Summary
胰腺导管腺癌 （PDAC） 的同源小鼠原位同种异体移植物概括了疾病亚型的生物学、表型和治疗反应。由于其快速、可重复的肿瘤进展，它们被广泛用于临床前研究。在这里，我们展示了生成这些模型的常见做法，将同源鼠PDAC培养物注射到胰腺中。
Abstract
胰腺导管腺癌（PDAC）是一种非常复杂的疾病，其特征是由多种基质，免疫细胞，血管，神经和细胞外基质成分组成的异质性肿瘤微环境。多年来，已经开发了PDAC的不同小鼠模型，以解决其进展，转移潜力和表型异质性带来的挑战。与基因工程小鼠模型相比，PDAC的免疫功能正常的小鼠原位同种异体移植物因其快速且可重复的肿瘤进展而显示出良好的前景。此外，结合它们模拟在本土PDAC中观察到的生物学特征的能力，基于细胞系的原位同种异体移植小鼠模型能够进行大规模的 体内 实验。因此，这些模型广泛用于临床前研究，用于快速基因型表型和药物反应分析。该协议的目的是提供一种可重复且稳健的方法，以成功将原代小鼠PDAC细胞培养物注射到同系受体小鼠的胰腺中。除了技术细节外，还提供了在进行这些实验之前必须考虑的重要信息。
Introduction
最近，PDAC成为西方世界癌症相关死亡的第三大原因1。它导致所有癌症中最高的死亡率和~1%的10年总生存率，几十年来一直没有改变2。由于PDAC治疗缺乏进展，预计到未来十年，这种疾病将成为癌症相关死亡的第二大原因3。
PDAC肿瘤是复杂的实体，其特征在于由基质，血管，免疫和细胞外基质成分的异质组装组成的多样化肿瘤微环境（TME）4。TME成分的差异影响疾病预后和对治疗的反应4，5，6。事实上，许多研究表明，PDAC的基础样间充质亚型与高度免疫抑制的TME有关，并显示出生存率降低和对治疗缺乏反应7，8，9，10，11，12。因此，更深入地了解TME组成的差异以及这些特征如何影响肿瘤生物学仍然是开发分子精确疗法的重要因素。为了更好地了解这种复杂表型背后的生物学并确定能够克服PDAC的TME构成的屏障的治疗策略，体内模型是必不可少的。
任何癌症临床前模型系统的一个关键方面是它应该模仿人类表型，概括遗传异质性和结合构成TME的众多基质和免疫群体的环境。因此，在选择小鼠模型进行临床前研究时，必须考虑几个方面。为了研究肿瘤 - 免疫相互作用，可以将组织相容的癌细胞系注射到同源免疫功能小鼠中。在大多数情况下，这些被皮下注射到小鼠的侧腹，允许通过触诊或目视检查轻松监测肿瘤。然而，由此产生的模型并不模拟肿瘤细胞在其起源器官中的生长。因此，原位移植成为同种异体移植模型的黄金标准。
小鼠原位同种异体移植物有几个优点：它们具有成本效益，可以通过相对简单的程序生成，并产生具有已知分子组成的模型，以及可重复和可预测的肿瘤进展和表型。事实上，虽然患者来源的异种移植模型准确地代表了人类PDAC细胞的行为，但植入免疫缺陷小鼠以避免移植排斥的需要限制了对肿瘤 - 免疫和肿瘤 - 基质相互作用的分析，允许研究人员仅捕获这些肿瘤复杂性的部分图像。与基因工程小鼠模型（GEMMs）相比，PDAC的同源原位同种异体移植物在这方面也具有优势。GEMM准确地概括了人类PDAC肿瘤发生和PDAC患者中观察到的异质性。然而，由于这些特征，GEMM肿瘤在其基因组成，肿瘤进展，侵袭性，组织学分化和TME组成方面可以显示出高度差异。虽然这在某些研究中可能是一个优势，但它限制了基因型到表型的研究和PDAC表型的重点研究13。因此，小鼠原位同种异体移植物构成了在 体内进行肿瘤宿主和治疗研究的良好权衡和模型。本文概述了小鼠PDAC细胞进入小鼠胰腺的原位移植实验方案。
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Protocol
动物实验得到了慕尼黑工业大学和上巴伐利亚大学地方当局的机构动物护理和使用委员会（IACUCs）的批准。
1. 手术前要考虑的信息
- 在开始任何动物实验之前，确保地方当局批准动物方案和人员。
- 选择受体小鼠。
- 选择年龄相似的小鼠进行植入（年龄范围在2个月至4个月之间的C57Bl / 6J受体小鼠）。
- 确保受体动物的性别和遗传背景与用于植入的细胞系起源的动物的性别和遗传背景（同种异体移植物）相匹配。
- 准备小鼠植入。
注意：根据当地动物设施的卫生标准处理小鼠。- 在植入当天，不要在手术前4小时喂食小鼠，以避免由于施用麻醉剂而导致的并发症。
- 在植入前称量小鼠以计算必要麻醉剂的量。
- 将小鼠转移到手术室。
- 选择PDAC细胞系。
- 确保来源细胞系的小鼠的遗传背景和性别与受体小鼠的背景和性别相匹配（例如，先前在实验室中由 PDAC GEMM 在 C57Bl/6J 背景上生成的 PDAC 细胞系 PDAC 1-3 具有以下基因型，如前所述14：PDAC 1 和 2： ptf1acre/+;LSL-克拉斯G12D/+;LSL-Trp53R172H/+， PDAC 3： ptf1acre/+;LSL-克拉斯G12D/+;LSL-Trp53 R172H/R172H）。
- 选择不表达潜在免疫原性蛋白质的细胞系。
- 培养PDAC细胞系。
注意：在层流罩下进行细胞培养工作。工作前对手套、工作空间和材料进行消毒。- 在植入前 1 周通过将沉淀重悬于 5 mL 细胞培养基中来解冻细胞。旋转细胞，吸出上清液，将沉淀重悬于5mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后再次旋转细胞。取出上清液，并将细胞重悬于含有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 0.1% 青霉素-链霉素 （PS） 的 5 mL Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 中。将细胞悬液转移到25cm²烧瓶中。
- 在植入前至少传代一次细胞系。
- 取出细胞培养基，用PBS洗涤1x，然后加入0.5mL胰蛋白酶以将细胞从烧瓶中分离。将细胞在37°C孵育，直到它们从烧瓶中分离（取决于细胞系，这通常需要5-10分钟）。当细胞分离时，将细胞重悬于含有 10% FBS 和 0.1% PS 的 10 mL DMEM 中，并将细胞悬液转移到 75 cm² 烧瓶中。
注意：由于FBS使胰蛋白酶失活，它会阻碍胰蛋白酶消化。
- 取出细胞培养基，用PBS洗涤1x，然后加入0.5mL胰蛋白酶以将细胞从烧瓶中分离。将细胞在37°C孵育，直到它们从烧瓶中分离（取决于细胞系，这通常需要5-10分钟）。当细胞分离时，将细胞重悬于含有 10% FBS 和 0.1% PS 的 10 mL DMEM 中，并将细胞悬液转移到 75 cm² 烧瓶中。
- 确保植入当天的汇合度为~70%-80%。
- 植入所需的材料
- 高压灭菌所有手术器械。
- 根据动物实验许可证准备好麻醉剂。
- 至少提前5分钟使用美洛昔康镇痛，作为具有抗炎特性的长效镇痛药。
- 手术时，使用咪达唑仑、美托咪定和芬太尼 （MMF） 的组合进行镇静。
- 使用阿替美唑、氟马西尼和纳洛酮 （AFN） 的组合来拮抗植入后的 MMF 镇静作用。
- 准备无菌窗帘、加热垫、剃须刀、手套、眼霜、0.9% 氯化钠、碘或氯己定手术磨砂膏、80% 乙醇、可溶性缝合线、伤口夹、50 μL 注射体积注射器和胶带。
2. 植入前准备细胞系
注意：仅当小鼠准备植入时才准备肿瘤细胞。确保收获或收集细胞与植入之间的时间短。
- 使用前将所有液体加热至37°C。
- 如步骤1.5.2.1中所述制备细胞（从1x T75（75cm2 培养瓶）开始），直到它们从烧瓶中分离。将细胞重悬于含有 10% FBS 和 0.1% PS 的 10 mL DMEM 中，并将细胞悬液转移到 15 mL 管中。
- 在离心机中以200× g 旋转细胞5分钟。根据注射细胞所需的最终浓度，吸出上清液并将细胞沉淀重悬于足够体积的DMEM中，无需添加剂。使用 10 μL 细胞悬液使用 Neubauer 室对细胞进行计数并计算可用细胞的数量。
- 在不含添加剂的DMEM中将细胞稀释至最终所需的注射细胞数（例如，20μL中的2，500个细胞）。将 1 mL 稀释的细胞悬液转移到 1.5 mL 管中。将管子放在旋转器上直到植入以防止细胞聚集。
3. PDAC细胞的原位植入
注意：如果手术经验不足，请先与尸体一起练习并获得足够的培训，例如，在动物训练方案中。进行手术和动物实验的人员需要满足各自当局的标准和机构指南。
- 使用美洛昔康作为围手术期镇痛药，皮下注射5mg / kg体重。
- 根据每只小鼠的体重腹膜内注射MMF（咪达唑仑[5.0mg / kg]，美托咪定[0.5mg / kg]和芬太尼[0.05mg / kg]）。
- 将鼠标放回笼子中10-15分钟。
- 在鼠标睡觉时涂抹眼霜。
- 10分钟后，通过测试踏板撤回反射（捏住双后脚的脚垫）来检查足够的镇静作用。如果出现反应，请使用原始剂量的1/3镇静剂。10分钟后，重复该过程，仅在没有踏板撤回反射的情况下进行。
- 剃掉小鼠的左外侧腹部。将右侧躺在无菌加热垫上的鼠标，并将其腿粘在表面上。使用碘或洗必泰为基础的手术磨砂膏对腹部进行消毒，然后以80%乙醇打圈的方式进行消毒，并重复该过程三次。为了保持手术区域的无菌性，请使用手术单。
- 戴上新手套并进行消毒。使用手术剪刀在脾脏突出的左胁纵向切开皮肤和皮下脂肪组织。进行约1厘米长的切割。
- 使用剪刀和镊子将皮肤与腹膜分开，以便更容易进入腹膜。
- 换一把剪刀。用1厘米的纵向切口打开脾脏位置的腹膜。
- 使用钝的细尖镊子活动脾脏和附着的胰腺。确保器官没有附着在其他组织上，并检查供应血管，以避免在处理胰腺时伤害血管或周围组织。
注意：不要直接抓住脾脏以防止出血。 - 小心地将胰腺从切口中拉出，以便更容易地进入器官的尾巴，并观察胰腺之后的脾脏。用非惯用手用镊子抓住胰腺，并小心地切断韧带，防止胰腺体外化。确保器官在注射过程中没有折叠，并且器官的囊在针刺部位保持张力，以避免溢出。
- 用惯用手进行注射。用注射器的针头沿着器官的纵轴小心地穿透器官的胶囊。瞄准可见血管之间的一块胰腺组织，以尽量减少穿刺或注射到血管中的风险。根据实验计划（此处为20μLDMEM中的2，500个细胞）用27 G套管和50μL注射器缓慢注射足够数量的细胞到胰腺尾部区域。
注意：成功注射到组织中后会形成透明气泡。 - 保持胰腺和插入的注射器静止约1分钟，以避免肿瘤细胞溢出。小心地将针头从注射部位移开。
注意：在小鼠之间更换针头并使用新的无菌注射器注射新的细胞系。 - 小心地重新排列腹部内的器官。注意不要伤害组织，以免细胞溢出。将 1 mL 的 0.9% 氯化钠倒入器官上，以避免器官粘连。
- 使用简单的间断缝合技术仔细缝合腹膜，并使用两到三个 9 毫米不锈钢缠绕夹闭合皮肤。
注意：如果手术切口已愈合，则在植入后 7 天取下伤口夹。 - 如有必要，通过皮下注射0.5mL氯化钠来防止由于手术和麻醉而导致的动物脱水。
- 植入后，根据小鼠体重，用皮下注射AFN（阿替美唑[2.5mg / kg]，氟马西尼[0.5mg / kg]，纳洛酮[1.2mg / kg]）拮抗MMF镇静。
- 将鼠标置于37°C加热室中，直到其唤醒并完全活跃。然后，将鼠标放回原来的笼子里。通过检查皮毛，肤色和活动来监测小鼠的健康状况，并在手术后3-4小时重复此操作。
4. 小鼠善后护理
- 回到动物设施时，让小鼠获得水和食物。
- 手术后每6-12小时继续皮下或口服美洛昔康（5mg / kg），持续2-3天。
- 根据动物方案和机构指南定期监测小鼠的健康状况。
- 根据实验目标，每周或通过触诊、超声成像、生物发光 （BLI） 或磁共振成像 （MRI） 更频繁地监测肿瘤生长。
注意：根据选择的方法，生长速率和植入的细胞数量，最早可以在注射后1周检测到肿瘤。
5. 采集肿瘤移植物
- 在实验结束时或需要按照机构动物护理和使用委员会或动物实验许可证的标准对小鼠实施安乐死时收获肿瘤。
- 使用动物实验许可证允许的方法对小鼠实施安乐死。
注意：以最小的时间损失执行步骤，以最大限度地减少缺血时间。因此，建议进行颈椎脱位，因为与终末期出血或化学方法相比，这是一种快速方法，并且可以准确确定死亡时间。 - 将鼠标仰卧放在无菌垫上，并将其腿粘在表面上。使用80%乙醇对腹部进行消毒。
- 戴上新手套并进行消毒。使用手术剪刀在腹部中央纵向切割皮肤。
- 使用剪刀和镊子将皮肤与腹膜分开，以便更容易进入腹膜。
- 换一把剪刀。用5厘米的纵向切口打开腹部中央的腹膜。
- 使用钝的细尖镊子活动脾脏和附着的胰腺。使用镊子和手术剪刀小心地将肿瘤与周围组织分离。
- 将肿瘤组织储存在适合下游实验的培养基中。立即处理组织，或者如有必要，将样品保持在4°C最多6小时，直到进一步处理。
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Representative Results
在大规模药物反应研究的背景下，我们使用上述方案成功植入了170多只小鼠（C75Bl6 / J受体小鼠，雄性和雌性小鼠性别匹配的PDAC细胞系注射），例如图1中的主要步骤12。在该协议中，我们原位植入了三种 KrasG12D 驱动的 PDAC 细胞系（PDAC 1 和 2：Ptf1aCre/+;LSL-克拉斯G12D/+;LSL-Trp53R172H/+， PDAC 3： ptf1acre/+;LSL-克拉斯G12D/+;LSL-Trp53 R172H/R172H），之前在实验室中生成。PDAC细胞的植入最早可以在手术后约7天进行腹部触诊，具体取决于注射的细胞数量以及接种细胞系的侵袭性和生长特性。MRI（图2A），超声和小鼠腹部的BLI可用于肿瘤体积的定量测量。根据细胞系的肿瘤细胞内在特征，所得植入小鼠的存活率可能会有所不同（图2B）。成功的胰腺内注射导致小鼠胰腺中完全成熟的肿瘤（图2C，D）。相反，不成功的植入可能导致胰腺肿瘤的缺失，因为a）注射非活细胞，b）排斥植入的细胞（例如，如果细胞与受体小鼠不同源），或c）注射的细胞数量不足。其他阴性结局可能导致胰腺中没有原发肿瘤，但在腹膜存在肿瘤，对应于注射部位（例如，通过胰腺注射部位的肿瘤细胞悬浮液溢出）。
图 1：协议主要步骤的示意图 。 （A）PDAC细胞在植入前应至少传代一次。（B）将细胞胰蛋白酶消化以将其从烧瓶中分离，转移到15mL管中并计数。（C）将适当的细胞稀释液放入管中并带到植入室。（D）受体小鼠在将要进行手术的区域进行麻醉，剃须和消毒。（E）在对应于胰尾位置的小鼠腹部进行1厘米的切口。（F）将所需数量的细胞注射到胰尾。缩写：PDAC = 胰腺导管腺癌。 请点击此处查看此图的大图。
图2：同系小鼠原位同种异体移植的成功结果示例 。 （A）原代小鼠PDAC细胞原位移植后2周小鼠的代表性MRI。虚线轮廓表示肿瘤。比例尺= 5毫米。 （B）三种不同小鼠PDAC细胞系（PDAC 1-3）的Kaplan-Meier存活曲线，原位移植到同系免疫活性小鼠的胰腺中（C57Bl / 6J背景）。（C）从原位注射的PDAC1细胞系的终点分离的肿瘤的代表性图像。照片中显示了由胰腺内成功注射肿瘤细胞和脾脏引起的胰腺肿瘤。比例尺 = 5 mm. （D） 条形图描绘了来自 PDAC 1-3 的原位移植肿瘤的平均肿瘤重量。点代表单个小鼠。缩写：PDAC = 胰腺导管腺癌;MRI = 磁共振成像。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
同系小鼠原位同种异体移植物因其成本效益、可重复性和相对简单的实验程序而代表了临床前研究的稳健模型13，15。这些模型不仅可以研究肿瘤 - 宿主相互作用，还可以保证在使用原代小鼠细胞培养物进行实验时保留其起源肿瘤的遗传异质性。
该协议为小鼠PDAC细胞培养物的原位植入胰腺提供了一种简单快速的程序。为了获得可重复的结果，必须牢记几个技术考虑因素，包括手术技术的质量。由于外科实践不同，建议一个人在同一实验中进行所有原位注射。
应谨慎将细胞注射到胰腺中。溢出的细胞、刺穿胰腺或损伤组织会导致细胞移植在胰腺以外的其他器官部位。这可能会使原发肿瘤的临床评估（例如大小和局部浸润）及其局部和远处转移扩散复杂化。因此，建议记录和评估气泡形成以及有关每只植入小鼠细胞溢出的任何信息。皮肤和腹膜的切口应以适当的大小进行，以便在保持伤口尽可能小的同时，以最佳方式进入胰腺。
植入细胞的数量可以根据实验计划进行调整。虽然大量植入的细胞会导致生理上快速生长的肿瘤和临床症状的快速进展，但较小的细胞数量会增加肿瘤无法移植的风险。此外，建议使用少量细胞悬液，因为较大的体积（>20μL）与囊性核心形成的可能性增加有关13。我们发现，在20μL的细胞培养基中植入2，500-5，000个细胞是临床前治疗研究的最佳量，可确保肿瘤在数周内生长。但是，对于其他应用，最多可以植入1.6×106 个细胞。
除细胞培养基外，基质胶还可作为营养丰富的培养基重悬PDAC细胞，这也增加了注射液的粘度，从而防止肿瘤细胞渗漏13.该方案优选将注射到胰腺尾部区域，因为胰尾很容易接近并且进入胰头的途径有限。成功将细胞注射到胰头的方案在别处描述13，15。为了执行外科手术，使用药物组合（包括咪达唑仑，美托咪定和芬太尼）以及美洛昔康作为围手术期和术后镇痛药，使小鼠保持镇静。或者，异氟醚与适当的镇痛药组合可在恒定流量下用作吸入麻醉剂。动物许可证选择的镇静方法的选择取决于机构指南和相应的地方当局。
仔细选择细胞系和受体小鼠势在必行。事实上，重要的是要确保受体小鼠的遗传背景与所选细胞系的遗传背景相匹配，以避免PDAC细胞的免疫原性和移植排斥反应。此外，由植入的肿瘤细胞表达的免疫原性外源蛋白，如荧光报告等位基因或Cas9，会影响宿主的反应，并可能导致免疫原性反应。因此，肿瘤生长和TME的组成会受到影响并引起偏倚。
与GEMMs相比，同源原位小鼠同种异体移植物显示出减少的纤维增生量，并且在某些情况下，转移播散率较低，部分限制了与人类肿瘤的相似性。此外，对手术干预的需求增加了手术的复杂性。由于非活细胞注射、植入细胞排斥、注射细胞数量少和注射泄漏，导致在所需位置没有胰腺肿瘤的植入不成功可能会阻止实验程序的完成。
尽管存在这些局限性，PDAC的同源原位小鼠同种异体移植模型已被证明可以有效地解决研究PDAC及其异质性的许多挑战。凭借其高度可重复的表型和肿瘤生长模式，以及肿瘤-TME相互作用，它们代表了一种宝贵的资源，可以按照相对简单的方案快速获得。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们要感谢TUM动物设施和核医学部成像核心设施Klinikum rechts der Isar提供的出色技术支持。这项研究得到了德国癌症联盟（DKTK）、德国研究协会（DFG SA 1374/4-2、DFG SA 1374/6-1、SFB 1321项目编号329628492 P06、P11和S01）的支持，威廉·桑德基金会（2020.174.1和2017.091.2）到D.S.，以及欧洲研究理事会（ERC CoG No. 648521，D.S.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
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