrüse werden bei diesem Protokoll bevorzugt, da der Pankreasschwanz leicht zugänglich ist und der Zugang zum Pankreaskopf begrenzt ist. Protokolle zur erfolgreichen Injektion von Zellen in den Pankreaskopf werden an anderer Stelle beschrieben13,15. Um den chirurgischen Eingriff durchzuführen, werden die Mäuse mit einer Wirkstoffkombination aus Midazolam, Medetomidin und Fentanyl sowie Meloxicam als peri- und postoperatives Analgetikum analgosediert. Alternativ kann Isofluran in Kombination mit geeigneten Analgetika als Inhalationsanästhesie unter konstantem Fluss eingesetzt werden. Die Auswahl der Analgosedierungsmethode der Wahl für die Tierzulassung hängt von den institutionellen Richtlinien und den jeweiligen lokalen Behörden ab.
Eine sorgfältige Auswahl der Zelllinien und Empfängermäuse ist unerlässlich. In der Tat ist es wichtig sicherzustellen, dass der genetische Hintergrund der Empfängermäuse mit dem genetischen Hintergrund der ausgewählten Zelllinien übereinstimmt, um Immunogenität und Transplantatabstoßung der PDAC-Zellen zu vermeiden. Darüber hinaus beeinflussen immunogene exogene Proteine, wie fluoreszierende Reporterallele oder Cas9, die von implantierten Tumorzellen exprimiert werden, die Antwort des Wirts und können zu einer immunogenen Reaktion führen. Daher können das Tumorwachstum und die Zusammensetzung des TME beeinflusst werden und zu Verzerrungen führen.
Im Vergleich zu GEMMs zeigen syngene orthotope Maus-Allotransplantate eine reduzierte Desmoplasie und in einigen Fällen eine geringere Metastasierungsrate, was die Ähnlichkeit mit humanen Tumoren teilweise einschränkt. Darüber hinaus erhöht die Notwendigkeit eines chirurgischen Eingriffs die Komplexität des Eingriffs. Fehlgeschlagene Implantationen, die dazu führen, dass aufgrund einer nicht lebensfähigen Zellinjektion, der Abstoßung implantierter Zellen, einer geringen Anzahl injizierter Zellen und einer Injektionsleckage keine Bauchspeicheldrüsentumoren an der gewünschten Stelle vorhanden sind, können den Abschluss des experimentellen Verfahrens verhindern.
Trotz dieser Einschränkungen hat sich gezeigt, dass syngene orthotope Maus-Allotransplantatmodelle von PDAC viele der Herausforderungen bei der Untersuchung von PDAC und seiner Heterogenität effektiv bewältigen können. Mit ihren hochgradig reproduzierbaren Phänotypen und Tumorwachstumsmustern sowie Tumor-TME-Interaktionen stellen sie eine unschätzbare Ressource dar, die nach einem relativ einfachen Protokoll schnell gewonnen werden kann.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei der TUM Tierklinik und der bildgebenden Core Facility der Klinik für Nuklearmedizin, Klinikum rechts der Isar, für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Studie wurde gefördert durch das Deutsche Konsortium für Translationale Krebsforschung (DKTK), die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Projekt-ID 329628492 P06, P11 und S01) bis D.S., die Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 und 2017.091.2) bis D.S. und den Europäischen Forschungsrat (ERC CoG Nr. 648521, bis D.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
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