Summary
현재 프로토콜은 영양소 고갈을 통한 초파리 멜라노가스터 유충 지방체에서 자가포식 유도를 설명하고 형질전환 파리 균주를 사용하여 자가포식의 변화를 분석합니다.
Abstract
자가포식은 세포 자가 소화 과정입니다. 그것은 기아를 포함한 다양한 스트레스에 대한 반응으로 분해를 위해 리소좀에 화물을 전달합니다. 자가포식의 오작동은 노화 및 여러 인간 질병과 관련이 있습니다. 자가포식 기계는 효모에서 인간에 이르기까지 고도로 보존되어 있습니다. 척추동물의 간 및 지방 조직의 유사체인 Drosophila melanogaster의 유충 지방체는 생체 내에서 자가포식을 모니터링하기 위한 고유한 모델을 제공합니다. 자가포식은 애벌레 지방체의 영양소 결핍에 의해 쉽게 유도될 수 있습니다. 대부분의 자가포식 관련 유전자는 초파리 에서 보존됩니다. 태그가 부착된 자가포식 마커를 발현하는 많은 형질전환 파리 균주가 개발되었으며, 이는 자가포식 과정의 여러 단계를 쉽게 모니터링할 수 있습니다. 클론 분석을 통해 동일한 조직에서 서로 다른 유전자형을 가진 세포의 자가포식 마커를 면밀히 비교할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 (1) 유충 지방체에서 체세포 클론 생성, (2) 아미노산 기아를 통한 자가포식 유도, (3) 유충 지방체 해부, 자가포식소체 마커(GFP-Atg8a) 및 클론 분석을 사용하여 자가포식의 차이를 분석하는 모델을 만드는 것을 목표로 합니다.
Introduction
자가포식(Autophagy)은 아미노산 결핍을 포함한 다양한 스트레스에 의해 유발되는 "자가 섭식" 과정이다1. 거대자가포식(Macroautophagy, 이하 자가포식)은 가장 잘 연구된 자가포식 유형으로, 세포 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다2. 자가포식의 오작동은 여러 인간 질병과 관련이 있습니다3. 또한, 일부 자가포식 관련 유전자는 다양한 질병을 치료하기 위한 잠재적 표적이다4.
자가포식은 매우 정교한 방식으로 조절됩니다5. 굶주림이 발생하면, 격리막은 세포질 물질을 격리하여 이중막의 자가포식소체를 형성한다6. 그런 다음 자가포식소체는 엔도솜 및 리소좀과 융합하여 양서류 및 자가이소좀을 형성합니다. 리소좀 가수분해 효소의 도움으로 삼켜진 세포질 내용물이 분해되고 영양소가 재활용된다7.
자가포식(Autophagy)은 진화적으로 보존된 과정이다8. Drosophila melanogaster는 생체 내에서 자가포식 과정을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 아미노산 결핍은 인간의 간과 지방 조직의 유사체인 파리 지방 신체 조직에서 자가포식을 쉽게 유도한다9. 자가포식의 결함은 Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 및 p62와 같은 여러 자가포식 관련 단백질의 뚜렷한 점자 패턴을 방해합니다10. 따라서 이러한 자가포식 마커의 패턴을 분석하면 자가포식 결함의 발생과 결함 있는 자가포식 단계를 식별하는 데 도움이 됩니다. 예를 들어, 유비퀴틴 유사 단백질 Atg8은 가장 일반적으로 사용되는 자가포식 마커(11)이다. 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)에서는 녹색 형광 단백질(GFP) 태그가 붙은 Atg8a를 가진 형질전환 균주가 성공적으로 개발되었다12. GFP-Atg8a는 공급된 세포의 세포질과 핵에서 확산됩니다. 굶주림시, GFP-Atg8a는 포스파티딜 에탄올 아민 (PE)에 의해 처리되고 변형되어 단열막과 완전히 발달 된 자가 포식 소체13,14를 표시하는 puncta를 형성합니다. 직접 형광 현미경을 통해, 자가포식 유도는 GFP-Atg8 점자 형성의 증가로 쉽게 관찰될 수 있다15. Atg8a 반점은 자가포식 개시 결함이 있는 경우 기아에 대한 반응으로 형성되지 않습니다. GFP-Atg8a는 자가분해체의 낮은 pH에 의해 소멸 및 소화될 수 있기 때문에, 자가포식이 후기 단계에서 차단되면 GFP-Atg8a 반점의 수가 증가할 수 있다16.
자가포식은 영양 가용성에 매우 민감하기 때문에17, 배양 조건의 약간의 차이는 종종 표현형의 변화로 이어진다. 그러므로, 동일한 조직에서 돌연변이 세포와 야생형 대조군 세포를 분석하는 방법인 클론 분석은 자가포식 결함을 해부하는 데 큰 이점이 있다18. 상동 염색체 사이의 플립파스/플립파제 인식 표적(FLP/FRT) 매개 부위 특이적 재조합을 이용하여, 모자이크 조직을 운반하는 파리는 쉽게 만들어진다19,20. 돌연변이 세포를 둘러싼 야생형 세포는 개인차를 피하기 위해 완벽한 내부 조절을 형성한다21.
본 연구는 아미노산 결핍에 의한 자가포식을 유도하고 GFP-Atg8a를 발현하는 모자이크 지방 신체 조직을 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 돌연변이 클론 간의 자가포식 차이를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 초파리 교배와 알을 낳기
- 수컷 3마리(유전자형 hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a)와 암컷 15마리(유전자형 y' w* Mu FRT19A/FM7, Kr GFP ) 성체 파리( 재료 표 참조)를 배양 바이알(25°C에서 표준 옥수수 가루/당밀/한천 초파리 배지 포함)에 넣습니다.
참고: 추가 실험을 위한 충분한 유충을 확보하기 위해 동일한 교배의 여러 배양 바이알을 설정해야 합니다. 유전자형 hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 를 갖는 수컷 파리 균주는 중심체 근처의 X 염색체(FRT19A)에서 FRT 부위를 운반합니다. 또한 37°C에서 열충격 시 FLP를 나타냅니다. 유비쿼터스 RFP 발현을 갖는 이식유전자가 X 염색체에 삽입됩니다. GFP-Atg8a는 유충 지방체에서 cgGal4 의 조절하에 발현된다22. 유전자형 y' w* Mu FRT19A /FM7, Kr GFP 를 가진 암컷 파리 균주는 X 염색체에 치명적인 돌연변이(Mu)와 FRT19A 를 가지고 있습니다. 자세한 교차 방식은 그림 1에 나와 있습니다. - 알을 낳기 위해서는 파리를 새로운 배양 약병으로 옮깁니다. 도입 후 48시간이 지나면 파리가 기절할 때까지 "짝짓기" 바이알을 탭하고 바이알 바닥에 있는 미디어에 떨어뜨립니다.
- "짝짓기" 바이알의 플러그를 뽑고 플러그를 뽑은 거꾸로 된 바이알에 신선한 배지(신선한 배양 바이알)로 입을 가립니다. 그런 다음 바이알을 뒤집고 두드려 파리를 신선한 배양 바이알로 옮깁니다.
- 신선한 배양 바이알(옮겨진 파리 포함)을 꽂고 오래된 배양 바이알을 버립니다. 이 신선한 배양 바이알을 25°C 인큐베이터에 넣어 신선한 배지에 알을 낳습니다.
참고: 파리 이동 과정 전에 신선한 배양 바이알을 25°C로 15분 동안 예열하면 파리가 새로운 환경에 빠르게 적응하고 알을 낳는 데 도움이 됩니다.
- 알을 낳은 지 6 시간 후에 파리를 제거하십시오. 실험을 반복해야 하는 경우 이러한 파리를 다른 배양 바이알로 옮깁니다(1.2단계에 설명된 대로). 그렇지 않으면 파리를 75% 에탄올이 들어 있는 플라스크에 버려 버리십시오.
- 바이알을 37°C 수조에서 1시간 동안 배아와 함께 인큐베이션하여 FLP 발현을 유도합니다. 그런 다음 25°C 인큐베이터에 넣고 배아가 계속 발달하도록 합니다.
참고: 돌연변이 클론의 성공적인 형성은 이미징을 통해 이후에 확인할 수 있습니다. RFP 신호가 없으면 돌연변이 클론이 표시됩니다.
- 바이알을 37°C 수조에서 1시간 동안 배아와 함께 인큐베이션하여 FLP 발현을 유도합니다. 그런 다음 25°C 인큐베이터에 넣고 배아가 계속 발달하도록 합니다.
2. 아미노산 결핍은 자가포식을 유도합니다.
- 실험실 주걱을 사용하여 알을 낳은 후 75시간 후에 발달 중인 유충이 들어 있는 배지를 페트리 접시에 퍼냅니다. 접시에 1x PBS 3mL를 넣고 긴 집게를 사용하여 배양 배지와 유충을 부드럽게 분리합니다. 10-15 마리의 초기 제 3 유충을 선택하십시오.
참고: 초기 세 번째 instar 유충은 신중하게 선택해야 합니다. 유충의 발달 단계는 이 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다. 제한된 알을 낳는 기간으로 인해 배양 바이알에 있는 대부분의 유충은 배양 75시간까지 초기 3번째 인스타 단계에 있을 것으로 예상됩니다. 그러나 다른 배양 배지 레시피는 유충의 발달 시기에 변화를 초래할 수 있습니다. 초기 제 3 instar 유충을 구별하는 기준은 몸 길이, 전방 및 후방 첨탑의 존재 여부, 입 장치23의 하악 고리입니다. - 9웰 유리 함몰 스폿 플레이트( 재료 표 참조)의 웰을 1x PBS로 채웁니다. 분리 된 세 번째 instar 유충을 긴 집게를 사용하여 우물에 넣고 유충을 철저히 씻어 모든 배지 잔류 물을 제거합니다.
- 빈 바이알에 20% 자당(1x PBS) 용액 5mL를 넣고 긴 집게를 사용하여 이 용액에 깨끗한 세 번째 instar 유충을 넣습니다. 이 바이알을 25°C 인큐베이터에서 6시간 동안 배양한 후 해부를 위해 수확합니다.
참고: 20% 자당(1x PBS) 용액은 아미노산 결핍 기아 배지 역할을 합니다.
3. 세 번째 instar 유충 해부 및 샘플 조직 처리
- 숫돌로 두 쌍의 #5 집게( 재료 표 참조)를 양쪽에 고르게 날카롭게 합니다.
- 400μL의 1x PBS를 9웰 유리 함몰 스폿 플레이트의 각 웰에 넣고 긴 집게가 있는 웰로 유충을 옮깁니다. 한 마리의 유충을 등쪽(기관이 있는 쪽)이 위를 향하도록 우물에 넣습니다.
- 유충 몸통 중앙에 두 개의 #5 집게로 유충의 큐티클을 잡고 큐티클을 부드럽게 찢습니다. 노출된 지방체는 다른 유충 내부 조직과 함께 여전히 유충의 사체에 부착됩니다. 내부 장기가 최대한 노출될 정도로 당깁니다. 모든 유충에 대해 이 단계를 반복합니다.
참고: 각 유충은 몸통을 따라 두 개의 큰 뚱뚱한 몸통을 가지고 있습니다. 뚱뚱한 신체 조직은 해부 현미경(24)으로 쉽게 구별될 수 있는 백색, 불투명 및 편평한 단층이다.
- 유충 몸통 중앙에 두 개의 #5 집게로 유충의 큐티클을 잡고 큐티클을 부드럽게 찢습니다. 노출된 지방체는 다른 유충 내부 조직과 함께 여전히 유충의 사체에 부착됩니다. 내부 장기가 최대한 노출될 정도로 당깁니다. 모든 유충에 대해 이 단계를 반복합니다.
- 유충 사체를 500μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)가 들어 있는 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 흔들지 않고 25°C에서 30분 동안 배양합니다.
주의 : 4 % PFA는 독성이 있습니다. 보호를 위해 장갑과 마스크를 착용하십시오.
알림: 4x PBS 버퍼에 1% PFA를 준비하는 것이 좋습니다. PFA 분말은 1x PBS에 즉시 용해되지 않습니다. 따라서 혼합물은 65°C에서 하룻밤 동안 인큐베이터에서 배양하거나 25°C에서 45분 동안 간헐적으로 진탕해야 합니다. - 4% PFA로 사체를 30분 배양한 후 PFA 용액을 피펫으로 꺼내고 500μL의 1x PBS를 튜브에 넣고 1x PBS 용액을 버리기 전에 평평한 회전자에서 튜브를 10분 동안 부드럽게 흔듭니다(3회 반복).
- 긴 집게를 사용하여 고정되고 세척된 유충 사체를 1x PBS로 채워진 9-함몰 스팟 플레이트의 우물로 옮깁니다. #5 집게를 사용하여 지방이 아닌 신체 조직을 모두 제거합니다.
- #5 집게를 사용하여 80% 글리세롤을 장착 매체로 사용하여 현미경 슬라이드에 지방 몸체 조각을 장착하고 그 위에 커버슬립을 놓습니다.
알림: 장착하기 전에 GFP 신호를 보호하기 위해 80% 글리세롤의 pH를 확인하십시오(pH 용지 사용, pH = 7이 최적임). 80% 글리세롤에 DAPI를 사용하여 매체( 재료 표 참조)를 장착하면 지방 세포의 핵을 이미징하는 데 도움이 됩니다. 이러한 슬라이드는 4°C의 암실에서 보관될 때 1주일 동안 안정하다.
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Representative Results
섭식 조건 하에서, GFP- 태그가 부착 된 유비퀴틴 유사 단백질 인 GFP-Atg8a는 세포 내부로 확산된다. 굶주리면 녹색 반점을 형성하고 자가포식소체에 라벨을 붙입니다. 자가포식소체가 리소좀과 융합되면 GFP는 산성 자가소체에서 소멸되고 녹색 반점은 사라집니다. 자가포식이 유도되지 않거나 자가포식소체 성숙이 가속화되면 GFP 점자의 수가 적을 것으로 예상됩니다. 그러나 자가포식소체와 리소좀의 융합이 차단되거나 자가소좀의 pH가 염기성이 되면 GFP 반점의 수 및/또는 크기가 높을 것으로 예상됩니다.
여기에 제시된 프로토콜에서 FLP/FRT 시스템은 유사분열 재조합을 유도하고 야생형 및 돌연변이 세포 모두를 갖는 조직을 생성합니다. 야생형 세포는 RFP를 발현하지만 돌연변이 세포는 RFP 발현이 부족합니다. 모든 지방체 세포에서 RFP의 발현은 FLP/FRT 매개 유사분열 재조합이 성공적으로 유도되지 않았거나 돌연변이가 세포에 치명적임을 나타냅니다. 후자의 경우(즉, 돌연변이가 세포 치명적인 경우), 유충 지방체는 주변 세포보다 더 높은 수준의 RFP 신호를 갖는 몇 개의 세포를 가질 것으로 예상됩니다.
그림 2에서 GFP-Atg8a(녹색)는 야생형 세포(빨간색)에서 반점을 형성하여 자가포식이 성공적으로 유도되었음을 의미합니다. 돌연변이 클론(RFP 음성)에서 GFP-Atg8a 반점의 패턴은 주변 야생형 세포의 패턴과 달랐으며, 이는 자가포식 결함을 시사합니다. Mu1 돌연변이 클론에서 GFP-ATG8a 반점이 거의 검출되지 않았으며(그림 2B), 이는 자가포식이 개시 단계에서 차단되었거나 자가분해체 성숙이 가속화되었음을 나타냅니다. GFP-Atg8a 반점의 수와 크기는 Mu2 돌연변이 클론에서 크게 증가했으며(그림 2C), 이는 자가포식소체-리소좀 융합 또는 자가소좀 산성화 결함을 시사합니다. 이러한 가능성을 구별하기 위해서는 추가 실험이 필요합니다. 또한, 관찰된 차이가 통계적으로 유의한지 여부를 결정하기 위해 점액의 크기와 수를 정량화해야 합니다.
그림 1: 돌연변이 클론을 운반하는 모자이크 유충 지방체에서 자가포식 마커 GFP-Atg8a를 모니터링하기 위한 실험 절차의 개략도. 유충 지방체 조직에서 GFP-Atg8a를 발현하고 돌연변이 클론을 운반하는 파리를 생성하는 교차 계획이 표시됩니다(X-염색체에 치사점 돌연변이[Mu]가 있는 균주가 예로 사용됨). FLP 발현을 활성화시키기 위해 37°C에서 1시간 동안 열 충격을 가한 후, GFP-Atg8a 발현을 갖는 동형접합체 돌연변이 세포가 y'w* Mu FRT19A/ hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a/ + 유충 지방체에서 생성될 수 있다. Autophagy는 유충을 20 % 자당 용액에서 6 시간 동안 배양하여 지방체에서 유도됩니다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Mu1 및 Mu2 클론에서 GFP-Atg8a 반점의 패턴은 대조군 클론의 패턴과 달랐습니다. Mu1과 Mu2는 X 염색체에 있는 두 개의 독립적인 치명적인 돌연변이입니다. Isogenized y' w*, FRT19A 파리는 대조군 역할을 합니다. GFP-Atg8a(녹색) 패턴은 대조군, Mu1 또는 Mu2 모자이크 유충 지방체에서 분석되었습니다. 돌연변이 클론(또는 대조군 클론)은 RFP(빨간색)로 음성으로 표시되었습니다. (A) 대조군 클론(RFP 음성)에서 GFP-Atg8a 반점의 패턴은 주변 RFP 양성 세포의 패턴과 유사했습니다. (B) Mu1 돌연변이 클론(RFP 음성)에서 GFP-Atg8a 반점이 크게 감소했습니다. (C) Mu2 돌연변이 클론(RFP 음성)에서 GFP-Atg8a 푼타의 수와 크기가 증가했습니다. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 프로토콜은 (1) 유충 지방체에서 돌연변이 클론을 운반하는 파리를 생성하고, (2) 아미노산 기아를 통해 자가포식을 유도하고, (3) 유충 지방체를 해부하는 방법을 설명합니다. 애벌레 지방체에서 클론을 성공적으로 생성하려면 다음과 같은 중요한 단계를 부지런히 수행해야 합니다. (1) 유사분열 재조합은 조직이 유사분열을 겪고 있을 때만 발생하기 때문에 열충격의 정확한 타이밍이 중요하고, (2) 열충격 온도와 지속 시간이 모두 FLP 발현을 유도하는 데 중요합니다. 37시간 동안 열 충격을 가하는 표준 1°C 수조를 사용하는 것이 좋습니다. 열 충격 및 기아 동안 배아/유충 사망 가능성이 증가한다는 점을 고려할 때 이미징을 위한 충분한 조직 샘플 생성을 위해 다중 교차점을 설정해야 합니다.
또한 실제 배양 조건을 고려하여 일부 단계를 수정해야 할 수도 있습니다. 예를 들어, 실험실 간의 환경 및 초파리 배양 배지의 차이는 유충의 성장률에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 배아가 초기 3차 인스타 단계에 도달하는 데 필요한 발달 시간과 유충 기아 기간(자가포식을 유도하기 위해 20% 자당에서 배양)은 각 실험실에서 별도로 표준화해야 할 수 있습니다.
GFP-Atg8a는 자가포식을 결정하는 데 가장 일반적으로 사용되는 마커입니다. 그러나 GFP-Atg8a 점자 패턴의 변화는 정확한 자가포식 결함이나 영향을 받는 단계를 직접 찾아내지 못합니다. 따라서 이러한 데이터를 정확하게 해석하려면 여러 마커를 분석해야 합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 각각의 형질전환 균주를 갖는 다른 자가포식 관련 단백질에 적용될 수 있다25. 서로 다른 형광 단백질(예: 청색 형광 단백질[BFP])로 표지된 여러 마커를 동시에 분석하여 개시 또는 융합 과정을 설명할 수 있습니다. 화학 물질(26 ) 또는 중요한 유전자(27)의 RNA 간섭을 사용하는 제어된 자가포식 변형은 자가포식 메커니즘을 추가로 설명하기 위해 본 접근법과 결합될 수 있습니다. 또한, 모자이크 조직에서 자가포식(면역조직화학을 사용하여)의 내인성 단백질 마커를 분석하는 것은 표현형을 확인하는 데 중요합니다28.
자가포식은 원래 무작위적이고 비선택적인 과정으로 인식되었지만, 미토콘드리아와 소포체와 같은 세포질 소기관을 선택적으로 분해할 수 있다는 증거가 증가하고 있다29. 또한, 여기에 설명된 절차는 선택적 자가포식을 탐색하는 데 적용될 수 있습니다. 예를 들어, 미토파지는 형광 단백질(예: Keima 또는 GFP-RFP 탠덤 태그)을 미토콘드리아 표적화 서열(30)에 부착시킴으로써 플라이 지방체에서 모니터링될 수 있다.
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Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
파리 균주를 제공한 THFC와 BDSC에 감사드립니다. Tong Chao 박사는 중국 국립 자연 과학 재단 (32030027, 91754103, 92157201)과 중앙 대학을위한 기초 연구 기금의 지원을 받고 있습니다. 서비스를 제공해 주신 생명과학연구소(LSI)의 핵심 시설에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| #5 Forceps | Dumont | RS-5015 | |
| 9 Dressions Spot plate | PYREX | 7220-85 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854-0100 | |
| KCl | Sangon Biotech | A610440-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A600445-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| Laboratory spatula | Fisher | 14-375-10 | |
| Long forceps | R' DEER | RST-14 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | 80340-1130 | |
| Microscope slides | CITOTEST | 80302-2104 | |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | Composition of 1x PBS solution |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | Composition of 1x PBS solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petri dish | Corning | 430166 | |
| Standard cornmeal/molasses/agar fly food | Tong Lab-made | ||
| Stereo microscope | Nikon | SMZ745 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd. | 10021418 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vectorlabratory | H-1200-10 | Recommended mounting medium |
| Fly stocks | |||
| y'w* Iso FRT19A | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu1FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| y'w* Mu2 FRT19A/ FM7,Kr GFP | Tong Lab's fly stocks | ||
| hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a | Tong Lab's fly stocks |
References
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