Summary
Burada immünohistokimya için formalin-sabit, parafin-gömülü hücre pelet kontrolleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Hedef proteinlerin bilinen ekspresyonuna sahip pozitif ve negatif kontroller, immünohistokimya (IHC) tahlillerinin geliştirilmesi için gereklidir. Doku kontrolleri, tanımlanmış doku ve hücresel ekspresyon paternlerine sahip iyi karakterize edilmiş proteinler için faydalı olsa da, yeni, kötü karakterize edilmiş veya her yerde eksprese edilen proteinler için IHC tahlillerinin ilk gelişimi için daha az uygundur. Alternatif olarak, standartlaştırılmış doğaları nedeniyle, tanımlanmış protein veya transkript ekspresyon seviyelerine sahip kanser hücresi hatları (örneğin, yüksek, orta ve düşük ekspresyon), transfekte edilmiş aşırı eksprese edici hücre hatları veya CRISPR gibi hücre mühendisliği teknolojileri aracılığıyla silinen genlere sahip hücre hatları dahil olmak üzere hücre peletleri, özellikle ilk antikor karakterizasyonu ve seçimi için değerli kontroller olarak hizmet edebilir. Bu hücre peletlerinin formalin sabit, parafin gömülü dokular için IHC tahlillerinin geliştirilmesinde kullanılabilmesi için, doku işleme için kullanılan prosedürleri özetleyecek şekilde işlenmesi ve gömülmesi gerekir. Bu protokol, IHC yöntemi geliştirmeleri için kullanılabilecek formalin sabit, parafin gömülü hücre pelet kontrollerinin oluşturulması ve işlenmesi için bir süreci açıklar.
Introduction
İmmünohistokimya (IHC), araştırmacı ve tanısal patolojide en sık kullanılan testlerden biridir. Bağlama ve tahlil bağlı olarak, IHC kanser tanısında yardımcı olmakiçin kullanılır 1,2, tedavi yanıtı 3,4'ü tahmin etmek, patojenleri tanımlamak5, hastalıklı dokulardaki hücre tiplerini karakterize etmek6 ve biyolojik yolları ve doku yanıtlarını incelemek 7,8. Her durumda, bir IHC testinin temel prensibi, bir antikorun özellikle ilgilenilen bir hedefe, en yaygın olarak bir proteine bağlanmasıdır ve bu bağlanma olayı daha sonra bir doku bölüm9'da görselleştirilir. Bununla birlikte, herhangi bir IHC testinin en büyük zorluklarından biri, antikorların özellikle ilgilenilen hedefi tespit etmesinisağlamaktır 10. Antikor özgüllüğü çoğu immünotahlilde bir zorluktur, ancak immünohistokimya, spesifik ve spesifik olmayan etiketlemeyi ayırt etmek için moleküler ağırlık gibi ikincil önlemlerin bulunmaması nedeniyle benzersiz zorluklar sunar. Bu, iyi tanımlanmış hücresel lokalizasyon paternlerinden yoksun, kötü karakterize edilmiş veya her yerde ifade edilen hedefleri değerlendirirken özellikle zahmetlidir. Bu nedenle, yeni bir IHC testi 10 geliştirilirken bağlayıcı özgüllüğün karakterize edilmesine yardımcı olabilecek sağlam kontroller kritiköneme sahiptir.
Karakteristik hücresel ekspresyon paternleri ile iyi tanımlanmış hedefler için, doku kontrolleri IHC yöntemi geliştirmelerinde sıklıkla kullanılmaktadır. Önceki verilerin zenginliğine dayanarak, antikorun eksprese edildiği bilinen dokuyu, hücreyi ve hücre altı bölmeyi etiketleyip etiketlemediği ve bulunmaması gereken doku bileşenlerini etiketlemediği belirlenebilir11. Bununla birlikte, doku kontrolleri, bilinen ekspresyon kalıpları olmayan kötü karakterize edilmiş, yeni hedefler veya yaygın olarak eksprese edilen ve farklı ekspresyon kalıplarından yoksun proteinler için sınırlı bir kullanıma sahiptir. Bu senaryoların her ikisinde de, iyi tanımlanmış bir ifade kalıbının olmaması, dokulardaki spesifik olmayan etiketlemeden spesifik olanı ayırt etmeyi imkansız kılar. Bu durumlarda, hücre peletleri değerli bir alternatif IHC kontrolü sunar. Hücre pelet kontrolleri şunları içerebilir: ilgilenilen proteinin endojen veya intrinsik / indüklenmemiş ekspresyon seviyelerine sahip olan ve protein ekspresyonu batı lekelenmesi, akış sitometrik analizleri ile karakterize edilebilen veya transkripsiyonel profillemeden ekstrapolasyon yapılabilen kanser veya diğer hücre hatları; ilgilenilen proteini aşırı eksprese eden veya ilgilenilen kodlama genini sildiren tasarlanmış hücre hatları; veya protein ekspresyonunu veya ilgili sinyal olaylarını (örneğin, fosforilasyon) indüklemek için belirli koşullar altında tedavi edilmiş hücreler 10,12. Hücre hatlarındaki iyi karakterize edilmiş protein ekspresyon seviyeleri, yüksek, orta, düşük ve eksik protein ekspresyonuna sahip bir hücre hatları paneli kullanarak bir tahlilin duyarlılığının değerlendirilmesine de izin verir. Ek olarak, mühendislik hücre peletleri, sınırlı karakterizasyonun veya mevcut doku kontrollerinin olabileceği veteriner türleri için değerli türlere özgü kontroller olabilir13. Hücre peletlerinin, dokulardaki çeşitli proteomları yansıtmayacak hücre hatlarında bulunan sınırlı proteom gibi sınırlamaları olsa da, antikorun ilgilenilen hedefi tespit edebileceğini doğrulamak ve birincil antikor, ikincil antikor veya tahlil10'daki diğer regentler tarafından ayrım gözetmeksizin bağlanmayı dışlamak için uygun kontroller olarak hizmet ederler.
Tanısal ve araştırmacı patolojideki dokuların çoğu, nötr tamponlu formalinde sabitlenir, bir dizi alkolde dehidre edilir, ksilen içinde temizlenir ve parafin mumunda işlenir ve gömülür. Formalin fiksasyonu proteinleri çapraz bağlar ve fiksasyon ve doku işlemedeki her ek adım, proteinleri ve antikorların bunları tespit etme yeteneğini doğrudan etkileyebilir 9,14. Bu nedenle, bir IHC testinde kullanılan herhangi bir kontrolün aynı fiksasyon, doku işleme ve gömme prosedürlerinden geçmesi önemlidir. Bu makalede, formalin sabit parafin gömülü dokularda IHC tahlillerinin geliştirilmesi için kontrol görevi görecek şekilde kültürlenmiş hücrelerin işlenmesi ve gömülmesi için benzersiz hususlar anlatılmaktadır ve metodoloji öncelikle bir histoloji laboratuvarında hücre peletinin işlenmesi ve işlenmesine odaklanmaktadır.
Protocol
1. Hücre pelet hazırlama
- Dört ila sekiz adet 150mm2 veya sekiz x T175 şişede, hücre hattı için önerilen ortam ve koşullardaki hücreleri %80-%90 oranında birleştirin. Örneğin, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı'nda (DMEM)% 10 fetal sığır serumu ve 2 mM L-glutamin15 ile 293T hücreleri büyütün.
NOT: Hücreler, ilgilenilen hücre hattı için gerekli koşullar ve ortam kullanılarak büyütülmelidir16. Bu koşullar hücre hattına bağlı olarak değişebilir, ancak aşağı akış peletleme yöntemleri, kültür koşullarından bağımsız olarak hücre hatları için uyarlanabilir olmalıdır. - Hücreler birleşmeye yakın olduğunda (% 80 -% 90), büyüme ortamını bir vakum pipeti ile aspire edin ve hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde durulayın.
- Her şişeye 5 mL 5-10 mM EDTA ekleyin ve şişeleri 5-10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hücreleri yerinden çıkarmak için şişenin yan tarafına hafifçe dokunun.
NOT: Tripsin kullanmayın, çünkü bu, bazı antijenleri olumsuz yönde etkileyecek yüzey epitoplarını parçalayabilir.- Hücreler yerinden çıktıktan sonra, her şişeye hücre hattı için kullanılan 5 mL büyüme ortamını (örneğin, 293T hücreleri için DMEM) ekleyin, ardından hücreleri 50 mL konik tüplere aktarın.
- Konik tüpleri oda sıcaklığında 930 x g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, ortamı ve EDTA'yı vakum pipet aspirasyonu ile çıkarın.
- Hücre peletlerini 10-20 mL 1x PBS içinde yıkayın ve birden fazla plaka veya şişe kullanılıyorsa, plakalardan veya şişelerden ( Şekil 1'de gösterilen deneyde yaklaşık altı T175 şişe) hücreleri tek bir 50 mL konik tüpte toplayın.
- Tüpü 5 dakika boyunca 930 x g'de santrifüj yapın. Vakum pipeti ile santrifüjlemeden sonra PBS'yi aspire edin.
- Hücre pelet tüpünü fiksasyona kadar ıslak buz üzerinde tutun.
NOT: Degradatif enzim aktivitesini sınırlamak ve protein lokalizasyonundaki değişiklikler de dahil olmak üzere hücrelerin otolizini ve ilişkili protein değişikliklerini en aza indirmek için hücreler soğutulmuş halde tutulur.
2. Hücre peletinin sabitlenmesi
- 10:1 (vol:vol) fiksatif hücre oranı oluşturmak için 3 mL hücre peletine 30 mL% 10 nötr tamponlu formalin ekleyerek fiksasyon gerçekleştirin.
- Sıkıca kapatılmış 50 mL tüpü, hücreler tamamen süspansiyona girene kadar tekrar tekrar ters çevirin.
NOT: Tam fiksasyondan önce yoğunlaştırılmış bir hücre peletinin oluşumu, düzensiz fiksasyona neden olabilir, bu da daha sonraki boyama ve immünoetiketleme prosedürleri sırasında artefaktlara neden olabilir. - Hücre süspansiyonunun gece boyunca oda sıcaklığında yerleşmesine izin verin.
- Hücreleri yeniden askıya almak için ertesi gün tüpü tekrar ters çevirin, fiksasyonu iyileştirmek için yüzey-hacim oranını artırın.
NOT: Hücre peletinin vorteklenmesi, hücre hasarına neden olabileceğinden gerekli değildir veya önerilmez.
3. Hücre peletinin kesilmesi ve işlenmesi
- 24 saatlik fiksasyondan sonra, 50 mL konik tüpü 10-15 dakika boyunca 5 ° C'de 930 x g'de santrifüj edin. Tüplerin sıkıca kapatıldığından, eşit olarak dağıtıldığından ve santrifüjde dengelendiğinden emin olun.
NOT: Fiksasyon süreleri, laboratuvar tarafından kullanılan doku fiksasyon sürelerini veya belirli deney koşullarının gerekliliklerini yansıtacak şekilde değiştirilebilir. - Santrifüjlemeden sonra, hücrelerin görünür bir pelet oluşturduğundan emin olun. Fiksatif, steril transfer pipeti ile dekantasyon ve/veya dikkatlice aspire ederek çıkarın.
- Erimiş (40-60 °C) hidroksietil agaroz bazlı jeli (bakınız Malzeme Tablosu) hücre peletine 1:4 (vol:vol) jel-hücre pelet oranında ekleyin.
- Musluk suyuyla durulanmış bir göze sahip temiz bir 5 inç, 2 mm uçlu Sterling probu kullanarak, erimiş jeli sabit hücre peletine hafifçe karıştırın ve 50 mL konik tüpün dibinde erimiş jelde sabit hücrelerin eşit bir süspansiyonunu oluşturun (Şekil 1A).
- Kapaklı 50 mL konik tüpü, jelleşmiş hücre peletini katılaştırmak için ıslak buz üzerine 5-10 dakika boyunca sabit hücreli pelet ile karıştırılmış erimiş jel ile yerleştirin.
- Temiz bir mikro-spatula kullanarak, tüpün yan tarafına bir spatula yerleştirerek ve peleti delmeden hafifçe kaldırarak peleti konik tüpten dikkatlice çıkarın. Peleti biyopsi kağıdına yerleştirin.
- Temiz bir mikro-spatula kullanarak, hücre peletini 4-5 mm kalınlığında dilimler halinde kesin, böylece her dilim 26 mm x 26 mm x 5 mm doku kasetine sığabilir (Şekil 1B).
- Tek tek jel pelet dilimlerini bir parça biyopsi kağıdının ortasına yerleştirin. Biyopsi kağıdının iki karşıt ucunu pelet üzerine katlayın ve sarın. Sarılmış peleti 26 mm x 26 mm x 5 mm doku kasetine yerleştirin. Kapağı kapatın, biyopsi sargısının açılmış taraflarını doku kaseti kapağı ile sıkın (Şekil 1C).
- Kesilmiş hücre pelet kaseti,% 10 nötr tamponlu formalin ile doldurulmuş doku işlemcisi imbiğine yerleştirin ve kısa bir işleme programında çalıştırın.
NOT: Kısa işleme programı, her bir imbikte% 10 nötr tamponlu formalinden başlayan, giderek artan derecelendirilmiş alkollerden dehidre edilen, üç ksilen değişiminde temizlenen ve 60 ° C erimiş infiltrasyon / gömme parafin (56 ° C erime noktası) iki değişikliğinde parafin infiltrasyonu ile sona eren 30 dakikadan oluşur.
4. Hücre peletinin gömülmesi
- İşlenen kasetleri gömme merkezinin tutma alanına yerleştirin.
- Doku kaseti kapağını açın ve biyopsi kağıdını dikkatlice açın.
- Hücre peletini 15 mm x 15 mm boyutlarında, kesilmiş tarafı aşağı doğru küçük bir tek kullanımlık gömme kalıbına yerleştirin.
NOT: Küçük bir gömme kalıbı, IHC testleri için lekesiz bir doku slaytına üç adede kadar hücre pelet bölümünün sığmasını sağlar. - Hücre peletini forseps ile kalıbın dibinde nazikçe tutarken, hücre peletini kaplayan 62 °C doku infiltrasyonu / parafini kalıba gömün.
- Parafini katılaştırmaya başlamak için kalıbı soğuk bir bloğa taşıyın. Parafin katılaşırken hücre peletlerini, kalıbın dibinde uygun konumlarına sabitlemek için ayarlayın.
- Kapağı kasetten çıkarın. Kaseti alt tarafı aşağıya, gömme kalıbının üstüne yerleştirin ve kaseti örtmek için ilave erimiş parafin ekleyin.
- Parafin doku kaseti üzerine doldurulduğunda,17,18'i katılaştırmak için kalıbı soğuk bloğa geri koyun.
5. Hücre peletinin bölümlenmesi
- Parafin bloğunun tam yüzü ve hücre peleti parafin kesit şeridinde yakalanana kadar hücre pelet bloğunu kesmek için 20 μm'lik bir kesit kalınlığında bir döner mikrotom seti kullanın. Buna bloğa "bakmak" denir.
- Kesitlemeden önce bloğu soğutmak ve nemlendirmek için yüz pelet bloklarını bir buz banyosu tepsisinde 5-15 dakika soğutun ve ıslatın.
NOT: Blok hidratlandığında, hücre peleti parafin şeridinde yarı saydam olacaktır. Opaksa, daha fazla ıslatma gerekir ve eserler mevcut olabilir. - Hücre pelet bloğunun parafin şeridini 4 μm kalınlığında veya istenen diğer kalınlıkta döner bir mikrotom kullanarak sürekli kesme modunda kesitleyin.
- Parafin şeritleri 42 ° C'ye ayarlanmış bir su yüzdürme banyosuna yerleştirin.
- Döner mikrotom kullanılarak hazırlanan parafin kesitlerini yüzdürme banyosundan pozitif yüklü slaytlara alın.
- İlk bölümü, kapağın kayması ve boyama sınırı içinde slaytın üst kısmına, ikincisini altına ve üçüncü hücre pelet bölümünü bunun altına yerleştirin (Şekil 1D).
- Kesitlemeden sonra, slaytları 24 saat boyunca oda sıcaklığında (yaklaşık 23 ° C), ardından 30 dakika boyunca 60 ° C'de kurutun.
NOT: Slaytlar 60 °C'de pişirildikten sonra, hücre pelet bölümleri, ısıya bağlı ve enzim bazlı antijen alımları kullanan protokoller de dahil olmak üzere herhangi bir standart IHC protokolü ile kullanılabilir9.
Representative Results
Agaroz bazlı jelin eklenmesini takiben, hücre peleti işlemeye uygun katı jelatinimsi bir kütle oluşturmalıdır (Şekil 1B). Gömüldükten sonra, pelet katı bir dokuya benzer bir kıvama sahip olacak ve bir mikrotom üzerinde rutin olarak kesilmesi nispeten kolay olmalıdır. Hücre peletleri gömüldükten sonra, histoloji ve IHC deneylerinde formalin sabit, parafin gömülü dokularla aynı şekilde kullanılabilirler. Bu, dolaylı kromojenik tespit yöntemleriyle (örneğin, yaban turpu peroksidaz ve Şekil 3'te gösterildiği gibi diaminobenzidin tespiti ile ikincil bir antikor kullanarak) ticari IHC platformları9 kullanılarak ısıya bağlı epitop veya enzimatik antijen alımının kullanımını içerir. Histolojik olarak, hücreler minimal hücre kümelenmesi ile bölüm boyunca eşit olarak dağılmalıdır, ancak yapışkan hücreler peletteki hücre-hücre etkileşimlerini koruyabilir. Bu dağılım, bireysel hücreler arasında ayrım yapılmasına izin verir, ancak bu ayrım, jel pelet içindeki hücre boyutu ve bağıl yoğunluktan önemli ölçüde etkilenecektir. Çekirdek, sitoplazma ve hücre zarı daha belirgindir ve dispersiyon üzerine görselleştirilmesi daha kolaydır (Şekil 2). Şekil 2'de, üç hücre hattı TEAD transkripsiyon faktörü için immüno-etiketlenmiştir. İmmünoetiketleme kahverengi diaminobenzidin (DAB) kromojen ile görselleştirilir. Hücre çizgileri, TEAD transkripsiyon faktörünün, ifade olmamasından (Şekil 2A) zayıf ifadeye (Şekil 2B), güçlü ifadeye (Şekil 2C) kadar değişen ifade seviyelerine sahiptir. Bu örnekte, bir transkripsiyon faktöründen beklendiği gibi çekirdekte etiketleme gözlenir ve görünür olan ancak etiketlemeden yoksun olan sitoplazma ve hücre zarında yoktur (Şekil 2). Hücre peletleri, standart 23 mm x 75 mm x 1 mm slaytlarda hücre pelet mikrodizilerine (Şekil 3) dahil edilebilir. Hücre peletlerinin bir mikrodiziye dahil edilmesi, aynı slaytta değişen ekspresyon seviyelerine sahip kontrollerin değerlendirilmesine olanak tanır. Bu örnekte, PEG10 eksikliği olan fare embriyonik kök hücreleri (solda) negatif kontrol görevi görür ve PEG10'u aşırı eksprese eden 293T hücreleri (sağda, kahverengi immünoetiketleme) mikrodizide pozitif bir kontrol görevi görür (Şekil 3). Mikrodizilere dahil edilecek hücre peletleri için doku ve gömme prosedürlerinde herhangi bir değişiklik yoktur ve dokular için kullanılanlara benzer yöntemler kullanılarak mikrodiziler üretilebilir19.
Şekil 1: Hücre pelet işleme . (A) Hücreler 50 mL konik tüplerde peletlenir ve jel ile karıştırılır. (B) Katılaştıktan sonra, peletler 26 mm x 26 mm x 5 mm doku kasetine sığacak şekilde seri olarak dilimlenir. (C) Hücre peletleri, doku işlemcisine yerleştirilmeden önce biyopsi kağıdına sarılır. (D) Tek bir 25 mm x 75 mm cam histoloji slaytında seri olarak üç hücreli peletler toplanabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Tahlilin dinamik aralığını değerlendirmek için farklı seviyelerde protein veya transkript ekspresyonuna sahip hücre peletleri kullanılabilir. Hücre peletleri TEAD transkripsiyon faktörü için immüno-etiketlenmiştir ve farklı seviyelerde TEAD ekspresyonu göstermektedir. (A) DAUDI hücreleri TEAD ekspresyonundan yoksundur ve sitoplazmada veya çekirdekte immünoetiketlemeye sahip değildir. Mavi boya, çekirdeğin hematoksilin karşı boyasıdır. (B) 293T hücreleri, TEAD transkripsiyon faktörünün zayıf nükleer etiketlemesini (kahverengi diaminobenzidin (DAB) kromojeni) gösterir. (C) Detroit 562 hücreleri, çekirdekteki yoğun kahverengi etiketlemenin gösterdiği gibi TEAD'yi güçlü bir şekilde eksprese eder. Çekirdek içinde etiketleme, ancak sitoplazma (kahverengi çekirdeğin etrafındaki kirli beyazdan griye bölge) değil, immünohistokimya testinin uygun şekilde etiketlendiğini gösterir. Her üç hücre hattında, hücrelerin dağıldığını ve nükleer ve sitoplazmik morfolojileri de dahil olmak üzere tek tek hücrelerin görselleştirilmesine izin verdiğini unutmayın. Ölçek çubuğu = 25 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farklı protein ekspresyon seviyelerine sahip çoklu hücre peletleri kullanılarak oluşturulan hücre pelet mikrodizisi, kontrollerin tek bir slaytta eşzamanlı olarak değerlendirilmesine olanak sağlar. PEG10 eksikliği olan fare embriyonik kök hücreleri (solda) ve PEG10'u aşırı eksprese eden 293T hücreleri (sağda) PEG10 için immüno-etiketlenmiştir. PEG10'u aşırı eksprese eden 293T hücrelerinde güçlü etiketleme (kahverengi DAB kromojeni) gözlenirken, PEG10 eksik hücrelerinde hiçbir etiketleme belirgin değildir. Mavi hematoksilin karşı stainini temsil eder. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu protokol, aşağı akış immünohistokimyası ve in situ hibridizasyon çalışmaları için kontrol olarak kullanılabilecek formalin sabit, parafin gömülü hücre peletleri üretmek için bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu protokolde açıklanan histoloji metodolojileri, çeşitli kanser ve birincil hücre hatlarına uygulanabilir ve öncelikle bu peletleri üretmek için rutin histoloji tekniklerini uyarlar17,18. İşlendiğinde ve gömüldüğünde, peletler dokulara benzer şekilde kullanılabilir. Bu, immünohistokimya deneyleri için ısıya bağlı ve enzimatik antijen geri kazanım protokolleri ile birlikte kullanılmasını içerir. Bu protokolde kullanılan metodolojilerin bir amacı, süreç boyunca hücrelerin morfolojisini ve antijenitesini korumaktır. Bu nedenle, hem morfolojideki hem de antijenitedeki değişiklikler açısından nispeten yumuşak olan EDTA, hücrelerin ayrılması için kullanılır. Bu, fiziksel bozulma gibi diğer yaklaşımların uygulanabilir olmadığı anlamına gelmez; Bununla birlikte, hücreleri ayırmaya yönelik herhangi bir yaklaşım, hücrelerin süreçte zarar görmemesini sağlamalıdır. Bu protokolün ikinci amacı, hücreleri dokulara benzer bir şekilde, aynı fiksatif, fiksatif oranı, işleme programını (fiksasyon, dehidrasyon, temizleme ve parafin infiltrasyonu) ve gömme tekniklerini kullanarak sabitlemek ve işlemektir, böylece aşağı akış tahlilleri için karşılaştırılabilir kontroller olarak hizmet edebilirler. Bu nedenle, hücre peletleri üretmek için kullanılan fiksasyon ve işleme yaklaşımları, dokular için kullanılan yaklaşımları taklit etmelidir.
Bu raporda açıklanan protokol, patojenik bakteri veya virüslerle enfekte olmuş hücreler gibi bulaşıcı ajanlara sahip hücreleri işlemek için uyarlanmamıştır, çünkü hücreler fiksasyondan önce ayrılır, toplanır ve santrifüj edilir. Araştırmacılar, ayrılmadan önce hücreleri sabitlemek için protokolleri düşünebilirler, ancak bu, hücre morfolojisini bozmadan hücreleri toplamak için daha fazla optimizasyon gerektirecektir. Ayrıca, enfeksiyöz ajanlı hücreler için fiksasyon süreleri ve taşıma koşulları, enfeksiyöz ajana ve ilgili kurumsal biyogüvenlik protokollerine dayanan ek hususlar gerektirir.
Formalin-sabit, parafin-gömülü hücre peletleri, iyi tanımlanmış protein ekspresyon seviyelerine sahip olma konusunda benzersiz bir avantaja sahiptir10. Kanser ve endojen hücre hatları, farklı seviyelerde protein ekspresyonuna sahip hücrelerin bir seçimini sunarken, genetik mühendisliği teknolojileri, bilim adamlarının, ilgilenilen proteinleri aşırı ifade ederek ve ilgi çekici kodlama genlerini çıkarmak veya eklemek için CRISPR teknolojilerinin kullanılması yoluyla protein ekspresyonunu modellemelerini sağlar20,21 . Hücre hatlarında aşırı eksprese edilen proteinlerin dezavantajı, endojen protein seviyelerini temsil etmeyebilecekleri için bir tahlilin duyarlılığı için zayıf ölçümler olmalarıdır22. Buna karşılık, hem endojen hücre hatları hem de kanser hücre hatları endojen ekspresyon seviyelerini daha iyi temsil edebilir ve bir konyak hattındaki kodlama geninin CRISPR aracılı silinmesi, karşılık gelen bir negatif kontrol görevi görebilir. Ayrıca, endojen hücre hatları veya farklı seviyelerde protein ekspresyonuna sahip kanser hücre hatları, nihai antikor seyreltmelerini seçmek ve bir tahlilin duyarlılığını en iyi şekilde anlamak için titrasyon deneyleri için idealdir (Şekil 2). Hangi hücre hatlarının kullanılacağını çevreleyen karar, bireysel deneysel ihtiyaçlara dayanmalıdır ve genellikle yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanacaktır.
Bir antikorun ilgilenilen proteini tespit edip edemeyeceğini değerlendirmenin yanı sıra, bir antikorun özgüllüğünü tanımlamak için bir hücre hatları paneli kullanılabilir. Örneğin, yakından ilişkili proteinlerden oluşan bir aileyi ayrı ayrı ifade eden bir hücre hatları paneli, bir antikorun bireysel bir protein için spesifik olup olmadığını veya yakından ilişkili diğer proteinleri de tespit edip etmediğini test etmek için kullanılabilir. Daha ayrıntılı kontroller, CRISPR knock-in veya aşırı ekspresyon yoluyla, tespit edilmekte olan spesifik sinyal olaylarına (örneğin, fosfo-spesifik bir antikoru değerlendirirken spesifik fosforilasyon bölgelerindeki mutasyon) maruz kalamayan nokta mutasyonlarına sahip proteinleri eksprese eden hücre hatlarının kullanılmasını içerebilir. Bunlar daha karmaşık yaklaşımlar olsa da, antikorun belirli koşullar altında sadece etiket kullandığını doğrulamak için gerekli olabilirler10.
Hücre hatlarının genetik manipülasyonlarının homojen bir hücre popülasyonu oluşturmayabileceğine dikkat etmek önemlidir. Örneğin, hücre çizgilerini aşırı eksprese etmede transfeksiyon etkinliği tipik olarak% 100 değildir ve bazı hücreler ilgilenilen proteini aşırı eksprese etmeyebilir. Transfeksiyona standart yöntemlerle tespit edilebilen FLAG veya ilgili bir etiketin dahil edilmesi, hücre satırı23'ün transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için yararlı olabilir. Bu, hem transfeksiyonun başarılı olup olmadığını belirlemek hem de protein ekspresyonu nedeniyle tespit eksikliğini dışlamak ve ilgilenilen proteini ifade etmesi gereken hücrelerin beklenen oranı için bir referans görevi görmek için yararlı olabilir.
In situ hibridizasyon (ISH), hücre peletlerindeki hedef gen ekspresyonunu karakterize etmek ve IHC yöntem gelişimini bilgilendirmek için yararlı bir araç olabilir10. Antikorları tararken, transkriptin ve dolayısıyla potansiyel proteinin ne zaman tespit edilebileceğini bilmek bilgilendirici olabilir. Ek olarak, hücre peleti ISH taraması ISH yönteminin geliştirilmesi için faydalı olabilir. Özgüllük, ISH tahlilleri için daha az sıklıkla bir sorun olsa da, ISH çalışmalarına uygulanabilecek kontrollerin geliştirilmesi ve kullanılması için uygun kontrollere ve benzer hususlara sahip olmak hala önemlidir.
Doku mikrodizileri, çekirdeklerin donör bloklardan çıkarılması ve bu çekirdeklerin, genellikle ızgara düzeninde, bir alıcı parafin bloğuna aktarılmasıyla oluşturulur. Sonunda, alıcı blok tek bir blokta bir numune spektrumu içerir, bu da bloktaki tüm numunelerin aynı IHC prosedürlerinden geçmesine izin verir ve aynı slayt24,25'teki birden fazla numunenin doğrudan karşılaştırılmasına izin verir. Hücre peletleri nispeten homojen popülasyonlar olduğundan, 1 mm çekirdeklerle doğru bir şekilde temsil edilebilirler, bu da onları benzer dizilere dahil etmek için ideal adaylar haline getirir. Bir hücre pelet dizisi kullanarak, farklı ekspresyon seviyelerine sahip hücre peletlerini, ilgili proteinleri benzersiz bir şekilde ifade eden hücre peletlerini ve farklı türlerden ilgilenilen proteinin ortologlarını eksprese eden hücre peletlerini tek bir slaytta dahil etmek mümkündür (Şekil 3). Bu, tüm hücre peletlerinin aynı anda tek tip koşullar altında hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlarken, reaktiflerin kullanımını en aza indirir25.
Bu protokol için sekiz T175 şişesinden toplanan minimum 2 mL'lik bir başlangıç hücresi pelet hacmi önerilir. Bu hacim, çoklu hücre pelet bloklarının üretilmesine ve arşivlenmesine izin verir, böylece hücre pelet kontrolleri daha uzun süreler boyunca standartlaştırılabilir ve belirli bir peletten çoklu hücre pelet dizileri oluşturulabilir. Alt hücre pelet hacimleri, birincil hasta kaynaklı hücre hatları, yavaş büyüyen hücre hatları ile uğraşırken veya koşullar numunenin hacmini sınırladığında kullanılabilir. Tabii ki, daha düşük başlangıç hacimleri, peletin sabitlenmesi ve hazırlanması sırasında herhangi bir hücre kaybından kaynaklanan olumsuz etkiyi güçlendirecek ve aşağı akış prosesleri için mevcut malzemeyi sınırlayacaktır. Santrifüjlemeden sonra fiksatif çıkarılırken, ilişkili kayıpları en aza indirmek için özellikle dikkat etmek önemlidir. Daha düşük numune hacimleri için, hücreleri peletlemek için 1,5 mL, kapaklı bir santrifüj tüpü kullanılabilir. Bu tüpler, işleme için bir bıçakla uzunlamasına ikiye bölünebilir.
Doku fiksasyonuna benzer şekilde, bu pelet içindeki hücre fiksasyonu, aşağı akış IHC değerlendirmeleri için kritik öneme sahiptir. Tam fiksasyon elde etmek için, en az 10: 1 formalin - hücre pelet oranı kullanıyoruz ve hücreleri süspansiyonda tutmak için konik tüpü tersine çeviriyoruz. Fiksasyon sırasında hücreler süspansiyonda değilse, aşağı akış immünoetiketlemesini etkileyecek eksik veya yetersiz fiksasyon riski vardır. Genellikle bu, çevrede güçlü etiketleme ve pelet merkezinde etiketleme kaybı veya pelet boyunca değişken yoğunlukta etiketleme olarak kendini gösterir.
Bu protokol, hem hücre peletini bağlamak hem de hücrelerin hücre peleti boyunca eşit olarak dağılmasını sağlamak için öncelikle hidroksietil agarozdan oluşan Histogel'i kullanır. Onsuz, hücreler sıkışır ve sitomorfolojik ayrıntılarını kaybeder. Bu sitomorfolojik detaylar genellikle antikor taraması sırasında önemlidir, çünkü antikorun uygun hücre altı bölmede (örneğin, çekirdek, sitoplazma veya plazma zarı) etiketlenip etiketlenmediğine dair ek bilgi sağlarlar. Buna karşılık, çok fazla jel, pelet içinde daha düşük hücre yoğunluklarına neden olabilir, bu da hücrelerin yaygın olarak dağılmasına ve bölüm başına hücre sayısının azalmasına neden olabilir.
Bu protokol, IHC kontrollerini geliştirmek için rutin olarak kullanılabilir. Bu peletleri oluşturmak için gereken malzemeler araştırmacı biyoloji ve histoloji laboratuvarlarında yaygındır ve yöntemler basit ve uyarlanması kolaydır. Hücre peletleri IHC kontrolleri olarak sınırlamalara sahip olsa da, ilk antikor taraması için harika araçlar olarak hizmet ederler ve diğer doku kontrollerini tamamlarlar.
Disclosures
Tüm yazarlar Genentech/Roche çalışanıdır ve Roche'un hissedarlarıdır.
Acknowledgments
Genentech'in Araştırma organizasyonundaki meslektaşlarımızın ve özellikle de yıllar içinde bu yöntemlerin geliştirilmesine katkıda bulunan Patoloji çekirdek (P-core) laboratuvarlarının işbirliğine teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).
- Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma. American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).
- Cobleigh, M. A., et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).
- Vogel, C. L., et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).
- Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).
- Havnar, C., et al. Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson's trichrome. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).
- Newton, K., et al. RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development. Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).
- Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling. Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).
- Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach. Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).
- Ramos-Vara, J. A., et al. American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).
- Dominguez, S., et al. Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).
- Lean, F. Z. X., et al. Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization. Transboundary and Emerging Disease. , 14232 (2021).
- Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies. Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).
- Atcc.org. , Available from: http://www.atcc.org (2022).
- Thermo Fisher Scientific. Cell Culture Basics Handbook. , Gibco. (2020).
- Carson, F. Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed. , ASCP Press. Chicago, IL. (1997).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Tissue Processing. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed. Spencer, L. T., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone-Elsevier. China. (2013).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. Cancer Gene Profiling. , Humana Press. New York. 53-65 (2016).
- Jinek, M., et al. Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).
- Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology. Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).
