Summary
يظهر هنا بروتوكول لتوليد ضوابط بيليه خلوية ثابتة بالفورمالين ومضمنة بالبارافين للكيمياء الهيستولوجية المناعية.
Abstract
تعتبر الضوابط الإيجابية والسلبية مع التعبير المعروف عن البروتينات المستهدفة ضرورية لتطوير مقايسات الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC). في حين أن ضوابط الأنسجة مفيدة للبروتينات ذات الخصائص الجيدة ذات أنماط التعبير النسيجي والخلوي المحددة ، إلا أنها أقل ملاءمة للتطوير الأولي لمقايسات IHC للبروتينات الجديدة أو سيئة التوصيف أو المعبر عنها في كل مكان. بدلا من ذلك ، نظرا لطبيعتها الموحدة ، يمكن أن تكون كريات الخلايا ، بما في ذلك خطوط الخلايا السرطانية ذات مستويات التعبير البروتيني أو النسخ المحددة (على سبيل المثال ، التعبير العالي والمتوسط والمنخفض) ، أو خطوط الخلايا التي يتم التعبير عنها بشكل مفرط ، أو خطوط الخلايا مع الجينات المحذوفة من خلال تقنيات هندسة الخلايا مثل كريسبر ، بمثابة عناصر تحكم قيمة ، خاصة بالنسبة لتوصيف الأجسام المضادة الأولية واختيارها. من أجل استخدام كريات الخلايا هذه في تطوير فحوصات IHC للأنسجة المثبتة بالفورمالين والمدمجة بالبارافين ، يجب معالجتها وتضمينها بطريقة تلخص الإجراءات المستخدمة لمعالجة الأنسجة. يصف هذا البروتوكول عملية لإنشاء ومعالجة عناصر التحكم في حبيبات الخلايا المثبتة بالفورمالين والمضمنة بالبارافين والتي يمكن استخدامها لتطوير طريقة IHC.
Introduction
الكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) هي واحدة من أكثر المقايسات شيوعا في علم الأمراض الاستقصائي والتشخيصي. اعتمادا على السياق والفحص ، يتم استخدام IHC للمساعدة في تشخيص السرطان1,2 ، والتنبؤ باستجابة العلاج 3,4 ، وتحديد مسببات الأمراض5 ، وتوصيف أنواع الخلايا في الأنسجة المريضة6 ، ودراسة المسارات البيولوجية واستجابات الأنسجة 7,8. في جميع الحالات ، فإن المبدأ الأساسي لفحص IHC هو أن الجسم المضاد يرتبط على وجه التحديد بهدف مهم ، وهو الأكثر شيوعا بروتين ، ويتم تصور حدث الربط هذا لاحقا في قسم الأنسجة9. ومع ذلك ، فإن أحد أكبر التحديات في أي اختبار IHC هو التأكد من أن الأجسام المضادة تكتشف على وجه التحديد هدف الاهتمام10. تمثل خصوصية الأجسام المضادة تحديا في معظم المقايسات المناعية ، لكن الكيمياء الهيستولوجية المناعية تقدم تحديات فريدة من نوعها حيث لا توجد مقاييس ثانوية ، مثل الوزن الجزيئي ، للتمييز بين العلامات المحددة وغير المحددة. هذا أمر مزعج بشكل خاص عند تقييم الأهداف سيئة التوصيف أو المعبر عنها في كل مكان والتي تفتقر إلى أنماط توطين خلوي محددة جيدا. لذلك ، فإن الضوابط القوية التي يمكن أن تساعد في توصيف خصوصية ملزمة أمر بالغ الأهمية عند تطوير فحص IHCجديد 10.
بالنسبة للأهداف المحددة جيدا مع أنماط التعبير الخلوي المميزة ، يتم استخدام ضوابط الأنسجة بشكل متكرر في تطورات طريقة IHC. استنادا إلى ثروة من البيانات السابقة ، يمكن للمرء تحديد ما إذا كان الجسم المضاد يضع علامات على الأنسجة والخلية والمقصورة تحت الخلوية التي من المعروف أنه يتم التعبير عنها فيها ، وأنه لا يضع علامات على مكونات الأنسجة حيث لا ينبغي أن يكون موجودا11. ومع ذلك ، فإن ضوابط الأنسجة ذات فائدة محدودة للأهداف الجديدة سيئة التوصيف دون أنماط تعبير معروفة أو للبروتينات التي يتم التعبير عنها على نطاق واسع وتفتقر إلى أنماط التعبير المميزة. في كلا السيناريوهين ، فإن عدم وجود نمط تعبير محدد جيدا يجعل من المستحيل التمييز بين وضع العلامات المحددة وغير المحددة في الأنسجة. في هذه الحالات, توفر كريات الخلايا تحكما بديلا قيما في IHC. يمكن أن تشمل ضوابط حبيبات الخلايا ما يلي: السرطان أو خطوط الخلايا الأخرى التي لها مستويات تعبير داخلية أو جوهرية / غير مستحثة للبروتين محل الاهتمام ، والتي يمكن وصف تعبيرها البروتيني بالنشاف الغربي ، أو تحليلات قياس التدفق الخلوي ، أو استقراء التنميط النسخي ؛ خطوط الخلايا المهندسة التي إما تفرط في التعبير عن البروتين محل الاهتمام أو يتم حذف الجين المشفر محل الاهتمام ؛ أو الخلايا التي عولجت في ظل ظروف محددة للحث على التعبير عن البروتين أو الإشارة إلى الأحداث ذات الأهمية (مثل الفسفرة)10,12. تسمح مستويات تعبير البروتين المميزة جيدا في خطوط الخلايا أيضا بتقييم حساسية الفحص باستخدام لوحة من خطوط الخلايا ذات تعبير البروتين العالي والمتوسط والمنخفض والغائب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تكون كريات الخلايا المهندسة ضوابط قيمة خاصة بالأنواع للأنواع البيطرية ، والتي قد يكون هناك توصيف محدود لها أو ضوابط الأنسجة المتاحة13. في حين أن كريات الخلايا لها حدودها ، مثل البروتين المحدود الموجود في خطوط الخلايا التي لن تعكس البروتين المتنوع في الأنسجة ، فإنها تعمل كعناصر تحكم مناسبة للتأكد من أن الجسم المضاد يمكنه اكتشاف الهدف محل الاهتمام وكذلك استبعاد الارتباط العشوائي بواسطة الجسم المضاد الأولي أو الجسم المضاد الثانوي أو الحكام الآخرين في الفحص10.
يتم تثبيت معظم الأنسجة في علم الأمراض التشخيصي والاستقصائي في الفورمالين المحايد ، وتجفيفها في سلسلة من الكحوليات ، وتطهيرها في الزيلين ، ومعالجتها ودمجها في شمع البارافين. تثبيت الفورمالين عبر البروتينات ، والتثبيت وكل خطوة إضافية في معالجة الأنسجة يمكن أن تؤثر بشكل مباشر على البروتينات وقدرة الأجسام المضادة على اكتشافها 9,14. لذلك ، من المهم أن تخضع أي عناصر تحكم مستخدمة في مقايسة IHC لنفس إجراءات التثبيت ومعالجة الأنسجة والتضمين. تصف هذه المقالة الاعتبارات الفريدة لمعالجة الخلايا المستزرعة وتضمينها لتكون بمثابة ضوابط لتطوير فحوصات IHC في الأنسجة المدمجة بالبارافين الثابت بالفورمالين ، مع تركيز المنهجية بشكل أساسي على التعامل مع حبيبات الخلية ومعالجتها في مختبر الأنسجة.
Protocol
1. إعداد بيليه الخلية
- في أربعة إلى ثمانية 150 مم2 أو ثمانية قوارير × T175 ، تنمو الخلايا في الوسط والظروف الموصى بها لخط الخلية إلى التقاء 80٪ -90٪. على سبيل المثال ، قم بزراعة 293 خلية تائية في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني و 2 mM L-glutamine15.
ملاحظة: يجب زراعة الخلايا باستخدام الظروف والوسط المطلوب لخط اهتمام الخلية16. قد تختلف هذه الظروف اعتمادا على خط الخلية, ولكن يجب أن تكون طرق التكوير النهائية قابلة للتكيف مع خطوط الخلايا المستقلة عن ظروف الزرع. - بمجرد أن تقترب الخلايا من الالتقاء (80٪ -90٪) ، قم بشفط وسائط النمو باستخدام ماصة مفرغة وشطف الخلايا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- أضف 5 مل من 5-10 مللي مول EDTA إلى كل دورق واحتضان القوارير عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق. اضغط برفق على جانب القارورة لإزاحة الخلايا.
ملاحظة: لا تستخدم التربسين لأن هذا يمكن أن يشق الحواتم السطحية التي من شأنها أن تؤثر سلبا على بعض المستضدات.- بمجرد إزاحة الخلايا ، أضف 5 مل من وسائط النمو المستخدمة لخط الخلية (على سبيل المثال ، DMEM لخلايا 293T) إلى كل دورق ، ثم انقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل.
- أجهزة الطرد المركزي للأنابيب المخروطية عند 930 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الوسائط و EDTA عن طريق شفط ماصة فراغ.
- اغسل كريات الخلية في 10-20 مل من 1x PBS ، وإذا تم استخدام ألواح أو قوارير متعددة ، فقم بتجميع الخلايا من الألواح أو القوارير (حوالي ستة قوارير T175 في التجربة الموضحة في الشكل 1) في أنبوب مخروطي واحد سعة 50 مل.
- جهاز طرد مركزي للأنبوب بسرعة 930 × جم لمدة 5 دقائق. نضح PBS بعد الطرد المركزي مع ماصة فراغ.
- حافظ على أنبوب بيليه الخلية على ثلج مبلل حتى التثبيت.
ملاحظة: يتم الاحتفاظ بالخلايا باردة للحد من نشاط الإنزيم المتحلل وتقليل التحلل الذاتي للخلايا وتغيرات البروتين المرتبطة بها ، بما في ذلك التغيرات في توطين البروتين.
2. تثبيت بيليه الخلية
- قم بإجراء التثبيت عن طريق إضافة 30 مل من الفورمالين المحايد المخزن بنسبة 10٪ إلى حبيبات الخلية سعة 3 مل لإنشاء نسبة تثبيت إلى خلية 10: 1 (vol: vol).
- اقلب الأنبوب سعة 50 مل المغطى بإحكام بشكل متكرر حتى يتم تعليق الخلايا تماما.
ملاحظة: يمكن أن يتسبب تكوين حبيبات الخلايا المكثفة قبل التثبيت الكامل في تثبيت غير متساو ، مما يؤدي إلى ظهور قطع أثرية أثناء إجراءات التلوين والملصقات المناعية اللاحقة. - اسمح لتعليق الخلية بالاستقرار طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
- أعد قلب الأنبوب في اليوم التالي لإعادة تعليق الخلايا ، وزيادة نسبة السطح إلى الحجم لتحسين التثبيت.
ملاحظة: دوامة بيليه الخلية غير مطلوبة أو موصى بها لأنها قد تؤدي إلى تلف الخلايا.
3. تقليم ومعالجة بيليه الخلية
- بعد تثبيت 24 ساعة ، قم بالطرد المركزي للأنبوب المخروطي سعة 50 مل عند 930 × جم عند 5 درجات مئوية لمدة 10-15 دقيقة. تأكد من أن الأنابيب مغطاة بإحكام وموزعة بالتساوي ومتوازنة في أجهزة الطرد المركزي.
ملاحظة: يمكن تعديل أوقات التثبيت لتعكس أوقات تثبيت الأنسجة المستخدمة من قبل المختبر أو متطلبات ظروف تجريبية محددة. - بعد الطرد المركزي ، تأكد من أن الخلايا تشكل حبيبات مرئية. قم بإزالة المثبت عن طريق الصب و / أو الشفط بعناية باستخدام ماصة نقل معقمة.
- أضف الجل المنصهر (40-60 درجة مئوية) القائم على هيدروكسي إيثيل أغاروز (انظر جدول المواد) إلى حبيبات الخلية بنسبة هلام إلى بيليه الخلية بنسبة 1: 4 (المجلد: المجلد) إلى بيليه الخلية.
- باستخدام مسبار ستيرلنج نظيف 5 بوصات و 2 مم مع شطف العين بماء الصنبور ، حرك الجل المنصهر برفق في حبيبات الخلية الثابتة ، مما يخلق تعليقا متساويا للخلايا الثابتة في هلام منصهر في قاع الأنبوب المخروطي سعة 50 مل (الشكل 1 أ).
- ضع الأنبوب المخروطي المغطى سعة 50 مل مع الجل المنصهر الممزوج بحبيبات الخلايا الثابتة على ثلج مبلل لمدة 5-10 دقائق لتصلب حبيبات الخلية المتبلورة.
- باستخدام ملعقة دقيقة نظيفة, قم بإزالة الحبيبات بعناية من الأنبوب المخروطي عن طريق وضع ملعقة على طول جانب الأنبوب والاستفادة من الحبيبات برفق دون ثقبها. ضع الحبيبات على ورق الخزعة.
- باستخدام ملعقة دقيقة نظيفة ، قم بقص حبيبات الخلية إلى شرائح بسمك 4-5 مم ، بحيث يمكن وضع كل شريحة في علبة مناديل مقاس 26 مم × 26 مم × 5 مم (الشكل 1 ب).
- ضع شرائح حبيبات الجل الفردية في وسط قطعة من ورق الخزعة. قم بطي الطرفين المتعارضين لورقة الخزعة فوق الحبيبات ولفها. ضع الحبيبات الملفوفة في علبة مناديل مقاس 26 مم × 26 مم × 5 مم. أغلق الغطاء ، وقم بتجعيد الجوانب غير المطوية من غلاف الخزعة بغطاء كاسيت الأنسجة (الشكل 1 ج).
- ضع كاسيت بيليه الخلية المشذبة في معوجة معالج الأنسجة المملوءة بالفورمالين المحايد بنسبة 10٪ وقم بتشغيلها وفقا لجدول معالجة قصير.
ملاحظة: يتكون جدول المعالجة القصير من 30 دقيقة في كل معوجة تبدأ في 10٪ من الفورمالين المحايد ، ويتم تجفيفها من خلال سلسلة من الكحولات المتدرجة بشكل متزايد ، ويتم تطهيرها في ثلاثة تغييرات من الزيلين ، وتنتهي بتسلل البارافين في تغييرين من 60 درجة مئوية تسلل المنصهر / تضمين البارافين (56 درجة مئوية نقطة الانصهار).
4. تضمين بيليه الخلية
- ضع الكاسيتات المعالجة في منطقة التخزين بمركز التضمين.
- افتح غطاء كاسيت الأنسجة وافتح ورق الخزعة بعناية.
- ضع حبيبات الخلية في قالب تضمين صغير يمكن التخلص منه مقاس 15 مم × 15 مم ، بحيث يكون الجانب المقطوع لأسفل.
ملاحظة: يسمح قالب التضمين الصغير بما يصل إلى ثلاثة أقسام بيليه خلوية لتناسب شريحة واحدة من الأنسجة غير الملوثة لفحوصات IHC. - أثناء إمساك حبيبات الخلية برفق في قاع القالب بالملقط, أضف 62 درجة مئوية تسلل الأنسجة / تضمين البارافين في القالب, تغطية بيليه الخلية.
- انقل القالب إلى كتلة باردة للبدء في ترسيخ البارافين. اضبط كريات الخلية أثناء تصلب البارافين لتثبيتها في موضعها المناسب في قاع القالب.
- قم بإزالة الغطاء من الكاسيت. ضع الكاسيت ، الجانب السفلي لأسفل ، أعلى قالب التضمين وأضف بارافين منصهر إضافي لتغطية الكاسيت.
- عندما يتم ملء البارافين فوق علبة الأنسجة ، أعد القالب إلى الكتلة الباردة لتصلب17,18.
5. تقسيم بيليه الخلية
- استخدم ميكروتوم دوار بسمك تقطيع 20 ميكرومتر لتقليم كتلة حبيبات الخلية حتى يتم التقاط الوجه الكامل لكتلة البارافين وحبيبات الخلية في شريط مقطع البارافين. وهذا ما يسمى "مواجهة" الكتلة.
- قم بتبريد ونقع كتل الحبيبات ذات الوجه على صينية حمام ثلج لمدة 5-15 دقيقة لتبريد الكتلة وترطيبها قبل التقسيم.
ملاحظة: عندما تكون الكتلة رطبة ، ستكون حبيبات الخلية شفافة في شريط البارافين. إذا كان معتما ، يلزم المزيد من النقع ، وقد تكون القطع الأثرية موجودة. - قسم شريط البارافين لكتلة بيليه الخلية بسمك 4 ميكرومتر أو أي سمك آخر مرغوب فيه في وضع القطع المستمر باستخدام ميكروتوم دوار.
- ضع شرائط البارافين على حمام عائم مائي مضبوط على 42 درجة مئوية.
- التقط مقاطع البارافين المحضرة باستخدام الميكروتوم الدوار من حمام الطفو على شرائح موجبة الشحنة.
- ضع القسم الأول في الجزء العلوي من الشريحة داخل غطاء الغطاء وحدود التلطيخ ، ضع القسم الثاني أسفله وقسم حبيبات الخلية الثالثة أسفل ذلك (الشكل 1 د).
- بعد التقسيم ، جفف الشرائح في درجة حرارة الغرفة (حوالي 23 درجة مئوية) لمدة 24 ساعة ، تليها 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: بعد خبز الشرائح عند 60 درجة مئوية ، يمكن استخدام أقسام حبيبات الخلية مع أي بروتوكول IHC قياسي ، بما في ذلك البروتوكولات التي تستخدم استرجاع المستضد الناجم عن الحرارة والإنزيم9.
Representative Results
بعد إضافة الجل القائم على الأغاروز ، يجب أن تشكل حبيبات الخلية كتلة جيلاتينية صلبة قابلة للمناولة (الشكل 1 ب). بمجرد تضمينها ، سيكون للحبيبات تناسق مشابه للنسيج الصلب ، ويجب أن يكون من السهل نسبيا تقسيمها بشكل روتيني على ميكروتوم. بمجرد تضمين كريات الخلايا ، يمكن استخدامها في تجارب الأنسجة و IHC بطريقة مماثلة للأنسجة المثبتة بالفورمالين والمضمنة بالبارافين. ويشمل ذلك استخدام الاسترجاع المستحث بالحرارة أو استرجاع المستضد الأنزيمي مع طرق الكشف الكروموجيني غير المباشرة (على سبيل المثال ، استخدام جسم مضاد ثانوي مع بيروكسيديز الفجل والكشف عن ديامينوبنزيدين كما هو موضح في الشكل 2 والشكل 3) باستخدام منصات IHC التجارية9. من الناحية النسيجية ، يجب أن تكون الخلايا منتشرة بالتساوي في جميع أنحاء القسم مع الحد الأدنى من تكتل الخلايا ، على الرغم من أن الخلايا الملتصقة قد تحافظ على تفاعلاتها الخلوية في الحبيبات. يسمح هذا التشتت بالتمييز بين الخلايا الفردية, على الرغم من أن هذا التمييز سيتأثر بشكل كبير بحجم الخلية والكثافة النسبية داخل حبيبات الهلام. تكون النواة والسيتوبلازم والغشاء الخلوي أكثر تميزا وأسهل في التصور عند التشتت (الشكل 2). في الشكل 2 ، تم تصنيف ثلاثة خطوط خلوية مناعية لعامل نسخ TEAD. يتم تصور وضع العلامات المناعية باستخدام كروموجين ديامينوبنزيدين البني (DAB). تحتوي خطوط الخلايا على مستويات متفاوتة من التعبير عن عامل نسخ TEAD ، تتراوح من عدم وجود تعبير (الشكل 2 أ) إلى التعبير الضعيف (الشكل 2 ب) ، إلى التعبير القوي (الشكل 2 ج). في هذا المثال، يلاحظ وضع العلامات في النواة، كما هو متوقع من عامل النسخ، ولا يوجد من السيتوبلازم وغشاء الخلية، وهما مرئيان ولكنهما يفتقران إلى وضع العلامات (الشكل 2). يمكن دمج كريات الخلايا في المصفوفات الدقيقة لحبيبات الخلايا (الشكل 3) على الشرائح القياسية 23 مم × 75 مم × 1 مم. يسمح دمج كريات الخلية في مصفوفة دقيقة بتقييم عناصر التحكم بمستويات تعبير مختلفة في نفس الشريحة. في هذا المثال ، تعمل الخلايا الجذعية الجنينية للفأر الناقصة PEG10 (يسار) كعنصر تحكم سلبي وخلايا 293T التي تعبر بشكل مفرط عن PEG10 (يمين ، علامة مناعية بنية) بمثابة عنصر تحكم إيجابي في microarray (الشكل 3). لا يوجد اختلاف في الأنسجة وإجراءات التضمين لكريات الخلايا التي سيتم تضمينها في المصفوفات الدقيقة ، ويمكن إنشاء المصفوفات الدقيقة باستخدام طرق مماثلة لتلك المستخدمة في الأنسجة19.
الشكل 1: معالجة حبيبات الخلية . (أ) توضع الخلايا في أنابيب مخروطية سعة 50 مل وتخلط مع الجل. (ب) بمجرد أن تصلب الكريات ، يتم تقطيعها بشكل متسلسل لتلائم علبة مناديل مقاس 26 مم × 26 مم × 5 مم. (ج) تغلف الكريات الخلوية بورق خزعة قبل وضعها في معالج الأنسجة. (د) يمكن جمع ما يصل إلى ثلاث كريات خلوية بشكل متسلسل على شريحة أنسجة زجاجية واحدة مقاس 25 مم × 75 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: يمكن استخدام كريات الخلايا ذات المستويات المختلفة من البروتين أو التعبير النصي لتقييم النطاق الديناميكي للفحص. يتم تصنيف كريات الخلايا المناعية لعامل نسخ TEAD وتظهر مستويات متفاوتة من تعبير TEAD. (أ) تفتقر خلايا داودي إلى تعبير TEAD، وليس لها علامات مناعية في السيتوبلازم أو النواة. البقعة الزرقاء هي صبغة مضادة للهيماتوكسيلين للنواة. (ب) تظهر الخلايا التائية 293 علامة نووية ضعيفة (كروموجين ثنائي أمينوبنزيدين بني (DAB)) لعامل نسخ TEAD. (ج) تعبر خلايا ديترويت 562 بقوة عن TEAD كما يتضح من وضع العلامات البنية الشديدة في النواة. يوضح وضع العلامات داخل النواة ، ولكن ليس السيتوبلازم (المنطقة البيضاء إلى الرمادية حول النواة البنية) ، وضع العلامات المناسبة لمقايسة الكيمياء المناعية. لاحظ أنه في جميع خطوط الخلايا الثلاثة ، تنتشر الخلايا ، مما يسمح بتصور الخلايا الفردية ، بما في ذلك مورفولوجياتها النووية والسيتوبلازمية. شريط المقياس = 25 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: يسمح ميكروأري بيليه الخلية الذي تم إنشاؤه باستخدام كريات خلايا متعددة بمستويات تعبير بروتينية مختلفة بالتقييم المتزامن للعناصر التحكم في شريحة واحدة. الخلايا الجذعية الجنينية للفأر التي تعاني من نقص PEG10 (يسار) والخلايا التائية 293T التي تعبر بشكل مفرط عن PEG10 (يمين) محصنة ل PEG10. بينما لوحظ وضع العلامات القوية (كروموجين DAB البني) في خلايا 293T التي تفرط في التعبير عن PEG10 ، لا يوجد وضع علامات واضح في الخلايا الناقصة PEG10. الأزرق يمثل الهيماتوكسيلين مضادة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Discussion
يصف هذا البروتوكول منهجية لتوليد كريات خلوية مثبتة بالفورمالين ومدمجة بالبارافين يمكن استخدامها كعناصر تحكم في الكيمياء الهيستولوجية المناعية النهائية ودراسات التهجين في الموقع. منهجيات الأنسجة الموصوفة في هذا البروتوكول قابلة للتطبيق على مجموعة متنوعة من خطوط السرطان والخلايا الأولية, وتتكيف في المقام الأول مع تقنيات الأنسجة الروتينية لإنتاج هذه الكريات17,18. عند معالجتها وتضمينها, يمكن استخدام الكريات بطريقة مماثلة للأنسجة. وهذا يشمل استخدامها مع بروتوكولات استرجاع المستضد الأنزيمي والمستحث بالحرارة لتجارب الكيمياء الهيستولوجية المناعية. أحد أهداف المنهجيات المستخدمة في هذا البروتوكول هو الحفاظ على مورفولوجيا ومستضدية الخلايا طوال العملية. لذلك ، يتم استخدام EDTA ، وهو لطيف نسبيا من حيث التغييرات في كل من التشكل والمستضد ، لفصل الخلايا. وهذا لا يعني أن النهج الأخرى، مثل التعطيل المادي، غير قابلة للتطبيق؛ بل إن النهج الأخرى غير قابلة للتطبيق. ومع ذلك ، فإن أي نهج لفصل الخلايا يجب أن يضمن عدم إصابة الخلايا في هذه العملية. الهدف الثاني من هذا البروتوكول هو إصلاح الخلايا ومعالجتها بطريقة مشابهة للأنسجة ، باستخدام نفس نسبة التثبيت ، والتثبيت ، وجدول المعالجة (التثبيت ، والجفاف ، والتطهير ، وتسلل البارافين) ، وتقنيات التضمين ، بحيث يمكن أن تكون بمثابة ضوابط قابلة للمقارنة للمقايسات النهائية. وبالتالي, يجب أن تحاكي أساليب التثبيت والمعالجة المستخدمة لتوليد كريات الخلايا الأساليب المستخدمة للأنسجة.
لم يتم تكييف البروتوكول الموصوف في هذا التقرير للتعامل مع الخلايا ذات العوامل المعدية ، مثل الخلايا المصابة بالبكتيريا المسببة للأمراض أو الفيروسات ، حيث يتم فصل الخلايا وجمعها وطردها المركزي قبل التثبيت. قد يفكر الباحثون في بروتوكولات لإصلاح الخلايا قبل الانفصال ، لكن هذا سيتطلب مزيدا من التحسين لجمع الخلايا دون الإخلال بمورفولوجيا الخلية. وعلاوة على ذلك، تتطلب أوقات التثبيت وظروف المناولة للخلايا ذات العوامل المعدية اعتبارات إضافية تستند إلى العامل المعدي وما يرتبط به من بروتوكولات السلامة البيولوجية المؤسسية.
تعتبر كريات الخلايا المثبتة بالفورمالين والمضمنة بالبارافين مفيدة بشكل فريد في وجود مستويات تعبير بروتين محددة جيدا10. في حين أن السرطان وخطوط الخلايا الداخلية تقدم مجموعة مختارة من الخلايا بمستويات متفاوتة من التعبير البروتيني ، فإن تقنيات الهندسة الوراثية تمكن العلماء من نمذجة تعبير البروتين ، من خلال الإفراط في التعبير عن البروتينات ذات الأهمية واستخدام تقنيات كريسبر لاستئصال أو إدخال الجينات المشفرة ذات الأهمية20,21 . عيب البروتينات المفرطة التعبير في خطوط الخلايا هو أنها مقاييس ضعيفة لحساسية الفحص لأنها قد لا تمثل مستويات البروتين الذاتية22. في المقابل ، يمكن لكل من خطوط الخلايا الداخلية وخطوط الخلايا السرطانية أن تمثل مستويات التعبير الداخلي بشكل أفضل ، ويمكن أن يكون الحذف بوساطة كريسبر للجين المشفر في خط مشابه بمثابة عنصر تحكم سلبي مقابل. علاوة على ذلك، تعد خطوط الخلايا الداخلية أو خطوط الخلايا السرطانية ذات المستويات المختلفة من التعبير البروتيني مثالية لتجارب المعايرة لاختيار التخفيفات النهائية للأجسام المضادة وفهم حساسية الفحص بشكل أفضل (الشكل 2). يجب أن يستند القرار المحيط بخطوط الخلايا التي يجب استخدامها إلى الاحتياجات التجريبية الفردية وغالبا ما يستخدم مجموعة من الأساليب.
بالإضافة إلى تقييم ما إذا كان الجسم المضاد يمكنه اكتشاف البروتين محل الاهتمام ، يمكن استخدام لوحة من خطوط الخلايا لتحديد خصوصية الجسم المضاد. على سبيل المثال ، يمكن استخدام مجموعة من خطوط الخلايا التي تعبر بشكل فردي عن عائلة من البروتينات وثيقة الصلة لاختبار ما إذا كان الجسم المضاد محددا لبروتين فردي أو ما إذا كان يكتشف أيضا بروتينات أخرى وثيقة الصلة. قد تتضمن الضوابط الأكثر تفصيلا استخدام خطوط الخلايا التي تعبر ، إما من خلال ضربة قاضية كريسبر أو من خلال الإفراط في التعبير ، عن البروتينات ذات الطفرات النقطية التي لا يمكن أن تخضع لأحداث إشارات محددة يتم اكتشافها (على سبيل المثال ، طفرة في مواقع فسفرة محددة عند تقييم جسم مضاد خاص بالفوسفو). في حين أن هذه الأساليب أكثر تعقيدا ، فقد تكون ضرورية للتأكد من أن الجسم المضاد يستخدم فقط الملصقات في ظل ظروف محددة10.
من المهم ملاحظة أن التلاعب الجيني لخطوط الخلايا قد لا يولد مجموعة خلايا متجانسة. على سبيل المثال ، لا تكون كفاءة النقل في الإفراط في التعبير عن خطوط الخلايا عادة 100٪ وقد لا تبالغ بعض الخلايا في التعبير عن البروتين محل الاهتمام. يمكن أن يكون تضمين FLAG أو علامة ذات صلة في النقل يمكن اكتشافها بالطرق القياسية مفيدا لتقييم كفاءة نقل خط الخلية23. يمكن أن يكون هذا مفيدا لتحديد ما إذا كان النقل ناجحا واستبعاد عدم الكشف بسبب تعبير البروتين ، وليكون بمثابة مرجع للنسبة المتوقعة من الخلايا التي يجب أن تعبر عن البروتين محل الاهتمام.
يمكن أن يكون التهجين في الموقع (ISH) أيضا أداة مفيدة لتوصيف التعبير الجيني المستهدف في كريات الخلايا وإبلاغ تطوير طريقة IHC10. عند فحص الأجسام المضادة ، قد يكون من المفيد معرفة متى يمكن اكتشاف النسخة ، وبالتالي البروتين المحتمل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يكون فحص ISH لحبيبات الخلايا مفيدا لتطوير طريقة ISH. في حين أن الخصوصية هي مشكلة أقل تكرارا لمقايسات ISH ، إلا أنه لا يزال من المهم وجود ضوابط مناسبة واعتبارات مماثلة لتطوير واستخدام الضوابط التي يمكن تطبيقها على دراسات ISH.
يتم إنشاء المصفوفات الدقيقة للأنسجة عن طريق إزالة النوى من كتل المانحين ونقل هذه النوى ، غالبا في نمط شبكي ، إلى كتلة البارافين المتلقي. في النهاية ، تحتوي الكتلة المستلمة على مجموعة من العينات في كتلة واحدة ، مما يسمح لجميع العينات الموجودة في الكتلة بالمرور بإجراءات IHC متطابقة والسماح بالمقارنة المباشرة لعينات متعددة على نفس الشريحة24,25. نظرا لأن كريات الخلايا عبارة عن مجموعات موحدة نسبيا ، فيمكن تمثيلها بدقة بواسطة نوى 1 مم ، مما يجعلها مرشحة مثالية لإدراجها في صفائف مماثلة. باستخدام مجموعة الحبيبات الخلوية, من الممكن تضمين كريات الخلايا بمستويات مختلفة من التعبير, كريات الخلايا التي تعبر بشكل فريد عن البروتينات ذات الصلة, وكريات الخلايا التي تعبر عن تقويم البروتين محل الاهتمام من الأنواع المختلفة في شريحة واحدة (الشكل 3). وهذا يسمح بتقييم جميع كريات الخلايا في وقت واحد في ظل ظروف موحدة بطريقة سريعة ، مع تقليل استخدام الكواشف25.
يوصى بحد أدنى لحجم حبيبات خلية البدء يبلغ 2 مل تم جمعها من ثماني قوارير T175 لهذا البروتوكول. يسمح هذا الحجم بإنتاج وأرشفة كتل الحبيبات متعددة الخلايا, بحيث يمكن توحيد عناصر التحكم في الحبيبات الخلوية على مدى فترات زمنية أطول ويمكن إنشاء صفائف حبيبات متعددة الخلايا من حبيبات معينة. يمكن استخدام أحجام حبيبات الخلايا المنخفضة عند التعامل مع خطوط الخلايا الأولية المشتقة من المريض ، أو خطوط الخلايا بطيئة النمو ، أو عندما تحد الظروف من حجم العينة. بالطبع ، ستؤدي أحجام البدء المنخفضة إلى تحفيز التأثير السلبي من أي فقدان للخلايا أثناء تثبيت وإعداد الحبيبات وستحد من المواد المتاحة لعمليات المصب. من المهم بشكل خاص توخي الحذر عند إزالة المثبت بعد الطرد المركزي ، لتقليل أي خسارة مرتبطة به. بالنسبة لأحجام العينات الأقل ، يمكن استخدام أنبوب طرد مركزي مغطى سعة 1.5 مل لتكوير الخلايا. يمكن تقسيم هذه الأنابيب طوليا بشفرة للمعالجة.
على غرار تثبيت الأنسجة ، يعد تثبيت الخلايا داخل هذه الحبيبات أمرا بالغ الأهمية لتقييمات IHC النهائية. من أجل تحقيق التثبيت الكامل ، نستخدم ما لا يقل عن 10: 1 من الفورمالين إلى نسبة حبيبات الخلية ونعكس الأنبوب المخروطي للحفاظ على الخلايا معلقة. إذا لم تكن الخلايا معلقة في وقت التثبيت ، فهناك خطر التثبيت غير الكامل أو غير الكافي ، مما سيؤثر على وضع العلامات المناعية في اتجاه مجرى النهر. غالبا ما يتجلى هذا على شكل علامات قوية في المحيط وفقدان الملصقات في وسط الحبيبات أو وضع العلامات ذات الكثافة المتغيرة في جميع أنحاء الحبيبات.
يستخدم هذا البروتوكول Histogel ، الذي يتكون بشكل أساسي من هيدروكسي إيثيل أغاروز ، لربط حبيبات الخلية ولتمكين الخلايا من التوزيع بالتساوي في جميع أنحاء حبيبات الخلية. بدونها ، تصبح الخلايا مضغوطة وتفقد تفاصيلها الخلوية. غالبا ما تكون هذه التفاصيل الخلوية مهمة أثناء فحص الأجسام المضادة ، لأنها توفر معلومات إضافية بشأن ما إذا كان الجسم المضاد يوضع علامات في المقصورة تحت الخلوية المناسبة (على سبيل المثال ، النواة أو السيتوبلازم أو غشاء البلازما). في المقابل ، يمكن أن يؤدي الكثير من الجل إلى انخفاض كثافة الخلايا داخل الحبيبات ، مما يؤدي إلى توزيع الخلايا على نطاق واسع ، وتقليل أعداد الخلايا لكل قسم.
يمكن استخدام هذا البروتوكول بشكل روتيني لتطوير ضوابط IHC. المواد اللازمة لإنشاء هذه الكريات شائعة في مختبرات البيولوجيا والأنسجة الاستقصائية ، والطرق واضحة وسهلة التكيف. في حين أن كريات الخلايا لها قيود مثل ضوابط IHC ، إلا أنها تعمل كأدوات رائعة للفحص الأولي للأجسام المضادة وتكمل عناصر التحكم الأخرى في الأنسجة.
Disclosures
جميع المؤلفين هم موظفون في Genentech / Roche ، وعلى هذا النحو ، هم مساهمون في Roche.
Acknowledgments
نود أن نعرب عن تقديرنا لتعاون زملائنا في منظمة أبحاث Genentech ، وخاصة مختبرات علم الأمراض الأساسية (P-core) الذين ساهموا في تطوير هذه الأساليب على مر السنين.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).
- Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma. American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).
- Cobleigh, M. A., et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).
- Vogel, C. L., et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).
- Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).
- Havnar, C., et al. Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson's trichrome. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).
- Newton, K., et al. RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development. Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).
- Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling. Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).
- Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach. Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).
- Ramos-Vara, J. A., et al. American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).
- Dominguez, S., et al. Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).
- Lean, F. Z. X., et al. Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization. Transboundary and Emerging Disease. , 14232 (2021).
- Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies. Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).
- Atcc.org. , Available from: http://www.atcc.org (2022).
- Thermo Fisher Scientific. Cell Culture Basics Handbook. , Gibco. (2020).
- Carson, F. Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed. , ASCP Press. Chicago, IL. (1997).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Tissue Processing. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed. Spencer, L. T., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone-Elsevier. China. (2013).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. Cancer Gene Profiling. , Humana Press. New York. 53-65 (2016).
- Jinek, M., et al. Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).
- Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology. Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).
