Summary
Presentert her er en protokoll for generering av formalinfaste, parafin-innebygde cellepelletskontroller for immunhistokjemi.
Abstract
Positive og negative kontroller med kjent ekspresjon av målproteiner er avgjørende for utviklingen av immunhistokjemi (IHC) analyser. Mens vevskontroller er gunstige for godt karakteriserte proteiner med definerte vevs- og cellulære uttrykksmønstre, er de mindre egnet for den første utviklingen av IHC-analyser for nye, dårlig karakteriserte eller allestedsnærværende uttrykte proteiner. Alternativt, på grunn av deres standardiserte natur, kan cellepellets, inkludert kreftcellelinjer med definerte protein- eller transkripsjonsuttrykksnivåer (f.eks. Høy, middels og lavt uttrykk), transfiserte overuttrykkende cellelinjer eller cellelinjer med gener slettet gjennom celleteknikkteknologier som CRISPR, tjene som verdifulle kontroller, spesielt for den første antistoffkarakteriseringen og utvelgelsen. For at disse cellepelletsene skal kunne brukes i utviklingen av IHC-analyser for formalinfaste, parafin-innebygde vev, må de behandles og bygges på en måte som rekapitulerer prosedyrene som brukes til vevsbehandling. Denne protokollen beskriver en prosess for å lage og behandle formalinfaste, parafininnebygde cellepelletskontroller som kan brukes til utvikling av IHC-metoder.
Introduction
Immunhistokjemi (IHC) er en av de mest brukte analysene innen undersøkende og diagnostisk patologi. Avhengig av kontekst og analyse brukes IHC til å bistå i kreftdiagnose1,2, forutsi behandlingsrespons3,4, identifisere patogener5, karakterisere celletyper i syke vev6 og studere biologiske veier og vevsresponser 7,8. I alle situasjoner er det grunnleggende prinsippet for en IHC-analyse at et antistoff binder seg spesifikt til et mål av interesse, oftest et protein, og denne bindingshendelsen blir deretter visualisert i et vevsavsnitt9. En av de største utfordringene ved enhver IHC-analyse er imidlertid å sikre at antistoffene spesifikt oppdager målet for interesse10. Antistoffspesifisitet er en utfordring i de fleste immunanalyser, men immunhistokjemi gir unike utfordringer ved at det ikke finnes sekundære mål, for eksempel molekylvekt, for å skille mellom spesifikk og ikke-spesifikk merking. Dette er spesielt plagsomt når man vurderer dårlig karakteriserte eller allestedsnærværende uttrykte mål som mangler veldefinerte cellulære lokaliseringsmønstre. Derfor er robuste kontroller som kan bidra til å karakterisere bindingsspesifisitet avgjørende når man utvikler en ny IHC-analyse10.
For mål som er veldefinerte med karakteristiske cellulære uttrykksmønstre, brukes vevskontroller ofte i IHC-metodeutvikling. Basert på et vell av tidligere data, kan man avgjøre om antistoffet merker vevet, cellen og det subcellulære rommet der det er kjent å bli uttrykt, og at det ikke merker vevskomponenter der det ikke skal være til stede11. Imidlertid er vevskontroller av begrenset bruk for dårlig karakteriserte, nye mål uten kjente uttrykksmønstre eller for proteiner som er bredt uttrykt og mangler distinkte uttrykksmønstre. I begge disse scenariene gjør mangelen på et veldefinert uttrykksmønster det umulig å diskriminere spesifikk fra ikke-spesifikk merking i vev. I disse situasjonene tilbyr cellepellets en verdifull alternativ IHC-kontroll. Cellepelletskontroller kan omfatte: kreft eller andre cellelinjer som har endogene eller inneboende / ikke-induserte ekspresjonsnivåer av proteinet av interesse, og hvis proteinuttrykk kan karakteriseres ved vestlig blotting, flowcytometriske analyser eller ekstrapolert fra transkripsjonell profilering; konstruerte cellelinjer som enten over-uttrykker proteinet av interesse eller har kodingsgenet av interesse slettet; eller celler som har blitt behandlet under spesifikke forhold for å indusere proteinuttrykk eller signalhendelser av interesse (f.eks. fosforylering)10,12. Godt karakteriserte proteinuttrykksnivåer i cellelinjer tillater også evaluering av følsomheten til en analyse ved å bruke et panel av cellelinjer med høyt, middels, lavt og fraværende proteinuttrykk. I tillegg kan konstruerte cellepellets være verdifulle artsspesifikke kontroller for veterinære arter, som det kan være begrenset karakterisering eller tilgjengelige vevskontroller13. Mens cellepellets har sine begrensninger, for eksempel det begrensede proteomet som er tilstede i cellelinjer som ikke vil gjenspeile det forskjellige proteomet i vev, tjener de som egnede kontroller for å bekrefte at antistoffet kan oppdage målet av interesse, samt utelukke vilkårlig binding av det primære antistoffet, sekundært antistoff eller andre regenter i analysen10.
De fleste vev i diagnostisk og undersøkende patologi er festet i nøytral bufret formalin, dehydrert i en serie alkoholer, ryddet i xylen og behandlet og innebygd i parafinvoks. Formalinfiksering kryssbindingsproteiner, og fiksering og hvert ekstra trinn i vevsbehandling kan direkte påvirke proteiner og antistoffenes evne til å oppdage dem 9,14. Derfor er det viktig at alle kontroller som brukes i en IHC-analyse, gjennomgår de samme fikserings-, vevsbehandlings- og innebyggingsprosedyrene. Denne artikkelen beskriver de unike hensynene til å behandle og legge inn dyrkede celler for å tjene som kontroller for å utvikle IHC-analyser i formalinfikserte parafininnstøpte vev, med metodikken primært fokusert på håndtering og behandling av cellepelleten i et histologisk laboratorium.
Protocol
1. Forberedelse av cellepellets
- I fire til åtte 150 mm2 eller åtte x T175 kolber, vokse celler i mediet og forhold som anbefales for cellelinjen til 80% -90% sammenløp. For eksempel vokse 293T celler i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum og 2 mM L-glutamin15.
MERK: Celler skal dyrkes ved hjelp av forholdene og mediet som kreves for cellelinjenav interesse 16. Disse forholdene kan variere avhengig av cellelinjen, men nedstrøms pelleteringsmetoder bør kunne tilpasses for cellelinjer uavhengig av kulturforhold. - Når cellene er nær sammenløp (80%-90%), aspirerer vekstmediet med en vakuumpipette og skyll cellene i fosfatbufret saltvann (PBS).
- Tilsett 5 ml 5-10 mM EDTA i hver kolbe og inkuber kolbene ved 37 °C i 5-10 minutter. Trykk forsiktig på siden av kolben for å løsne celler.
MERK: Ikke bruk trypsin, da dette kan spalte overflateepitoper som vil påvirke noen antigener negativt.- Når cellene er løsnet, legg til 5 ml vekstmedier som brukes til cellelinjen (f.eks. DMEM for 293T-celler) til hver kolbe, og overfør deretter cellene til 50 ml koniske rør.
- Sentrifuge de koniske rørene ved 930 x g ved romtemperatur i 5 min. Etter sentrifugering, fjern mediet og EDTA ved vakuumpipette aspirasjon.
- Vask cellepellets i 10-20 ml 1x PBS, og hvis flere plater eller kolber brukes, samle cellene fra platene eller kolber (ca. seks T175-kolber i eksperimentet som er avbildet i figur 1) til et enkelt 50 ml konisk rør.
- Sentrifuge røret på 930 x g i 5 min. Aspirer PBS etter sentrifugering med en vakuumpipette.
- Hold cellepelletsrøret på våt is til fiksering.
MERK: Celler holdes avkjølt for å begrense nedbrytende enzymaktivitet og minimere autolyse av celler og tilhørende proteinendringer, inkludert endringer i proteinlokalisering.
2. Fiksering av cellepellets
- Utfør fiksering ved å tilsette 30 ml 10% nøytral bufret formalin til 3 ml cellepellet for å skape et 10: 1 (vol: vol) fiksativ til celleforhold.
- Snu det tett kappede 50 ml røret gjentatte ganger til cellene er helt i suspensjon.
MERK: Dannelse av en kondensert cellepellet før fullstendig fiksering kan forårsake ujevn fiksering, noe som resulterer i artefakter under senere farging og immunmerkingsprosedyrer. - La cellesuspensjonen slå seg ned over natten ved romtemperatur.
- Snu røret på nytt neste dag for å resuspendere cellene, og øk forholdet mellom overflate og volum for å forbedre fikseringen.
MERK: Vortexing av cellepelleten er ikke nødvendig eller anbefalt, da det kan føre til celleskade.
3. Trimming og prosessering av cellepellets
- Etter 24 timers fiksering, sentrifuger 50 ml konisk rør ved 930 x g ved 5 ° C i 10-15 minutter. Sørg for at rørene er tett avkortet, fordelt likt og balansert i sentrifugen.
MERK: Fikseringstider kan endres for å gjenspeile vevsfikseringstidene som brukes av laboratoriet eller krav til spesifikke eksperimentelle forhold. - Etter sentrifugering, sørg for at cellene danner en synlig pellet. Fjern fikseringsmiddelet ved å dekantere og/eller forsiktig aspirere med steril overføringspipette.
- Tilsett smeltet (40-60 ° C) hydroksyetylagarosebasert gel (se materialtabell) til cellepelleten ved et 1: 4 (vol: vol) gel til cellepelletsforhold.
- Bruk en ren 5 tommer, 2 mm spiss Sterling sonde med et øye skyllet med vann fra springen, rør forsiktig smeltet gel inn i den faste cellepelleten, og lag en jevn suspensjon av faste celler i smeltet gel i bunnen av 50 ml konisk rør (figur 1A).
- Plasser det kappede 50 ml koniske røret med smeltet gel blandet med fast cellepellet på våt is i 5-10 minutter for å størkne gelert cellepellet.
- Bruk en ren mikrospatel til å fjerne pelleten forsiktig fra det koniske røret ved å plassere en slikkepott langs siden av røret og forsiktig utnytte pelleten uten å stikke hull i den. Legg pelleten på biopsipapir.
- Bruk en ren mikrospatel til å trimme cellepelleten i 4-5 mm tykke skiver, slik at hver skive får plass i en 26 mm x 26 mm x 5 mm vevskassett (figur 1B).
- Plasser individuelle gelpelletskiver i midten av et stykke biopsipapir. Brett de to motsatte endene av biopsipapiret over pelleten, pakk den inn. Plasser den innpakkede pelleten i en 26 mm x 26 mm x 5 mm vevskassett. Lukk lokket, og krymp de utfoldede sidene av biopsipakningen med vevskassettlokket (figur 1C).
- Plasser den trimmede cellepelletskassetten i vevsprosessorretorten fylt med 10% nøytral bufret formalin og kjør på en kort behandlingsplan.
MERK: Den korte behandlingsplanen består av 30 minutter i hver retort som starter i 10% nøytral bufret formalin, dehydrert gjennom en serie stadig mer graderte alkoholer, ryddet i tre endringer av xylener, og slutter med parafininfiltrasjon i to endringer på 60 ° C smeltet infiltrasjon / innebygging av parafin (56 ° C smeltepunkt).
4. Innebygging av cellepellets
- Plasser de bearbeidede kassettene i holdeområdet til innebyggingssenteret.
- Åpne lokket på vevskassetten og brett forsiktig ut biopsipapiret.
- Plasser cellepelleten i en liten 15 mm x 15 mm engangsinnstøpingsform, med kuttsiden ned.
MERK: En liten innbyggingsform gjør det mulig for opptil tre cellepelletsseksjoner å passe på en ufarget vevsglide for IHC-analyser. - Mens du forsiktig holder cellepelleten i bunnen av formen med tang, tilsett 62 ° C vevsinfiltrasjon / innebygging av parafin i formen, som dekker cellepelleten.
- Flytt formen til en kald blokk for å begynne å størkne parafinen. Juster cellepellets mens parafinen størkner for å fikse dem i riktig posisjon i bunnen av formen.
- Fjern lokket fra kassetten. Plasser kassetten, nederste side, på toppen av innbyggingsformen og tilsett ekstra smeltet parafin for å dekke kassetten.
- Når parafin er fylt over vevskassetten, returner formen til kjøleblokken for å størkne17,18.
5. Seksjonering av cellepellets
- Bruk et roterende mikrotomsett med en seksjoneringstykkelse på 20 μm for å trimme cellepelletsblokken til hele ansiktet av parafinblokken og cellepelleten fanges opp i parafinseksjonsbåndet. Dette kalles "vendt" mot blokken.
- Avkjøl og bløtlegg de møtte pelletsblokkene på et isbadbrett i 5-15 minutter for å avkjøle og hydrere blokken før snitting.
MERK: Når blokken er hydrert, vil cellepelleten være gjennomsiktig i parafinbåndet. Hvis ugjennomsiktig, er det nødvendig med mer bløtlegging, og gjenstander kan være til stede. - Seksjon parafinbåndet til cellepelletsblokken med en tykkelse på 4 μm eller annen ønsket tykkelse i kontinuerlig kuttmodus ved hjelp av en roterende mikrotom.
- Plasser parafinbåndene på et vannflytebad satt til 42 °C.
- Plukk opp parafinseksjonene som er tilberedt ved hjelp av den roterende mikrotomen fra flytebadet på positivt ladede lysbilder.
- Plasser den første delen øverst på lysbildet innenfor dekselet og fargegrensen, og plasser den andre under den og den tredje cellepelletsdelen under den (figur 1D).
- Etter snitting tørker du lysbildene ved romtemperatur (ca. 23 °C) i 24 timer, etterfulgt av 60 °C i 30 minutter.
MERK: Etter å ha bakt lysbildene ved 60 °C, kan cellepelletsseksjonene brukes med hvilken som helst standard IHC-protokoll, inkludert protokoller ved bruk av varmeinduserte og enzymbaserte antigeninnhentinger9.
Representative Results
Etter tilsetning av agarosebasert gel skal cellepelleten danne en fast gelatinøs masse som er egnet til håndtering (figur 1B). Når den er innebygd, vil pelleten ha en konsistens som ligner på et fast vev, og bør være relativt enkelt å rutinemessig seksjonere på en mikrotom. Når cellepellets er innebygd, kan de brukes i histologi og IHC-eksperimenter på samme måte som formalinfaste, parafin-innebygde vev. Dette inkluderer bruk av varmeindusert epitop eller enzymatisk antigeninnhenting med indirekte kromogene deteksjonsmetoder (f.eks. bruk av et sekundært antistoff med pepperrotperoksidase og diaminobenzidindeteksjon som vist i figur 2 og figur 3) ved bruk av kommersielle IHC-plattformer9. Histologisk bør cellene dispergeres jevnt over hele seksjonen med minimal celleklumping, selv om adherente celler kan opprettholde sine celle-celle-interaksjoner i pelleten. Denne dispersjonen tillater skille mellom individuelle celler, selv om dette skillet vil bli betydelig påvirket av cellestørrelse og relativ tetthet i gelpelleten. Kjernen, cytoplasma og cellemembranen er tydeligere og lettere å visualisere ved dispersjon (figur 2). I figur 2 er tre cellelinjer immunmerket for TEAD-transkripsjonsfaktoren. Immunmerking visualiseres med det brune diaminobenzidinet (DAB). Cellelinjene har varierende uttrykksnivåer for TEAD-transkripsjonsfaktoren, alt fra ingen uttrykk (figur 2A) til svakt uttrykk (figur 2B), til sterkt uttrykk (figur 2C). I dette eksemplet observeres merking i kjernen, som forventet fra en transkripsjonsfaktor, og er fraværende fra cytoplasma og cellemembran, som er synlige, men mangler merking (figur 2). Cellepellets kan inkorporeres i cellepelletsmikromatriser (figur 3) på standard 23 mm x 75 mm x 1 mm lysbilder. Inkorporering av cellepellets i en mikromatrise gjør det mulig å evaluere kontroller med varierende uttrykksnivåer i samme lysbilde. I dette eksemplet fungerer PEG10 mangelfulle museembryonale stamceller (venstre) som en negativ kontroll og 293T-celler som overuttrykker PEG10 (høyre, brun immunmerking) tjener som en positiv kontroll i mikromatrisen (figur 3). Det er ingen variasjon i vev og embedding prosedyrer for cellepellets som vil bli inkludert i microarrays, og microarrays kan genereres ved hjelp av metoder som ligner på de som brukes for vev19.
Figur 1: Behandling av cellepellets . (A) Cellene pelleteres i 50 ml koniske rør og blandes med gelen. (B) Når de er størknet, blir pellets serielt skåret for å passe inn i en 26 mm x 26 mm x 5 mm vevskassett. (C) Cellepellets pakkes inn i biopsipapir før de plasseres i vevsprosessoren. (D) Opptil tre cellepellets kan serielt samles på et enkelt 25 mm x 75 mm glasshistologiglass. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Cellepellets med forskjellige nivåer av protein eller transkripsjonsuttrykk kan brukes til å evaluere analysens dynamiske område. Cellepellets er immunmerket for TEAD-transkripsjonsfaktoren og demonstrerer varierende nivåer av TEAD-uttrykk. (A) DAUDI-celler mangler TEAD-uttrykk og har ingen immunmerking i cytoplasma eller kjerne. Blå flekk er hematoksylin motstykke av kjernen. (B) 293T-celler demonstrerer svak nukleær merking (brun diaminobenzidin (DAB) kromogen) av TEAD-transkripsjonsfaktoren. (C) Detroit 562-celler uttrykker sterkt TEAD som demonstrert av den intense brune merkingen i kjernen. Merking i kjernen, men ikke cytoplasma (off-white til grå region rundt den brune kjernen), demonstrerer riktig merking av immunhistokjemianalysen. Legg merke til at i alle tre cellelinjer er cellene dispergert, noe som muliggjør visualisering av individuelle celler, inkludert deres nukleære og cytoplasmatiske morfologier. Skala bar = 25 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Cellepelletsmikromatrise opprettet ved å bruke flere cellepellets med varierende proteinuttrykksnivåer muliggjør samtidig vurdering av kontroller i et enkelt lysbilde. PEG10 mangelfulle museembryonale stamceller (venstre) og 293T-celler som overuttrykker PEG10 (høyre) er immunmerket for PEG10. Mens sterk merking (brun DAB-kromogen) observeres i 293T-celler som overuttrykker PEG10, er det ingen merking tydelig i PEG10-mangelfulle celler. Blå representerer hematoxylin counterstain. Skala bar = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for å generere formalin-faste, parafin-innebygde cellepellets som kan brukes som kontroller for nedstrøms immunhistokjemi og in situ hybridiseringsstudier. Histologimetodene beskrevet i denne protokollen gjelder for et mangfoldig utvalg av kreft- og primære cellelinjer, og tilpasser primært rutinemessige histologiteknikker for å produsere disse pellets17,18. Når de behandles og legges inn, kan pellets brukes på samme måte som vev. Dette inkluderer bruk av dem med varmeinduserte og enzymatiske antigeninnhentingsprotokoller for immunhistokjemieksperimenter. Et mål med metodene som brukes i denne protokollen er å bevare morfologien og antigeniteten til cellene gjennom hele prosessen. Derfor brukes EDTA, som er relativt forsiktig når det gjelder endringer i både morfologi og antigenitet, for å løsne cellene. Dette er ikke å si at andre tilnærminger, som fysisk forstyrrelse, ikke er levedyktige; Imidlertid bør enhver tilnærming til å løsne celler sikre at cellene ikke blir skadet i prosessen. Det andre målet med denne protokollen er å fikse og behandle cellene på en måte som ligner på vev, ved hjelp av samme fikseringsmiddel, fikseringsforhold, behandlingsplan (fiksering, dehydrering, rydding og parafininfiltrasjon) og innebyggingsteknikker, slik at de kan tjene som sammenlignbare kontroller for nedstrøms analyser. Derfor bør fikserings- og behandlingsmetodene som brukes til å generere cellepellets, etterligne tilnærmingene som brukes til vev.
Protokollen beskrevet i denne rapporten er ikke tilpasset for å håndtere celler med smittestoffer, for eksempel celler infisert med sykdomsfremkallende bakterier eller virus, da celler løsnes, samles inn og sentrifugeres før fiksering. Forskere kan vurdere protokoller for å fikse cellene før løsrivelse, men dette vil kreve ytterligere optimalisering for å samle cellene uten å forstyrre cellemorfologien. Videre krever fikseringstider og håndteringsbetingelser for celler med smittsomme stoffer ytterligere hensyn basert på smittestoffet og tilhørende institusjonelle biosikkerhetsprotokoller.
Formalin-faste, parafin-innebygde cellepellets er unikt fordelaktige ved å ha veldefinerte proteinuttrykksnivåer10. Mens kreft og endogene cellelinjer tilbyr et utvalg av celler med varierende nivåer av proteinuttrykk, gjør genteknologiske teknologier det mulig for forskere å modellere proteinuttrykket, gjennom overuttrykkende proteiner av interesse og bruk av CRISPR-teknologier for å excise eller sette inn kodende gener av interesse20,21 . Ulempen med over-uttrykte proteiner i cellelinjer er at de er dårlige tiltak for følsomheten til en analyse, da de kanskje ikke representerer endogene proteinnivåer22. I motsetning til dette kan både endogene cellelinjer og kreftcellelinjer bedre representere endogene ekspresjonsnivåer, og CRISPR-mediert sletting av kodegenet i en beslektet linje kan tjene som en tilsvarende negativ kontroll. Videre er endogene cellelinjer eller kreftcellelinjer med varierende nivåer av proteinuttrykk ideelle for titreringseksperimenter for å velge endelige antistofffortynninger og for best å forstå sensitiviteten til en analyse (figur 2). Beslutningen rundt hvilke cellelinjer som skal brukes, bør være basert på individuelle eksperimentelle behov og vil ofte benytte en kombinasjon av tilnærminger.
I tillegg til å vurdere om et antistoff kan oppdage proteinet av interesse, kan et panel av cellelinjer brukes til å definere et antistoffs spesifisitet. For eksempel kan et panel av cellelinjer som individuelt uttrykker en familie av nært beslektede proteiner, brukes til å teste om et antistoff er spesifikt for et individuelt protein, eller om det også oppdager andre nært beslektede proteiner. Mer forseggjorte kontroller kan innebære bruk av cellelinjer som uttrykker, enten gjennom CRISPR-knock-in eller gjennom overuttrykk, proteiner med punktmutasjoner som ikke kan gjennomgå spesifikke signalhendelser som oppdages (f.eks. mutasjon i spesifikke fosforyleringssteder ved evaluering av et fosfospesifikt antistoff). Selv om disse er mer komplekse tilnærminger, kan de være nødvendige for å bekrefte at antistoffet bare brukte etiketter under spesifikke omstendigheter10.
Det er viktig å merke seg at genetiske manipulasjoner av cellelinjer kanskje ikke genererer en homogen cellepopulasjon. For eksempel er transfeksjonseffektiviteten i overuttrykkende cellelinjer vanligvis ikke 100%, og noen celler kan ikke overuttrykke proteinet av interesse. Inkludering av FLAG eller en relatert tag i transfeksjonen som kan oppdages med standardmetoder, kan være nyttig for å vurdere transfeksjonseffektiviteten til cellelinjen23. Dette kan være nyttig både for å avgjøre om transfeksjon var vellykket og utelukke mangel på deteksjon på grunn av proteinuttrykket, og for å tjene som referanse for den forventede andelen celler som skal uttrykke proteinet av interesse.
In situ hybridisering (ISH) kan også være et gunstig verktøy for å karakterisere målgenuttrykket i cellepellets og informere IHC-metodeutvikling10. Ved screening av antistoffer kan det være informativt å vite når transkriptet, og dermed det potensielle proteinet, kan detekteres. I tillegg kan cellepellets ISH-screening være gunstig for utvikling av ISH-metoder. Selv om spesifisitet sjeldnere er et problem for ISH-analyser, er det fortsatt viktig å ha passende kontroller og lignende hensyn til utvikling og bruk av kontroller som kan brukes på ISH-studier.
Vevsmikromatriser opprettes ved å fjerne kjerner fra donorblokker og overføre disse kjernene, ofte i et rutenettmønster, til en mottakerparaffinblokk. Til slutt inneholder mottakerblokken et spekter av prøver i en enkelt blokk, slik at alle prøvene i blokken kan gå gjennom identiske IHC-prosedyrer og muliggjør direkte sammenligning av flere prøver på samme lysbilde24,25. Siden cellepellets er relativt ensartede populasjoner, kan de nøyaktig representeres av 1 mm kjerner, noe som gjør dem ideelle kandidater for inkludering i lignende arrays. Ved hjelp av en cellepelletsmatrise er det mulig å inkludere cellepellets med varierende ekspresjonsnivåer, cellepellets som unikt uttrykker relaterte proteiner, og cellepellets som uttrykker ortologer av proteinet av interesse fra forskjellige arter i et enkelt lysbilde (figur 3). Dette gjør at alle cellepellets kan evalueres samtidig under ensartede forhold på en rask måte, samtidig som bruken av reagenser minimeres25.
Et minimum startcellepelletsvolum på 2 ml samlet fra åtte T175-kolber anbefales for denne protokollen. Dette volumet tillater produksjon og arkivering av flere cellepelletsblokker, slik at cellepelletskontroller kan standardiseres over lengre tidsperioder og flere cellepelletsarrayer kan opprettes fra en gitt pellet. Lavere cellepelletsvolumer kan brukes når det gjelder primære pasientavledede cellelinjer, sakte voksende cellelinjer, eller når forholdene begrenser volumet av prøven. Selvfølgelig vil lavere startvolumer forsterke den negative effekten fra ethvert celletap under fiksering og fremstilling av pelleten og vil begrense materialet som er tilgjengelig for nedstrømsprosesser. Det er spesielt viktig å være forsiktig når du fjerner fikseringsmiddel etter sentrifugering, for å minimere eventuelle tilknyttede tap. For lavere prøvevolumer kan et 1,5 ml, avkortet sentrifugerør brukes til å pelletere cellene. Disse rørene kan halvveis i lengderetningen med et blad for behandling.
I likhet med vevsfiksering er cellefiksering i denne pelleten kritisk for nedstrøms IHC-vurderinger. For å oppnå fullstendig fiksering bruker vi minst et 10: 1 formalin til cellepelletforhold og inverterer det koniske røret for å opprettholde cellene i suspensjon. Hvis cellene ikke er i suspensjon på tidspunktet for fiksering, er det fare for ufullstendig eller utilstrekkelig fiksering, noe som vil påvirke nedstrøms immunmerking. Ofte manifesterer dette seg som sterk merking i periferien og tap av merking i midten av pelleten eller merking av variabel intensitet i hele pelleten.
Denne protokollen bruker Histogel, som hovedsakelig består av hydroksyetylagarose, både for å binde cellepelleten og for å gjøre det mulig for cellene å bli jevnt fordelt over hele cellepelleten. Uten det blir cellene komprimert og mister sine cytomorfologiske detaljer. Disse cytomorfologiske detaljene er ofte viktige under antistoffscreening, da de gir ytterligere informasjon om hvorvidt antistoffet merker i riktig subcellulært rom (f.eks. Kjernen, cytoplasma eller plasmamembranen). I motsetning til dette kan for mye gel resultere i lavere celletettheter i pelleten, noe som fører til at cellene blir bredt distribuert, og reduserer celletallene per seksjon.
Denne protokollen kan rutinemessig brukes til å utvikle IHC-kontroller. Materialene som trengs for å lage disse pellets er vanlige i undersøkelsesbiologi og histologilaboratorier, og metodene er enkle og enkle å tilpasse. Mens cellepellets har begrensninger som IHC-kontroller, fungerer de som gode verktøy for innledende antistoffscreening og utfyller andre vevskontroller.
Disclosures
Alle forfattere er ansatte i Genentech / Roche og er som sådan aksjonærer i Roche.
Acknowledgments
Vi ønsker å anerkjenne samarbeidet med våre kolleger i Genentechs forskningsorganisasjon, og spesielt patologikjernen (P-kjerne) laboratorier som bidro til utviklingen av disse metodene gjennom årene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).
- Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma. American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).
- Cobleigh, M. A., et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).
- Vogel, C. L., et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).
- Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).
- Havnar, C., et al. Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson's trichrome. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).
- Newton, K., et al. RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development. Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).
- Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling. Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).
- Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach. Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).
- Ramos-Vara, J. A., et al. American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).
- Dominguez, S., et al. Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).
- Lean, F. Z. X., et al. Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization. Transboundary and Emerging Disease. , 14232 (2021).
- Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies. Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).
- Atcc.org. , Available from: http://www.atcc.org (2022).
- Thermo Fisher Scientific. Cell Culture Basics Handbook. , Gibco. (2020).
- Carson, F. Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed. , ASCP Press. Chicago, IL. (1997).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Tissue Processing. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed. Spencer, L. T., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone-Elsevier. China. (2013).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. Cancer Gene Profiling. , Humana Press. New York. 53-65 (2016).
- Jinek, M., et al. Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).
- Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology. Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).
