Summary
Præsenteret her er en protokol til generering af formalinfikserede, paraffinindlejrede cellepelletkontroller til immunhistokemi.
Abstract
Positive og negative kontroller med kendt ekspression af målproteiner er afgørende for udviklingen af immunohistokemiske (IHC) assays. Mens vævskontrol er gavnlig for velkarakteriserede proteiner med definerede vævs- og cellulære ekspressionsmønstre, er de mindre egnede til den indledende udvikling af IHC-assays til nye, dårligt karakteriserede eller allestedsnærværende udtrykte proteiner. Alternativt, på grund af deres standardiserede karakter, kan cellepellets, herunder kræftcellelinjer med definerede protein- eller transkriptionsekspressionsniveauer (f.eks. Høj, medium og lav ekspression), transficerede overekspressive cellelinjer eller cellelinjer med gener slettet gennem celletekniske teknologier som CRISPR, tjene som værdifulde kontroller, især til den indledende antistofkarakterisering og udvælgelse. For at disse cellepiller kan anvendes i udviklingen af IHC-assays til formalinfikserede, paraffinindlejrede væv, skal de behandles og indlejres på en måde, der rekapitulerer de procedurer, der anvendes til vævsbehandling. Denne protokol beskriver en proces til oprettelse og behandling af formalinfaste, paraffinindlejrede cellepelletkontroller, der kan bruges til udvikling af IHC-metoder.
Introduction
Immunohistokemi (IHC) er en af de mest almindeligt anvendte assays i undersøgende og diagnostisk patologi. Afhængigt af konteksten og analysen bruges IHC til at hjælpe med kræftdiagnose1,2, forudsige behandlingsrespons3,4, identificere patogener5, karakterisere celletyper i syge væv6 og studere biologiske veje og vævsresponser 7,8. I alle situationer er det grundlæggende princip for et IHC-assay, at et antistof binder specifikt til et mål af interesse, oftest et protein, og denne bindingshændelse visualiseres efterfølgende i et vævsafsnit9. En af de største udfordringer ved ethvert IHC-assay er imidlertid at sikre, at antistofferne specifikt detekterer måletfor interesse 10. Antistofspecificitet er en udfordring i de fleste immunassays, men immunhistokemi giver unikke udfordringer, idet der ikke er nogen sekundære foranstaltninger, såsom molekylvægt, til at skelne mellem specifik og uspecifik mærkning. Dette er især besværligt, når man evaluerer dårligt karakteriserede eller allestedsnærværende udtrykte mål, der mangler veldefinerede cellulære lokaliseringsmønstre. Derfor er robuste kontroller, der kan hjælpe med at karakterisere bindingsspecificitet, kritiske, når man udvikler et nyt IHC-assay10.
For mål, der er veldefinerede med karakteristiske cellulære ekspressionsmønstre, anvendes vævskontroller ofte i IHC-metodeudvikling. Baseret på et væld af tidligere data kan man afgøre, om antistoffet mærker vævet, cellen og det subcellulære rum, hvori det vides at blive udtrykt, og at det ikke mærker vævskomponenter, hvor det ikke skal være til stede11. Vævskontrol er imidlertid af begrænset anvendelse for dårligt karakteriserede, nye mål uden kendte ekspressionsmønstre eller for proteiner, der udtrykkes bredt og mangler forskellige ekspressionsmønstre. I begge disse scenarier gør manglen på et veldefineret udtryksmønster det umuligt at skelne specifikt fra ikke-specifik mærkning i væv. I disse situationer tilbyder cellepiller en værdifuld alternativ IHC-kontrol. Cellepelletskontroller kan omfatte: kræft eller andre cellelinjer, der har endogene eller iboende / ikke-inducerede ekspressionsniveauer af det interessante protein, og hvis proteinekspression kan karakteriseres ved western blotting, flowcytometriske analyser eller ekstrapoleres fra transkriptionel profilering; konstruerede cellelinjer, der enten overudtrykker proteinet af interesse eller får det kodende gen af interesse slettet; eller celler, der er blevet behandlet under særlige betingelser for at inducere proteinekspression eller signalerende hændelser af interesse (f.eks. phosphorylering)10,12. Velkarakteriserede proteinekspressionsniveauer i cellelinjer giver også mulighed for evaluering af følsomheden af et assay ved hjælp af et panel af cellelinjer med høj, medium, lav og fraværende proteinekspression. Derudover kan manipulerede cellepiller være værdifulde artsspecifikke kontroller for veterinærarter, for hvilke der kan være begrænset karakterisering eller tilgængelig vævskontrol13. Mens cellepiller har deres begrænsninger, såsom det begrænsede proteom, der er til stede i cellelinjer, der ikke afspejler det forskellige proteom i væv, tjener de som passende kontroller til at bekræfte, at antistoffet kan detektere målet af interesse samt udelukke vilkårlig binding af det primære antistof, sekundært antistof eller andre regenter i assay10.
De fleste væv i diagnostisk og undersøgende patologi er fastgjort i neutral bufferet formalin, dehydreret i en række alkoholer, ryddet i xylen og behandlet og indlejret i paraffinvoks. Formalinfiksering tværbinder proteiner og fiksering og hvert yderligere trin i vævsbehandling kan direkte påvirke proteiner og antistoffers evne til at detektere dem 9,14. Derfor er det vigtigt, at alle kontroller, der anvendes i et IHC-assay, gennemgår de samme fikserings-, vævsbehandlings- og indlejringsprocedurer. Denne artikel beskriver de unikke overvejelser om at behandle og integrere dyrkede celler til at fungere som kontroller til udvikling af IHC-assays i formalinfikseret paraffinindlejret væv, hvor metoden primært fokuserer på håndtering og behandling af cellepellet i et histologisk laboratorium.
Protocol
1. Forberedelse af cellepellet
- I fire til otte 150 mm2 eller otte x T175 kolber vokser celler i mediet og betingelser, der anbefales til cellelinjen til 80% -90% sammenløb. For eksempel vokse 293T celler i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) med 10% føtalt bovin serum og 2 mM L-glutamin15.
BEMÆRK: Celler skal dyrkes ved hjælp af de betingelser og medium, der kræves til cellelinjenaf interesse 16. Disse betingelser kan variere afhængigt af cellelinjen, men pelleteringsmetoderne nedstrøms bør kunne tilpasses til cellelinjer uafhængigt af dyrkningsbetingelser. - Når cellerne er nær sammenløb (80%-90%), aspireres vækstmediet med en vakuumpipette og skylles cellerne i fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Der tilsættes 5 ml 5-10 mM EDTA til hver kolbe og kolberne inkuberes ved 37 °C i 5-10 min. Bank forsigtigt på siden af kolben for at løsne celler.
BEMÆRK: Brug ikke trypsin, da dette kan spalte overfladeepitoper, der ville påvirke nogle antigener negativt.- Når cellerne er løsnet, tilsættes 5 ml vækstmedier, der bruges til cellelinjen (f.eks. DMEM til 293T-celler) til hver kolbe, og overfør derefter cellerne til 50 ml koniske rør.
- Centrifuge de koniske rør ved 930 x g ved stuetemperatur i 5 min. Efter centrifugering fjernes mediet og EDTA ved vakuumpipetteaspiration.
- Cellepillerne vaskes i 10-20 ml 1x PBS, og hvis der anvendes flere plader eller kolber, samles cellerne fra pladerne eller kolberne (ca. seks T175-kolber i eksperimentet afbildet i figur 1) i et enkelt 50 ml konisk rør.
- Centrifuger røret ved 930 x g i 5 min. Pbs aspireres efter centrifugering med en vakuumpipette.
- Opbevar cellepillerøret på våd is indtil fiksering.
BEMÆRK: Celler holdes nedkølet for at begrænse nedbrydende enzymaktivitet og minimere autolyse af celler og tilhørende proteinændringer, herunder ændringer i proteinlokalisering.
2. Fiksering af cellepellet
- Udfør fiksering ved at tilføje 30 ml 10% neutral bufferet formalin til 3 ml cellepellet for at skabe et 10: 1 (vol: vol) fikseringsmiddel til celleforhold.
- Vend det tæt lukkede 50 ml rør gentagne gange, indtil cellerne er helt i suspension.
BEMÆRK: Dannelse af en kondenseret cellepellet før fuldstændig fiksering kan forårsage ujævn fiksering, hvilket resulterer i artefakter under senere farvnings- og immunmærkningsprocedurer. - Lad cellesuspensionen sætte sig natten over ved stuetemperatur.
- Vend røret igen den næste dag for at resuspendere cellerne, hvilket øger forholdet mellem overflade og volumen for at forbedre fikseringen.
BEMÆRK: Hvirvelning af cellepellet er ikke påkrævet eller anbefalet, da det kan resultere i celleskader.
3. Trimning og behandling af cellepellet
- Efter 24 timers fiksering centrifugeres det 50 ml koniske rør ved 930 x g ved 5 °C i 10-15 min. Sørg for, at rørene er tæt lukket, fordelt ligeligt og afbalanceret i centrifugen.
BEMÆRK: Fikseringstider kan ændres for at afspejle de vævsfikseringstider, der anvendes af laboratoriet eller krav til specifikke eksperimentelle tilstande. - Efter centrifugering skal du sikre dig, at cellerne danner en synlig pellet. Fjern fikseringsmidlet ved dekantering og/eller forsigtigt aspirering med steril overføringspipette.
- Der tilsættes smeltet (40-60 °C) hydroxyethylagarosebaseret gel (se materialetabel) til cellepelleten ved forholdet 1:4 (vol:vol) gel til cellepellet.
- Brug en ren 5 tommer, 2 mm spids Sterling sonde med et øje skyllet med ledningsvand, rør forsigtigt den smeltede gel ind i fikscellepelleten, hvilket skaber en jævn suspension af faste celler i smeltet gel i bunden af det 50 ml koniske rør (figur 1A).
- Placer det lukkede 50 ml koniske rør med den smeltede gel blandet med fastcellepellet på våd is i 5-10 minutter for at størkne den gelerede cellepellet.
- Brug en ren mikrospatel til forsigtigt at fjerne pelleten fra det koniske rør ved at placere en spatel langs siden af røret og forsigtigt udnytte pelleten uden at gennembore den. Anbring pellet på biopsipapir.
- Brug en ren mikrospatel til at trimme cellepillen i 4-5 mm tykke skiver, så hver skive kan passe ind i en 26 mm x 26 mm x 5 mm vævskassette (figur 1B).
- Placer individuelle gelpelletskiver i midten af et stykke biopsipapir. Fold de to modsatte ender af biopsipapiret over pelleten, og pakk det ind. Anbring den indpakkede pille i en 26 mm x 26 mm x 5 mm vævskassette. Luk låget, krymp de udfoldede sider af biopsiindpakningen med vævskassettelåget (figur 1C).
- Placer den trimmede cellepillekassette i vævsprocessorens retort fyldt med 10% neutral bufferet formalin og kør på en kort behandlingsplan.
BEMÆRK: Den korte behandlingsplan består af 30 minutter i hver retort, der starter i 10% neutralt bufferet formalin, dehydreret gennem en række stadig mere klassificerede alkoholer, ryddet i tre ændringer af xylener og slutter med paraffininfiltration i to ændringer af 60 ° C smeltet infiltration / indlejring af paraffin (56 ° C smeltepunkt).
4. Indlejring af cellepellet
- Anbring de forarbejdede kassetter i indlejringscentrets holdeområde.
- Åbn vævskassettelåget, og fold forsigtigt biopsipapiret ud.
- Placer cellepellet i en lille 15 mm x 15 mm engangsindlejringsform, skåret med siden nedad.
BEMÆRK: En lille indlejringsform giver mulighed for op til tre cellepelletssektioner, der passer på et ufarvet vævsglas til IHC-assays. - Mens du forsigtigt holder cellepelleten i bunden af formen med tang, tilsættes 62 ° C vævsinfiltration / indlejring af paraffin i formen, der dækker cellepelleten.
- Flyt formen til en kold blok for at begynde at størkne paraffinen. Juster cellepillerne, mens paraffinen størkner for at fastgøre dem i deres passende position i bunden af formen.
- Fjern låget fra kassetten. Placer kassetten med bunden nedad oven på indlejringsformen, og tilsæt yderligere smeltet paraffin for at dække kassetten.
- Når paraffin er fyldt over vævskassetten, skal du returnere formen til den kolde blok for at størkne17,18.
5. Sektionering af cellepellet
- Brug en roterende mikrotom, der er indstillet til en sektionstykkelse på 20 μm, til at trimme cellepilleblokken, indtil paraffinblokkens fulde overflade og cellepelleten er fanget i paraffinsektionsbåndet. Dette kaldes "vendt" mod blokken.
- Chill og blødgør de facetterede pilleblokke på en isbadbakke i 5-15 minutter for at køle af og hydrere blokken inden sektionering.
BEMÆRK: Når blokken er hydreret, vil cellepelleten være gennemskinnelig i paraffinbåndet. Hvis uigennemsigtig, mere blødning er påkrævet, og artefakter kan være til stede. - Sektion paraffinbåndet i cellepelletblokken med en tykkelse på 4 μm eller anden ønsket tykkelse i kontinuerlig skæretilstand ved hjælp af et roterende mikrotom.
- Paraffinbåndene anbringes på et vandflådebad, der er indstillet til 42 °C.
- Hent paraffinsektionerne forberedt ved hjælp af det roterende mikrotom fra flydebadet på positivt ladede dias.
- Placer den første sektion øverst på diaset inden for dækslip- og farvningsgrænsen, og placer den anden under den og den tredje cellepillesektion under den (figur 1D).
- Efter sektionering tørres lysbillederne ved stuetemperatur (ca. 23 °C) i 24 timer efterfulgt af 60 °C i 30 min.
BEMÆRK: Efter bagning af diasene ved 60 ° C kan cellepelletsektionerne bruges med enhver standard IHC-protokol, inklusive protokoller, der bruger varmeinduceret og enzymbaseret antigenhentning9.
Representative Results
Efter tilsætning af den agarosebaserede gel skal cellepelleten danne en fast gelatinøs masse, der kan håndteres (figur 1B). Når pelleten er indlejret, vil den have en konsistens svarende til et fast væv og skal være relativt let at rutinemæssigt sektionere på et mikrotom. Når cellepiller er indlejret, kan de bruges i histologi og IHC-eksperimenter på samme måde som formalinfikserede, paraffinindlejrede væv. Dette omfatter anvendelse af varmeinduceret epitop eller enzymatisk antigenhentning med indirekte kromogene detektionsmetoder (f.eks. anvendelse af et sekundært antistof med peberrodsperoxidase og diaminobenzidindetektion som vist i figur 2 og figur 3) ved hjælp af kommercielle IHC-platforme9. Histologisk skal cellerne spredes jævnt i hele sektionen med minimal celleklumpning, selvom klæbende celler kan opretholde deres celle-celleinteraktioner i pelleten. Denne dispersion gør det muligt at skelne mellem individuelle celler, selvom denne sondring vil blive signifikant påvirket af cellestørrelse og relativ densitet inden for gelpellet. Kernen, cytoplasmaet og cellemembranen er mere tydelige og lettere at visualisere ved dispersion (figur 2). I figur 2 er tre cellelinjer immunmærket for TEAD-transkriptionsfaktoren. Immunolabeling visualiseres med det brune diaminobenzidin (DAB) kromogen. Cellelinjerne har forskellige ekspressionsniveauer for TEAD-transkriptionsfaktoren, lige fra intet udtryk (figur 2A) til svagt udtryk (figur 2B) til stærkt udtryk (figur 2C). I dette eksempel observeres mærkning i kernen, som man kunne forvente af en transkriptionsfaktor, og er fraværende fra cytoplasmaet og cellemembranen, som er synlige, men mangler mærkning (figur 2). Cellepiller kan inkorporeres i cellepelletmikroarrays (figur 3) på standard 23 mm x 75 mm x 1 mm dias. Inkorporering af cellepillerne i et mikroarray giver mulighed for evaluering af kontroller med forskellige ekspressionsniveauer i samme dias. I dette eksempel tjener PEG10-mangelfulde museembryonale stamceller (til venstre) som en negativ kontrol, og 293T-celler, der overudtrykker PEG10 (højre, brun immunmærkning) tjener som en positiv kontrol i mikroarrayet (figur 3). Der er ingen variation i vævs- og indlejringsprocedurerne for cellepellets, der vil blive inkluderet i mikroarrays, og mikroarrays kan genereres ved hjælp af metoder svarende til dem, der anvendes til væv19.
Figur 1: Behandling af cellepellets . (A) Celler pelleteres i 50 ml koniske rør og blandes med gelen. (B) Når pellets er størknet, skæres de serielt, så de passer ind i en 26 mm x 26 mm x 5 mm vævskassette. (C) Cellepiller pakkes ind i biopsipapir, inden de anbringes i vævsprocessoren. (D) Op til tre cellepiller kan opsamles serielt på et enkelt 25 mm x 75 mm glas histologi dias. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Cellepiller med forskellige niveauer af protein eller transkriptionsekspression kan bruges til at evaluere analysens dynamiske område. Cellepiller er immunmærket for TEAD-transkriptionsfaktoren og viser forskellige niveauer af TEAD-ekspression. (A) DAUDI-celler mangler TEAD-ekspression og har ingen immunmærkning i cytoplasmaet eller kernen. Blå plet er hæmatoxylin modfarve af kernen. (B) 293T-celler viser svag nuklear mærkning (brun diaminobenzidin (DAB) kromogen) af TEAD-transkriptionsfaktoren. (C) Detroit 562-celler udtrykker stærkt TEAD som demonstreret af den intense brune mærkning i kernen. Mærkning inden for kernen, men ikke cytoplasmaet (offwhite til gråt område omkring den brune kerne), viser den passende mærkning af immunohistokemi-assayet. Bemærk, at cellerne i alle tre cellelinjer spredes, hvilket muliggør visualisering af individuelle celler, herunder deres nukleare og cytoplasmatiske morfologier. Skala bar = 25 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Cellepelletmikroarray skabt ved hjælp af flere cellepellets med varierende proteinekspressionsniveauer giver mulighed for samtidig vurdering af kontroller i et enkelt dias. PEG10-mangelfulde museembryonale stamceller (venstre) og 293T-celler, der overudtrykker PEG10 (højre), er immunmærket til PEG10. Mens stærk mærkning (brunt DAB-kromogen) observeres i 293T-celler, der overudtrykker PEG10, er der ingen mærkning tydelig i PEG10-mangelfulde celler. Blå repræsenterer hæmatoxylin modfarve. Skala bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Denne protokol beskriver en metode til at generere formalinfikserede, paraffinindlejrede cellepellets, der kan bruges som kontroller til downstream immunohistokemi og in situ hybridiseringsundersøgelser. De histologimetoder, der er beskrevet i denne protokol, kan anvendes på en bred vifte af kræft- og primære cellelinjer og tilpasser primært rutinemæssige histologiteknikker til fremstilling af disse pellets17,18. Når de behandles og indlejres, kan pellets bruges på samme måde som væv. Dette inkluderer brug af dem med varmeinducerede og enzymatiske antigenhentningsprotokoller til immunohistokemiske eksperimenter. Et mål med de metoder, der anvendes i denne protokol, er at bevare cellernes morfologi og antigenicitet gennem hele processen. Derfor anvendes EDTA, som er relativt skånsom med hensyn til ændringer i både morfologi og antigenicitet, til at løsne cellerne. Dette betyder ikke, at andre tilgange, såsom fysisk forstyrrelse, ikke er levedygtige; Enhver tilgang til at løsne celler bør dog sikre, at cellerne ikke skades i processen. Det andet formål med denne protokol er at fiksere og behandle cellerne på en måde, der ligner væv, ved hjælp af det samme fikseringsmiddel, fikseringsforhold, behandlingsplan (fiksering, dehydrering, rydning og paraffininfiltration) og indlejringsteknikker, så de kan tjene som sammenlignelige kontroller til nedstrøms assays. Derfor bør fikserings- og behandlingsmetoderne, der anvendes til at generere cellepellets, efterligne de tilgange, der anvendes til væv.
Den protokol, der er beskrevet i denne rapport, er ikke tilpasset til at håndtere celler med smitsomme stoffer, såsom celler inficeret med patogene bakterier eller vira, da celler løsnes, opsamles og centrifugeres før fiksering. Efterforskere kan overveje protokoller til at fikse cellerne før løsrivelse, men dette ville kræve yderligere optimering for at indsamle cellerne uden at forstyrre cellemorfologien. Desuden kræver fikseringstider og håndteringsbetingelser for celler med infektiøse agenser yderligere overvejelser baseret på det infektiøse middel og tilhørende institutionelle biosikkerhedsprotokoller.
Formalinfaste, paraffinindlejrede cellepiller er unikt fordelagtige ved at have veldefinerede proteinekspressionsniveauer10. Mens kræft og endogene cellelinjer tilbyder et udvalg af celler med varierende niveauer af proteinekspression, gør genteknologiske teknologier det muligt for forskere at modellere proteinekspressionen gennem overekspressive proteiner af interesse og brugen af CRISPR-teknologier til at udskære eller indsætte kodningsgener af interesse20,21 . Ulempen ved overudtrykte proteiner i cellelinjer er, at de er dårlige mål for følsomheden af et assay, da de muligvis ikke repræsenterer endogene proteinniveauer22. I modsætning hertil kan både endogene cellelinjer og kræftcellelinjer bedre repræsentere endogene ekspressionsniveauer, og CRISPR-medieret sletning af kodningsgenet i en beslægtet linje kan tjene som en tilsvarende negativ kontrol. Desuden er endogene cellelinjer eller kræftcellelinjer med varierende niveauer af proteinekspression ideelle til titreringseksperimenter til at vælge endelige antistoffortyndinger og bedst forstå følsomheden af et assay (figur 2). Beslutningen om, hvilke cellelinjer der skal bruges, skal baseres på individuelle eksperimentelle behov og vil ofte bruge en kombination af tilgange.
Ud over at evaluere, om et antistof kan detektere proteinet af interesse, kan et panel af cellelinjer bruges til at definere et antistofs specificitet. For eksempel kan et panel af cellelinjer, der individuelt udtrykker en familie af nært beslægtede proteiner, bruges til at teste, om et antistof er specifikt for et individuelt protein, eller om det også detekterer andre nært beslægtede proteiner. Mere detaljerede kontroller kan indebære brug af cellelinjer, der enten gennem CRISPR-knock-in eller gennem overekspression udtrykker proteiner med punktmutationer, der ikke kan gennemgå specifikke signalhændelser, der detekteres (f.eks. mutation i specifikke fosforyleringssteder, når man vurderer et fosfospecifikt antistof). Selv om der er tale om mere komplekse fremgangsmåder, kan det være nødvendigt at bekræfte, at antistoffet kun anvendes etiketter under særlige omstændigheder10.
Det er vigtigt at bemærke, at genetiske manipulationer af cellelinjer muligvis ikke genererer en homogen cellepopulation. For eksempel er transfektionseffektiviteten i overekspression af cellelinjer typisk ikke 100%, og nogle celler overudtrykker muligvis ikke proteinet af interesse. Inkludering af FLAG eller et relateret tag i transfektionen, der kan detekteres med standardmetoder, kan være nyttigt til at vurdere transfektionseffektiviteten af cellelinjen23. Dette kan være nyttigt både for at afgøre, om transfektion var vellykket og udelukke manglende detektion på grund af proteinekspressionen, og for at tjene som reference for den forventede andel af celler, der skal udtrykke proteinet af interesse.
In situ hybridisering (ISH) kan også være et gavnligt værktøj til at karakterisere målgenekspressionen i cellepiller og informere IHC-metodeudvikling10. Ved screening af antistoffer kan det være informativt at vide, hvornår transkriptet og dermed det potentielle protein kan påvises. Derudover kan cellepellet ISH-screening være gavnlig for ISH-metodeudvikling. Mens specificitet er mindre hyppigt et problem for ISH-assays, er det stadig vigtigt at have passende kontroller og lignende overvejelser til udvikling og udnyttelse af kontroller, der kan anvendes på ISH-undersøgelser.
Vævsmikroarrays skabes ved at fjerne kerner fra donorblokke og overføre disse kerner, ofte i et gittermønster, til en modtagerparaffinblok. I sidste ende indeholder modtagerblokken et spektrum af prøver i en enkelt blok, hvilket gør det muligt for alle prøverne i blokken at gennemgå identiske IHC-procedurer og giver mulighed for direkte sammenligning af flere prøver på samme dias24,25. Da cellepiller er relativt ensartede populationer, kan de nøjagtigt repræsenteres af 1 mm kerner, hvilket gør dem ideelle kandidater til optagelse i lignende arrays. Ved hjælp af et cellepelletarray er det muligt at inkludere cellepiller med varierende udtryksniveauer, cellepellets, der unikt udtrykker relaterede proteiner, og cellepellets, der udtrykker orthologs af proteinet af interesse fra forskellige arter i et enkelt dias (figur 3). Dette gør det muligt at evaluere alle cellepiller samtidigt under ensartede forhold på en hurtig måde, samtidig med at brugen af reagenser25 minimeres.
Et mindste startcellepelletvolumen på 2 ml indsamlet fra otte T175-kolber anbefales til denne protokol. Dette volumen giver mulighed for produktion og arkivering af flere cellepelletblokke, så cellepelletskontroller kan standardiseres over længere perioder, og der kan oprettes flere cellepelletarrays fra en given pellet. Lavere cellepelletvolumener kan bruges, når man beskæftiger sig med primære patientafledte cellelinjer, langsomt voksende cellelinjer, eller når forholdene begrænser prøvens volumen. Selvfølgelig vil lavere startvolumener forstærke den negative virkning af ethvert celletab under fiksering og forberedelse af pelleten og vil begrænse det materiale, der er tilgængeligt til downstream-processer. Det er især vigtigt at være forsigtig, når du fjerner fikseringsmiddel efter centrifugering, for at minimere ethvert tilknyttet tab. For lavere prøvevolumener kan et 1,5 ml centrifugerør med låg bruges til at pelletere cellerne. Disse rør kan gennemskæres i længderetningen med et blad til behandling.
I lighed med vævsfiksering er cellefiksering i denne pille afgørende for nedstrøms IHC-vurderinger. For at opnå fuldstændig fiksering bruger vi mindst et 10: 1 formalin til cellepelletforhold og inverterer det koniske rør for at opretholde cellerne i suspension. Hvis cellerne ikke er i suspension på tidspunktet for fiksering, er der risiko for ufuldstændig eller utilstrækkelig fiksering, hvilket vil påvirke downstream immunolabeling. Ofte manifesterer dette sig som stærk mærkning i periferien og tab af mærkning i midten af pelleten eller mærkning af variabel intensitet i hele pelleten.
Denne protokol bruger Histogel, som primært består af hydroxyethylagarose, til både at binde cellepellet og gøre det muligt for cellerne at blive jævnt fordelt i hele cellepelleten. Uden det bliver celler komprimeret og mister deres cytomorfologiske detaljer. Disse cytomorfologiske detaljer er ofte vigtige under antistofscreening, da de giver yderligere oplysninger om, hvorvidt antistoffet er mærket i det relevante subcellulære rum (f.eks. Kernen, cytoplasmaet eller plasmamembranen). I modsætning hertil kan for meget gel resultere i lavere celletætheder i pelleten, hvilket fører til, at cellerne distribueres bredt og reducerer cellenumrene pr. Sektion.
Denne protokol kan rutinemæssigt bruges til at udvikle IHC-kontroller. De materialer, der er nødvendige for at skabe disse pellets, er almindelige i undersøgelsesbiologi og histologilaboratorier, og metoderne er ligetil og nemme at tilpasse. Mens cellepiller har begrænsninger som IHC-kontroller, fungerer de som gode værktøjer til indledende antistofscreening og supplerer andre vævskontroller.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte i Genentech/ Roche og er som sådan aktionærer i Roche.
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende samarbejdet mellem vores kolleger i Genentechs forskningsorganisation og især patologikernelaboratorierne (P-core), der har bidraget til udviklingen af disse metoder gennem årene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).
- Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma. American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).
- Cobleigh, M. A., et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).
- Vogel, C. L., et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).
- Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).
- Havnar, C., et al. Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson's trichrome. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).
- Newton, K., et al. RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development. Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).
- Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling. Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).
- Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach. Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).
- Ramos-Vara, J. A., et al. American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).
- Dominguez, S., et al. Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).
- Lean, F. Z. X., et al. Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization. Transboundary and Emerging Disease. , 14232 (2021).
- Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies. Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).
- Atcc.org. , Available from: http://www.atcc.org (2022).
- Thermo Fisher Scientific. Cell Culture Basics Handbook. , Gibco. (2020).
- Carson, F. Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed. , ASCP Press. Chicago, IL. (1997).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Tissue Processing. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed. Spencer, L. T., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone-Elsevier. China. (2013).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. Cancer Gene Profiling. , Humana Press. New York. 53-65 (2016).
- Jinek, M., et al. Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).
- Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology. Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).
