Summary
Hier wird ein Protokoll zur Erzeugung formalinfixierter, paraffineingebetteter Zellpelletkontrollen für die Immunhistochemie vorgestellt.
Abstract
Positive und negative Kontrollen mit bekannter Expression von Zielproteinen sind essentiell für die Entwicklung von immunhistochemischen (IHC) Assays. Während Gewebekontrollen für gut charakterisierte Proteine mit definierten Gewebe- und Zellexpressionsmustern von Vorteil sind, sind sie für die anfängliche Entwicklung von IHC-Assays für neuartige, schlecht charakterisierte oder ubiquitär exprimierte Proteine weniger geeignet. Alternativ können Zellpellets, einschließlich Krebszelllinien mit definierten Protein- oder Transkriptexpressionsniveaus (z. B. hohe, mittlere und niedrige Expression), transfizierte überexprimierende Zelllinien oder Zelllinien mit Genen, die durch Zelltechnologien wie CRISPR gelöscht wurden, aufgrund ihrer standardisierten Natur als wertvolle Kontrollen dienen, insbesondere für die anfängliche Antikörpercharakterisierung und -selektion. Damit diese Zellpellets bei der Entwicklung von IHC-Assays für formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebe verwendet werden können, müssen sie so verarbeitet und eingebettet werden, dass die für die Gewebeverarbeitung verwendeten Verfahren rekapituliert werden. Dieses Protokoll beschreibt einen Prozess zur Erstellung und Verarbeitung formalinfixierter, paraffineingebetteter Zellpelletkontrollen, die für die Entwicklung von IHC-Methoden verwendet werden können.
Introduction
Die Immunhistochemie (IHC) ist einer der am häufigsten verwendeten Assays in der Untersuchungs- und Diagnosepathologie. Je nach Kontext und Assay wird IHC verwendet, um bei der Krebsdiagnose1,2, der Vorhersage des Behandlungsansprechens3,4, der Identifizierung von Krankheitserregern5, der Charakterisierung von Zelltypen in erkrankten Geweben 6 und der Untersuchung biologischer Signalwege und Gewebereaktionen 7,8 zu unterstützen. In allen Situationen besteht das Grundprinzip eines IHC-Assays darin, dass ein Antikörper spezifisch an ein interessantes Ziel, am häufigsten ein Protein, bindet und dieses Bindungsereignis anschließend in einem Gewebeschnitt9 sichtbar gemacht wird. Eine der größten Herausforderungen eines jeden IHC-Assays besteht jedoch darin, sicherzustellen, dass die Antikörper spezifisch das Ziel von Interesseerkennen 10. Die Antikörperspezifität ist in den meisten Immunoassays eine Herausforderung, aber die Immunhistochemie bietet einzigartige Herausforderungen, da es keine sekundären Maße wie das Molekulargewicht gibt, um zwischen spezifischer und unspezifischer Markierung zu unterscheiden. Dies ist besonders problematisch bei der Bewertung schlecht charakterisierter oder ubiquitär exprimierter Ziele, denen klar definierte zelluläre Lokalisierungsmuster fehlen. Daher sind robuste Kontrollen, die zur Charakterisierung der Bindungsspezifität beitragen können, bei der Entwicklung eines neuen IHC-Assays10 von entscheidender Bedeutung.
Für Targets, die mit charakteristischen zellulären Expressionsmustern gut definiert sind, werden Gewebekontrollen häufig in der Entwicklung von IHC-Methoden eingesetzt. Basierend auf einer Fülle früherer Daten kann man feststellen, ob der Antikörper das Gewebe, die Zelle und das subzelluläre Kompartiment, in dem er bekanntermaßen exprimiert wird, markiert und dass er keine Gewebebestandteile markiert, wo er nicht vorhanden sein sollte11. Gewebekontrollen sind jedoch von begrenztem Nutzen für schlecht charakterisierte, neuartige Ziele ohne bekannte Expressionsmuster oder für Proteine, die weit verbreitet sind und keine eindeutigen Expressionsmuster aufweisen. In beiden Szenarien macht es das Fehlen eines klar definierten Expressionsmusters unmöglich, spezifische von unspezifischen Markierungen in Geweben zu unterscheiden. In diesen Situationen bieten Zellpellets eine wertvolle Alternative zur IHC-Kontrolle. Zellpelletkontrollen können umfassen: Krebs oder andere Zelllinien, die endogene oder intrinsische/nicht induzierte Expressionsniveaus des interessierenden Proteins aufweisen und deren Proteinexpression durch Western Blotting, durchflusszytometrische Analysen oder extrapoliert aus transkriptioneller Profilerstellung charakterisiert werden kann; manipulierte Zelllinien, die entweder das interessierende Protein überexprimieren oder das kodierende Gen von Interesse gelöscht haben; oder Zellen, die unter bestimmten Bedingungen behandelt wurden, um Proteinexpression oder Signalereignisse von Interesse zu induzieren (z. B. Phosphorylierung)10,12. Gut charakterisierte Proteinexpressionsniveaus in Zelllinien ermöglichen auch die Bewertung der Empfindlichkeit eines Assays unter Verwendung eines Panels von Zelllinien mit hoher, mittlerer, niedriger und fehlender Proteinexpression. Darüber hinaus können technisch hergestellte Zellpellets wertvolle speziesspezifische Kontrollen für Tierarten sein, für die es möglicherweise nur eine begrenzte Charakterisierung oder verfügbare Gewebekontrollen gibt13. Während Zellpellets ihre Grenzen haben, wie das begrenzte Proteom in Zelllinien, das das vielfältige Proteom in Geweben nicht widerspiegelt, dienen sie als geeignete Kontrollen, um zu bestätigen, dass der Antikörper das Ziel von Interesse erkennen kann, sowie eine wahllose Bindung durch den primären Antikörper, sekundären Antikörper oder andere Regenten im Assayauszuschließen 10.
Die meisten Gewebe in der diagnostischen und investigativen Pathologie werden in neutralem gepuffertem Formalin fixiert, in einer Reihe von Alkoholen dehydriert, in Xylol gereinigt und verarbeitet und in Paraffinwachs eingebettet. Die Formalinfixierung vernetzt Proteine, und die Fixierung und jeder weitere Schritt in der Gewebeverarbeitung kann Proteine und die Fähigkeit von Antikörpern, sie nachzuweisen, direkt beeinflussen 9,14. Daher ist es wichtig, dass alle Kontrollen, die in einem IHC-Assay verwendet werden, den gleichen Fixierungs-, Gewebeverarbeitungs- und Einbettungsverfahren unterzogen werden. Dieser Artikel beschreibt die einzigartigen Überlegungen zur Verarbeitung und Einbettung kultivierter Zellen, um als Kontrollen für die Entwicklung von IHC-Assays in formalinfixiertem Paraffingewebe zu dienen, wobei sich die Methodik hauptsächlich auf die Handhabung und Verarbeitung des Zellpellets in einem histologischen Labor konzentriert.
Protocol
1. Zellpellet-Zubereitung
- In vier bis acht 150 mm2 oder acht x T175 Kolben wachsen Zellen im Medium und den für die Zelllinie empfohlenen Bedingungen zu 80%-90% Konfluenz. Zum Beispiel wachsen 293T-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Adlermedium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 2 mM L-Glutamin15.
HINWEIS: Zellen sollten unter Verwendung der Bedingungen und des Mediums gezüchtet werden, die für die Zelllinie von Interesse16 erforderlich sind. Diese Bedingungen können je nach Zelllinie variieren, aber die nachgeschalteten Pelletierungsmethoden sollten unabhängig von den Kulturbedingungen für Zelllinien anpassbar sein. - Sobald sich die Zellen in der Nähe des Zusammenflusses befinden (80% -90%), saugen Sie die Wachstumsmedien mit einer Vakuumpipette ab und spülen Sie die Zellen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- In jeden Kolben werden 5 ml 5-10 mM EDTA gegeben und die Kolben bei 37 °C für 5-10 min inkubiert. Klopfen Sie vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um die Zellen zu entfernen.
HINWEIS: Verwenden Sie kein Trypsin, da dies Oberflächenepitope spalten kann, die einige Antigene beeinträchtigen würden.- Sobald die Zellen entfernt sind, fügen Sie 5 ml Wachstumsmedien, die für die Zelllinie verwendet werden (z. B. DMEM für 293T-Zellen), in jeden Kolben und überführen Sie die Zellen dann in 50 ml konische Röhrchen.
- Zentrifugieren Sie die konischen Röhrchen bei 930 x g bei Raumtemperatur für 5 min. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das Medium und EDTA durch Vakuumpipettenaspiration.
- Die Zellpellets werden in 10-20 ml 1x PBS gewaschen und, wenn mehrere Platten oder Kolben verwendet werden, die Zellen aus den Platten oder Kolben (ungefähr sechs T175-Kolben in dem in Abbildung 1 dargestellten Experiment) in ein einzelnes 50-ml-konisches Röhrchen gepoolt.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 930 x g für 5 min. Saugen Sie das PBS nach dem Zentrifugieren mit einer Vakuumpipette ab.
- Halten Sie das Zellpelletrohr bis zur Fixierung auf nassem Eis.
HINWEIS: Die Zellen werden gekühlt, um die abbauende Enzymaktivität zu begrenzen und die Autolyse der Zellen und die damit verbundenen Proteinveränderungen, einschließlich Änderungen der Proteinlokalisierung, zu minimieren.
2. Fixierung von Zellpellets
- Führen Sie eine Fixierung durch, indem Sie 30 ml 10% neutrales gepuffertes Formalin zu 3 ml Zellpellet hinzufügen, um ein Fixiermittel-Zell-Verhältnis von 10:1 (vol:vol) zu erzeugen.
- Drehen Sie das dicht verschlossene 50-ml-Röhrchen wiederholt um, bis die Zellen vollständig in Suspension sind.
HINWEIS: Die Bildung eines kondensierten Zellpellets vor der vollständigen Fixierung kann zu einer ungleichmäßigen Fixierung führen, was zu Artefakten bei späteren Färbe- und Immunmarkierungsverfahren führt. - Lassen Sie die Zellsuspension über Nacht bei Raumtemperatur absetzen.
- Kehren Sie die Röhre am nächsten Tag um, um die Zellen zu resuspendieren, und erhöhen Sie das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen, um die Fixierung zu verbessern.
HINWEIS: Das Vortexen des Zellpellets ist nicht erforderlich oder empfohlen, da dies zu Zellschäden führen kann.
3. Beschneiden und Verarbeiten von Zellpellets
- Nach 24 h Fixierung das 50 mL konische Röhrchen bei 930 x g bei 5 °C für 10-15 min zentrifugieren. Stellen Sie sicher, dass die Röhrchen fest verschlossen, gleichmäßig verteilt und in der Zentrifuge ausbalanciert sind.
HINWEIS: Die Fixierungszeiten können geändert werden, um die vom Labor verwendeten Gewebefixierungszeiten oder die Anforderungen bestimmter experimenteller Bedingungen widerzuspiegeln. - Stellen Sie nach dem Zentrifugieren sicher, dass die Zellen ein sichtbares Pellet bilden. Fixiermittel durch Dekantieren und/oder vorsichtiges Absaugen mit steriler Transferpipette entfernen.
- Fügen Sie geschmolzenes (40-60 °C) Gel auf Hydroxyethylagarosebasis (siehe Materialtabelle) in einem Verhältnis von 1:4 (vol:vol) Gel zu Zellpellet hinzu.
- Rühren Sie das geschmolzene Gel vorsichtig mit einer sauberen 5-Zoll-Sterling-Sonde mit 2-mm-Spitze und einem mit Leitungswasser gespülten Auge in das fixierte Zellpellet ein, wodurch eine gleichmäßige Suspension fester Zellen in geschmolzenem Gel am Boden des 50-ml-Konikegelöhrchens entsteht (Abbildung 1A).
- Legen Sie das verschlossene 50 ml konische Röhrchen mit dem geschmolzenen Gel, gemischt mit festzelligem Pellet, für 5-10 min auf nasses Eis, um das gelierte Zellpellet zu verfestigen.
- Entfernen Sie das Pellet vorsichtig mit einem sauberen Mikrospatel aus dem konischen Röhrchen, indem Sie einen Spatel an der Seite des Röhrchens platzieren und das Pellet vorsichtig hebeln, ohne es zu durchstechen. Legen Sie das Pellet auf Biopsiepapier.
- Schneiden Sie das Zellpellet mit einem sauberen Mikrospatel in 4-5 mm dicke Scheiben, so dass jede Scheibe in eine 26 mm x 26 mm x 5 mm große Gewebekassette passt (Abbildung 1B).
- Legen Sie einzelne Gelpelletscheiben in die Mitte eines Biopsiepapiers. Falten Sie die beiden gegenüberliegenden Enden des Biopsiepapiers über das Pellet und wickeln Sie es ein. Legen Sie das eingewickelte Pellet in eine 26 mm x 26 mm x 5 mm große Gewebekassette. Schließen Sie den Deckel, und kräuseln Sie die entfalteten Seiten der Biopsieverpackung mit dem Deckel der Gewebekassette (Abbildung 1C).
- Legen Sie die getrimmte Zellpelletkassette in die mit 10% neutralem gepuffertem Formalin gefüllte Gewebeprozessorretorte und laufen Sie nach einem kurzen Verarbeitungszeitplan.
HINWEIS: Der kurze Verarbeitungsplan besteht aus 30 Minuten in jeder Retorte, beginnend mit 10% neutralem gepuffertem Formalin, dehydriert durch eine Reihe von zunehmend gradierten Alkoholen, die in drei Xylolwechseln gereinigt werden, und endend mit Paraffininfiltration in zwei Änderungen von 60 °C geschmolzenem Infiltrations-/Einbettungsparaffin (56 °C Schmelzpunkt).
4. Einbettung von Zellpellets
- Legen Sie die verarbeiteten Kassetten in den Haltebereich des Einbettzentrums.
- Öffnen Sie den Deckel der Taschentuchkassette und falten Sie das Biopsiepapier vorsichtig auseinander.
- Legen Sie das Zellpellet in eine kleine 15 mm x 15 mm große Einweg-Einbettungsform, die mit der Seite nach unten geschnitten ist.
HINWEIS: Eine kleine Einbettungsform ermöglicht es, dass bis zu drei Zellpelletabschnitte auf einen ungefärbten Gewebeobjektträger für IHC-Assays passen. - Während Sie das Zellpellet vorsichtig mit einer Pinzette im Boden der Form halten, fügen Sie 62 °C Gewebeinfiltration / Einbettung von Paraffin in die Form hinzu und bedecken Sie das Zellpellet.
- Bewegen Sie die Form in einen kalten Block, um mit der Verfestigung des Paraffins zu beginnen. Stellen Sie die Zellpellets ein, während das Paraffin erstarrt, um sie an der entsprechenden Position am Boden der Form zu fixieren.
- Entfernen Sie den Deckel von der Kassette. Legen Sie die Kassette mit der Unterseite nach unten auf die Einbettungsform und fügen Sie zusätzliches geschmolzenes Paraffin hinzu, um die Kassette abzudecken.
- Wenn Paraffin über die Gewebekassette gefüllt ist, bringen Sie die Form in den kalten Block zurück, um17,18 zu erstarren.
5. Schneiden von Zellpellets
- Verwenden Sie ein rotierendes Mikrotom mit einer Schnittdicke von 20 μm, um den Zellpelletblock zu trimmen, bis die gesamte Oberfläche des Paraffinblocks und das Zellpellet im Paraffinabschnittsband erfasst sind. Dies wird als "Gegenüberstellung" des Blocks bezeichnet.
- Kühlen und tränken Sie die beschichteten Pelletblöcke für 5-15 min auf einer Eisbadschale, um den Block vor dem Schneiden zu kühlen und zu hydratisieren.
HINWEIS: Wenn der Block hydratisiert ist, ist das Zellpellet im Paraffinband durchscheinend. Wenn undurchsichtig, ist mehr Einweichen erforderlich, und Artefakte können vorhanden sein. - Schneiden Sie das Paraffinband des Zellpelletblocks mit einer Dicke von 4 μm oder einer anderen gewünschten Dicke im kontinuierlichen Schnittmodus mit einem rotierenden Mikrotom.
- Die Paraffinbänder auf ein auf 42 °C eingestelltes Wasserschwimmbad legen.
- Nehmen Sie die mit dem Rotationsmikrotom präparierten Paraffinabschnitte aus dem Floating-Bad auf positiv geladene Objektträger auf.
- Platzieren Sie den ersten Abschnitt oben auf dem Objektträger innerhalb der Deckglas- und Färbegrenze, platzieren Sie den zweiten darunter und den dritten Zellpelletabschnitt darunter (Abbildung 1D).
- Nach dem Schneiden trocknen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur (ca. 23 °C) für 24 h, gefolgt von 60 °C für 30 min.
HINWEIS: Nach dem Einbrennen der Objektträger bei 60 °C können die Zellpelletabschnitte mit jedem Standard-IHC-Protokoll verwendet werden, einschließlich Protokollen mit wärmeinduzierten und enzymbasierten Antigenextraktionen9.
Representative Results
Nach Zugabe des Gels auf Agarosebasis sollte das Zellpellet eine feste gallertartige Masse bilden, die handhabbar ist (Abbildung 1B). Einmal eingebettet, hat das Pellet eine ähnliche Konsistenz wie ein festes Gewebe und sollte relativ einfach routinemäßig auf einem Mikrotom zu schneiden sein. Sobald Zellpellets eingebettet sind, können sie in Histologie- und IHC-Experimenten in identischer Weise wie formalinfixierte, paraffineingebettete Gewebe verwendet werden. Dies beinhaltet die Verwendung von wärmeinduziertem Epitop oder enzymatischem Antigen-Retrieval mit indirekten chromogenen Nachweismethoden (z. B. unter Verwendung eines sekundären Antikörpers mit Meerrettichperoxidase und Diaminobenzidin-Nachweis wie in Abbildung 2 und Abbildung 3 gezeigt) unter Verwendung kommerzieller IHC-Plattformen9. Histologisch sollten die Zellen gleichmäßig über den gesamten Abschnitt mit minimaler Zellverklumpung verteilt sein, obwohl adhärente Zellen ihre Zell-Zell-Interaktionen im Pellet beibehalten können. Diese Dispersion ermöglicht die Unterscheidung zwischen einzelnen Zellen, obwohl diese Unterscheidung signifikant von der Zellgröße und der relativen Dichte innerhalb des Gelpellets beeinflusst wird. Der Zellkern, das Zytoplasma und die Zellmembran sind bei der Dispersion deutlicher und leichter sichtbar (Abbildung 2). In Abbildung 2 sind drei Zelllinien für den TEAD-Transkriptionsfaktor immunmarkiert. Die Immunmarkierung wird mit dem braunen Diaminobenzidin (DAB)-Chromogen visualisiert. Die Zelllinien weisen unterschiedliche Expressionsgrade des TEAD-Transkriptionsfaktors auf, die von keiner Expression (Abbildung 2A) über schwache Expression (Abbildung 2B) bis hin zu starker Expression (Abbildung 2C) reichen. In diesem Beispiel wird eine Markierung im Zellkern beobachtet, wie es von einem Transkriptionsfaktor zu erwarten wäre, und fehlt im Zytoplasma und in der Zellmembran, die sichtbar sind, aber keine Markierung haben (Abbildung 2). Zellpellets können in Zellpellet-Microarrays (Abbildung 3) auf Standardobjektträgern mit den Maßen 23 mm x 75 mm x 1 mm integriert werden. Die Integration der Zellpellets in ein Microarray ermöglicht die Auswertung von Kontrollen mit unterschiedlichen Expressionsgraden im selben Objektträger. In diesem Beispiel dienen PEG10-defiziente embryonale Stammzellen der Maus (links) als Negativkontrolle und 293T-Zellen, die PEG10 überexprimieren (rechts, braune Immunmarkierung), als Positivkontrolle im Microarray (Abbildung 3). Es gibt keine Variation in den Gewebe- und Einbettungsverfahren für Zellpellets, die in Microarrays enthalten sein werden, und Microarrays können mit Methoden erzeugt werden, die denen ähneln, die für Gewebe19 verwendet werden.
Abbildung 1: Zellpelletverarbeitung . (A) Die Zellen werden in 50 ml konischen Röhrchen pelletiert und mit dem Gel gemischt. (B) Nach der Verfestigung werden die Pellets seriell geschnitten, so dass sie in eine 26 mm x 26 mm x 5 mm große Gewebekassette passen. (C) Zellpellets werden in Biopsiepapier eingewickelt, bevor sie in den Gewebeprozessor gegeben werden. (D) Bis zu drei Zellpellets können seriell auf einem einzigen 25 mm x 75 mm großen Glashistologieobjektträger gesammelt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Zellpellets mit unterschiedlicher Protein- oder Transkriptexpression können verwendet werden, um den dynamischen Bereich des Assays zu bewerten. Zellpellets sind für den TEAD-Transkriptionsfaktor immunmarkiert und zeigen unterschiedliche TEAD-Expressionsgrade. (A) DAUDI-Zellen haben keine TEAD-Expression und keine Immunmarkierung im Zytoplasma oder Zellkern. Blauer Färbstoff ist Hämatoxylin-Gegenfärbung des Zellkerns. (B) 293T-Zellen zeigen eine schwache Kernmarkierung (braunes Diaminobenzidin (DAB)-Chromogen) des TEAD-Transkriptionsfaktors. (C) Detroit 562-Zellen exprimieren TEAD stark, wie die intensive braune Markierung im Zellkern zeigt. Die Markierung innerhalb des Zellkerns, aber nicht des Zytoplasmas (cremefarbene bis graue Region um den braunen Kern) zeigt die geeignete Markierung des immunhistochemischen Assays. Beachten Sie, dass die Zellen in allen drei Zelllinien verteilt sind, was die Visualisierung einzelner Zellen ermöglicht, einschließlich ihrer Kern- und Zytoplasmamorphologien. Maßstabsbalken = 25 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Der Zellpellet-Microarray, der unter Verwendung mehrerer Zellpellets mit unterschiedlichen Proteinexpressionsgraden erstellt wurde, ermöglicht die gleichzeitige Bewertung von Kontrollen in einem einzigen Objektträger. PEG10-defiziente embryonale Stammzellen der Maus (links) und 293T-Zellen, die PEG10 überexprimieren (rechts), sind für PEG10 immunmarkiert. Während bei 293T-Zellen, die PEG10 überexprimieren, eine starke Markierung (braunes DAB-Chromogen) beobachtet wird, ist bei PEG10-defizienten Zellen keine Markierung erkennbar. Blau steht für Hämatoxylin-Gegenfärbung. Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Erzeugung formalinfixierter, paraffineingebetteter Zellpellets, die als Kontrollen für nachgeschaltete Immunhistochemie- und In-situ-Hybridisierungsstudien verwendet werden können. Die in diesem Protokoll beschriebenen histologischen Methoden sind auf eine Vielzahl von Krebs- und primären Zelllinien anwendbar und passen in erster Linie routinemäßige histologische Techniken an, um diese Pellets herzustellen17,18. Wenn sie verarbeitet und eingebettet werden, können die Pellets ähnlich wie Gewebe verwendet werden. Dies beinhaltet die Verwendung mit wärmeinduzierten und enzymatischen Antigen-Retrieval-Protokollen für immunhistochemische Experimente. Ein Ziel der in diesem Protokoll verwendeten Methoden ist es, die Morphologie und Antigenität der Zellen während des gesamten Prozesses zu erhalten. Daher wird EDTA, das in Bezug auf Veränderungen sowohl der Morphologie als auch der Antigenität relativ sanft ist, zur Ablösung der Zellen verwendet. Das soll nicht heißen, dass andere Ansätze, wie physische Störungen, nicht praktikabel sind; Jeder Ansatz zum Ablösen von Zellen sollte jedoch sicherstellen, dass die Zellen dabei nicht verletzt werden. Das zweite Ziel dieses Protokolls besteht darin, die Zellen ähnlich wie Gewebe zu fixieren und zu verarbeiten, wobei das gleiche Fixiermittel, das gleiche Fixierungsverhältnis, der gleiche Verarbeitungsplan (Fixierung, Dehydratisierung, Reinigung und Paraffininfiltration) und Einbettungstechniken verwendet werden, so dass sie als vergleichbare Kontrollen für nachgeschaltete Assays dienen können. Daher sollten die Fixierungs- und Verarbeitungsansätze, die zur Erzeugung von Zellpellets verwendet werden, die Ansätze für Gewebe nachahmen.
Das in diesem Bericht beschriebene Protokoll ist nicht für den Umgang mit Zellen mit Infektionserregern geeignet, wie z. B. Zellen, die mit pathogenen Bakterien oder Viren infiziert sind, da Zellen vor der Fixierung abgelöst, gesammelt und zentrifugiert werden. Die Forscher könnten Protokolle in Betracht ziehen, um die Zellen vor der Ablösung zu fixieren, aber dies würde eine weitere Optimierung erfordern, um die Zellen zu sammeln, ohne die Zellmorphologie zu stören. Darüber hinaus erfordern Fixierungszeiten und Handhabungsbedingungen für Zellen mit Infektionserregern zusätzliche Überlegungen auf der Grundlage des Infektionserregers und der damit verbundenen institutionellen Biosicherheitsprotokolle.
Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete Zellpellets sind einzigartig vorteilhaft, da sie gut definierte Proteinexpressionsniveaus10 aufweisen. Während Krebs und endogene Zelllinien eine Auswahl von Zellen mit unterschiedlicher Proteinexpression bieten, ermöglichen gentechnische Technologien den Wissenschaftlern, die Proteinexpression zu modellieren, indem sie Proteine von Interesse überexprimieren und CRISPR-Technologien verwenden, um kodierende Gene von Interesse herauszuschneiden oder einzufügen20,21 . Der Nachteil von überexprimierten Proteinen in Zelllinien besteht darin, dass sie schlechte Maße für die Empfindlichkeit eines Assays sind, da sie möglicherweise keine endogenen Proteinspiegel darstellen22. Im Gegensatz dazu können sowohl endogene Zelllinien als auch Krebszelllinien endogene Expressionsniveaus besser darstellen, und die CRISPR-vermittelte Deletion des kodierenden Gens in einer verwandten Linie kann als entsprechende Negativkontrolle dienen. Darüber hinaus sind endogene Zelllinien oder Krebszelllinien mit unterschiedlicher Proteinexpression ideal für Titrationsexperimente, um endgültige Antikörperverdünnungen auszuwählen und die Empfindlichkeit eines Assays am besten zu verstehen (Abbildung 2). Die Entscheidung, welche Zelllinien verwendet werden sollen, sollte auf individuellen experimentellen Bedürfnissen basieren und wird oft eine Kombination von Ansätzen verwenden.
Neben der Bewertung, ob ein Antikörper das interessierende Protein nachweisen kann, kann ein Panel von Zelllinien verwendet werden, um die Spezifität eines Antikörpers zu definieren. Zum Beispiel kann ein Panel von Zelllinien, die einzeln eine Familie eng verwandter Proteine exprimieren, verwendet werden, um zu testen, ob ein Antikörper spezifisch für ein einzelnes Protein ist oder ob er auch andere eng verwandte Proteine nachweist. Aufwendigere Kontrollen können die Verwendung von Zelllinien beinhalten, die entweder durch CRISPR-Knock-in oder durch Überexpression Proteine mit Punktmutationen exprimieren, die keine spezifischen Signalereignisse durchlaufen können, die detektiert werden (z. B. Mutation in bestimmten Phosphorylierungsstellen bei der Bewertung eines Phospho-spezifischen Antikörpers). Obwohl dies komplexere Ansätze sind, können sie notwendig sein, um zu bestätigen, dass der verwendete Antikörper nur unter bestimmten Umständen markiertwurde 10.
Es ist wichtig zu beachten, dass genetische Manipulationen von Zelllinien möglicherweise keine homogene Zellpopulation erzeugen. Zum Beispiel ist die Transfektionseffizienz bei der Überexprimierung von Zelllinien typischerweise nicht 100% und einige Zellen überexprimieren das interessierende Protein möglicherweise nicht. Die Aufnahme von FLAG oder einem verwandten Tag in die Transfektion, der mit Standardmethoden nachgewiesen werden kann, kann hilfreich sein, um die Transfektionseffizienz der Zelllinie23 zu beurteilen. Dies kann hilfreich sein, um festzustellen, ob die Transfektion erfolgreich war, und um einen Mangel an Detektion aufgrund der Proteinexpression auszuschließen, und um als Referenz für den erwarteten Anteil von Zellen zu dienen, die das interessierende Protein exprimieren sollten.
Die In-situ-Hybridisierung (ISH) kann auch ein nützliches Werkzeug sein, um die Zielgenexpression in Zellpellets zu charakterisieren und die Entwicklung der IHC-Methode zu informieren10. Beim Screening von Antikörpern kann es aufschlussreich sein zu wissen, wann das Transkript und damit das potenzielle Protein nachgewiesen werden kann. Darüber hinaus kann das Zellpellet-ISH-Screening für die Entwicklung der ISH-Methode von Vorteil sein. Während die Spezifität bei ISH-Assays seltener ein Problem darstellt, ist es immer noch wichtig, geeignete Kontrollen und ähnliche Überlegungen für die Entwicklung und Nutzung von Kontrollen zu haben, die auf ISH-Studien angewendet werden können.
Gewebe-Microarrays werden erzeugt, indem Kerne aus Spenderblöcken entfernt und diese Kerne, oft in einem Gittermuster, in einen Empfängerparaffinblock übertragen werden. Am Ende enthält der Empfängerblock ein Spektrum von Proben in einem einzigen Block, so dass alle Proben im Block identische IHC-Verfahren durchlaufen können und der direkte Vergleich mehrerer Proben auf demselben Objektträger24,25 ermöglicht wird. Da Zellpellets relativ einheitliche Populationen sind, können sie genau durch 1-mm-Kerne dargestellt werden, was sie zu idealen Kandidaten für die Aufnahme in ähnliche Arrays macht. Unter Verwendung eines Zellpellet-Arrays ist es möglich, Zellpellets mit unterschiedlichen Expressionsgraden, Zellpellets, die verwandte Proteine eindeutig exprimieren, und Zellpellets, die Orthologe des interessierenden Proteins verschiedener Spezies in einem einzigen Objektträger exprimieren (Abbildung 3). Dadurch können alle Zellpellets gleichzeitig unter einheitlichen Bedingungen schnell ausgewertet werden, wobei der Einsatz von Reagenzien minimiertwird 25.
Für dieses Protokoll wird ein minimales Pelletvolumen der Startzelle von 2 ml aus acht T175-Kolben empfohlen. Dieses Volumen ermöglicht die Herstellung und Archivierung von mehreren Zellpelletblöcken, so dass Zellpelletkontrollen über längere Zeiträume standardisiert und aus einem gegebenen Pellet mehrere Zellpelletarrays erstellt werden können. Niedrigere Zellpelletvolumina können verwendet werden, wenn es sich um primäre Zelllinien handelt, die von Patienten stammen, langsam wachsende Zelllinien oder wenn die Bedingungen das Volumen der Probe begrenzen. Natürlich verstärken geringere Ausgangsvolumina die negativen Auswirkungen von Zellverlusten während der Fixierung und Vorbereitung des Pellets und begrenzen das Material, das für nachgelagerte Prozesse zur Verfügung steht. Es ist besonders wichtig, beim Entfernen von Fixiermitteln nach der Zentrifugation vorsichtig zu sein, um den damit verbundenen Verlust zu minimieren. Für geringere Probenvolumina kann ein 1,5 ml verschlossenes Zentrifugenröhrchen verwendet werden, um die Zellen zu pelletieren. Diese Rohre können zur Bearbeitung mit einer Klinge längs halbiert werden.
Ähnlich wie bei der Gewebefixierung ist die Zellfixierung innerhalb dieses Pellets entscheidend für nachgeschaltete IHC-Bewertungen. Um eine vollständige Fixierung zu erreichen, verwenden wir mindestens ein Verhältnis von 10:1 Formalin zu Zellpellet und kehren das konische Röhrchen um, um die Zellen in Suspension zu halten. Wenn sich die Zellen zum Zeitpunkt der Fixierung nicht in Suspension befinden, besteht das Risiko einer unvollständigen oder unzureichenden Fixierung, die die nachgeschaltete Immunmarkierung beeinträchtigt. Oft manifestiert sich dies als starke Markierung in der Peripherie und Verlust der Markierung in der Mitte des Pellets oder Markierung mit variabler Intensität im gesamten Pellet.
Dieses Protokoll verwendet Histogel, das hauptsächlich aus Hydroxyethylagarose besteht, um sowohl das Zellpellet zu binden als auch eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im Zellpellet zu ermöglichen. Ohne sie verdichten sich die Zellen und verlieren ihre zytomorphologischen Details. Diese zytomorphologischen Details sind beim Antikörper-Screening oft wichtig, da sie zusätzliche Informationen darüber liefern, ob der Antikörper im entsprechenden subzellulären Kompartiment (z. B. Zellkern, Zytoplasma oder Plasmamembran) markiert ist. Im Gegensatz dazu kann zu viel Gel zu niedrigeren Zelldichten innerhalb des Pellets führen, was dazu führt, dass die Zellen weit verteilt sind und die Zellzahl pro Abschnitt reduziert wird.
Dieses Protokoll kann routinemäßig zur Entwicklung von IHC-Kontrollen verwendet werden. Die Materialien, die zur Herstellung dieser Pellets benötigt werden, sind in forschenden Biologie- und Histologielabors üblich, und die Methoden sind einfach und leicht anzupassen. Während Zellpellets Einschränkungen als IHC-Kontrollen haben, dienen sie als großartige Werkzeuge für das anfängliche Antikörper-Screening und ergänzen andere Gewebekontrollen.
Disclosures
Alle Autoren sind Mitarbeiter von Genentech/ Roche und als solche Aktionäre von Roche.
Acknowledgments
Wir möchten die Zusammenarbeit unserer Kollegen in der Forschungsorganisation von Genentech und insbesondere der Pathologie-Kernlabore (P-Core) würdigen, die im Laufe der Jahre zur Entwicklung dieser Methoden beigetragen haben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
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