Summary
Pankreatik duktal adenokarsinomun (PDAC) sinjenik fare ortotopik allogreftleri, hastalık alt tiplerinin biyolojisini, fenotiplerini ve terapötik yanıtlarını özetler. Hızlı, tekrarlanabilir tümör progresyonları nedeniyle, preklinik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Burada, pankreasa sinjenik murin PDAC kültürleri enjekte ederek bu modelleri oluşturmak için ortak uygulamalar gösteriyoruz.
Abstract
Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC), çeşitli stroma, immün hücreler, damarlar, sinirler ve hücre dışı matriks bileşenlerinden oluşan heterojen bir tümör mikroçevresi ile karakterize çok karmaşık bir hastalıktır. Yıllar geçtikçe, ilerlemesinin, metastatik potansiyelinin ve fenotipik heterojenliğinin yarattığı zorlukları ele almak için farklı PDAC fare modelleri geliştirilmiştir. PDAC'nin immünkompetan fare ortotopik allogreftleri, genetiği değiştirilmiş fare modellerine kıyasla hızlı ve tekrarlanabilir tümör progresyonları nedeniyle iyi bir umut vaat etmektedir. Ayrıca, otokton PDAC'de gözlenen biyolojik özellikleri taklit etme yetenekleriyle birlikte, hücre çizgisi tabanlı ortotopik allogreft fare modelleri, büyük ölçekli in vivo deneylere olanak tanır. Bu nedenle, bu modeller hızlı genotip-fenotip ve ilaç-yanıt analizleri için klinik öncesi çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokolün amacı, birincil fare PDAC hücre kültürlerini sinjenik alıcı farelerin pankreasına başarılı bir şekilde enjekte etmek için tekrarlanabilir ve sağlam bir yaklaşım sağlamaktır. Teknik detayların yanı sıra bu deneyleri yapmadan önce dikkat edilmesi gereken önemli bilgiler de verilmektedir.
Introduction
Son zamanlarda, PDAC batı dünyasında kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedeni haline geldi1. Tüm kanserler arasında en yüksek ölüm oranına ve on yıllardır değişmeyen ~% 1'lik 10 yıllık genel sağkalım oranına neden olur2. PDAC tedavisinde ilerleme kaydedilmemesi nedeniyle, bu hastalığın önümüzdeki on yılda kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedeni haline gelmesi beklenmektedir3.
PDAC tümörleri, stroma, vasküler, immün ve hücre dışı matriks bileşenlerinin heterojen bir birleşiminden oluşan çeşitli tümör mikroçevresi (TME) ile karakterize kompleks antitelerdir4. TME'nin bileşimindeki farklılıklar hastalık prognozunu ve tedaviye yanıtı etkiler 4,5,6. Gerçekten de, birçok çalışma, PDAC'nin bazal benzeri, mezenkimal alt tipinin yüksek immünsüpresif bir TME ile ilişkili olduğunu ve sağkalımın azaldığını ve tedavilere yanıt eksikliğini gösterdiğini göstermiştir 7,8,9,10,11,12. Bu nedenle, TME kompozisyonundaki farklılıkların ve bu özelliklerin tümör biyolojisini nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılması, moleküler olarak kesin tedavilerin geliştirilmesi için önemli bir faktör olmaya devam etmektedir. Bu karmaşık fenotipin arkasındaki biyolojiyi daha iyi anlamak ve PDAC TME'sinin oluşturduğu engeli aşabilecek terapötik stratejileri tanımlamak için, in vivo modeller vazgeçilmezdir.
Herhangi bir kanser preklinik model sistemi için kilit bir husus, insan fenotiplerini taklit etmesi, hem genetik heterojenliği hem de TME'yi oluşturan çok sayıda stromal ve immün popülasyonu içeren ortamı özetlemesidir. Bu nedenle, klinik öncesi araştırmalar için fare modellerini seçerken, çeşitli hususlar dikkate alınmalıdır. Tümör-immün etkileşimini araştırmak için, histouyumlu kanser hücre hatları sinjenik immünokompetan farelere enjekte edilebilir. Çoğu durumda, bunlar farenin yan tarafına deri altından enjekte edilir ve palpasyon veya görsel muayene ile kolay tümör izlemesi sağlar. Bununla birlikte, ortaya çıkan modeller, menşe organlarındaki tümör hücrelerinin büyümesini taklit etmez. Bu nedenle ortotopik transplantasyonlar allogreft modelleri için altın standart haline gelmiştir.
Fare ortotopik allogreftlerinin birçok avantajı vardır: uygun maliyetlidirler, nispeten basit bir prosedürle üretilebilirler ve bilinen moleküler yapıya sahip modellerin yanı sıra tekrarlanabilir ve öngörülebilir bir tümör progresyonu ve fenotipine sahip modellerle sonuçlanırlar. Gerçekten de, hasta kaynaklı ksenogreft modelleri, insan PDAC hücrelerinin davranışını doğru bir şekilde temsil ederken, greft reddini önlemek için immün yetmezlikli farelere implantasyon ihtiyacı, tümör-immün ve tümör-stroma etkileşimlerinin analizini sınırlayarak, araştırmacıların bu tümörlerin karmaşıklığının yalnızca kısmi bir görüntüsünü yakalamalarına izin verir. PDAC'nin sinjenik ortotopik allogreftleri, genetiği değiştirilmiş fare modellerine (GEMM'ler) kıyasla bu konuda da avantajlıdır. GEMM'ler insan PDAC tümörigenezini ve PDAC hastalarında gözlenen heterojeniteyi doğru bir şekilde özetler. Ancak bu özelliklerinden dolayı GEMM tümörleri genetik yapılarında, tümör progresyonunda, agresifliğinde, histolojik farklılaşmasında ve TME kompozisyonunda yüksek varyans gösterebilir. Bu, bazı çalışmalarda bir avantaj olsa da, genotip-fenotip çalışmalarını ve PDAC fenotiplerinin odaklanmış araştırmasını sınırlar13. Bu nedenle fare ortotopik allogreftleri, tümör-konakçı ve tedavi çalışmalarını in vivo olarak gerçekleştirmek için iyi bir denge ve model oluşturmaktadır. Bu yazıda, murin PDAC hücrelerinin fare pankreasına ortotopik transplantasyon deneyleri için bir protokol özetlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri, Münih Teknik Üniversitesi ve Regierung von Oberbayern yerel makamlarının kurumsal hayvan bakım ve kullanım komiteleri (IACUC'ler) tarafından onaylandı.
1. İşlemden önce dikkat edilmesi gereken bilgiler
- Herhangi bir hayvan deneyine başlamadan önce hayvan protokolünün ve personelinin yerel yetkililer tarafından onaylanmasını sağlayın.
- Alıcı fareleri seçin.
- İmplantasyon için benzer yaştaki fareleri seçin (2 ay ile 4 ay arasında yaş aralığına sahip C57Bl/6J alıcı fareler).
- Alıcı hayvanların cinsiyetinin ve genetik arka planının, implantasyon için kullanılan hücre hattının kaynaklandığı hayvanların (sinjenik allogreftler) cinsiyeti ve genetik arka planı ile eşleştiğinden emin olun.
- Fareleri implantasyon için hazırlayın.
NOT: Fareleri yerel hayvan tesisinin hijyen standartlarına göre kullanın.- İmplantasyon gününde, anesteziklerin uygulanmasından kaynaklanan komplikasyonları önlemek için fareleri işlemden 4 saat önce beslemeyin.
- Gerekli anesteziklerin miktarını hesaplamak için implantasyondan önce fareleri tartın.
- Fareleri ameliyathaneye aktarın.
- PDAC hücre satırlarını seçin.
- Hücre çizgilerinin türetildiği farelerin genetik arka planının ve cinsiyetinin, alıcı farelerin arka planı ve cinsiyetiyle eşleştiğinden emin olun (örneğin, daha önceaçıklandığı gibi, aşağıdaki genotiplere sahip, laboratuvarda bir C57Bl / 6J arka plan üzerinde PDAC GEMM'lerden daha önce üretilen PDAC hücre çizgileri PDAC 1-3: PDAC 1 ve 2: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H).
- Potansiyel olarak immünojenik olan proteinleri eksprese etmeyen hücre çizgilerini seçin.
- PDAC hücre hatlarını kültürleyin.
NOT: Hücre kültürü çalışmasını laminer akış başlığı altında gerçekleştirin. Çalışmadan önce eldivenleri, çalışma alanını ve malzemeleri dezenfekte edin.- Pelet 5 mL hücre kültürü ortamında yeniden askıya alınarak implantasyondan 1 hafta önce hücreleri çözün. Hücreleri aşağı doğru döndürün, süpernatanı aspire edin, pelet 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alın ve hücreleri tekrar aşağı döndürün. Süpernatantı çıkarın ve Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamının (DMEM) 5 mL'sindeki hücreleri% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 0.1 penisilin-streptomisin (PS) ile yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 25 cm²'lik bir şişeye aktarın.
- İmplantasyondan önce hücre çizgilerini en az bir kez geçirin.
- Hücre ortamını çıkarın, PBS ile 1x yıkayın ve hücreleri şişeden ayırmak için 0.5 mL tripsin ekleyin. Hücreleri şişeden ayrılana kadar 37 ° C'de inkübe edin (hücre hattına bağlı olarak, bu genellikle 5-10 dakika sürer). Hücreler ayrıldığında, hücreleri% 10 FBS ve% 0.1 PS ile 10 mL DMEM'de yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu 75 cm²'lik bir şişeye aktarın.
NOT: FBS tripsini inaktive ettiğinden, tripsinizasyonu engeller.
- Hücre ortamını çıkarın, PBS ile 1x yıkayın ve hücreleri şişeden ayırmak için 0.5 mL tripsin ekleyin. Hücreleri şişeden ayrılana kadar 37 ° C'de inkübe edin (hücre hattına bağlı olarak, bu genellikle 5-10 dakika sürer). Hücreler ayrıldığında, hücreleri% 10 FBS ve% 0.1 PS ile 10 mL DMEM'de yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu 75 cm²'lik bir şişeye aktarın.
- İmplantasyon gününde ~% 70 -% 80 arasında akıcılık sağlayın.
- İmplantasyon için gerekli malzeme
- Tüm cerrahi aletleri otoklavlayın.
- Hayvan deneyi lisansına dayanarak anestezikleri hazır tutun.
- Analjezi için meloksikamı en az 5 dakika önceden, anti-enflamatuar özelliklere sahip uzun süreli bir analjetik olarak kullanın.
- Cerrahi için, analgosedasyon için midazolam, medetomidin ve fentanil (MMF) kombinasyonu kullanın.
- İmplantasyondan sonra MMF analgosedasyonunu antagonize etmek için atipamezol, flumazenil ve nalokson (AFN) kombinasyonu kullanın.
- Steril bir örtü, bir ısıtma matı, bir tıraş makinesi, eldivenler, göz kremi,% 0,9 sodyum klorür, iyot veya klorheksidin bazlı cerrahi ovma,% 80 etanol, çözünür sütür, yara klipsleri, 50 μL enjeksiyon hacimli şırınga ve bant hazırlayın.
2. İmplantasyondan önce hücre hatlarının hazırlanması
NOT: Tümör hücrelerini sadece fareler implantasyon için hazır olduğunda hazırlayın. Hücrelerin toplanması veya toplanması ile implantasyon arasında kısa bir zaman dilimi olmasını sağlayın.
- Kullanmadan önce tüm sıvıları 37 °C'ye ısıtın.
- Hücreleri (1x T75'ten (75cm2'lik bir kültür şişesi) başlayarak adım 1.5.2.1'de açıklandığı gibi şişeden ayrılana kadar hazırlayın. Hücreleri% 10 FBS ve% 0.1 PS ile 10 mL DMEM'de yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Hücreleri bir santrifüjde 5 dakika boyunca 200 × g'da döndürün. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini, enjeksiyon için hücrelerin gerekli son konsantrasyonuna dayanan katkı maddeleri olmadan yeterli miktarda DMEM içinde yeniden askıya alın. Neubauer odası kullanarak hücreleri saymak ve mevcut hücrelerin sayısını hesaplamak için hücre süspansiyonunun 10 μL'sini kullanın.
- Hücreleri, DMEM'de katkı maddesi olmadan enjeksiyon için gereken son hücre sayısına (örneğin, 20 μL'de 2.500 hücre) seyreltin. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 1 mL'sini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücrelerin birikmesini önlemek için implantasyona kadar tüpü bir rotatöre yerleştirin.
3. PDAC hücrelerinin ortotopik implantasyonu
NOT: Cerrahi deneyimin yetersiz olması durumunda, önce kadavralarla pratik yapın ve örneğin bir hayvan eğitim protokolü dahilinde yeterli eğitim alın. Ameliyatı ve hayvan deneylerini gerçekleştiren personelin, ilgili makamların kriterlerini ve kurumsal yönergeleri yerine getirmesi gerekmektedir.
- Meloksikamı perioperatif analjezik olarak kullanın ve deri altından 5 mg / kg vücut ağırlığı uygulayın.
- Her farenin vücut ağırlığına göre intraperitoneal olarak MMF enjekte edin (midazolam [5.0 mg / kg], medetomidin [0.5 mg / kg] ve fentanil [0.05 mg / kg]).
- Fareyi 10-15 dakika boyunca kafese geri koyun.
- Fare uyurken göz kremi sürün.
- Pedal çekme refleksini test ederek 10 dakika sonra yeterli analjosedasyonu kontrol edin (her iki arka ayağın ayak pedlerini sıkıştırın). Bir yanıt durumunda, orijinal analgosedasyon dozunun 1 / 3'ünü uygulayın. 10 dakika sonra, prosedürü tekrarlayın ve sadece pedal çekme refleksi olmadığında devam edin.
- Farenin sol yanal karın kanadını tıraş edin. Sağ tarafta yatan fareyi steril bir ısıtma paspasının üzerine yerleştirin ve bacaklarını yüzeye bantlayın. Karnı iyot veya klorheksidin bazlı cerrahi ovma ve ardından dairesel bir hareketle% 80 etanol kullanarak dezenfekte edin ve prosedürü üç kez tekrarlayın. Cerrahi alanın sterilitesini korumak için cerrahi bir örtü kullanın.
- Yeni eldivenler giyin ve dezenfekte edin. Dalağın yansıtıldığı sol kanatta cildi ve deri altı yağ dokusunu uzunlamasına kesmek için cerrahi makas kullanın. Yaklaşık 1 cm uzunluğunda bir kesim yapın.
- Makas ve forseps kullanarak, peritona daha kolay erişmek için cildi peritondan ayırın.
- Makas çiftini değiştirin. Peritonu dalağın bulunduğu yerde 1 cm uzunlamasına bir kesimle açın.
- Dalağı ve bağlı pankreası künt, ince uçlu forsepsler kullanarak harekete geçirin. Organların diğer dokulara bağlı olmadığından emin olun ve pankreası tutarken damarlara veya çevresindeki dokuya zarar vermemek için kan damarlarının tedarik edilip edilmediğini kontrol edin.
NOT: Kanamayı önlemek için dalağı doğrudan tutmayın. - Organın kuyruğuna daha kolay erişim sağlamak için pankreası dikkatlice insizyondan çekin ve pankreası takip eden dalağı gözlemleyin. Pankreası forseps ile tutmak için baskın olmayan eli kullanın ve pankreasın ekstrakorporalleşmesini önleyen bağları dikkatlice kesin. Enjeksiyon sırasında organın katlanmadığından ve dökülmeyi önlemek için organın kapsülünün iğne penetrasyon bölgesinde gerginlik altında tutulduğundan emin olun.
- Enjeksiyonu gerçekleştirmek için baskın eli kullanın. Organın kapsülüne, organın uzunlamasına eksenini takip eden şırınganın iğnesiyle dikkatlice nüfuz edin. Bir damara delinme veya enjekte edilme riskini en aza indirmek için görünür kan damarları arasında bir pankreas dokusu parçasını hedefleyin. Deneysel plana göre yeterli sayıda hücreyi (burada, 20 μL DMEM'de 2.500 hücre) pankreasın kuyruk bölgesine 27 G kanül ve 50 μL şırınga ile yavaşça enjekte edin.
NOT: Dokuya başarılı bir şekilde enjekte edildiğinde şeffaf bir kabarcık oluşur. - Tümör hücrelerinin dökülmesini önlemek için pankreası ve yerleştirilen şırıngayı yaklaşık 1 dakika boyunca sabit tutun. İğneyi enjeksiyon bölgesinden dikkatlice çıkarın.
NOT: İğneleri fareler arasında değiştirin ve yeni bir hücre hattının enjeksiyonu için yeni bir steril şırınga kullanın. - Karın içindeki organları dikkatlice yeniden düzenleyin. Hücrelerin dökülmesini önlemek için dokuya zarar vermemeye dikkat edin. Organ yapışmasını önlemek için organlara 1 mL% 0.9 sodyum klorür dökün.
- Basit kesilmiş dikiş tekniğini kullanarak peritonu dikkatlice dikin ve iki ila üç adet 9 mm paslanmaz çelik yara klipsi kullanarak cildi kapatın.
NOT: Cerrahi kesi iyileştiyse, implantasyondan 7 gün sonra yara klipslerini çıkarın. - Gerekirse, deri altına 0.5 mL sodyum klorür enjekte ederek prosedür ve anestezi nedeniyle hayvanların dehidrasyonunu önleyin.
- İmplantasyondan sonra, MMF ile analjosedasyonu, farenin vücut ağırlığına göre deri altı AFN enjeksiyonu (atipamezol [2.5 mg / kg], flumazenil [0.5 mg / kg], nalokson [1.2 mg / kg]) ile antagonize edin.
- Fareyi uyanık ve tamamen aktif olana kadar 37 °C ısıtılmış bir odaya yerleştirin. Ardından, fareyi orijinal kafesine geri yerleştirin. Kürkü, ten rengini ve aktivitesini kontrol ederek farenin sağlık durumunu izleyin ve ameliyattan 3-4 saat sonra bunu tekrarlayın.
4. Fareler için bakım sonrası
- Hayvan tesisine geri döndüklerinde farelerin suya ve yiyeceğe erişmesini sağlayın.
- Ameliyattan sonra 2-3 gün boyunca her 6-12 saatte bir deri altı veya oral meloksikam (5 mg / kg) uygulamasına devam edin.
- Farelerin sağlık durumunu, hayvan protokolüne ve kurumsal yönergelere göre düzenli olarak izleyin.
- Deneyin amacına bağlı olarak, palpe etme, ultrason görüntüleme, biyolüminesans (BLI) veya manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile tümör büyümesini her hafta veya daha sık izleyin.
NOT: Tercih edilen yönteme, büyüme hızına ve implante edilen hücre sayısına bağlı olarak, bir tümör enjeksiyondan 1 hafta sonra tespit edilebilir.
5. Tümör greftlerinin toplanması
- Deney sonunda veya farelerin kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitelerinin veya hayvan deneyi lisansının kriterlerini izleyerek ötenazi yapılması gerektiğinde tümörleri toplayın.
- Hayvan deneyi lisansının izin verdiği bir yöntemi kullanarak fareyi ötenazi yapın.
NOT: İskemi süresini en aza indirmek için minimum zaman kaybı ile adımları uygulayın. Bu nedenle servikal çıkık hızlı bir yöntem olduğu ve terminal kanama veya kimyasal yöntemlerin aksine ölüm zamanı tam olarak belirlenebildiği için önerilmektedir. - Fareyi sırtüstü yatarak steril bir paspas üzerine yerleştirin ve bacaklarını yüzeye bantlayın. Karnı dezenfekte etmek için% 80 etanol kullanın.
- Yeni eldivenler giyin ve dezenfekte edin. Cildi merkezi karın bölgesinde uzunlamasına kesmek için cerrahi makas kullanın.
- Makas ve forseps kullanarak, peritona daha kolay erişmek için cildi peritondan ayırın.
- Makas çiftini değiştirin. Peritonu orta karın bölgesinde 5 cm uzunlamasına bir kesimle açın.
- Dalağı ve bağlı pankreası künt, ince uçlu forsepsler kullanarak harekete geçirin. Forseps ve cerrahi makas kullanarak tümörü çevreleyen dokudan dikkatlice ayırın.
- Tümör dokusunu aşağı akış deneyleri için uygun bir ortamda saklayın. Dokuları hemen işleyin veya gerekirse numuneyi sonraki işlemlere kadar maksimum 6 saat boyunca 4 ° C'de tutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Büyük ölçekli bir ilaç yanıtı çalışması bağlamında, yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, Şekil 112'deki ana adımlarında örneklenen 170'ten fazla fareyi (C75Bl6 / J alıcı fareler, enjekte edilen PDAC hücre hatlarıyla eşleşen erkek ve dişi farelerin cinsiyeti) başarıyla implante ettik. Bu protokolde, üç KrasG12D güdümlü PDAC hücre hattını (PDAC 1 ve 2: Ptf1aCre / +; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+, PDAC 3: Ptf1aCre/+; LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53 R172H/R172H), daha önce laboratuvarda üretilenler. PDAC hücrelerinin engraftasyonu, enjekte edilen hücre sayısına ve aşılanan hücre hattının agresifliğine ve büyüme özelliklerine bağlı olarak, ameliyattan yaklaşık 7 gün sonra en erken abdominal olarak palpe edilebilir. MRG (Şekil 2A), ultrason ve fare karnının BLI'sı, tümör hacminin kantitatif ölçümleri için kullanılabilir. Hücre hatlarının tümör hücresine özgü özelliklerine bağlı olarak, ortaya çıkan implante farelerin hayatta kalma süreleri değişebilir (Şekil 2B). Başarılı intrapankreas enjeksiyonları fare pankreasında tam gelişmiş tümörlere yol açar (Şekil 2C, D). Buna karşılık, başarısız implantasyonlar, a) canlı olmayan hücrelerin enjeksiyonu, b) implante edilen hücrelerin reddedilmesi (örneğin, hücreler alıcı fareye sinjenik değilse) veya c) enjekte edilen yetersiz sayıda hücre nedeniyle pankreas tümörlerinin yokluğuna neden olabilir. Alternatif negatif sonuçlar, pankreasta primer bir tümörün bulunmamasına, ancak peritonda enjeksiyon bölgesine karşılık gelen bir tümörün varlığına yol açabilir (örneğin, tümör hücresi süspansiyonunun pankreas enjeksiyon bölgesinden dökülmesi yoluyla).
Şekil 1: Protokolün ana adımlarının şematik gösterimi . (A) PDAC hücreleri implantasyondan önce en az bir kez geçirilmelidir. (B) Hücreler, şişeden ayrılmak için tripnize edilir, 15 mL'lik bir tüpe aktarılır ve sayılır. (C) Uygun hücre seyreltmesi bir tüpe yerleştirilir ve implantasyon odasına getirilir. (D) Alıcı fare, ameliyatın yapılacağı bölgede uyuşturulur, tıraş edilir ve dezenfekte edilir. (E) Pankreas kuyruğunun bulunduğu yere karşılık gelen fare karnına 1 cm'lik bir kesim yapılır. (F) İstenilen sayıda hücre pankreasın kuyruğuna enjekte edilir. Kısaltma: PDAC = pankreatik duktal adenokarsinom. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sinjenik fare ortotopik allogreftleri üzerinde başarılı sonuçlara örnekler. (A) Primer fare PDAC hücrelerinin ortotopik transplantasyonundan 2 hafta sonra bir farenin temsili MRG'si. Kesikli anahat tümörü gösterir. Ölçek çubuğu = 5 mm. (B) Üç farklı fare PDAC hücre hattının (PDAC 1-3) Kaplan-Meier hayatta kalma eğrisi, topikal olarak sinjenik immünokompetan farelerin pankreasına nakledilir (C57Bl / 6J arka plan). (C) Ortopikal olarak enjekte edilen PDAC1 hücre hattından uç noktada izole edilen bir tümörün temsili görüntüsü. Hem tümör hücrelerinin başarılı bir intrapankreas enjeksiyonundan kaynaklanan bir pankreas tümörü hem de dalak fotoğrafta gösterilmiştir. Ölçek çubuğu = 5 mm. (D) PDAC 1-3 arasında ortotopik olarak nakledilen tümörlerin ortalama tümör ağırlıklarını gösteren Barplot. Noktalar bireysel fareleri temsil eder. Kısaltmalar: PDAC = pankreatik duktal adenokarsinom; MRG = manyetik rezonans görüntüleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sinjenik fare ortotopik allogreftleri, maliyet etkinlikleri, tekrarlanabilirlikleri ve nispeten basit deneysel prosedürleri nedeniyle klinik öncesi çalışmalar için sağlam bir model oluşturmaktadır13,15. Bu modeller sadece tümör-konakçı etkileşimlerinin incelenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda deney için birincil fare hücre kültürleri kullanıldığında ortaya çıktıkları tümörlerin genetik heterojenliğinin korunmasını da garanti eder.
Bu protokol, fare PDAC hücre kültürlerinin pankreasa ortotopik implantasyonu için basit ve hızlı bir prosedür sunar. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, cerrahi tekniğin kalitesi de dahil olmak üzere çeşitli teknik hususlar akılda tutulmalıdır. Cerrahi uygulamalar değiştiğinden, bir kişinin tüm ortotopik enjeksiyonları aynı deney içinde gerçekleştirmesi önerilir.
Hücrelerin pankreas içine enjeksiyonu dikkatle yapılmalıdır. Dökülen hücreler, pankreası delmek veya dokuya zarar vermek, hücrelerin pankreas dışındaki diğer organ bölgelerine aşılanmasına neden olabilir. Bu, primer tümörün klinik değerlendirmesini (örneğin, boyut ve lokal infiltrasyon) ve lokal ve uzak metastatik yayılımını zorlaştırabilir. Bu nedenle, implante edilen her fare için kabarcık oluşumunu ve hücre dökülmesi ile ilgili herhangi bir bilgiyi belgelemeniz ve değerlendirmeniz önerilir. Deri ve peritondaki kesikler, yaraları mümkün olduğunca küçük tutarken pankreasa en uygun erişimi sağlamak için uygun bir boyutta yapılmalıdır.
İmplante edilen hücrelerin sayısı deney planına bağlı olarak ayarlanabilir. Daha fazla sayıda implante edilmiş hücre fizyolojik olarak hızlı büyüyen tümörlere ve klinik semptomların hızlı ilerlemesine yol açarken, daha küçük hücre sayıları tümörlerin aşılanmama riskini arttırır. Ayrıca, daha büyük hacimler (>20 μL), kistik çekirdek13 oluşumunun artmış potansiyeli ile ilişkili olduğundan, küçük hacimli hücre süspansiyonları önerilir. 20 μL hücre kültürü ortamının hacmine 2.500-5.000 hücrenin implante edilmesinin, birkaç hafta boyunca tümör büyümesini sağlayarak klinik öncesi terapötik çalışmalar için en uygun miktar olduğunu bulduk. Bununla birlikte, diğer uygulamalar için, 1.6 × 106 hücreye kadar implante edilebilir.
Hücre kültürü ortamına ek olarak, Matrigel, PDAC hücrelerini yeniden askıya almak için besin açısından zengin bir ortam olarak kullanılabilir, bu da enjeksiyon çözeltisinin viskozitesini arttırır, böylece tümör hücrelerinin sızmasını önler13. Pankreas kuyruğuna kolay ulaşılabilmesi ve pankreas kafasına erişimin sınırlı olması nedeniyle pankreasın kuyruk bölgesine enjeksiyonlar bu protokol ile tercih edilmektedir. Hücreleri pankreas kafasına başarılı bir şekilde enjekte etmek için kullanılan protokoller başka bir yerde tanımlanmıştır13,15. Cerrahi prosedürü gerçekleştirmek için, fareler midazolam, medetomidin ve fentanil içeren bir ilaç kombinasyonunun yanı sıra peri- ve postoperatif analjezik olarak meloksikam kullanılarak analgozedasyon altında tutulur. Alternatif olarak, uygun analjeziklerle kombinasyon halinde izofluran, sabit akış altında inhalan anestezi olarak kullanılabilir. Hayvan lisansı için tercih edilen analgosedasyon yönteminin seçimi, kurumsal yönergelere ve ilgili yerel makamlara bağlıdır.
Hücre hatlarının ve alıcı farelerin dikkatli seçimi zorunludur. Gerçekten de, alıcı farelerin genetik arka planının, PDAC hücrelerinin immünojenisitesini ve greft reddini önlemek için seçilen hücre hatlarının genetik arka planıyla eşleştiğinden emin olmak önemlidir. Ayrıca, implante edilmiş tümör hücreleri tarafından eksprese edilen floresan muhabir alelleri veya Cas9 gibi immünojenik eksojen proteinler, konağın tepkisini etkiler ve immünojenik reaksiyona yol açabilir. Bu nedenle, tümör büyümesi ve TME'nin bileşimi etkilenebilir ve önyargıya neden olabilir.
GEMM'lere kıyasla, sinjenik ortotopik fare allogreftleri, kısmen insan tümörlerine benzerliği sınırlayan, daha az miktarda desmoplazi ve bazı durumlarda daha düşük bir metastatik yayılma oranı göstermektedir. Ayrıca, cerrahi müdahale ihtiyacı prosedürün karmaşıklığını arttırmaktadır. Canlı olmayan hücre enjeksiyonu nedeniyle istenilen yerde pankreas tümörlerinin bulunmaması, implante edilen hücrelerin reddedilmesi, enjekte edilen hücre sayısının az olması ve enjeksiyon kaçağı ile sonuçlanan başarısız implantasyonlar, deneysel prosedürün tamamlanmasını engelleyebilir.
Bu sınırlamalara rağmen, PDAC'nin sinjenik ortotopik fare allogreft modellerinin, PDAC ve heterojenliğini incelemenin zorluklarının çoğunu etkili bir şekilde ele aldığı gösterilmiştir. Yüksek oranda tekrarlanabilir fenotipleri ve tümör büyüme paternlerinin yanı sıra tümör-TME etkileşimleri ile, nispeten basit bir protokolü takiben hızlı bir şekilde elde edilebilecek paha biçilmez bir kaynağı temsil ederler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
TUM hayvan tesisine ve Nükleer Tıp Anabilim Dalı Klinikum rechts der Isar'ın görüntüleme çekirdek tesisine mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Alman Kanser Konsorsiyumu (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 ve S01) tarafından D.S.'ye, Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 ve 2017.091.2) tarafından D.S.'ye ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC CoG No. 648521, D.S.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D.
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
