Summary
Apresentamos aqui um protocolo para a geração de controles de pellets celulares fixados em formalina e embebidos em parafina para imuno-histoquímica.
Abstract
Controles positivos e negativos com expressão conhecida de proteínas-alvo são essenciais para o desenvolvimento de ensaios de imuno-histoquímica (IHC). Embora os controles teciduais sejam benéficos para proteínas bem caracterizadas com padrões de expressão tecidual e celular definidos, eles são menos adequados para o desenvolvimento inicial de ensaios de IHC para proteínas novas, mal caracterizadas ou onipresentes. Alternativamente, devido à sua natureza padronizada, as pastilhas celulares, incluindo linhagens de células cancerígenas com níveis definidos de expressão de proteínas ou transcritos (por exemplo, alta, média e baixa expressão), linhas celulares transfectadas com superexpressão ou linhagens celulares com genes excluídos por meio de tecnologias de engenharia celular como CRISPR, podem servir como controles valiosos, especialmente para a caracterização e seleção inicial de anticorpos. Para que esses pellets celulares sejam usados no desenvolvimento de ensaios de IHC para tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina, eles precisam ser processados e incorporados de uma maneira que recapitule os procedimentos usados para o processamento tecidual. Este protocolo descreve um processo para criar e processar controles de pellets de células fixados em formalina e incorporados à parafina que podem ser usados para o desenvolvimento do método IHC.
Introduction
A imuno-histoquímica (IHC) é um dos ensaios mais comumente utilizados em patologia investigativa e diagnóstica. Dependendo do contexto e do ensaio, a IHC é utilizada para auxiliar no diagnóstico do câncer1,2, prever a resposta ao tratamento 3,4, identificar patógenos5, caracterizar tipos celulares em tecidos doentes6 e estudar vias biológicas e respostas teciduais 7,8. Em todas as situações, o princípio básico de um ensaio de IHC é que um anticorpo se liga especificamente a um alvo de interesse, mais comumente uma proteína, e esse evento de ligação é posteriormente visualizado em uma seção de tecido9. No entanto, um dos maiores desafios de qualquer ensaio de IHC é garantir que os anticorpos estejam detectando especificamente o alvo de interesse10. A especificidade de anticorpos é um desafio na maioria dos imunoensaios, mas a imuno-histoquímica oferece desafios únicos, na medida em que não há medidas secundárias, como o peso molecular, para diferenciar entre marcação específica e inespecífica. Isso é particularmente problemático quando se avalia alvos mal caracterizados ou onipresentes que não possuem padrões de localização celular bem definidos. Portanto, controles robustos que possam ajudar a caracterizar a especificidade de ligação são críticos ao desenvolver um novo ensaio de IHC10.
Para alvos bem definidos com padrões característicos de expressão celular, os controles teciduais são frequentemente utilizados no desenvolvimento do método IHC. Com base em uma riqueza de dados prévios, pode-se determinar se o anticorpo está marcando o tecido, a célula e o compartimento subcelular no qual se sabe que ele é expresso, e se não está marcando componentes teciduais onde não deveria estar presente11. No entanto, os controles teciduais são de uso limitado para novos alvos mal caracterizados, sem padrões de expressão conhecidos, ou para proteínas que são amplamente expressas e carecem de padrões de expressão distintos. Em ambos os cenários, a falta de um padrão de expressão bem definido impossibilita a discriminação da marcação específica da não específica nos tecidos. Nessas situações, os pellets celulares oferecem uma alternativa valiosa de controle IHC. Os controles de pellets celulares podem incluir: câncer ou outras linhagens celulares que tenham níveis de expressão endógena ou intrínseca/não induzida da proteína de interesse e cuja expressão proteica possa ser caracterizada por western blotting, análises citométricas de fluxo ou extrapoladas a partir do perfil transcricional; linhagens celulares modificadas que superexpressam a proteína de interesse ou têm o gene codificador de interesse excluído; ou células que tenham sido tratadas em condições específicas para induzir a expressão de proteínas ou sinalizar eventos de interesse (por exemplo, fosforilação)10,12. Níveis de expressão proteica bem caracterizados em linhagens celulares também permitem avaliar a sensibilidade de um ensaio usando um painel de linhagens celulares com expressão proteica alta, média, baixa e ausente. Além disso, os pellets de células modificadas podem ser valiosos controles específicos de espécies para espécies veterinárias, para as quais pode haver caracterização limitada ou controles teciduais disponíveis13. Embora os pellets celulares tenham suas limitações, como o proteoma limitado presente em linhagens celulares que não refletirá o proteoma diversificado nos tecidos, eles servem como controles adequados para confirmar que o anticorpo pode detectar o alvo de interesse, bem como descartar a ligação indiscriminada pelo anticorpo primário, anticorpo secundário ou outros regentes no ensaio10.
A maioria dos tecidos em patologia diagnóstica e investigativa é fixada em formalina tamponada neutra, desidratada em uma série de álcoois, limpa em xileno e processada e embutida em cera de parafina. A fixação de formalina reticula proteínas, a fixação e cada etapa adicional no processamento tecidual podem afetar diretamente as proteínas e a capacidade dos anticorpos de detectá-las 9,14. Portanto, é importante que todos os controles utilizados em um ensaio de IHC passem pelos mesmos procedimentos de fixação, processamento tecidual e incorporação. Este artigo descreve as considerações únicas para processar e incorporar células cultivadas para servir como controles para o desenvolvimento de ensaios de IHC em tecidos embutidos de parafina fixada em formol, com a metodologia se concentrando principalmente no manuseio e processamento do pellet celular em um laboratório de histologia.
Protocol
1. Preparação do pellet celular
- Em quatro a oito frascos de 150 mm2 ou oito x T175, células de crescimento no meio e condições recomendadas para a linhagem celular a 80%-90% de confluência. Por exemplo, cultivar células 293T no Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco com 10% de soro fetal bovino e 2 mM de L-glutamina15.
NOTA: As células devem ser cultivadas usando as condições e o meio necessários para a linhagem celular de interesse16. Essas condições podem variar dependendo da linhagem celular, mas os métodos de peletização a jusante devem ser adaptáveis para linhagens celulares independentemente das condições de cultura. - Uma vez que as células estão perto da confluência (80%-90%), aspirar o meio de crescimento com uma pipeta a vácuo e enxaguar as células em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Adicionar 5 ml de EDTA 5-10 mM a cada balão e incubar os balões a 37 °C durante 5-10 min. Bater suavemente no lado do balão para desalojar as células.
NOTA: Não use tripsina, pois isso pode clivar epítopos de superfície que afetariam negativamente alguns antígenos.- Uma vez que as células estejam desalojadas, adicione 5 mL de meios de crescimento usados para a linhagem celular (por exemplo, DMEM para células 293T) a cada frasco e, em seguida, transfira as células para tubos cônicos de 50 mL.
- Centrifugar os tubos cónicos a 930 x g à temperatura ambiente durante 5 minutos. Após centrifugação, remova o meio e o EDTA por aspiração por pipeta a vácuo.
- Lavar os pellets de células em 10-20 mL de 1x PBS e, se forem utilizadas várias placas ou frascos, agrupar as células das placas ou frascos (aproximadamente seis frascos T175 no experimento descrito na Figura 1) em um único tubo cônico de 50 mL.
- Centrifugar o tubo a 930 x g durante 5 minutos. Aspirar o PBS após centrifugação com uma pipeta de vácuo.
- Mantenha o tubo de pellets da célula no gelo molhado até a fixação.
NOTA: As células são mantidas resfriadas para limitar a atividade enzimática degradativa e minimizar a autólise das células e as alterações proteicas associadas, incluindo alterações na localização das proteínas.
2. Fixação do pellet celular
- Realize a fixação adicionando 30 mL de formalina tamponada neutra a 10% a 3 mL de pellet de célula para criar uma relação fixadora de 10:1 (vol:vol) para célula.
- Inverta o tubo de 50 mL bem tampado repetidamente até que as células estejam completamente em suspensão.
NOTA: A formação de um pellet de células condensadas antes da fixação completa pode causar fixação irregular, resultando em artefatos durante procedimentos posteriores de coloração e imunomarcação. - Deixe a suspensão da célula assentar durante a noite à temperatura ambiente.
- Re-inverter o tubo no dia seguinte para ressuspender as células, aumentando a relação superfície/volume para melhorar a fixação.
NOTA: O vórtice do pellet celular não é necessário ou recomendado, pois pode resultar em danos celulares.
3. Aparar e processar pellets de células
- Após 24 h de fixação, centrifugar o tubo cônico de 50 mL a 930 x g a 5 °C por 10-15 min. Certifique-se de que os tubos estejam bem tampados, distribuídos igualmente e equilibrados na centrífuga.
NOTA: Os tempos de fixação podem ser modificados para refletir os tempos de fixação tecidual utilizados pelo laboratório ou os requisitos de condições experimentais específicas. - Após a centrifugação, certifique-se de que as células formam um pellet visível. Remover o fixador por decantação e/ou aspiração cuidadosa com pipeta de transferência estéril.
- Adicionar gel fundido (40-60 °C) à base de hidroxietilo agarose (ver Tabela de Materiais) ao pellet celular numa relação de 1:4 (vol:vol) gel para pellet celular.
- Usando uma sonda Sterling de ponta limpa de 5 pol e 2 mm com um olho enxaguado com água da torneira, mexa suavemente o gel fundido no pellet de célula fixa, criando uma suspensão uniforme de células fixas em gel fundido no fundo do tubo cônico de 50 mL (Figura 1A).
- Coloque o tubo cônico tampado de 50 mL com o gel fundido misturado com pellet de célula fixa em gelo úmido por 5-10 min para solidificar o pellet de célula gelificada.
- Usando uma microespátula limpa, remova cuidadosamente a pastilha do tubo cônico, colocando uma espátula ao longo do lado do tubo e alavancando suavemente a pastilha sem perfurá-la. Coloque o pellet no papel da biópsia.
- Usando uma microespátula limpa, corte o pellet de célula em fatias de 4 a 5 mm de espessura, para que cada fatia possa caber em um de tecido de 26 mm x 26 mm x 5 mm (Figura 1B).
- Coloque fatias individuais de pellets de gel no centro de um pedaço de papel de biópsia. Dobre as duas extremidades opostas do papel de biópsia sobre o pellet, embrulhando-o. Coloque o pellet embrulhado em um de tecido de 26 mm x 26 mm x 5 mm. Feche a tampa, apertando os lados desdobrados do envoltório da biópsia com a tampa do de tecido (Figura 1C).
- Coloque o de pellets de célula aparado na réplica do processador de tecido preenchida com formalina tamponada 10% neutra e execute em um curto cronograma de processamento.
NOTA: O curto período de processamento consiste em 30 minutos em cada retorta, começando em formalina tamponada neutra a 10%, desidratada através de uma série de álcoois cada vez mais graduados, eliminada em três mudanças de xilenos e terminando com infiltração de parafina em duas mudanças de infiltração/incorporação de parafina derretida a 60 °C (ponto de fusão de 56 °C).
4. Incorporação de pellet celular
- Coloque as processadas na área de retenção do centro de incorporação.
- Abra a tampa do de tecido e desdobre cuidadosamente o papel da biópsia.
- Coloque o pellet de célula em um pequeno molde de incorporação descartável de 15 mm x 15 mm, cortado de lado para baixo.
NOTA: Um pequeno molde de incorporação permite que até três seções de pellets de células caibam em uma lâmina de tecido não corada para ensaios de IHC. - Ao segurar suavemente a pastilha de célula no fundo do molde com pinça, adicione infiltração/incorporação de tecido a 62 °C de parafina no molde, cobrindo a pastilha celular.
- Mova o molde para um bloco frio para começar a solidificar a parafina. Ajuste os pellets de células enquanto a parafina está se solidificando para fixá-los em sua posição apropriada na parte inferior do molde.
- Retire a tampa do. Coloque o, de baixo para baixo, em cima do molde de incorporação e adicione parafina derretida adicional para cobrir o.
- Quando a parafina for preenchida sobre o de tecido, devolva o molde ao bloco frio para solidificar17,18.
5. Seccionamento de pellets celulares
- Use um micrótomo rotativo definido em uma espessura de seção de 20 μm para aparar o bloco de pellets de células até que a face completa do bloco de parafina e o pellet de células sejam capturados na fita da seção de parafina. Isso é chamado de "enfrentar" o bloco.
- Esfrie e mergulhe os blocos de pellets em uma bandeja de banho de gelo por 5-15 minutos para resfriar e hidratar o bloco antes de seccionar.
NOTA: Quando o bloco estiver hidratado, o pellet celular será translúcido na fita de parafina. Se opaco, mais imersão é necessária, e artefatos podem estar presentes. - Secção da fita de parafina do bloco de pellets de células a uma espessura de 4 μm ou outra espessura desejada em modo de corte contínuo utilizando um micrótomo rotativo.
- Coloque as fitas de parafina sobre um banho de flutuação de água regulado para 42 °C.
- Pegue as seções de parafina preparadas usando o micrótomo rotativo do banho de flutuação em lâminas carregadas positivamente.
- Coloque a primeira seção na parte superior do slide dentro do limite de cobertura e coloração, colocando a segunda abaixo dela e a terceira seção de pellets de célula abaixo dela (Figura 1D).
- Após seccionamento, secar as lâminas à temperatura ambiente (cerca de 23 °C) durante 24 h, seguidas de 60 °C durante 30 min.
NOTA: Após o cozimento das lâminas a 60 °C, as seções de pellets celulares podem ser usadas com qualquer protocolo IHC padrão, incluindo protocolos que usam recuperações de antígenos induzidas pelo calor e à base de enzimas9.
Representative Results
Após a adição do gel à base de agarose, o pellet celular deve formar uma massa gelatinosa sólida passível de manuseio (Figura 1B). Uma vez incorporado, o pellet terá uma consistência semelhante a um tecido sólido e deve ser relativamente fácil de seccionar rotineiramente em um micrótomo. Uma vez que os pellets celulares são incorporados, eles podem ser usados em histologia e experimentos de IHC de maneira idêntica aos tecidos fixados em formalina e embutidas em parafina. Isso inclui o uso de epítopo induzido pelo calor ou recuperação de antígeno enzimático com métodos de detecção cromogênica indireta (por exemplo, usando um anticorpo secundário com peroxidase de rábano e detecção de diaminobenzidina, como mostrado na Figura 2 e na Figura 3) usando plataformas comerciais de IHC9. Histologicamente, as células devem ser uniformemente dispersas ao longo da seção com aglomeração celular mínima, embora as células aderentes possam manter suas interações célula-célula no pellet. Esta dispersão permite a distinção entre células individuais, embora esta distinção seja significativamente influenciada pelo tamanho da célula e densidade relativa dentro do pellet de gel. O núcleo, o citoplasma e a membrana celular são mais distintos e mais fáceis de visualizar após a dispersão (Figura 2). Na Figura 2, três linhagens celulares são imunomarcadas para o fator de transcrição TEAD. A imunomarcação é visualizada com o cromogênio diaminobenzidina marrom (DAB). As linhagens celulares apresentam níveis variados de expressão do fator de transcrição TEAD, variando de nenhuma expressão (Figura 2A) a expressão fraca (Figura 2B) a expressão forte (Figura 2C). Neste exemplo, a marcação é observada no núcleo, como seria de se esperar de um fator de transcrição, e está ausente do citoplasma e da membrana celular, que são visíveis, mas carecem de marcação (Figura 2). Os pellets de células podem ser incorporados em microarrays de pellets de células (Figura 3) em lâminas padrão de 23 mm x 75 mm x 1 mm. A incorporação dos pellets de células em um microarray permite a avaliação de controles com diferentes níveis de expressão na mesma lâmina. Neste exemplo, as células-tronco embrionárias de camundongos deficientes em PEG10 (à esquerda) servem como controle negativo e as células 293T que superexpressam a PEG10 (imunomarcação marrom à direita) servem como controle positivo no microarray (Figura 3). Não há variação nos procedimentos de tecido e incorporação de pellets celulares que serão incluídos nos microarrays, e os microarrays podem ser gerados utilizando métodos semelhantes aos utilizados para os tecidos19.
Figura 1: Processamento de pellets celulares . (A) As células são peletizadas em tubos cônicos de 50 mL e misturadas com o gel. (B) Uma vez solidificados, os pellets são cortados em série para caber em um de tecido de 26 mm x 26 mm x 5 mm. (C) Os pellets de células são embrulhados em papel de biópsia antes de serem colocados no processador de tecido. (D) Até três pellets de células podem ser coletados em série em uma única lâmina histológica de vidro de 25 mm x 75 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Pellets celulares com diferentes níveis de expressão de proteína ou transcrito podem ser utilizados para avaliar a faixa dinâmica do ensaio. Os pellets celulares são imunomarcados para o fator de transcrição TEAD e demonstram níveis variados de expressão de TEAD. (A) As células DAUDI não têm expressão de TEAD e não têm imunomarcação no citoplasma ou núcleo. A mancha azul é a contracoloração de hematoxilina do núcleo. (B) As células 293T demonstram fraca marcação nuclear (cromogênio diaminobenzidina marrom (DAB)) do fator de transcrição TEAD. (C) As células Detroit 562 expressam fortemente TEAD, como demonstrado pela intensa marcação marrom no núcleo. A marcação dentro do núcleo, mas não do citoplasma (região esbranquiçada a cinza ao redor do núcleo marrom), demonstra a marcação apropriada do ensaio imuno-histoquímico. Observe que em todas as três linhagens celulares, as células estão dispersas, permitindo a visualização de células individuais, incluindo suas morfologias nucleares e citoplasmáticas. Barra de escala = 25 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: O microarray de pellets celulares criado usando vários pellets celulares com diferentes níveis de expressão de proteínas permite a avaliação simultânea de controles em uma única lâmina. As células-tronco embrionárias de camundongos deficientes em PEG10 (à esquerda) e as células 293T que expressam PEG10 em excesso (à direita) são imunomarcadas para PEG10. Enquanto a marcação forte (cromogênio DAB marrom) é observada em células 293T superexpressando PEG10, nenhuma marcação é aparente em células deficientes em PEG10. O azul representa a contracoloração da hematoxilina. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este protocolo descreve uma metodologia para gerar pellets celulares fixados em formalina e embebidos em parafina que podem ser usados como controles para estudos de imunohistoquímica a jusante e hibridização in situ. As metodologias histológicas descritas neste protocolo são aplicáveis a uma gama diversificada de linhagens celulares primárias e oncológicas, e adaptam principalmente técnicas histológicas de rotina para produzir esses pellets17,18. Quando processados e incorporados, os pellets podem ser usados de maneira semelhante aos tecidos. Isso inclui usá-los com protocolos de recuperação de antígenos enzimáticos e induzidos pelo calor para experimentos imuno-histoquímicos. Um dos objetivos das metodologias utilizadas neste protocolo é preservar a morfologia e antigenicidade das células durante todo o processo. Portanto, o EDTA, que é relativamente suave em termos de mudanças tanto na morfologia quanto na antigenicidade, é usado para separar as células. Isso não quer dizer que outras abordagens, como a interrupção física, não sejam viáveis; no entanto, qualquer abordagem para separar as células deve garantir que as células não sejam lesadas no processo. O segundo objetivo deste protocolo é fixar e processar as células de maneira semelhante aos tecidos, usando o mesmo fixador, razão fixativa, esquema de processamento (fixação, desidratação, limpeza e infiltração de parafina) e técnicas de incorporação, para que possam servir como controles comparáveis para ensaios a jusante. Assim, as abordagens de fixação e processamento usadas para gerar pellets celulares devem imitar as abordagens usadas para os tecidos.
O protocolo descrito neste relatório não é adaptado para lidar com células com agentes infecciosos, como células infectadas com bactérias patogênicas ou vírus, pois as células são destacadas, coletadas e centrifugadas antes da fixação. Os pesquisadores podem considerar protocolos para fixar as células antes do descolamento, mas isso exigiria uma otimização adicional para coletar as células sem perturbar a morfologia celular. Além disso, os tempos de fixação e as condições de manuseio de células com agentes infecciosos requerem considerações adicionais com base no agente infeccioso e nos protocolos institucionais de biossegurança associados.
Os pellets celulares fixados em formalina e embebidos em parafina são excepcionalmente vantajosos por terem níveis de expressão proteica bem definidos10. Enquanto o câncer e as linhagens celulares endógenas oferecem uma seleção de células com diferentes níveis de expressão proteica, as tecnologias de engenharia genética permitem que os cientistas modelem a expressão proteica, por meio da superexpressão de proteínas de interesse e do uso de tecnologias CRISPR para extirpar ou inserir genes codificadores de interesse20,21 . A desvantagem das proteínas superexpressas em linhagens celulares é que elas são medidas pobres para a sensibilidade de um ensaio, pois podem não representar níveis endógenos de proteína22. Em contraste, tanto as linhagens celulares endógenas quanto as linhagens celulares cancerígenas podem representar melhor os níveis de expressão endógena, e a deleção mediada por CRISPR do gene codificador em uma linha cognata pode servir como um controle negativo correspondente. Além disso, linhagens celulares endógenas ou linhagens celulares de câncer com diferentes níveis de expressão proteica são ideais para experimentos de titulação para escolher diluições finais de anticorpos e entender melhor a sensibilidade de um ensaio (Figura 2). A decisão em torno de quais linhagens celulares usar deve ser baseada em necessidades experimentais individuais e muitas vezes utilizará uma combinação de abordagens.
Além de avaliar se um anticorpo pode detectar a proteína de interesse, um painel de linhagens celulares pode ser usado para definir a especificidade de um anticorpo. Por exemplo, um painel de linhagens celulares que expressam individualmente uma família de proteínas intimamente relacionadas pode ser usado para testar se um anticorpo é específico para uma proteína individual ou se também detecta outras proteínas intimamente relacionadas. Controles mais elaborados podem envolver o uso de linhagens celulares que expressam, seja através da entrada de CRISPR ou através da superexpressão, proteínas com mutações pontuais que não podem sofrer eventos de sinalização específicos que estão sendo detectados (por exemplo, mutação em locais específicos de fosforilação ao avaliar um anticorpo fosfo-específico). Embora essas sejam abordagens mais complexas, elas podem ser necessárias para confirmar que o anticorpo usado apenas rotula em circunstâncias específicas10.
É importante notar que as manipulações genéticas de linhagens celulares podem não gerar uma população celular homogênea. Por exemplo, a eficiência da transfecção na superexpressão de linhagens celulares normalmente não é 100% e algumas células podem não expressar demais a proteína de interesse. A inclusão de FLAG ou uma etiqueta relacionada na transfecção que possa ser detectada com métodos padrão pode ser útil para avaliar a eficiência de transfecção da linhagem celular23. Isso pode ser útil tanto para determinar se a transfecção foi bem-sucedida e descartar a falta de detecção devido à expressão proteica, quanto para servir de referência para a proporção esperada de células que devem expressar a proteína de interesse.
A hibridização in situ (ISH) também pode ser uma ferramenta benéfica para caracterizar a expressão gênica-alvo em pellets celulares e informar o desenvolvimento do método IHC10. Ao rastrear anticorpos, pode ser informativo saber quando o transcrito e, portanto, a proteína potencial, podem ser detectados. Além disso, a triagem de ISH de pellets celulares pode ser benéfica para o desenvolvimento do método ISH. Embora a especificidade seja menos frequentemente um problema para os ensaios de ISH, ainda é importante ter controles apropriados e considerações semelhantes para o desenvolvimento e utilização de controles que possam ser aplicados a estudos de ISH.
Os microarrays de tecido são criados removendo núcleos de blocos de doadores e transferindo esses núcleos, muitas vezes em um padrão de grade, para um bloco de parafina receptor. Ao final, o bloco receptor contém um espectro de amostras em um único bloco, permitindo que todas as amostras do bloco passem por procedimentos idênticos de IHC e permitindo a comparação direta de várias amostras na mesma lâmina24,25. Como os pellets celulares são populações relativamente uniformes, eles podem ser representados com precisão por núcleos de 1 mm, tornando-os candidatos ideais para inclusão em matrizes semelhantes. Usando uma matriz de pellets celulares, é possível incluir pellets celulares com diferentes níveis de expressão, pellets celulares que expressam exclusivamente proteínas relacionadas e pellets celulares que expressam ortólogos da proteína de interesse de diferentes espécies em uma única lâmina (Figura 3). Isso permite que todos os pellets celulares sejam avaliados simultaneamente em condições uniformes de forma rápida, minimizando o uso de reagentes25.
Recomenda-se um volume mínimo de pellets de células iniciais de 2 mL coletados de oito frascos T175 para este protocolo. Esse volume permite a produção e o arquivamento de vários blocos de pellets de células, de modo que os controles de pellets de células possam ser padronizados por longos períodos de tempo e várias matrizes de pellets de células possam ser criadas a partir de um determinado pellet. Volumes celulares mais baixos podem ser usados ao lidar com linhagens celulares primárias derivadas de pacientes, linhagens celulares de crescimento lento ou quando as condições limitam o volume da amostra. Naturalmente, volumes iniciais mais baixos potencializarão o impacto negativo de qualquer perda celular durante a fixação e preparação do pellet e limitarão o material disponível para processos a jusante. É especialmente importante tomar cuidado ao remover o fixador após a centrifugação, para minimizar qualquer perda associada. Para volumes de amostra mais baixos, um tubo de centrífuga tampado de 1,5 mL pode ser usado para peletizar as células. Estes tubos podem ser cortados longitudinalmente com uma lâmina para processamento.
Semelhante à fixação tecidual, a fixação celular dentro deste pellet é crítica para as avaliações de IHC a jusante. Para alcançar a fixação completa, usamos pelo menos uma proporção de formalina para célula de 10:1 e invertemos o tubo cônico para manter as células em suspensão. Se as células não estiverem em suspensão no momento da fixação, existe o risco de fixação incompleta ou inadequada, o que afetará a imunomarcação a jusante. Muitas vezes, isso se manifesta como uma forte rotulagem na periferia e perda de rotulagem no centro do pellet ou rotulagem de intensidade variável em todo o pellet.
Este protocolo usa Histogel, que é composto principalmente de hidroxietilagarose, para ligar o pellet celular e permitir que as células sejam distribuídas uniformemente por todo o pellet celular. Sem ele, as células se compactam e perdem seus detalhes citomorfológicos. Esses detalhes citomorfológicos geralmente são importantes durante a triagem de anticorpos, pois fornecem informações adicionais sobre se o anticorpo está marcando no compartimento subcelular apropriado (por exemplo, núcleo, citoplasma ou membrana plasmática). Em contraste, muito gel pode resultar em densidades celulares mais baixas dentro do pellet, levando as células a serem amplamente distribuídas e reduzindo o número de células por seção.
Este protocolo pode ser usado rotineiramente para desenvolver controles IHC. Os materiais necessários para criar esses pellets são comuns em laboratórios de biologia investigativa e histologia, e os métodos são simples e fáceis de adaptar. Embora os pellets celulares tenham limitações como controles de IHC, eles servem como ótimas ferramentas para a triagem inicial de anticorpos e complementam outros controles teciduais.
Disclosures
Todos os autores são funcionários da Genentech/ Roche e, como tal, são acionistas da Roche.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a colaboração de nossos colegas na organização de Pesquisa da Genentech e, especialmente, dos laboratórios do núcleo de Patologia (P-core) que contribuíram para o desenvolvimento desses métodos ao longo dos anos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).
- Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma. American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).
- Cobleigh, M. A., et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).
- Vogel, C. L., et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).
- Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).
- Havnar, C., et al. Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson's trichrome. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).
- Newton, K., et al. RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development. Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).
- Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling. Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).
- Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach. Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).
- Ramos-Vara, J. A., et al. American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).
- Dominguez, S., et al. Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).
- Lean, F. Z. X., et al. Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization. Transboundary and Emerging Disease. , 14232 (2021).
- Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies. Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).
- Atcc.org. , Available from: http://www.atcc.org (2022).
- Thermo Fisher Scientific. Cell Culture Basics Handbook. , Gibco. (2020).
- Carson, F. Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed. , ASCP Press. Chicago, IL. (1997).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Tissue Processing. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed. Spencer, L. T., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone-Elsevier. China. (2013).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. Cancer Gene Profiling. , Humana Press. New York. 53-65 (2016).
- Jinek, M., et al. Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).
- Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology. Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).
